CN103805634A

CN103805634A - 一种带有绿色荧光蛋白基因的ca16感染性克隆及构建方法和应用

Info

Publication number: CN103805634A
Application number: CN201410077204.5A
Authority: CN
Inventors: 张波; 邓成林; 徐琳琳; 秦成峰; 李晓丹; 袁志明; 叶寒青
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2014-03-05
Filing date: 2014-03-05
Publication date: 2014-05-21
Anticipated expiration: 2034-03-05
Also published as: CN103805634B

Abstract

本发明公开了一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆及构建方法和应用。以低拷贝质粒pACYC177为载体，首先插入CA16/GD09/24病毒株的全长cDNA；然后以此全长感染性克隆为骨架，在5’UTR和VP4间插入eGFP报告基因并添加2A蛋白酶切割位点(AITTL)，从而获得带有eGFP报告基因的CA16全长感染性克隆。本发明所构建的带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆可以拯救出具有与重组CA16病毒及亲本CA16生长趋势相似的eGFP-CA16报告病毒，并可以用于抗病毒药物筛选，为深入开展病毒复制与致病机理研究提供了便捷的平台，为今后筛选和开发新型疫苗奠定了坚实的基础。

Description

一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆及构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆，还涉及该克隆的的构建方法，还涉及利用反向遗传学技术由该克隆拯救出的eGFP-CA16报告病毒的应用。

背景技术

柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16，CA16)属于小RNA病毒科肠道病毒属，病毒颗粒为立体对称的20面体，呈球形，直径为23～30nm，无包膜和突起，由核酸和衣壳组成。其核酸是全长约为7410个核苷酸的单股正链RNA，基因组由一个开放读码框架(ORF)和5’，3’非编码区（UTR）组成。ORF编码一个多聚前体蛋白，经蛋白酶切水解为P1、P2和P3三个前体蛋白，P1编码病毒的结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，其中VP1、VP2、VP3三个多肽暴露在病毒外壳的表面，VP4包埋在病毒外壳的内侧与病毒核心紧密连接，VP1区长891bp，编码297个氨基酸残基，是病毒主要的中和抗原表位所在区；P2、P3区编码非结构蛋白，包括2A、2B、2C、3A、VPg(3B)、3C和3D。5’，3’非编码区（UTR）分别含有多肽翻译和RNA合成的起始信号，在3’非编码区的末端带有一个长度可变的多聚腺苷酸尾巴(polyA)。

CA16于1951年首次在南非被成功分离并与肠道病毒71型（Enterovirus71，EV71）成为了引起手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD）的最主要病原，主要引起5岁以下婴幼儿出现手、足、口部疱疹、咽峡炎等症状，少数患者可出现心肌炎、无菌性脑膜炎等多种并发症。自1957年首例HFMD在多伦多报道以来，CA16常与EV71交替或共同流行，已造成全球范围内多次大流行。以往研究多认为EV71感染除引起HFMD外还可引起较为严重的并发症，如无菌性脑炎、脑膜炎、肺水肿等，而CA16感染引起的HFMD症状较温和，且并发症的发生率也较低，但近年来，越来越多的报道显示除引起轻症外，CA16感染亦可导致心肌、心包、脑部和肺部等疾病，甚至引发致死性心肌炎、脑干脑炎和肺炎等致死性症状。近几年的流行病学资料显示，中国已成为HFMD高流行区，每年HFMD报告病例数均在100万以上，CA16和EV71引起的HFMD已成为我国的一种严重的公共卫生问题。目前对EV71的相关研究投入较多，EV71的疫苗和药物得到了快速的发展，而对CA16的感染、致病机制等了解较少，缺乏流行病学研究资料，其疫苗和治疗药物的研究也相对滞后，因此深入开展对CA16的研究具有重要意义。

目前反向遗传学技术已广泛应用于生命科学研究的各个领域，尤其是在RNA病毒的研究方面显示出了巨大的作用。通过构建RNA病毒的全长感染性克隆，按照研究方向和目的，在DNA分子水平上对病毒基因组进行体外操作，再由感染性克隆通过体外转录获取病毒基因组RNA，将此RNA转染病毒敏感细胞中可以拯救出活病毒。通过观察其表型变化，来判断这些操作对病毒的影响，从而为病毒复制机制、致病机理以及新型疫苗的研发等方面提供平台。因此，感染性克隆的构建解决了RNA病毒基因组难以操作的困扰，为RNA病毒的研究提供了有效的工具。报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。目前，增强绿色荧光蛋白（eGFP）报告基因因其检测不需要添加任何底物或辅助因子，不使用同位素，也不需要测定酶的活性，对细胞无毒害作用，具有能在活细胞状态下直接观察等优点被广大科学工作者广泛应用。在全长感染性克隆的基础上，将eGFP报告基因与病毒基因组融合，构建含有报告基因的病毒感染性克隆,拯救出具有感染性的稳定表达报告基因的病毒，通过荧光显微镜观察eGFP的表达情况即可直观指示病毒生长情况。因此，带有报告基因的感染性克隆较不带标签的感染性克隆有着更加便捷的优势。

本发明提供一种带有绿色荧光蛋白（eGFP）基因的CA16病毒的感染性克隆的构建方法，以及利用反向遗传学技术由该克隆拯救出的eGFP-CA16报告病毒与CA16病毒在生物学特性方面的比较，以及其在抗病毒药物筛选中的应用。本发明所构建的带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆将为深入了解CA16的感染、致病机制，以及其疫苗和治疗药物的研究提供有效的平台，对开展CA16的基础研究和应用研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆pACYC177-eGFP-CA16-FL（其拯救出的病毒简称为eGFP-CA16），其序列为SEQ ID NO.1所示。本发明所构建的带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆可以拯救出具有与CA16病毒生长趋势相似的eGFP-CA16报告病毒。

本发明的另一个目的在于提供了一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆eGFP-CA16的构建方法。首先构建CA16全长感染性克隆（pACYC177-CA16-FL）（其拯救出的病毒简称为重组CA16），在5’UTR和VP4间采用融合PCR的方法加入BsiWI和NotI酶切位点，以及2A蛋白酶切割位点(AITTL)，然后再通过BsiWI和NotI双酶切插入eGFP报告基因，从而获得带有eGFP报告基因的CA16全长感染性克隆。

本发明的另一个目的在于提供了一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆在抗病毒药物筛选上的应用。利用反向遗传学技术由该克隆拯救出的eGFP-CA16报告病毒通过荧光显微镜观察eGFP的表达情况即可直观指示药物对病毒的抑制情况，可以作为有效的抗病毒药物筛选平台。

为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：

一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆pACYC177-eGFP-CA16-FL，其构建方法如下：

1.提取亲本CA16（CA16/GD09/24）病毒株基因组RNA；

2.CA16/GD09/24病毒株基因组序列分段扩增：

以步骤1中的亲本CA16病毒RNA为模版，采用RT-PCR分别获得片段A、B、C和D，四对引物分别为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7；SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9；SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11；SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示。四个片段分别用AatII和SmaI/ClaI插入低拷贝质粒pACYC177载体，质粒均经过DNA测序鉴定为正确序列，分别命名为CA16-A,CA16-B,CA16-C和CA16-D；

3.含有病毒基因组的CA16cDNA全长感染性克隆的构建：

（1）CA16基因组片段A+B的拼接：用NdeI和SmaI酶切上述步骤2中所得的CA16-A和CA16-B，回收CA16-A的大片段与CA16-B的大片段；将CA16-A的大片段作为载体，CA16-B的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶将载体与片段连接，测序正确的质粒命名为CA16-AB；

（2）CA16基因组片段C+D的拼接：用AatII和SphI酶切上述步骤2中所得的CA16-C和CA16-D，回收CA16-C的大片段与CA16-D的大片段；将CA16-D的大片段作为载体，CA16-C的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶将载体与片段连接，测序正确的质粒命名为CA16-CD；

（3）CA16基因组全长A+B+C+D的拼接：用AatII和EcoRV酶切上述步骤中所得的CA16-AB和CA16-CD，回收CA16-AB的大片段与CA16-CD的大片段；CA16-CD的大片段作为载体，CA16-AB的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶将载体与片段连接，测序正确的质粒即为拼接完成的含有CA16全长基因组的cDNA质粒，命名为pACYC-CA16-FL。

4.带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆的的构建：

（1）插入BsiWI和NotI酶切位点，以及2A蛋白酶切割位点(AITTL)的CA16全长感染性克隆的构建：

①片段T7-5’UTR-BsiWI-NotI-2A protease cleavage site-VP4的扩增：以pACYC-CA16-FL为模板，扩增含有T7-5’UTR-BsiWI-NotI的序列，引物为SEQ ID NO.6和SEQID NO.14所示；扩增含有NotI-2A protease cleavage site-VP4的序列，引物为SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.13所示，2A蛋白酶切割位点(AITTL)的序列如SEQ ID NO.4所示，分别回收PCR产物；以上述所得的2段PCR回收产物为模板，扩增含有T7-5’UTR-BsiWI-NotI-2A protease cleavage site-VP4的序列，引物为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.13，回收DNA片段；

②pACYC177-CA16-FL-5’UTR-BsiWI-NotI-VP4克隆的构建：分别用AatII和SalI双酶切片段T7-5’UTR-BsiWI-NotI-2A protease cleavage site-VP4和质粒pACYC-CA16-FL，经过T4DNA连接酶将回收的酶切产物进行连接，测序正确的质粒即为插入BsiWI和NotI酶切位点，以及2A蛋白酶切割位点(AITTL)的CA16全长感染性克隆，命名为pACYC177-CA16-FL-5’UTR-BsiWI-NotI-VP4。

（2）PCR扩增绿色荧光蛋白基因eGFP片段：

以带有eGFP基因的质粒pEGFPN1为模版，使用PrimeSTAR HS酶，扩增eGFP基因片段，序列为SEQ ID NO.5所示，扩增eGFP的引物为SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17。

（3）将绿色荧光蛋白基因eGFP插入载体pACYC177-CA16-FL-5’UTR-BsiWI-NotI-VP4：将eGFP和载体pACYC177-CA16-FL-5’UTR-BsiWI-NotI-VP4分别用BsiWI和NotI双酶切。经过T4DNA连接酶将回收的酶切产物进行连接，测序正确的质粒即为带有绿色荧光蛋白基因eGFP的CA16感染性克隆，命名为pACYC177-eGFP-CA16-FL，其序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆成功拯救出与重组CA16病毒生长趋势相似的eGFP-CA16报告病毒，其步骤是：

1、用MluI分别对pACYC177-CA16-FL及pACYC177-eGFP-CA16-FL进行线性化处理，线性化产物经酚氯仿抽提后作为模板，使用体外转录试剂盒MEGA Script T7kit（购自美国Ambion公司），按照试剂盒说明书分别得到重组CA16的RNA及eGFP-CA16的RNA。

2、体外转录得到的重组CA16的RNA及eGFP-CA16的RNA分别使用脂质体转染的方法转染于每孔放置了三个10mm×10mm盖玻片的6孔板中的vero细胞，37℃，5%CO₂培养箱中培养，并同时设置未转染RNA的细胞为对照组，显微镜下每天观察实验组和对照组的细胞状态，并收集实验组的病毒上清，作为eGFP-CA16病毒与重组CA16病毒转染后不同时间点的病毒样，于-80℃保存。于荧光显微镜下每天观察eGFP-CA16eGFP的表达情况，并分别于转染后24、48、72h后取一个玻片用5%丙酮固定液（购于国药集团化学试剂公司）对细胞进行固定，使用鼠源的CA16VLP多抗进行免疫荧光检测。

3、于35mm细胞培养皿中接种2×10⁵vero细胞，在37℃，5%CO₂培养条件下，待汇合度达到60%时，按照感染复数MOI为0.1，分别向每孔中加入400μl稀释后的重组CA16及亲本CA16病毒液，37℃、5%CO₂培养箱中吸附1h后，弃病毒液，每孔中加入2ml含2%胎牛血清的DMEM培养基，分别于感染后12、24、36、48h收病毒上清，作为重组CA16及亲本CA16病毒相同感染复数下不同时间点的病毒样，于-80℃保存。

4.单层噬斑检测转染后不同时间点的重组CA16及eGFP-CA16病毒滴度，以及相同感染复数下不同时间点的重组CA16及亲本CA16病毒的噬斑形态及生长曲线：在24孔细胞培养板的各孔中分别接种1×10⁵个Vero细胞，待细胞汇合度达到90%时，弃孔中的培养基，加入100μl用含2%FBS的DMEM培养基10倍比稀释的上述步骤3和4收集的病毒，37℃吸附1h，每15分钟充分晃动一次。吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，加入含有2%FBS的DMEM培养基和2%甲基纤维素的覆盖物，于37℃、5%CO₂的培养箱中培养3天，待噬斑形成后用含有1%结晶紫和3.7%甲醛的染色液染色，室温处理30min后，取出孔中的染色液，并用流水冲洗孔底，烘干后即可观察噬斑形态并计数。

一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆eGFP-CA16在抗病毒药物筛选中的应用，其步骤是：

选取对亲本CA16有抑制作用的药物NITD008来检测其对重组CA16及eGFP-CA16的抑制作用：

1.在12孔细胞培养板每孔中接种1×10⁵vero细胞，在37℃，5%CO₂培养条件下，待汇合度达到60%时，按照感染复数MOI为0.1，分别向每孔中加入200μl稀释后的亲本CA16、重组CA16及eGFP-CA16病毒液，37℃、5%CO₂培养箱中吸附1h后，弃病毒液，每孔中加入1ml含2％胎牛血清的DMEM培养基；

2.用DMSO将存储的浓度为20mM的NITD008分别稀释为0、1、2、3、4mM，于孔中分别加入1μl稀释后的NITD008，即终浓度分别为0、1、2、3、4μM。37℃、5%CO₂的培养箱中培养48h，用荧光显微镜观察不同浓度NITD008作用下eGFP的表达情况，并收集亲本CA16、重组CA16及eGFP-CA16病毒上清，用单层噬斑方法检测不同浓度NITD008作用下亲本CA16、重组CA16及eGFP-CA16病毒滴度。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、本发明构建的带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆是通过将CA16全长基因组分成4个片段扩增并拼接后克隆到低拷贝质粒pACYC177载体上，所扩增的片段相对较短，不仅避免了长片段扩增的操作难度，还能够更好地保证所扩增片段序列的保真性。用低拷贝质粒pACYC177作为载体，以大肠杆菌感受态HB101作为宿主菌，保证了全长感染性克隆的稳定性。同时在全长cDNA5’端非编码区连接T7RNA聚合酶的启动子序列，3’末端添加一个多聚腺苷酸尾巴(poly(A)₂₇)序列；然后以此全长感染性克隆为骨架，在5’UTR和VP4间插入eGFP报告基因并添加2A蛋白酶切割位点(AITTL)，获得的带有eGFP报告基因的CA16全长感染性克隆可以高效获得正确的病毒RNA，并解决了外源基因插入病毒基因组造成基因组不复制的现象，转录出的RNA转染细胞后，RNA可正常复制，并产生具有感染性的病毒粒子。

2、本发明中的带有CA16病毒基因组的全长感染性克隆拯救出的重组CA16病毒与亲本CA16病毒具有相似的生物学特性，可以用来开展CA16的相关研究，,同时eGFP-CA16报告病毒感染性克隆拯救出的eGFP-CA16与重组CA16病毒有着相同的生长趋势，eGFP-CA16病毒滴度又与eGFP表达水平相关，随着病毒滴度的增加，eGFP表达水平也在提高，因此，可通过用荧光显微镜直接观察eGFP表达情况即可判断eGFP-CA16的病毒生长情况，继而反映亲本CA16病毒的生长情况。因此，可通过直接观察eGFP的表达情况来替换传统的病毒滴度测定方法，通过eGFP的表达情况来反映病毒生长趋势更加方便快捷、更加经济节约。

3、通过药物抑制实验，证明本发明中的带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆所拯救出的eGFP-CA16病毒可有效地应用于药物筛选。与传统的药物筛选方法相比，eGFP-CA16病毒可通过直接观察eGFP的表达情况来反映药物作用下病毒的生长趋势，省去了费时费力的各种检测，不仅更加方便快捷、经济节约，还可以用于高通量筛选抗病毒药物，可同时对多种药物抗病毒效果进行快速检测，缩短药物研发周期，是研发出特异性抗CA16病毒药物的有效工具。同时本发明所拯救出的eGFP-CA16病毒含有病毒全长基因组，可形成具有感染性的病毒粒子，不仅可以筛选作用靶点为非结构蛋白的药物，还能筛选出作用靶点为结构蛋白的药物，并可区分出所筛选药物的作用机制是基于病毒的复制过程还是包装过程，最重要的是能够更加真实地反映药物对野生型病毒的抑制情况。

因此，以本发明为基础，将为深入开展CA16病毒复制与致病机理研究提供便捷的平台，为今后筛选和开发新型疫苗奠定坚实的基础，具有十分重要的理论意义和现实意义。

附图说明

图1为一种含有CA16/GD09/24病毒株基因组cDNA的全长感染性克隆的构建示意图。

图2为一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆的构建示意图。

图3为亲本CA16与由感染性克隆拯救出的重组CA16的噬斑形态及生长曲线示意图。

A：亲本CA16及重组CA16噬斑形态示意图。；

B：相同感染复数下亲本CA16及重组CA16病毒的生长曲线示意图。

图4为由感染性克隆拯救出的重组CA16及eGFP-CA16病毒免疫荧光及噬斑形态示意图。

A：转染后不同时间点重组CA16及eGFP-CA16病毒免疫荧光图；

B：重组CA16及eGFP-CA16噬斑形态示意图。

图5为重组CA16及eGFP-CA16RNA转染vero细胞后的病毒生长曲线和eGFP-CA16病毒eGFP的表达情况示意图。

A：转染后eGFP-CA16病毒的eGFP的表达情况示意图；;

B：转染后重组CA16及eGFP-CA16病毒的生长曲线示意图。

图6为抗病毒药物NITD008对亲本CA16、重组CA16及eGFP-CA16病毒的抑制作用示意图。

A：不同浓度NITD008作用下eGFP-CA16病毒的eGFP表达情况；

B：不同浓度NITD008作用下亲本CA16、重组CA16及eGFP-CA16病毒的病毒滴度曲线示意图。

具体实施方式

本实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以下实施例，还可以有许多变形。因此本领域的技术人员在本发明公开内容的基础上做的修改或改进，均应属于本发明要求保护的范围。

实施例1：

一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆的制备，其步骤是：

1.CA16/GD09/24病毒RNA的提取：

取140ul的亲本CA16：CA16/GD09/24病毒液（来自Jian-Feng Han,Nan Yu,Yu-Xian Pan,Si-Jie He,Li-Juan Xu,Rui-Yuan Cao,Yue-Xiang Li,Shun-Ya Zhu,Yu Zhang,E-De Qin,Xiao-Yan Che,Cheng-Feng Qin.Phenotypic and genomic characterization of humancoxsackievirus A16strains with distinct virulence in mice.Virus Re s.2014Jan22;179:212-9.，按照QIAamp Viral RNA Mini Kit(购至Qiagen公司)试剂盒说明书的要求抽提CA16的RNA,于-80℃保存备用；

2.CA16/GD09/24病毒株基因组序列分段扩增：

构建带有CA16全长基因组的cDNA感染性克隆：根据CA16/GD09/24病毒株序列（GenBank accession no.KC117317），以步骤1中的病毒RNA为模版，采用RT-PCR分成四个片段进行基因扩增，这四个片段分别命名为片段A,片段B,片段C,和片段D，其中片段A为T7+基因组1-2441nt序列,T7为启动子，启动子序列如SEQ ID NO.2所示，位于病毒基因组5’UTR之前，是为了保证构建的cDNA在体外转录得到基因组RNA;片段B为基因组2101-3782nt序列，片段C为基因组3511-6362nt序列，片段D为基因组5940-7409nt+poly(A)₂₇序列，poly(A)₂₇序列为SEQ ID NO.3所示，四个片段分别用AatII和SmaI/ClaI插入低拷贝质粒pACYC177载体，转化至大肠杆菌感受态HB101；质粒均经过DNA测序鉴定为正确序列，分别命名为CA16-A,CA16-B,CA16-C和CA16-D；

3.含有病毒基因组的CA16cDNA感染性克隆的构建：

（1）CA16基因组片段A+B的拼接：用NdeI和SmaI（均购于美国NEB公司）酶切上述步骤2中所得的CA16-A和CA16-B，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒（购自天根生化科技有限公司）回收CA16-A的大片段与CA16-B的大片段，使用Thermo Scientific NanoDrop2000(购于Thermo公司)测定回收片段的浓度，使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的质量。将CA16-A的大片段作为载体，CA16-B的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶(购于美国NEB公司)将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HB101，挑取菌落并进行PCR鉴定。PCR的鉴定反应体系为：10×buffer:2μl,dNTP:0.4μl,引物(5’-GAAGTCAACAACCTAAAGAC-3’):0.2μl,引物(5’-CACTAGCTGGTGACATGAAG-3’):0.2μl,Taq酶：0.2μl，水：16.8μl，总体系20μl.扩增条件为：94℃2min，94℃20s，55℃10s，72℃1min10s，72℃5min，16℃10min，30个循环。将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，将测序正确的质粒命名为CA16-AB；

（2）CA16基因组片段C+D的拼接：用AatII和SphI（均购于美国NEB公司）酶切上述步骤2中所得的CA16-C和CA16-D，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收CA16-C的大片段与CA16-D的大片段，使用Thermo Scientific NanoDrop2000测定回收片段的浓度，使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的质量。将CA16-D的大片段作为载体，CA16-C的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HB101，挑取菌落并进行PCR鉴定。PCR鉴定的反应体系为：10×buffer:2μl,dNTP:0.4μl,引物(5’-CCTATTCTGGTGCACCTAAG-3’):0.2μl,引物(5’-GTGTCATTGTCAACCCATAC-3’):0.2μl,Taq酶：0.2μl，水：16.8μl，总体系20μl.扩增条件为：94℃2min，94℃20s，55℃10s，72℃1min50s，72℃5min，16℃10min，30个循环。将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒命名为CA16-CD；

（3）CA16基因组全长A+B+C+D的拼接：用AatII（前面已述）和EcoRV（购于美国NEB公司）酶切上述步骤中所得的CA16-AB和CA16-CD，分别使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收CA16-AB的大片段与CA16-CD的大片段，使用Thermo ScientificNanoDrop2000测定回收片段的浓度，使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的质量。将CA16-CD的大片段作为载体，CA16-AB的大片段作为片段，使用T4DNA连接酶将载体与片段连接，并将连接产物转化大肠杆菌感受态HB101，挑取菌落并进行PCR鉴定。PCR鉴定的反应体系为：10×buffer:2μl,dNTP:0.4μl,引物(5’-GACACCTCGCTACACACAAC-3’):0.2μl,引物(5’-TCTCTGATTAGCTCTGACAC-3’):0.2μl,Taq酶：0.2μl，水：16.8μl，总体系20μl.扩增条件为：94℃2min，94℃20s，55℃10s，72℃1min50s，72℃5min，16℃10min，30个循环。将PCR鉴定为阳性的菌落进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的质粒即为拼接完成的包含有CA16全长基因组的cDNA质粒（图1），命名为pACYC-CA16-FL。

4.带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆的的构建：

①片段T7-5’UTR-BsiWI-NotI-2A protease cleavage site-VP4的扩增：以pACYC-CA16-FL为模板，分别使用PrimeSTAR HS酶扩增含有T7-5’UTR-BsiWI-NotI的序列，引物为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.14所示，以及含有NotI-2A protease cleavage site-VP4的序列，引物为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.13所示，2A蛋白酶切割位点(AITTL)的序列如SEQ ID NO.4所示，分别回收PCR产物；以上述所得的2段PCR产物为模板，使用PrimeSTAR HS酶扩增含有T7-5’UTR-BsiWI-NotI-2A protease cleavage site-VP4的序列，引物为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.13，回收DNA片段。PCR的反应体系均为5×PS buffer：10μl，dNTP：4μl，引物：0.5μl，引物：0.5μl，模板：0.5μl，PrimeSTAR HS酶：0.5μl，水：34μl。扩增条件为：94℃2min,94℃20s,55℃10s,68℃2min40s,68℃10min,16℃10min,30个循环。；

②pACYC177-CA16-FL-5’UTR-BsiWI-NotI-VP4克隆的构建：分别用AatII和SalI双酶切片段T7-5’UTR-BsiWI-NotI-2A protease cleavage site-VP4和质粒pACYC-CA16-FL，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收酶切产物，经过T4DNA连接酶将回收的酶切产物按照片段:载体摩尔比为6:1进行连接，并将连接产物转化HB101感受态，将PCR鉴定阳性的菌落进行培养并抽提质粒，测序正确，获得的质粒即为插入BsiWI和NotI酶切位点，以及2A蛋白酶切割位点(AITTL)的CA16全长感染性克隆，命名为pACYC177-CA16-FL-5’UTR-BsiWI-NotI-VP4。

（2）PCR扩增绿色荧光蛋白基因eGFP片段：

以带有eGFP基因的质粒pEGFPN1（购自Clontech公司）为模版，使用PrimeSTAR HS酶，由特异引物扩增eGFP基因片段，其序列为SEQ ID NO.5所示，扩增eGFP的引物为SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR产物，并于-20℃保存备用。；

（3）将绿色荧光蛋白基因eGFP插入载体pACYC177-CA16-FL-5’UTR-BsiWI-NotI-VP4：将eGFP和载体pACYC177-CA16-FL-5’UTR-BsiWI-NotI-VP4分别用BsiWI和NotI双酶切。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收酶切产物，使用Thermo Scientific NanoDrop2000测定回收产物的浓度，使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测回收产物的质量。经过T4DNA连接酶将回收的酶切产物按照片段:载体摩尔比为6:1进行连接，并将连接产物转化HB101感受态，将PCR鉴定阳性的菌落进行培养并抽提质粒，测序正确，获得的质粒即为带有绿色荧光蛋白基因eGFP的CA16感染性克隆（图2），命名为pACYC177-eGFP-CA16-FL，其序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2：

带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆成功拯救出与重组CA16病毒生长趋势相同的病毒：

1.质粒的线性化和酚氯仿抽提：用MluI(前面已述)分别酶切10μg质粒pACYC177-CA16-FL和质粒pACYC177-eGFP-CA16-FL，37℃酶切两小时，经0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切完全后，向酶切产物中加入100μl饱和酚（购自国药集团化学试剂公司），振荡混匀，17000g离心5min，吸取上清于新的离心管中，并向原离心管中加入100μl无菌水振荡混匀，17000g离心5min；吸取上清与上一步所得上清合并（总体积约200μl），加入200μl氯仿（购自国药集团化学试剂公司）混匀，17000g离心5min；吸取上清于无RNAase的离心管中（约150～200μl），加入十分之一体积的pH5.2，3mol/l醋酸钠（购自国药集团化学试剂公司）和2.5倍体积无水乙醇（购自国药集团化学试剂公司）混匀，-20℃放置30min，17000g离心5min；吸弃上清，加入1ml70%乙醇洗涤，17000g离心5min，吸弃上清；室温放置15min，最后加入11μl无RNAase的水溶解，使用ThermoScientific NanoDrop2000测定DNA的浓度，使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，于-20℃保存备用。

2.体外转录RNA：各取1μg上述酚氯仿抽提的pACYC177-CA16-FL和pACYC177-eGFP-CA16-FL线性化产物作为模板，使用体外转录试剂盒MEGA Script T7kit（购自美国Ambion公司），按照试剂盒说明书分别得到重组CA16的RNA及eGFP-CA16的RNA。用Thermo Scientific NanoDrop2000测定RNA的浓度，使用0.8%新鲜制备的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，于-80℃保存备用，用于以下实施例。

3.转染后不同时间点的重组CA16及eGFP-CA16病毒样以及相同感染复数下（感染复数MOI为0.1）不同时间点的重组CA16及亲本CA16病毒样收集：（1）于转染前一天，接种2×10⁵个vero细胞于6孔板培养板中，每孔放置三个10mm×10mm盖玻片，使细胞在转染当天达到约80%；转染时，先弃小皿中培养基，用1ml Opti-MEM洗一次，再加1ml Opti-MEM（使细胞处于浸润状态）；于1.5mlEP管中加入1ml Opti-MEM，加4ul DMRIE-C（DMRIE-C用前先混匀）先上下颠倒混匀，再分别加入1ug体外转录得到的重组CA16的RNA及eGFP-CA16的RNA（对照组不加RNA），上下颠倒混匀；迅速弃小皿中Opti-MEM，将混匀物加入孔中（动作要轻，勿对着细胞吹打）；于37℃二氧化碳培养箱中培养4h后，弃培养物，再各加2mL含2%FBS的DMEM培养基；37℃，5%CO₂培养箱中培养，显微镜下每天观察实验组和对照组的细胞状态，并收集实验组的病毒上清，作为eGFP-CA16病毒与重组CA16病毒转染后不同时间点的病毒样，于-80℃保存，于荧光显微镜下每天观察eGFP-CA16eGFP的表达情况，并分别于转染后24、48、72h后取一个玻片，用5%丙酮固定液对细胞室温固定15分钟，PBS洗三遍后，于4℃保存。（2）于35mm细胞培养皿中接种2×10⁵vero细胞，在37℃，5%CO₂培养条件下，待汇合度达到60%时，按照感染复数MOI为0.1，分别向每孔中加入400μl稀释后的重组CA16及亲本CA16病毒液，37℃、5%CO₂培养箱中吸附1h后，弃病毒液，每孔中加入2ml含2%胎牛血清的DMEM培养基，分别于感染后12、24、36、48h收病毒上清，作为重组CA16及亲本CA16病毒相同感染复数下不同时间点的病毒样，于-80℃保存。

4.亲本CA16、重组CA16及eGFP-CA16病毒的生物学特性比较：使用单层噬斑的方法检测相同感染复数下亲本CA16及重组CA16病毒的生长曲线及噬斑形态，同时用单层噬斑方法检测转染后不同时间点的重组CA16病毒与eGFP-CA16报告病毒生长曲线，具体方法是：在24孔细胞培养板的各孔中分别接种1×10⁵个Vero细胞，待细胞汇合度达到90%时，弃孔中的培养基，加入100μl用含2%FBS的DMEM培养基10倍比稀释的病毒，37℃吸附1h，每15分钟充分晃动一次。吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，加入含有2%FBS的DMEM培养基和2%甲基纤维的素覆盖物，于37℃、5%CO₂的培养箱中培养3天，待噬斑形成后用含有1%结晶紫和3.7%甲醛的染色液染色，室温处理30min后，取出孔中的覆盖物，并用流水冲洗孔底，烘干后即可观察噬斑形态（图3A；图4B）并计数（图3B，表1；图5B，表2）。从图中可以看到，重组CA16病毒与亲本CA16病毒具有相似的噬斑形态和生长曲线，eGFP-CA16病毒生长曲线与CA16病毒生长曲线趋势相同，同时，eGFP-CA16的病毒滴度随着eGFP的表达水平提高而增加，表明eGFP的表达情况可以反映eGFP-CA16病毒的生长情况，进而反映出亲本CA16病毒的生长趋势。

表1 相同感染复数下不同时间点的重组CA16及亲本CA16病毒的病毒滴度

表2 转染后不同时间点重组CA16及eGFP-CA16病毒的病毒滴度

于此同时，使用免疫荧光的方法检测重组CA16及eGFP-CA16的病毒蛋白表达情况，具体方法是：上述步骤3中4℃保存的玻片，于室温环境孵育一抗，抗体为1:250倍稀释的鼠源的CA16VLP多抗（军事医学科学院微生物流行病研究所秦成峰实验室所赠，Hui Zh ao,Hao-Yang Li,Jian-Feng Han,Yong-Qiang Deng,Yue-Xiang Li,Shun-Ya Zhu,Ya-Li ng He,E-De Qin,Rong Chen,Cheng-Feng Qin.Virus-like particles produced in Saccharomyces cerevisiae elicit protective immunity against Coxsackievirus A16in mice.Appl Microbiol Biotechnol.2013Dec;97(24):10445-52.），一抗孵育1～2h，PBS冲洗10遍后，于室温避光孵育二抗，抗体为1:125倍稀释的偶联德克萨斯红（Texs-Red）羊抗鼠抗体。二抗孵育1h后，PBS冲洗10遍，取出载玻片，做好标记，每个标记处，点一小点95%甘油，将盖玻片有细胞面朝下，置于甘油滴上，于荧光显微镜下使用200×放大倍数进行观察（图4A）。从图中可以看到重组CA16及eGFP-CA16随着转染后培养时间的延长，阳性细胞的数目在增加，即病毒蛋白表达水平在提高，且两者的表达水平提高趋势相似。表明重组CA16及eGFP-CA16具有相似的拯救病毒的能力。

实施例3：

一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆在抗病毒药物筛选中的应用，其步骤是：

2.用DMSO将存储的浓度为20mM的NITD008分别稀释为0、1、2、3、4mM，于孔中分别加入1μl稀释后的NITD008，即终浓度分别为0、1、2、3、4μM。37℃、5%CO₂的培养箱中培养48h，用荧光显微镜观察不同浓度NITD008作用下eGFP的表达情况（图5A），并收集亲本CA16、重组CA16及eGFP-CA16病毒上清，用单层噬斑方法检测不同浓度NITD008作用下病毒滴度（图6B，表3）。通过在荧光显微镜下观察eGFP的表达情况发现，随着NITD008浓度的增加，eGFP的表达水平降低（图6A），进一步通过病毒滴度测定实验表明随着NITD008浓度的增加，eGFP-CA16病毒滴度明显降低，且此种降低趋势与亲本及重组病毒趋势一致，证明本发明所构建的带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆所拯救出的eGFP-CA16报告病毒能够用于抗CA16的药物筛选，省去了费时费力的各种检测，不仅更加方便快捷、经济节约，还能够更加真实地反映药物对亲本CA16病毒的抑制情况。

表3 不同浓度NITD008作用下亲本CA16、重组CA16及eGFP-CA16病毒的病毒滴度

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院武汉病毒研究所

<120> 一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆及构建方法和应用

<130> 一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆及构建方法和应用

<160> 17

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 8189

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttaaaacagc ctgtgggttg ttcccaccca cagggcccac tgggcgctag cacaccgatt 60

ctgcgggatc tttgtgcgcc tgttttataa cccctcccct aagcagcaac ttagaagctt 120

tgcacaatca cgaccagtag tgggcgtggc gcaccagcca cgtcttggtc aagcacttct 180

gtatccccgg actgagtacc aatagactgc tcacgcggtt gaaggagaaa atgttcgtta 240

cccggctaac tacttcgaga aacctagtaa caccatgaaa gttgcggagt gtttcgctca 300

gcacttcccc cgtgtagatc aggtcgatga gtcactgtaa accccacggg cgaccgtgac 360

agtggctgcg ttggcggcct gcccatgggg taacccatgg gacgctctaa tacagacatg 420

gtgtgaagag tctattgagc tagttagtag tcctccggcc cctgaatgcg gctaatccta 480

actgcggagc gcgcaccctc aacccagggg gcagcgcgtc gtaatgggta actctgcagc 540

ggaaccgact actttgggtg tccgtgtttc cttttattcc ttattggctg cttatggtga 600

caattgaaaa gttgttacca tatagctatt ggattggcca tccggtgtct aatagagcca 660

ttgtttacct gtttattgga tacgttcctc ttaatctcaa agccattcaa actcttgact 720

atatactgct ccttaactgt aagaaatggg gtcacgtacg atggtgagca agggcgagga 780

gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa 840

gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt 900

catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta 960

cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc 1020

cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta 1080

caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa 1140

gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa 1200

cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa 1260

gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac 1320

ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc 1380

cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc 1440

cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaaggcg gccgcagcca ttactaccct 1500

tgggtcacaa gtctccaccc agcgatccgg gtcacatgag aactcaaact ctgcatcgga 1560

gggttcgacc ataaattaca caactataaa ctactacaaa gatgcatacg ctgcaagtgc 1620

ggggcgccag gatatgtccc aagacccaaa gaaatttact gatcctgtca tggacgttat 1680

acatgagatg gccccgccgc tcaagtctcc aagcgctgag gcatgcggtt atagtgatcg 1740

tgtagctcaa cttaccattg ggaactctac tatcacgaca caggaagcag ctaacatagt 1800

tatagcttat ggggagtggc ctgagtactg cccagacaca gatgctacgg cagtcgacaa 1860

acccacacga cctgacgtgt cagtgaacag gtttttcacg ttggacacta aatcttgggc 1920

caaggattca aagggttggt attggaaatt ccctgatgtt ttgacagagg tgggtgtttt 1980

tggtcaaaac gctcagttcc actacctgta tcgatctggg ttttgcgtgc acgttcagtg 2040

caacgcaagt aaatttcacc aaggcgctct actggtggct gtactacctg aatatgtact 2100

cggcaccatc gcaggaggga ctgggaacga gaattctcat cctccctacg ccactactca 2160

gcctggccag gttggtgcag ttttgacgca cccttacgta ctagatgcag ggatcccctt 2220

gagccagttg actgtgtgcc cacatcagtg gattaactta agaactaata attgcgcaac 2280

cattatagtt ccatatatga acacagttcc ctttgactca gctctcaacc actgcaactt 2340

tggtctatta gtcattccgg tggtaccatt ggatttcaat acaggcgcca catctgagat 2400

tcccattaca gtcaccatag ctcccatgtg cgcggaattt gcgggtctgc gtcaggcagt 2460

aaagcaaggc ataccaacag agctcaagcc tggtaccaat cagtttctta ctactgatga 2520

tggtgtttcc gcaccaatcc tgccaggttt ccatccaact ccacccatac acataccagg 2580

agaagtacac aacctattgg aaatatgcag agtggagacc attctggaag tcaacaacct 2640

gaagaccaat gagaccaccc ccatgcagcg cttgtgcttt ccagtgtcgg tgcagagcaa 2700

aacgggcgaa ttatgtgctg cctttagagc agaccctgga agagatggtc cgtggcagtc 2760

cacaatacta ggccaactct gcaggtacta cacccaatgg tcaggttcac tggaggtaac 2820

attcatgttt gcaggctcat tcatggctac aggtaaaatg ctcatcgcct acaccccacc 2880

tgggggaaat gtgcccgcgg acagaatcac agcaatgcta ggaacacatg taatctggga 2940

cttcggatta cagtcttctg tgacgttggt cgtgccatgg attagtaata cacactacag 3000

ggcacacgcc cgcgctgggt actttgacta ttacaccact ggcatcataa ccatatggta 3060

tcaaactaac tatgtagtac ccattggcgc tcccactaca gcgtacatcg tggctttggc 3120

agctgctcag gacaacttca ctatgaaact atgcaaggac acggaggaca ttgagcaaac 3180

agctaatata caaggggatc ctattgcaga tatgattgac cagactgtga acaatcaagt 3240

gaaccgctcc ttgactgcgt tgcaagtgct acctacagct gccaacactg aagcaagtag 3300

tcacaggtta ggcactggtg ttgtaccagc actacaagcc gcggagacag gggcgtcgtc 3360

taatgccagt gataagaacc tcattgagac taggtgtgtg ttgaaccatc actccacgca 3420

ggagacagcc attgggaatt tcttcagccg tgccggtctt gtcagcatta ttacgatgcc 3480

caccacgggt acacaaaata cagatggcta tgttaattgg gacattgact tgatgggata 3540

tgctcagctg cggcggaaat gcgaattgtt tacctacatg cgttttgacg ctgaattcac 3600

atttgtcgtg gccaaaccca atggcgagct agtcccccaa ttactgcagt acatgtatgt 3660

cccaccagga gctccgaaac ctacttccag agattcgttt gcttggcaga ctgctaccaa 3720

cccatctgtg tttgtgaaaa tgacagaccc accagctcaa gtgtcagtcc ccttcatgtc 3780

accagctagt gcataccaat ggttttatga tggttatccc accttcggag agcacctcca 3840

agcaaatgac atggattatg gtcaatgccc gaataatatg atgggcactt ttagcattag 3900

gacagtgggg actgaaaagt caccacactc cattaccttg agggtgtaca tgagaattaa 3960

acatgttagg gcatggatcc caagacctct gagaaatcaa ccctatttgt ttaagaccaa 4020

cccaaattat aaaggcaatg atattaagtg caccagcact agcagagata agataacaac 4080

gttgggaaag tttggacagc aatcaggcgc catatatgtg ggcaattata gggtggtgaa 4140

tcgacacctt gccacacaca atgactgggc aaaccttgtg tgggaggaca gctctaggga 4200

cttgttagtc tcttccacca ctgcccaggg gtgcgacacc atcgctaggt gcaattgtca 4260

aaccggagta tactattgca gctccaaaag gaaacactat ccagttactt tcaccaagcc 4320

cagtctgata tttgtggaag ctagtgagta ttacccagct agatatcaat cccatctcat 4380

gcttgctgtg ggtcattcgg agcctggtga ctgtggtggt atcctcaggt gccagcatgg 4440

tgtagtagga attgtctcca ctggtggaaa tggtcttgtg gggtttgccg atgtcagaga 4500

ccttctatgg ctggatgaag aagcaatgga acaaggagtg tctgactata tcaaaggcct 4560

cggtgatgct tttggcacgg gcttcactga tgcagtgtcc agggaagtag aggcattgaa 4620

gaaccattta attggctcag aaggagctgt tgagaagatc ttgaagaact tggtgaaact 4680

aatctcagct ttagtcatag tcgttaggag tgactatgac atggtcaccc tcacggccac 4740

actagctttg attgggtgtc atggaagccc ttgggcatgg atcaaggcga agacagcctc 4800

tattcttggt attcccatag tgcaaaaaca gagcgcttca tggctaaaga agtttaatga 4860

tatggctaat gctgcgaaag ggcttgagtg gatttctagt aagatcagca agttcatcga 4920

ttggctcaag gaaaagatta ttccggctgc taaggagaaa gttgaattct tgaacaacct 4980

gaagcagctt cccctgttgg agaaccaaat ctccaatctt gaacaatctg ctgcctcgca 5040

agaggatcta gaagctatgt ttggtaatgt gtcatattta gcccacttct gccgcaagtt 5100

tcagccactc tatgcggttg aagccaaaag agtttatgcc ctagagaaaa ggatgaacaa 5160

ttacatgcag ttcaagagca aacaccgtat tgaacctgta tgtttaatca ttagaggctc 5220

tccaggaaca ggtaagtcac ttgctacggg catcatagct agagctattg ctgacaaata 5280

ccattctagc gtctactcgc tccctccaga cccagaccat tttgatggat acaagcaaca 5340

agtggtcact gttatggatg atctctgcca aaacccagat ggaaaggaca tgtccctatt 5400

ttgccaaatg gtttctacag tggactttat accacctatg gcatcattgg aagagaaagg 5460

agtgtctttc acctccaagt tcgtcattgc gtcaaccaat gctagcaaca ttgtagtccc 5520

cacagtttca gattctgatg cgattcgcag gcggttttat atggactgcg atatagaggt 5580

gacagactcc tacaagacgg accttggtcg tctcgacgca ggcagggccg ctaagctttg 5640

cacagaaaac aacactgcta actttaagag atgcagccca ctagtgtgtg gcaaggccat 5700

tcaattaagg gataggaagt ctaaagtgag atatagtatt gacactgtag tgtcagagct 5760

gatcagagag tataataata ggtctgctat cgggaatacc atagaagccc tcttccaagg 5820

accccctaag tttaggccta taagaattag ccttgaagaa aagccggccc cagatgccat 5880

cagtgaccta cttgctagtg tggatagtga ggaggttcga caatactgta gggaacaggg 5940

gtggataatt ccagaaacgt ctaccaatgt ggaacgccac cttaatagag cagtgttggt 6000

gatgcagtcc atcgccaccg tggttgcggt tgtgtctctc gtctatgtca tttataaatt 6060

gtttgctgga tttcaaggtg cctattctgg tgcacccaag caagctctca aaaagcctgt 6120

gctaagaaca gccacagtcc aaggaccgag cttagacttt gccttatccc tcctaaggcg 6180

caacatcaga caggtgcaaa ctgaccaagg acatttcact atgttaggag tgcgagatcg 6240

cctagctatt ttgccacgcc actcgcaacc aggaaaaact atttgggtgg aacacaagtt 6300

aatcaatgtg ttggatgctg ttgaattggt ggatgagcaa ggcgtaaact tggaactcac 6360

actagtaacc ttggacacca acgaaaagtt tagggatgtc accaagttta ttccggagac 6420

gatcaccgga gcaagcgacg caaccttggt catcaacact gagcatatgc cctcaatgtt 6480

cgttccagtg ggtgatgttg tacaatatgg gttcctaaat ctcagtggta agcccacaca 6540

ccgaaccatg atgtacaatt tccccacaaa ggcaggacag tgtggaggtg tggtcacctc 6600

agtcggcaag attattggaa ttcatatcgg tgggaatgga cgccaaggtt tctgtgctgg 6660

actgaagaga ggttactttg ccagtgaaca aggagagatc caatggatga agtccaacaa 6720

agaaactggg agactgaaca ttaatggccc aacccgtacc aaattggagc ctagtgcatt 6780

ctatgatgtg tttgagggca gcaaagaacc agcagtctta accagcaagg atcccagact 6840

cgaggttgac tttgagcaag ctttgttttc caagtatgtg ggaaacactc tgcacgaacc 6900

tgacgagtac gtgacacagg ctgctctcca ttatgcaaac cagctaaagc agttagatat 6960

aaatgtcaat aagatgagca tggaggaagc atgctacggc actgagtatc tagaggccat 7020

agacttgcac accagtgctg ggtaccccta tagcgccctg ggtgtcaaga aaagagacat 7080

acttgaccca atcactagag atactaccaa aatgaaattc tacatggata aatatgggtt 7140

agacttgccc tactccacct atgtgaaaga tgaacttaga tccttagaca agatcaggaa 7200

agggaaatcc cgtttgattg aagccagtag tctgaatgac tcagtctatc ttaggatgac 7260

cttcgggcat ctctatgaaa ctttccatgc caacccgggg actgtgactg ggtctgcagt 7320

agggtgtaat cctgatgtgt tctggagcaa attaccgatc ctgctgccag gatcgctctt 7380

tgcatttgac tattcaggat atgatgcaag tctcagccca gtgtggttca gagctttgga 7440

ggtggttctc cgagagatcg gctacccaga agaggctgta tcattgatag aagggatcaa 7500

ccacacccat catgtgtatc ggaacaggac atattgtgtc cttggtggaa tgccttcagg 7560

ttgttccggt acttccatct ttaattccat gatcaataac ataataatca gaaccctctt 7620

gatcaaaact tttaagggga ttgatttaga tgagttgcat atggtagctt atggggatga 7680

tgtgttagct agttacccat tccctattga ctgcttggag ttagccaaaa ctggtaaaga 7740

gtatggattg acaatgacac ccgctgacaa gtcaccttgc tttaatgaag tcacctggga 7800

aaatgctaca ttcttaaaga gaggcttcct gccagatcac caattcccat ttcttattca 7860

ccctaccatg cccatgaggg agatccacga gtccattcgt tggactaagg acgcacgcaa 7920

cactcaggat cacgtgcgct ctctgtgcct cttagcatgg cataatggga aggaggaata 7980

tgaaaaattt gtgagtacaa ttagatcggt tcccattgga agagccttgg ccataccaaa 8040

ttatgagaac ttgagaagaa attggctcga gttattttaa tatacagttt aaagctgaac 8100

cccaccagaa gtctggtcgt gttaatgact ggtgggggta aatttgttat aaccagaata 8160

gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 8189

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

taatacgact cactatagg 19

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 27

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gccattacta ccctt 15

<210> 5

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgcagacgtc taatacgact cactataggt taaaacagcc tgtgggttg 49

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcccccgggt tgtatattgg ccgtttgctc 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgcagacgtc gtaaaatgct catcgcctac 30

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tcccccgggt tgttccattg cttcttc 27

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgcagacgtc ccggagtgta ctattgcag 29

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcccccgggc attttggtag tgtctctag 29

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgcagacgtc ggagagatcc aatggatg 28

<210> 13

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ccatcgatac gcgttttttt tttttttttt tttttttttt tgctattctg gttataa 57

<210> 14

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tgcggccgca catacataca tcgtacgtga ccccatttct tacagttaag gagcagt 57

<210> 15

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atgtatgtat gtgcggccgc agccattact acccttgggt cacaagtctc cacccag 57

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gggtcacgta cgatggtgag caagggcgag ga 32

<210> 17

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

aaggaaaaaa gcggccgcct tgtacagctc gtccatg 37

Claims

1.一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆pACYC177-eGFP-CA16-FL，其序列为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述感染性克隆的构建方法，步骤如下：

1）.提取亲本CA16（CA16/GD09/24）病毒株基因组RNA；

2）.CA16/GD09/24 病毒株基因组序列分段扩增：

以步骤1中的亲本CA16病毒RNA为模版，采用RT-PCR分别获得片段A、B、C和D，四对引物分别为SEQ ID NO.6和 SEQ ID NO.7；SEQ ID NO.8和 SEQ ID NO.9；SEQ ID NO.10和 SEQ ID NO.11；SEQ ID NO.12和 SEQ ID NO.13所示；四个片段分别用AatII和SmaI/ClaI插入低拷贝质粒pACYC177载体，质粒均经过DNA测序鉴定为正确序列，分别命名为CA16-A, CA16-B, CA16-C和 CA16-D；

3）.含有病毒基因组的CA16 cDNA全长感染性克隆的构建：

（1）CA16基因组片段A+B的拼接：用NdeI和SmaI酶切上述步骤2中所得的CA16-A和CA16-B，回收CA16-A的大片段与CA16-B的大片段；将CA16-A的大片段作为载体，CA16-B的大片段作为片段，使用T4 DNA连接酶将载体与片段连接，测序正确的质粒命名为CA16-AB；

（2）CA16基因组片段C+D的拼接：用AatII和SphI酶切上述步骤2中所得的CA16-C和CA16-D，回收CA16-C的大片段与CA16-D的大片段；将CA16-D的大片段作为载体，CA16-C的大片段作为片段，使用T4 DNA连接酶将载体与片段连接，测序正确的质粒命名为CA16-CD；

（3）CA16基因组全长A+B+C+D的拼接：用AatII和EcoRV酶切上述步骤中所得的CA16-AB和CA16-CD，回收CA16-AB的大片段与CA16-CD的大片段；CA16-CD的大片段作为载体，CA16-AB的大片段作为片段，使用T4 DNA连接酶将载体与片段连接，测序正确的质粒即为拼接完成的含有CA16全长基因组的cDNA质粒，命名为pACYC-CA16-FL；

4）.带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆的的构建：

① 片段T7-5’UTR-BsiWI-NotI-2A protease cleavage site-VP4的扩增：以pACYC-CA16-FL为模板，扩增含有T7-5’UTR-BsiWI-NotI的序列，引物为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.14所示；扩增含有NotI-2A protease cleavage site-VP4的序列，引物为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.13所示，2A蛋白酶切割位点(AITTL)的序列如SEQ ID NO.4所示，分别回收PCR产物；以上述所得的2段PCR回收产物为模板，扩增含有T7-5’UTR-BsiWI-NotI-2A protease cleavage site-VP4的序列，引物为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.13，回收DNA片段；

② pACYC177-CA16-FL-5’UTR-BsiWI-NotI-VP4克隆的构建：分别用AatII和SalI双酶切片段T7-5’UTR-BsiWI-NotI-2A protease cleavage site-VP4和质粒pACYC-CA16-FL，经过T4 DNA连接酶将回收的酶切产物进行连接，测序正确的质粒即为插入BsiWI和NotI酶切位点，以及2A蛋白酶切割位点(AITTL)的CA16全长感染性克隆，命名为pACYC177-CA16-FL-5’UTR-BsiWI-NotI-VP4；

（2）PCR扩增绿色荧光蛋白基因eGFP片段：

以带有eGFP基因的质粒pEGFPN1为模版，使用PrimeSTAR HS酶，扩增eGFP基因片段，序列为SEQ ID NO.5所示，扩增eGFP的引物为SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17；

（3）将绿色荧光蛋白基因eGFP插入载体pACYC177-CA16-FL-5’UTR-BsiWI-NotI-VP4：将eGFP和载体pACYC177-CA16-FL-5’UTR-BsiWI-NotI-VP4分别用BsiWI和NotI双酶切；经过T4 DNA连接酶将回收的酶切产物进行连接，测序正确的质粒即为带有绿色荧光蛋白基因eGFP的CA16感染性克隆。

3.权利要求1所述的感染性克隆在制备病毒上的应用。

4.权利要求1所述的感染性克隆在抗CA16病毒药物筛选上的应用。