CN107631921A - 一种大花红山茶花丝染色体制片方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种大花红山茶花丝染色体制片方法。该方法包括如下步骤：选取5～10年生盆栽大花红山茶放置于温室内，晴天上午9～10时取生长旺盛的盆栽大花红山茶花芽中的花丝；将获得的花丝用冰水漂洗干净后，立即放入预处理溶液中在4℃冰箱处理8～10h；预处理后的花丝漂洗干净后固定液固定24h；然后在解离液中55℃水浴解离10～12min；解离后的花丝卡宝品红染色剂染色10min，镜检照相、进行核型分析。采用本发明所述方法，可以准确快速的确定大花红山茶的倍性，获得多种分裂相染色体的清晰图像，从而攻克了大花红山茶染色体多，清晰分裂相获取难度大这一技术难题，对系统研究大花红山茶染色体的构型变化规律及品种改良和杂交育种奠定了良好的基础。
Description
技术领域
本发明属于植物细胞学研究领域，具体涉及一种大花红山茶花丝染色体制片方法。
背景技术
大花红山茶(Camellia Magniflora)为山茶科山茶属内罕见的天然多倍体物种，其花大如牡丹，艳红亮丽；茶籽榨油，既为高级食用油，又可制成高级化妆品，具有极高的观赏价值和经济价值。分布在低山地区而具有较强的抗寒、抗病能力，因而是一种重要的遗传种质资源。红山茶组（Sect. Camellia）多种植物开花量大，但花径小，抗性差。因此，开展红山茶组种类与山茶的种间杂交工作，是培育大花、抗性强观赏品种最具潜力的途径之一。搞清楚大花红山茶的倍性，有针对性的开展杂交实验，是杂交育种的基础性工作。
染色体是基因的载体，染色体的数目、形态和结构，决定着细胞减数分裂中染色体的配对行为；配对行为的正常与否，决定着植物大小孢子育性的高低。因此，染色体的结构和行为支配着植物的生殖过程和繁育行为，研究染色体的数目、结构以及细胞学行为，对于了解植物的遗传背景，进而进行有选择的杂交育种具有重要的意义。
山茶倍性复杂，除二倍体外，还有三倍体、四倍体、六倍体、八倍体等。有的山茶品种可育，有的则表现为高度不育。综上可见，确定大花红山茶花丝染色体制片的最佳技术方法，对于其细胞遗传学的理论研究及育种实践具有重要的意义。
发明内容
本发明是为了克服现有技术的不足，建立一种大花红山茶花丝染色体制片方法，提高大花红山茶花丝染色体制片质量，为深入开展山茶杂交育种研究提供一种新的技术平台。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：首先，选取适合的大花红山茶花丝，进行预处理；然后，对材料进行固定和解离；再次对花丝进行染色；最后，对染色过的花丝压片，镜检，确定染色体数目，以便进行核型分析。
本发明所述大花红山茶花丝染色体制片方法包括如下步骤：
1）材料处理：11～12月份，将5～10年生盆栽大花红山茶放置于温室内，浇透水；
2）取材：浇透水3～5天后，晴天上午9～10时取生长旺盛的盆栽大花红山茶花芽，除去外部芽鳞、雏花瓣、子房，仅留下雄蕊部分；
3）预处理：将取材获得的雄蕊用冰水漂洗干净后，立即放入预处理溶液中在4℃冰箱处理8～10h；
4）固定：将预处理后的雄蕊用蒸馏水漂洗3次，之后放入固定液固定24h；
5)解离：将固定后的雄蕊用蒸馏水漂洗3次，然后放入解离液中55℃水浴解离10～12min，然后加入0.01mol/L氢氧化钠溶液漂洗3次；
6）染色：将解离后的雄蕊置于载玻片上，取雄蕊下端0.5～1mm呈现出乳白色的花丝，用
解剖刀将取下的花丝沿纵向切割成两部分，用吸水纸吸干花丝周围的水分，滴入1～2滴卡宝品红染液，染色10min，然后用蒸馏水漂洗；
7）压片：将染色处理过的花丝重新移至载玻片上，盖上盖玻片，吸干盖玻片周围染液，再用拇指轻挤压盖玻片，使组织成为一薄层，轻轻敲击盖玻片，使细胞分散；
8）镜检：将压片置于OLYMPUS显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行显微照
相，以便进行核型分析。
作为一种优选方案，其特征在于，所述步骤3）中，所述预处理溶液为：10mg/L 8-羟基喹啉+500mg/L的风油精。
作为一种优选方案，其特征在于，所述步骤4）中，所述固定液为：无水乙醇：冰乙酸=5:2。
作为一种优选方案，其特征在于，所述步骤5）中，所述解离液为：2mol/L盐酸+0.1mol/L高氯酸。
本发明的有益效果在于：采用本发明所述方法，可以准确快速的确定大花红山茶的倍性，获得多种分裂相染色体的清晰图像，从而攻克了大花红山茶染色体多，清晰分裂相获取难度大这一技术难题，对系统研究大花红山茶染色体的构型变化规律及杂交育种具有积极意义。
附图说明
图1为单瓣大花红山茶的染色体制片；图2为重瓣大花红山茶的染色体制片。
具体实施方式
以下实施例用来说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。
实施例1成功观察并统计出了单瓣大花红山茶的染色体数目。
1）材料处理：11～12月份，将5～10年生盆栽大花红山茶放置于温室内，浇透水；
2）取材：浇透水3～5天后，晴天上午9～10时取生长旺盛的盆栽大花红山茶花芽，除去外部芽鳞、雏花瓣、子房，仅留下雄蕊部分；
3）预处理：将取材获得的雄蕊用冰水漂洗干净后，立即放入10mg/L 8-羟基喹啉+500mg/L的风油精预处理溶液中在4℃冰箱处理8～10h；
4）固定：将预处理后的雄蕊用蒸馏水漂洗3次，之后放入固定液（无水乙醇：冰乙酸=5:2）固定24h；
5）解离：将固定后的雄蕊用蒸馏水漂洗3次，然后放入在2mol/L盐酸+0.1mol/L高氯酸解离液中55℃水浴解离10～12min，然后加入0.01mol/L氢氧化钠溶液漂洗3次；
6）染色：将解离后的雄蕊置于载玻片上，取雄蕊下端0.5～1mm呈现出乳白色的花丝，用
解剖刀将取下的花丝沿纵向切割成两部分，用吸水纸吸干花丝周围的水分，滴入1～2滴卡宝品红染液，染色10min，然后用蒸馏水漂洗；
7）压片：将染色处理过的花丝重新移至载玻片上，盖上盖玻片，吸干盖玻片周围染液，再用拇指轻挤压盖玻片，使组织成为一薄层，轻轻敲击盖玻片，使细胞分散；
8）镜检：将压片置于OLYMPUS显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行显微照
相，镜检结果和显微照相见图1。
实施例2 成功观察并统计出了重瓣大花红山茶的染色体数目
具体实施方法同实施例1，镜检结果和显微照相见图2。
以上在两个代表性大花红山茶品种上的实施应用结果表明，本方法是一种有效的大花红山茶染色体制片的方法，并且该制片方法操作简单方便，染色体分散均匀且背景较浅，染色体数目易计数，采用本方法制片得出的染色体数目准确度高。
Claims (4)
1.一种大花红山茶花丝染色体制片方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）材料处理：11～12月份，将5～10年生盆栽大花红山茶放置于温室内，浇透水；
2）取材：浇透水3～5天后，晴天上午9～10时取生长旺盛的盆栽大花红山茶花芽，除去外部芽鳞、雏花瓣、子房，仅留下雄蕊部分；
3）预处理：将取材获得的雄蕊用冰水漂洗干净后，立即放入预处理溶液中在4℃冰箱处理8～10h；
4）固定：将预处理后的雄蕊用蒸馏水漂洗3次，之后放入固定液固定24h；
5)解离：将固定后的雄蕊用蒸馏水漂洗3次，然后放入解离液中55℃水浴解离10～12min，然后加入0.01mol/L氢氧化钠溶液漂洗3次；
6）染色：将解离后的雄蕊置于载玻片上，取雄蕊下端0.5～1mm呈现出乳白色的花丝，用
解剖刀将取下的花丝沿纵向切割成两部分，用吸水纸吸干花丝周围的水分，滴入1～2滴卡宝品红染液，染色10min，然后用蒸馏水漂洗；
7）压片：将染色处理过的花丝重新移至载玻片上，盖上盖玻片，吸干盖玻片周围染液，再用拇指轻挤压盖玻片，使组织成为一薄层，轻轻敲击盖玻片，使细胞分散；
8）镜检：将压片置于OLYMPUS显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行显微照
相，以便进行核型分析。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中，所述预处理溶液为：10mg/L8-羟基喹啉+500mg/L的风油精。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4）中，所述固定液为：无水乙醇：冰乙酸=5:2。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5）中，所述解离液为：2mol/L盐酸+0.1mol/L高氯酸。
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