CN109781493A - 一种可长时间连续精细切削成像的生物组织水凝胶包埋方法 - Google Patents
一种可长时间连续精细切削成像的生物组织水凝胶包埋方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109781493A CN109781493A CN201811598963.0A CN201811598963A CN109781493A CN 109781493 A CN109781493 A CN 109781493A CN 201811598963 A CN201811598963 A CN 201811598963A CN 109781493 A CN109781493 A CN 109781493A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tissue
- hydrogel
- biological tissue
- embedding
- hydrogel solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
本发明公开一种可长时间连续精细切削成像的生物组织水凝胶包埋方法,包括:将组织进行预处理,将NAGA单体与交联剂、引发剂、溶剂混合得到水凝胶溶液;将所述预处理后的组织在所述水凝胶溶液中进行渗透处理;将渗透后的组织在水凝胶溶液中聚合;将聚合后的生物组织在成像系统上成像。本发明提供的方法操作简洁,使用过程中不需要对生物组织进行脱水处理,不会引起组织形变,能保存生物组织荧光,本发明对包埋的配方及流程进行探索和建立,使包埋后的组织具有一定的机械强度,可用于生物组织样本长时间连续的三维切削成像。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物医学领域,尤其涉及一种可长时间连续精细切削成像的生物组织水凝胶包埋方法。
背景技术
荧光显微成像是我们获取生物体荧光标记信息的有效途径。在神经科学领域,荧光蛋白通常被用在转基因技术和病毒标记技术上来示踪神经环路或标记神经元的完整形态,以及其它一些生物学问题的研究如胞体计数等。但组织自身的高散射使得光穿透深度降低,这严重限制了我们对大体积生物组织完整信号的探测。光学成像方法结合物理切削可以部分的解决光散射的问题,使得大体积生物组织完整信号的获取成为可能,很多样本制备方法也同时得以发展。比如琼脂包埋,树脂包埋,石蜡包埋等。
然而琼脂无法进入生物组织内部,不能填充脑室等组织内部空隙对其进行支撑,组织容易引起塌陷,且生物组织样本长时间浸泡在水溶液中其荧光会逐渐损失。树脂包埋适合于超薄切片或um切片获取神经元精细结构,虽然其能有效的保存绿色荧光蛋白荧光,但对红色荧光蛋白荧光保存较差,且其样本处理时间较长,脱水和树脂聚合环节使得生物组织形态出现一定的形变,虽然能在后期通过图像处理进行部分的校正,但费时费力。石蜡包埋也同样无法避免有机试剂的脱水渗透环节,耗时长,且样本形变大。
发明内容
本发明提供了一种可长时间连续精细切削成像的生物组织水凝胶包埋方法。此方法操作简洁,使用过程中不需要对生物组织进行脱水处理,不会引起组织形变,能保存生物组织荧光。本发明提出了全新的包埋的配方及流程,使包埋后的组织具有一定的机械强度,可用于生物组织样本长时间连续的三维切削成像。
为解决以上技术问题,本发明的技术方案为采用一种小分子渗透进生物组织,在交联剂、引发剂共存的条件下引发聚合,形成交联度高的组织和凝胶分子的三维网络结构,保护生物组织结构和荧光的同时提供机械强度,适用于精细切削。这种方法具体包括:
将组织进行预处理;
将NAGA单体与交联剂、引发剂、溶剂混合得到水凝胶溶液;
将所述预处理后的组织在所述水凝胶溶液中进行渗透处理;
将渗透后的组织在所述水凝胶溶液中聚合;
将聚合后的生物组织在成像系统上成像。
优选的,所述将组织进行预处理具体为:
提供生物组织;
将所述组织进行PFA后固定,PBS漂洗。
优选的,所述NAGA单体占体系的质量百分比为5%-50%。
优选的,所述交联剂选自水溶性交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺,乙二醇二甲基丙烯酸酯。
优选的,所述交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)。
优选的,所述交联剂的占体系的质量百分比0.1%-5%。
优选的,所述引发剂选自过硫酸铵、过硫酸钾、偶氮二异丙基丁咪盐酸盐、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐中的一种或多种。
优选的,所述引发剂占体系的质量百分比为0.01‰-5‰。
优选的,所述溶剂选自盐、酸或者碱的水溶液或者纯水。
例如水溶液可以包括:蒸馏水+盐(磷酸盐等)=磷酸盐缓冲液;蒸馏水+碱(碳酸钠、氢氧化钠等)=碱性溶液;蒸馏水+酸(盐酸等)=酸性溶液。
优选的,所述将渗透后的组织在水凝胶溶液中聚合具体为:
将水凝胶溶液渗透后的组织浸泡在新的水凝胶溶液中,充入氮气后在烘箱中热聚合。
优选的,所述的热聚合的温度在25-50℃,热聚合时间为1-24h。
优选的,所述将渗透后的组织在成像系统上成像获取三维连续数据集的方法具体为:
将包埋后的生物组织振动切片-fMOST上切削成像。
优选的,所述组织样本为小鼠脑、猴脑等。
本发明的技术方案为采用一种小分子渗透进生物组织,在交联剂、引发剂共存的条件下引发聚合,形成交联度高的组织和凝胶分子的三维网络结构,保护生物组织结构和荧光的同时提供机械强度,适用于精细切削。此方法操作简洁,使用过程中不需要对生物组织进行脱水处理,不会引起组织形变,能保存生物组织荧光。本发明提出了一种全新的包埋的配方及流程,使包埋后的组织具有一定的机械强度,可用于生物组织样本长时间连续的三维切削成像。
附图说明
图1为包埋流程图;
图2为水凝胶切削表面平整度曲线图;
图3为水凝胶包埋和琼脂糖包埋鼠脑组织脑室结构比对图;
图4为病毒标记鼠脑样本水凝胶包埋后三维成像结果图;
图5为血管标记鼠脑样本水凝胶包埋后三维成像结果图;
图6为病毒标记猴脑样本水凝胶包埋后成像结果图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
如图1所示,本发明采用将NAGA分子渗透进生物组织形成生物组织-凝胶三维网络的一种的水凝胶的生物组织包埋方法,这种方法具体包括:
将组织进行预处理,将NAGA单体与交联剂、引发剂、溶剂混合得到水凝胶溶液;
将所述预处理后的组织在所述水凝胶溶液中进行渗透处理;
将渗透后的组织在水凝胶溶液中聚合;
将聚合后的生物组织在成像系统上成像。
按照本发明,为了增强水凝胶的生物包埋效果,所述将组织进行预处理具体为:
提供生物组织;将所述组织进行PFA后固定,PBS漂洗。所述配制水凝胶溶液具体为:将NAGA单体与一定浓度的交联剂、引发剂、溶剂混合得到水凝胶溶液。优选的,所述NAGA的质量比例为5%-50%。所述交联剂选自水溶性交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺,乙二醇二甲基丙烯酸酯等。更优选为N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)。所述交联剂的质量比为0.1%-5%。
按照本发明,引入交联剂增加凝胶网络交联点,提高凝胶三维网络机械强度。调控水凝胶单体、交联剂、水溶液的比例,调控聚合后的水凝胶——组织凝胶网络机械性能,同时检测其切削后的表面平整度,确定适用于精细切削的水凝胶配方。由前面提到的这种包埋方法能长时间保存组织形态和荧光,再加上对其机械性能的改进,使其具有可切削性,因此本发明能对包埋后的生物组织样本进行长时间连续的三维切削成像。
相对于更为传统的树脂包埋、石蜡包埋来说,本发明提供的方法省去了脱水剂梯度脱水环节和树脂或石蜡的梯度渗透环节,只需将漂洗后的生物组织在水凝胶溶液中渗透完全即可聚合包埋,整个小鼠脑的包埋也仅需不到2天的时间,提高了包埋的效率。
为了进一步增加反应的活性,所述引发剂选自氧化还原类引发剂如过硫酸铵、过硫酸钾等,或水溶性偶氮类引发剂如偶氮二异丙基丁咪盐酸盐(AIBA),偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐(AIBI),更优选为AIBI。所述引发剂的质量比为0.01‰-5‰。所述水溶剂为蒸馏水或以蒸馏水和其它物质配成的水溶液。例如水溶液可包括:
蒸馏水+盐(磷酸盐等)=磷酸盐缓冲液
蒸馏水+碱(碳酸钠、氢氧化钠等)=碱性溶液
蒸馏水+酸(盐酸等)=酸性溶液。
将水凝胶溶液渗透后的组织浸泡在新的水凝胶溶液中,充入氮气后在烘箱中热聚合。所述的热聚合的温度优选为25-50℃,热聚合时间优选为1-24h。所述将渗透后的组织在成像系统上成像获取三维连续数据集的方法具体为:
将包埋后的生物组织振动切片-fMOST上切削成像。所述组织样本为小鼠脑、猴脑等。通过实验证明,生物组织脱水剂的脱水及其它有机试剂渗透会导致生物组织体积收缩,由于与生物组织各种结构中水的存在状态和含量不一致,且很多生物组织如脑都存在脑室间隙,因此这种收缩多数是非线性收缩。由于本发明提供的水凝胶的制备本就是富含水分,同时水凝胶的性质决定其依赖水环境的存在而存在,因此生物组织在水凝胶包埋的过程中不需要进行脱水处理,且水凝胶单体本身是水溶性的,因此整个包埋过程中不会引起组织形变。
实施例1C57小鼠脑样本的水凝胶包埋和琼脂糖包埋比对
步骤一,4只二月龄的C57BL/6雄性小鼠腹腔注射10%乌拉坦和2%水合氯醛混合物进行麻醉,灌流后取脑,PFA后固定24h,PBS漂洗24h;
步骤二,配制NAGA溶液,其中交联剂选用MBA,引发剂选用AIBI,同时配制琼脂糖溶液;
步骤三,2只漂洗后的鼠脑放入NAGA溶液中渗透1-5d;
步骤四,将渗透好的脑组织于新的水凝胶溶液中25-50℃热聚合1-24h;
步骤五,2只漂洗后的鼠脑用常规的琼脂糖包埋方法包埋;
步骤六,将水凝胶包埋后的脑组织样本和琼脂糖包埋后的脑组织样本于系统上连续切削成像或取实时PI染色信息。
通过图3所示的内容可以看出这种改进的水凝胶样本包埋方法可以获取到相对琼脂更完整的脑室结构信息。
水凝胶包埋的样本在脑室部分能进行完整切削,脑室边缘形态保持良好。
琼脂糖包埋样本切削后脑室结构不完整,脑室边缘呈现“塌陷”情况,如白色箭头所示。
实施例2病毒标记小鼠脑样本的包埋
步骤一,在二月龄的C57BL/6雄性小鼠HDB脑区注射AAV-GFP,表达21d后,腹腔注射10%乌拉坦和2%水合氯醛混合物进行麻醉,灌流后取脑,PFA后固定24h,PBS漂洗24h;
步骤二,配制NAGA溶液,其中交联剂选用MBA,引发剂选用AIBI;
步骤三,漂洗后的鼠脑放入NAGA溶液中渗透1-5d;
步骤四,将渗透好的脑组织于新的水凝胶溶液中25-50℃热聚合1-24h;
步骤五,将聚合后的脑组织于系统上连续切削成像;
通过图4所示的内容可以看出这种改进的水凝胶样本包埋方法可以获取到完整的三维数据集,同时能获取精细的神经元结构信息;
a,GFP通道信号的三维重建;
b,从HDB发出的神经元的投射末梢细节图;
c,从HDB发出的神经元的投射纤维细节图。
实施例3血管标记小鼠脑样本的包埋
步骤一,在二月龄的C57BL/6雄性小鼠尾静脉注射DyLight594,20min后,腹腔注射10%乌拉坦和2%水合氯醛混合物进行麻醉,灌流后取脑,PFA后固定24h,PBS漂洗24h;
步骤二,配制NAGA溶液,其中交联剂选用MBA,引发剂选用AIBI;
步骤三,漂洗后的鼠脑放入NAGA溶液中渗透1-5d;
步骤四,将渗透好的脑组织于新的水凝胶溶液中25-50℃热聚合1-24h;
步骤五,将聚合后的脑组织于系统上连续切削成像;
通过图5所示的内容可以看出这种改进的水凝胶样本包埋方法可以获取到大组织块的三维数据集,同时能维持血管的空腔结构;
a,皮层M1脑区的320um*320um*320um尺寸的血管三维重建;
b,丘脑区域的320um*180um*140um尺寸的血管三维重建。
实施例4病毒标记猴脑样本的包埋
步骤一,获取病毒标记的猴脑脑,0.01MPBS漂洗2d;
步骤二,配制NAGA溶液,其中交联剂选用MBA,引发剂选用VA-044;
步骤三,漂洗后的猴脑脑放入NAGA溶液中渗透2-10d;
步骤四,将渗透好的脑组织于新的水凝胶溶液中25-50℃热聚合1-24h;
步骤五,将聚合后的脑组织于系统上连续切削成像;
通过图6所示的内容可以看出,这种改进的水凝胶样本包埋方法可以获取到猴脑大组织块的三维数据集,通过PI染色我们能获取到猴脑的细胞构筑信息;
a,猕猴脑冠状面PI染色结果;
b/c/d/图a白色框的细节放大,展示不同区域的细胞形态。
通过实施例1~6的结果绘制图2所示的折线图,证明我们改进后的水凝胶具备优异的切削性能,切削平整度在2μm左右。本发明中所给出的所有实施例都是切削成像的实施例,按优选的水凝胶溶液配方制备水凝胶块,对其进行切片测试,台阶仪检测切片方向(X方向),垂直切片方向(Y方向)的平整度,发现其表面平整度在2um左右,证明其适用于切削成像。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,上述优选实施方式不应视为对本发明的限制,本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明的精神和范围内,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种可长时间连续精细切削成像的生物组织水凝胶包埋方法,其特征在于,包括:
将组织进行预处理;
将NAGA单体与交联剂、引发剂、溶剂混合得到水凝胶溶液;
将所述预处理后的组织在所述水凝胶溶液中进行渗透处理;
将渗透后的组织在所述水凝胶溶液中聚合;
将聚合后的生物组织在成像系统上成像。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述将组织进行预处理具体为:
提供生物组织;
将所述组织进行PFA后固定,PBS漂洗。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述NAGA单体占体系的质量百分比为5%-50%。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述交联剂选自水溶性交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺,乙二醇二甲基丙烯酸酯。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述交联剂的占体系的质量百分比0.1%-5%。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述引发剂选自过硫酸铵、过硫酸钾、偶氮二异丙基丁咪盐酸盐、偶氮二异丙基咪唑啉盐酸盐中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述引发剂占体系的质量百分比为0.01‰-5‰。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述溶剂选自盐、酸或者碱的水溶液或者纯水。
10.根据权利要求1所述的方法其特征在于,所述将渗透后的组织在水凝胶溶液中聚合具体为:
将水凝胶溶液渗透后的组织浸泡在所述水凝胶溶液中,充入氮气后在烘箱中热聚合。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811598963.0A CN109781493A (zh) | 2018-12-26 | 2018-12-26 | 一种可长时间连续精细切削成像的生物组织水凝胶包埋方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811598963.0A CN109781493A (zh) | 2018-12-26 | 2018-12-26 | 一种可长时间连续精细切削成像的生物组织水凝胶包埋方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109781493A true CN109781493A (zh) | 2019-05-21 |
Family
ID=66498394
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811598963.0A Pending CN109781493A (zh) | 2018-12-26 | 2018-12-26 | 一种可长时间连续精细切削成像的生物组织水凝胶包埋方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109781493A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113654863A (zh) * | 2021-08-30 | 2021-11-16 | 南通大学 | 一种透射电镜观察用原位体外培养细胞的样品处理方法 |
CN113804667A (zh) * | 2021-09-23 | 2021-12-17 | 上海交通大学 | 一种新型可膨胀生物样本的水凝胶及其应用 |
CN116621889A (zh) * | 2023-04-12 | 2023-08-22 | 广东医科大学附属医院 | 一种超水分子凝胶引发剂及其制备方法和应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104350372A (zh) * | 2012-08-09 | 2015-02-11 | 斯坦福大学托管董事会 | 用于制备供显微镜分析的生物样本的方法和组合物 |
CN104804115A (zh) * | 2015-04-21 | 2015-07-29 | 天津大学 | 一种高强度超分子水凝胶及其制备方法和应用 |
CN108474723A (zh) * | 2015-12-02 | 2018-08-31 | 克莱尔莱特诊断有限责任公司 | 制备和分析肿瘤组织样品用于检测和监测癌症的方法 |
CN108827747A (zh) * | 2018-06-04 | 2018-11-16 | 华中科技大学苏州脑空间信息研究院 | 一种多色荧光标记样本的塑性包埋方法 |
-
2018
- 2018-12-26 CN CN201811598963.0A patent/CN109781493A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104350372A (zh) * | 2012-08-09 | 2015-02-11 | 斯坦福大学托管董事会 | 用于制备供显微镜分析的生物样本的方法和组合物 |
CN104804115A (zh) * | 2015-04-21 | 2015-07-29 | 天津大学 | 一种高强度超分子水凝胶及其制备方法和应用 |
CN108474723A (zh) * | 2015-12-02 | 2018-08-31 | 克莱尔莱特诊断有限责任公司 | 制备和分析肿瘤组织样品用于检测和监测癌症的方法 |
CN108827747A (zh) * | 2018-06-04 | 2018-11-16 | 华中科技大学苏州脑空间信息研究院 | 一种多色荧光标记样本的塑性包埋方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
XIYANG DAI等: "《A mechanically strong,highly stable,thermoplastic,and self-healable supramolecualr polymer hydrogel》", 《ADVANCED MATERIALS》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113654863A (zh) * | 2021-08-30 | 2021-11-16 | 南通大学 | 一种透射电镜观察用原位体外培养细胞的样品处理方法 |
WO2023029909A1 (zh) * | 2021-08-30 | 2023-03-09 | 南通大学 | 一种透射电镜观察用原位体外培养细胞的样品处理方法 |
CN113804667A (zh) * | 2021-09-23 | 2021-12-17 | 上海交通大学 | 一种新型可膨胀生物样本的水凝胶及其应用 |
CN116621889A (zh) * | 2023-04-12 | 2023-08-22 | 广东医科大学附属医院 | 一种超水分子凝胶引发剂及其制备方法和应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109781493A (zh) | 一种可长时间连续精细切削成像的生物组织水凝胶包埋方法 | |
Richardson et al. | Tissue clearing | |
Möckl et al. | Quantitative super-resolution microscopy of the mammalian glycocalyx | |
Choi et al. | Basic principles of hydrogel-based tissue transformation technologies and their applications | |
Merkel et al. | Using mechanobiological mimicry of red blood cells to extend circulation times of hydrogel microparticles | |
Tang et al. | Contraction-type glucose-sensitive microgel functionalized with a 2-substituted phenylboronic acid ligand | |
WO2017031249A1 (en) | Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high resolution intact circuit mapping and phenotyping | |
KR20200134197A (ko) | 생체 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법 | |
CN102620966B (zh) | 一种适用于超薄切片和荧光成像的生物样品制备方法 | |
CN112930404A (zh) | 用于治疗剂分析的方法和系统 | |
Song et al. | A star-shaped molecularly imprinted polymer derived from polyhedral oligomeric silsesquioxanes with improved site accessibility and capacity for enantiomeric separation via capillary electrochromatography | |
CN106866876B (zh) | 一种光透明化生物组织的包埋剂、包埋方法及应用 | |
US11873374B2 (en) | Swellable and structurally homogenous hydrogels and methods of use thereof | |
CN110006862A (zh) | 膨胀切削显微成像方法及适用于该方法的超吸水水凝胶 | |
Susaki et al. | Perspective: extending the utility of three-dimensional organoids by tissue clearing technologies | |
KR20200037113A (ko) | 온도에 따라 가역적 팽창/초기화가 가능한 하이드로젤을 이용한 생체조직 이미징 | |
Glaser et al. | Expansion-assisted selective plane illumination microscopy for nanoscale imaging of centimeter-scale tissues | |
CN106872252A (zh) | 一种光透明化生物组织的树脂包埋方法 | |
CN109612811A (zh) | 一种保护生物组织结构和荧光的水凝胶包埋方法 | |
CN103808553A (zh) | 一种弱背景荧光的树脂包埋方法 | |
Fiorelli et al. | Enhanced tissue penetration of antibodies through pressurized immunohistochemistry | |
CN112521550A (zh) | 一种超分子共聚水凝胶及其制备方法 | |
CN115655834A (zh) | 一种用于透明化处理人工微器官的透明试剂及其应用 | |
Dabrovska et al. | Transport properties of hydrolyzed polyacrylonitrile | |
JP5333140B2 (ja) | 電気泳動ゲル分離媒体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190521 |