CN101126684A - 一种用于超薄切片的样品包埋方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于超薄切片的样品包埋方法，该方法包括以下步骤：1)在硬质支持物上设置一可拆除的密封的槽体，所述槽体和硬质支持物之间是密封连接的；2)一可以弯折的盖体，将其与所述槽体的顶部密封连接；其中，预留一部分尚不进行密封连接的部位，作为样品和包埋物植入口；3)从所述样品和包埋物植入口将所需包埋的样品植入所述槽体中，再将包埋物注入，并充满所述槽体的内部空间；4)将所述样品和包埋物植入口部分的所述盖体和所述槽体密封；5)使注入槽体的所述包埋物固化；6)拆除所述盖体、槽体及支持物，得到包埋了样品的固化包埋物。本发明的目的是：本发明使应用LR White树脂进行薄层包埋变得简单易行，具有较大的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域中，样品的包埋方法，特别是涉及一种用于制作超薄切片的样品的包埋方法。
背景技术
电子显微镜是细胞生物学研究中的重要工具，不仅能够研究细胞的亚显微结构，而且能对各种酶、除酶以外的其它蛋白质、核酸、脂肪等生化物质以及Ca2+等无机离子进行精确的亚细胞定位；还能追踪细胞内生化物质的合成、分解等动态变化，应用非常广泛。电子显微镜技术中，超薄切片制作是最基本、最常用的技术。超薄切片制作过程中，对样品的包埋是关键的步骤。胡适宜和徐丽云曾提出薄层包埋法(胡适宜，徐丽云(1993)介绍一种超薄切片中细胞定位的薄层包埋方法，植物学通报，10(1)：63～64)，后来邢树平等又对这一方法进行改进(邢树平等(1999)薄层包埋法的改进，植物学通报，16(4)：468)，获得了较好的效果。但是他们的方法不能使得树脂在聚合过程中保持与外界空气隔绝，因此只适用于利用Epon812、Spurr等环氧类树脂进行包埋的情况，而免疫电镜中常用的LR White等树脂，因其聚合过程中必须隔绝氧气，目前还只能采取传统的胶囊包埋法(Scoccianti et al.(2003)Involvement of theubiquitin/proteasome pathway in the organization and polarised growth of kiwifruit pollentubes.Sex Plant Reprod 16：123-133)。而用胶囊法包埋的样品(尤其是花粉管等)，在包埋块中的排列方向不一，因此在后续的切片过程中很难精确定位特定的组织或细胞，严重影响后续的超薄切片的效率和质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单有效的用于超薄切片的样品包埋方法。
一种用于超薄切片的样品包埋方法，包括以下步骤：1)在硬质支持物上设置一可拆除的密封的槽体，所述槽体和硬质支持物之间是密封连接的；
2)一可以弯折的盖体，将其与所述槽体的顶部密封连接；其中，预留一部分尚不进行密封连接的部位，作为样品和包埋物植入口；
3)从所述样品和包埋物植入口将所需包埋的样品植入所述槽体中，再将包埋物注入，并充满所述槽体的内部空间；
4)将所述样品和包埋物植入口部分的所述盖体和所述槽体密封；
5)使注入槽体的所述包埋物固化；
6)拆除所述盖体、槽体及支持物，得到包埋了样品的固化包埋物。
在上述过程中，槽体是用胶粘结在硬质支持物上的。可以用的胶的种类是非常广泛的，只要是能够将槽体和硬质支持物粘结住即可，例如502胶等。
为了方便将固化的包埋物取出，在所述硬质支持物上可以先粘结铺设一层非透气性的隔离膜，所述槽体设置在该隔离膜上。所述用作隔离膜的材料也是非常广泛的，例如透明胶带，就是一个很好的选择。一般市售的透明胶带即可，其宽度应大于或等于硬质支持物的宽度；所述槽体是用胶粘结在隔离膜上的。
所述盖体和槽体之间是用胶粘结在一起的。可以用的胶的种类也是非常广泛的，只要是能够将槽体和盖体之间粘结住即可，例如502胶等
所述槽体和盖体的选材都是非常广泛的，只要是不透水，能够密封就可以。比如槽体可以用废电话卡剪成的薄片制作(切割成约2mm宽的小条即可)，既经济又方便。盖体可以用具有一定柔韧度的透明胶片来充当。硬质支持物可以选择载玻片或硬质塑料等平整的物品。
所述包埋物可以选择的范围是非常广泛的，一般的包埋材料均可以，例如丙烯酸树脂或环氧树脂(Epon812树脂或Spurr树脂)。特别是对于丙烯酸树脂LR White树脂尤为适用，因为该方法可以保证LR White树脂与外界空气的隔绝。
在树脂的固化过程中，根据不同的树脂要采用不同的固化条件，LR White树脂的固化温度为50-60℃，固化时间是24-48h；Spurr树脂的固化温度为55-60℃，固化时间是16-24h；Epon812树脂的固化温度为37-45-60℃，固化时间是每步12h。
本发明的方法简单易行，可高效率地获得较高质量的超薄切片，并应用于细胞超微结构观察和免疫电镜观察。样品可以为花粉管、菌丝、悬浮培养的单细胞、原生质体和需要精确定位的特定组织或细胞等。本发明方法中所用到的材料均是常见的材料，没有特殊的要求，甚至可以说是“废物利用”。作为隔离膜的透明胶带可以使得聚合好后的树脂薄片很容易地和载玻片分离；用电话卡小条自制的槽体可以根据实验需要随意调整槽体的大小以及深度；而具有一定硬度的透明胶片既能保证在加样以及聚合时观察样品的位置，又能保证树脂聚合过程中树脂薄片不会发生大的变形。此外，透明胶带、电话卡小条以及透明胶片都具有空气不通透性，加上选用502胶合剂作为粘连剂，共同保证了槽体中的LR White树脂与外界空气隔绝。本发明使应用LR White树脂进行薄层包埋变得简单易行，具有较大的实际应用价值。
附图说明
图1为本发明的流程示意图。
图2为本发明的方法制作的青扦花粉管顶端径向超薄切片图片。
图3为常规胶囊包埋法制作的猕猴桃花粉管顶端超薄切片图片。
具体实施方式
实施例1、利用本发明的方法制作青扦花粉管顶端LR White树脂薄层包埋切片
如图1所示，制作青扦花粉管顶端LR White树脂薄层包埋切片的具体步骤如下：
1.如图1-A所示，取1张洁净的载玻片1，并在其中的一面粘贴上宽度和载玻片1相同的透明胶带2。
2.如图1-B所示，裁取4条宽度均为2mm的塑料质地的电话卡小条，作为槽壁3，其中两条长1cm，两条长2cm；用502胶将四条槽壁3粘结在一起，并将其底部粘贴在透明胶带上，形成一个槽体。
3.如图1-C所示，裁取面积大于槽体横切面的透明胶片作为盖体4，并用502胶将其粘贴于槽体上，但要留一角暂时不粘，作为放入样品以及树脂的样品和包埋物植入口5。
4.如图1-D所示，从样品和包埋物植入口5将6放入槽体总，并注满LR White树脂，再用502胶将包埋物植入口5处的盖体5和槽体之间密封粘贴住。
5.将载玻片连同封闭好的槽体放入55℃恒温箱中，进行热聚合35h。
6.取出经过聚合的槽体，去除载玻片1、透明胶带2、电话卡小条3以及透明胶片4，得到一片聚合好的树脂薄片。
7.然后按照一般的常规超薄切片技术进行切片和观察即可。
图2为利用上述方法制作的青扦花粉管顶端的超薄切片，图3为采用传统的胶囊法包埋制作的猕猴桃花粉管顶端的超薄切片(Scoccianti et al.(2003)Involvement of theubiquitin/proteasome pathway in the organization and polarised growth of kiwifruit pollentubes.Sex Plant Reprod 16：123-133)。可以明显看到，用传统方法得到的切片明显偏离径向切面，用本发明的方法获得的切片，在切片方向的精确定位上，其效果要明显好于用常规方法获得的切片。
当然，在上述实施例中，也可以不设隔离膜，直接将槽体粘结在载玻片上，同样可以达到本发明的目的，只不过将树脂薄片从载玻片上取下时会有一定难度。
如果制作用其它树脂进行包埋的切片，和本实施例的步骤是相同的，只是根据不同树脂的性质调整聚合时的条件即可。
Claims (10)
1.一种用于超薄切片的样品包埋方法，包括以下步骤：1)在硬质支持物上设置一可拆除的密封的槽体，所述槽体和硬质支持物之间是密封连接的；
2)一可以弯折的盖体，将其与所述槽体的顶部密封连接；其中，预留一部分尚不进行密封连接的部位，作为样品和包埋物植入口；
3)从所述样品和包埋物植入口将所需包埋的样品植入所述槽体中，再将包埋物注入，并充满所述槽体的内部空间；
4)将所述样品和包埋物植入口部分的所述盖体和所述槽体密封；
5)使注入槽体的所述包埋物固化；
6)拆除所述盖体、槽体及支持物，得到包埋了样品的固化包埋物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述槽体是用胶粘结在硬质支持物上的。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述硬质支持物上先粘结铺设一层非透气性的隔离膜，所述槽体设置在该隔离膜上。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述隔离膜为透明胶带；所述槽体是用胶粘结在隔离膜上的。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于：所述盖体和槽体之间是用胶粘结在一起的。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述硬质支持物为载玻片；所述槽体是用电话卡的塑料薄片制成的；所述盖体为透明胶片。
7.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于：所述包埋物为丙烯酸树脂或环氧树脂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述丙烯酸树脂为LR White树脂；所述环氧树脂为Epon812树脂或Spurr树脂。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述LR White树脂和Spurr树脂的固化温度为55-60℃，固化时间是16-24h；Epon812树脂的固化温度为37-45-60℃，固化时间是每步12h。
10.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于：所述样品为花粉管、菌丝、悬浮培养的单细胞、原生质体、组织或细胞。
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