KR102200618B1 - 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 생물학적 분자의 조직침투용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 생물학적 분자의 조직침투용 조성물 및 이의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102200618B1 KR102200618B1 KR1020180004121A KR20180004121A KR102200618B1 KR 102200618 B1 KR102200618 B1 KR 102200618B1 KR 1020180004121 A KR1020180004121 A KR 1020180004121A KR 20180004121 A KR20180004121 A KR 20180004121A KR 102200618 B1 KR102200618 B1 KR 102200618B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- biological sample
- sulfobetaine
- biological
- tissue
- zwitterionic surfactant
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 28
- 230000035515 penetration Effects 0.000 title description 5
- 239000003599 detergent Substances 0.000 title 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 131
- PSBDWGZCVUAZQS-UHFFFAOYSA-N (dimethylsulfonio)acetate Chemical compound C[S+](C)CC([O-])=O PSBDWGZCVUAZQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 94
- 229940117986 sulfobetaine Drugs 0.000 claims abstract description 94
- 239000002888 zwitterionic surfactant Substances 0.000 claims abstract description 90
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 14
- -1 antibodies Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 89
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 41
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 30
- 239000000693 micelle Substances 0.000 claims description 24
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 23
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 23
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 claims description 17
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 claims description 10
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 8
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 claims description 6
- BHATUINFZWUDIX-UHFFFAOYSA-O dimethyl-(3-sulfopropyl)-tetradecylazanium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS(O)(=O)=O BHATUINFZWUDIX-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 6
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 claims description 6
- IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N lauryl sulfobetaine Chemical group CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- DIROHOMJLWMERM-UHFFFAOYSA-N 3-[dimethyl(octadecyl)azaniumyl]propane-1-sulfonate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O DIROHOMJLWMERM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- TUBRCQBRKJXJEA-UHFFFAOYSA-N 3-[hexadecyl(dimethyl)azaniumyl]propane-1-sulfonate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O TUBRCQBRKJXJEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- FUPYROAFYPQUSH-UHFFFAOYSA-N 3-[[3-(4-heptylphenyl)-3-hydroxypropyl]-dimethylazaniumyl]propane-1-sulfonate Chemical compound CCCCCCCC1=CC=C(C(O)CC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C=C1 FUPYROAFYPQUSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WKALLSVICJPZTM-UHFFFAOYSA-N 3-[decyl(dimethyl)azaniumyl]propane-1-sulfonate Chemical compound CCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O WKALLSVICJPZTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- UTSXERRKRAEDOV-UHFFFAOYSA-N 3-[dimethyl-[3-(tetradecanoylamino)propyl]azaniumyl]propane-1-sulfonate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O UTSXERRKRAEDOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- JPNPRWMRUCIEMN-UHFFFAOYSA-N 3-ditert-butylphosphaniumylpropane-1-sulfonate Chemical compound CC(C)(C)P(C(C)(C)C)CCCS(O)(=O)=O JPNPRWMRUCIEMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- CHVFGCXPLGAAQN-UHFFFAOYSA-N 3-triphenylphosphaniumylpropane-1-sulfonate Chemical compound C=1C=CC=CC=1[P+](C=1C=CC=CC=1)(CCCS(=O)(=O)[O-])C1=CC=CC=C1 CHVFGCXPLGAAQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- DQNQWAVIDNVATL-UHFFFAOYSA-N NDSB 221 Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CCC[N+]1(C)CCCCC1 DQNQWAVIDNVATL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ZIQVFZHFAUZKPD-UHFFFAOYSA-L disodium;3-[4-[1,2-diphenyl-2-[4-(3-sulfonatopropoxy)phenyl]ethenyl]phenoxy]propane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC(OCCCS(=O)(=O)[O-])=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)=C(C=1C=CC(OCCCS([O-])(=O)=O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 ZIQVFZHFAUZKPD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 3-[dimethyl-[3-[[(4r)-4-[(3r,5s,7r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]propyl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CC(O)CS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 0.000 claims description 2
- CNXPCGBLGHKAIL-UHFFFAOYSA-N NSDB 211 Chemical compound OCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O CNXPCGBLGHKAIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims 2
- 125000006367 bivalent amino carbonyl group Chemical group [H]N([*:1])C([*:2])=O 0.000 claims 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 abstract description 37
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 abstract description 30
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 27
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 25
- 230000008569 process Effects 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 13
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 13
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 13
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 9
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 6
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 5
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 5
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 4
- 239000002563 ionic surfactant Substances 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-M propane-1-sulfonate Chemical compound CCCS([O-])(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 3
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- NNCRHRDBFDCWPA-UHFFFAOYSA-N ethyl dimethyl ammonio propane sulfonate Chemical group CC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O NNCRHRDBFDCWPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 238000012634 optical imaging Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- QURLONWWPWCPIC-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminoethoxy)ethanol;3,6-dichloro-2-methoxybenzoic acid Chemical compound NCCOCCO.COC1=C(Cl)C=CC(Cl)=C1C(O)=O QURLONWWPWCPIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010016803 Fluid overload Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000000656 azaniumyl group Chemical group [H][N+]([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000010291 electrical method Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000002360 explosive Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/36—Embedding or analogous mounting of samples
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
- G01N2001/302—Stain compositions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures
Abstract
본 발명은 설포-베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는, 핵산, 다당류, 항체, 항체단편, 펩타이드,폴리펩타이드 또는 단백질 등 생물학적 분자를 생물학적 시료의 조직 내에 침투시키기 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 항체 등 생물학적 분자를 생체조직의 심부로 신속하고 균일하게 침투시킬 수 있으므로, 3차원 구조의 생체조직 또는 기관의 면역화학염색에 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물을 생체조직의 투명화에 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 생물학적 분자의 생체조직침투용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
생체 조직 (tissue), 기관 (organ), 또는 이것의 일부를 포함하는 생물학적 시료는 불투명하므로, 3차원 상태에서 그 조직 내부를 일반적인 광학현미경으로 관찰하는 것은 거의 불가능하다. 이에 광학이미징 기술을 이용해 생체 조직을 포함하는 생물학적 시료의 내부를 3차원 (3D) 상태에서 관찰하기 위한 수단으로서 공초점현미경 또는 다광자현미경이 사용되어 왔으나, 사용되는 광원이 생물학적 시료를 통과할 수 있는 깊이는 수백 ㎛에 불과하여 매우 제한된 정보만 얻을 수 있다. 또한, 3차원 구조의 생물학적 시료를 관찰하기 위한 다른 방법으로서 면역염색방법이 이용되고 있다. 또한, 최근에는 면역염색방법과 조직 투명화방법을 함께 적용하여 생물학적 시료를 3차원 상태에서 효율적으로 관찰하고자 하는 방법이 제안된 바 있다.
면역염색방법은 조직을 고정액으로 고정한 후, 파라핀 또는 폴리머로 포매 (embedding)한 다음, 수 ㎛ 또는 ㎚ 두께로 절편을 만들어 빛이나 전자파가 투과할 수 있도록 한 후, 광학 또는 전자현미경을 이용하여 조직 시료를 이미징 한다. 그러나, 이러한 방법은 전체 조직 또는 두꺼운 조직의 정보를 얻고자 할 때, 수십 ㎛ 두께 이하의 연속적인 절편을 제작해야 하고, 이들 각각을 현미경을 이용하여 이미징 한 후 다시 재구성하는 일련의 번거로운 과정을 필요로 한다. 생체조직 투명화 방법은 이러한 면역염색방법의 한계를 극복할 수 있는 방법의 하나이며, 조직의 물리화학적 특성을 변형시켜 이미징을 얻을 때 사용하는 빛이 흡수, 산란 및 굴절되는 현상을 억제하여 빛이 조직을 투과할 수 있도록 하는 방법이다. 관련하여 다양한 기술이 개발되고 있으며, 예를 들어, 전기영동 방법 기반, 수용액 또는 유기 용매 기반의 투명화 방법이 생물학적 시료의 관찰에 이용되고 있다. 이러한 조직 투명화 방법들은 모두 생물학적 시료의 조직 내 지질을 제거하고, 상기 시료의 굴절보상률을 보정하는 방법으로서, 투명화 과정에서 단백질 변성 등에 의한 DNA, RNA, 또는 단백질 등 생체 조직의 정보가 왜곡되거나 손실되지 않도록 하는 것이 중요하다.
한편, 생체조직 또는 기관의 3차원 구조나 분포를 관찰하기 위해 항체 또는 고분자 등을 생물학적 시료에 염색하는 방법은 현재에도 여전히 개발 중에 있다. 일반적으로, 입자는 자연적으로 스스로 불규칙적인 운동을 하고 사방으로 퍼지면서 다른 분자와 섞이는 확산을 통해 이동한다. 특히, 다양한 물질로 구성되고 복잡한 구조를 갖는 생체 조직 내에서 항체 또는 고분자의 확산은 느리기 진행되기 때문에 일정한 볼륨 이상을 지닌 조직 내로 침투하는데 오랜 시간이 걸린다. 따라서 이러한 문제점을 해결하기 위해, 생체 조직 또는 기관과 같은 생물학적 시료를 고정하는 고정제를 소량 사용하거나 수화젤의 구조 간격을 넓게 하는 방법도 적용되고 있다. 또한, 고분자의 신속한 확산을 위해서 조직을 다공성으로 만드는 방법도 제안된 바 있다. 그러나 이러한 방법은 주로 조직을 얼렸다 녹이는 과정을 반복하거나 탈수 및 재수화를 반복해야 하는 번거로움이 있다. 또 다른 방법으로 항체나 고분자 자체의 확산 속도를 빠르게 하기 위해서 고분자가 담긴 용액의 온도를 높이거나, 마이크로파를 이용하는 방법도 개발된 바 있고, 항체나 고분자의 고른 전달을 위해 혈관을 이용하는 방법도 개발된 바 있다. 또한 최근에는 유기 용매를 이용해 염색하는 방법과 회전하는 용액에서 전기장의 외력을 주는 방법, 고분자를 높은 농도로 사용해 농도 구배를 이용하는 방법, 원심력 등을 이용해 고분자에 압력을 주어 조직을 고속으로 투과하는 방법이 개발된 바 있다. 그러나, 전기장을 이용하는 방법은 60 ~ 100 V의 높은 전압 때문에 조직이 훼손이 될 수 있는데, 이는 조직이나 생물학적 시료 내의 구성물이 전하를 갖고 있어 전기장에 따라 움직이기 때문이다. 확률적 전기 수송방법 또한 전기장의 외력과 함께 유체의 흐름을 주기 때문에 유체 속도에 따라서 조직의 손상이 발생할 수 있다. 원심력을 주어 고분자의 이동속도를 늘리는 방법은 조직의 안정성을 보장하지만, 한쪽 방향으로만 흐르는 단점이 있다. 고분자를 높은 농도로 주어서 농도 구배를 하는 방법은 반응 속도를 조절할 수 있는 장점이 있지만, 많은 양의 고분자를 사용해야하기 때문에 경제적으로 비효율적이다. 특히, 이와 같은 방법들은 특별한 사양의 기계 장치가 필요하다는 단점이 있다. 이와 달리 유기 용매를 이용한 방법은 특별한 장치가 필요 없고, 전기적 방법보다 높은 보존성을 보이지만, 한 조직으로 한 번의 염색 밖에 할 수 없는 단점이 있다. 또한, 많은 유기용매들이 그 고유의 특성상 독성 또는 폭발성이 있기 때문에 실험자가 취급하기 어렵다는 문제점도 있다.
따라서 일정한 볼륨 이상의 생체조직 또는 장기를 포함하는 생물학적 시료를 3차원 상태에서 관찰하기 위해, 이것의 심부로 항체, 항체단편, 단백질, 다당류, RNA 및 DNA를 포함하는 핵산, 펩타이드 및 폴리펩타이드와 같은 생물학적 분자 (biological molecule)를 신속하고 균일하게 침투시켜 상기 시료에 대한 관찰 및 분석 효율을 증진시킬 수 있는 방법이 여전히 요구되고 있는 실정이다.
본 발명의 목적은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 사용하여 생물학적 시료 내로 생물학적 분자를 신속하고 균일하게 침투시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 생물학적 분자의 조직침투용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 생물학적 시료의 면역화학염색용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 생물학적 시료의 조직투명화 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 생체 외로 분리된 조직 (tissue), 기관 (organ) 또는 이것의 일부를 포함하는 생물학적 시료에 처리하는 것을 포함하는, 설포베타인계 쯔비터 이온성 계면활성제를 이용하여 생물학적 분자를 생물학적 시료 내로 침투시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 이러한 면에 따르면, 본 발명에 따른 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 생물학적 시료의 조직침투 방법은, (a) 생물학적 시료를 고정시키는 단계; (b) 선택적으로 그리고 필요에 따라, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 고정 용액을 제거하는 단계; (c) 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 상기 생물학적 시료에 처리하는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 제거하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 생물학적 시료에 항체, 항체단편, 단백질, 다당류, RNA 및 DNA를 포함하는 핵산, 펩타이드 및 폴리펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 한 이상인 것인 생물학적 분자를 가하는 단계를 포함한다. 본 발명의 다른 실시예에서, 상기 생물학적 분자는 그 특성에 따라 상기 (c) 단계에서 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제와 함께 처리되거나, (b) 단계 후 (c) 단계 전에 처리 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 상기 생물학적 시료에 처리하는 것은, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제에 상기 생물학적 시료를 침지하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 생물학적 분자의 생체조직 침투용 조성물을 제공한다.
본 발명의 이러한 면에서, 본 발명의 생체조직 침투용 조성물 및 이를 이용하여 조직을 침투시키는 방법은, 특히 0.1 ㎜ 이상의 두께를 지닌 조직 또는 기관의 심부 내로 생물학적 분자를 신속하고 균일하게 침투시킬 수 있다.
본 발명에서, 생물학적 분자 (biological molecules)는 생체조직 내로 침투시키고자 하는 화합물, 항체, 항체단편, 단백질, 다당류, RNA 및 DNA를 포함하는 핵산, 펩타이드 및 폴리펩타이드를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 생체조직 내로 전달하고자 하는 임의의 고분자 및 저분자 물질을 모두 포함한다.
본 발명에서, 생물학적 시료는 생체 외로 분리된 생체 조직 (tissue), 기관 (organ), 및 세포를 포함하며, 바람직하게는 0.1 ㎜ 이상의 두께를 갖는 생체 조직이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는 그리고 본 발명에 따르면, 본 발명의 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 하기 화학식 1로 표시된 것이다.
<화학식 1>
상기 식에서, R은 탄소 원자수 8 ~ 22개의 알킬기 또는 알케닐기이고, 상기 x는 0 ~ 3의 정수이며, 상기 y는 2 ~ 4의 정수이다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 계면활성제는 Dimethylethylammoniumpropane sulfonate; N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate; Sodium 3,3′-[(1,2-diphenylethene-1,2-diyl)bis(4,1-phenylene)]bis(oxy)bis(propane-1-sulfonate); 3-(4-Heptyl)phenyl-3-hydroxypropyl)dimethylammoniopropanesulfonate; 3-(Decyldimethylammonio)-propanesulfonate; 3-[Dimethyl-(2-hydroxyethyl)ammonio]-1-propanesulfonate; 3-(1-Methylpiperidinio)-1-propanesulfonate; 3-(Triphenylphosphonio)propane-1- sulfonate; 3-(Di-tert-butylphosphonium)propane sulfonate; 3-(N,N- Dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate; 3-[N,N-Dimethyl(3- myristoylaminopropyl)ammonio]propanesulfonate; 3-(N,N-
Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate; 3-(N,N-Dimethyloctadecylammonio)propanesulfonate; 3-([3-Cholamidopropyl]dimethylammonio)-2-hydroxy-1-propanesulfonate; 및 3-[(3- Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 생물학적 시료의 조직 내로 생물학적 분자를 침투시키기 위해, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 각 계면활성제가 고유의 값으로 갖고 있는 미셀임계농도 (critical micelle concentration) 이상의 농도로 바람직하게는 4 ~ 200시간 동안 상기 생물학적 시료에 처리하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 바람직하게는 상기 각 계면활성제의 미셀임계온도 내지 60℃ 이하의 온도에서 처리하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 생물학적 시료에 처리하는 것이, 10 ~ 500 rpm의 속도를 갖는 롤링바틀 (rolling bottle) 인큐베이터, 10 ~ 500 rpm의 속도를 갖는 진탕기 (shaker) 또는 10 ~ 500 rpm 속도와 30°~ 45°의 기울기를 갖는 락커 (rocker)를 이용하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에서, 상기 시료에 침투시키고자 하는 생물학적 분자는 그 특성에 따라, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제와 함께 동시에 처리되거나 상기 계면활성제 처리 전 또는 후에 적용될 수 있다.
본 발명은 또한 설포-베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 면역조직화학염색 방법 및 설포-베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 유효성분으로 포함하는 면역조직화학염색용 조성물을 제공한다. 유리하게는 그리고 본 발명에 따르면, 본 발명의 면역화학염색용 조성물은, 0.1 ㎜ 이상의 두께를 갖는 생체 조직의 심부를 면역조직화학염색 하는데 이용될 수 있다.
본 발명에서, 면역조직화학염색은 항원과 항체간의 반응을 이용하여 세포나 조직 내에 존재하는 물질을 확인하는 면역염색법이며, 면역염색 또는 면역화학염색과 혼용하여 사용하였다.
본 발명의 이러한 면에 따르면, 본 발명의 면역화학염색용 조성물은 상기 화학식 1의 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 유효성분으로 포함하며, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 Dimethylethylammoniumpropane sulfonate; N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3- ammonio-1-propanesulfonate; Sodium 3,3′-[(1,2-diphenylethene-1,2-diyl)bis(4,1-phenylene)]bis(oxy)bis(propane-1-sulfonate); 3-(4-Heptyl)phenyl- 3-hydroxypropyl)dimethylammoniopropanesulfonate; 3-(Decyldimethylammonio)propanesulfonate; 3-[Dimethyl-(2-hydroxyethyl)ammonio]-1-propanesulfonate; 3-(1-Methylpiperidinio)-1-propanesulfonate; 3-(Triphenylphosphonio)propane-1- sulfonate; 3-(Di-tert-butylphosphonium)propane sulfonate; 3-(N,N- Dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate; 3-[N,N-Dimethyl(3- myristoylaminopropyl)ammonio]propanesulfonate; 3-(N,N-
Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate; 3-(N,N- Dimethyloctadecylammonio)propanesulfonate; 3-([3-
Cholamidopropyl]dimethylammonio)-2-hydroxy-1-propanesulfonate; 및 3-[(3- Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 실시예는 상기 설포-베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용하여 생물학적 시료를 면역화학염색 하는 방법을 제공하며, 이는 다음 단계를 포함한다: (a) 생물학적 시료를 고정시키는 단계; (b) 선택적으로 그리고 필요에 따라, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 고정용액을 제거하는 단계; (c) 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 상기 생물학적 시료에 처리하는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 제거하는 단계; (e) 상기 (d) 단계의 생물학적 시료를 항체와 반응시켜 면역염색 하는 단계; (f) 상기 (e) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 반응하지 않은 항체를 제거하는 단계; 및 (g) 상기 면역염색이 완료된 생물학적 시료를 투명화 하는 단계.
본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 (c) 단계에서의 처리는 설포베 타인계 쯔비터이온성 계면활성제를, 예를 들어, 증류수 또는 PBS (phosphate-buffered saline)를 함유하는 용액에 각 계면활성제가 갖는 고유 미셀임계농도 이상의 농도로 용해시킨 용액으로, 바람직하게는 4 ~ 200시간 동안 생물학적 시료에 처리하는 것일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 실시예에 있어서, 상기 처리는 바람직하게는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제가 갖는 미셀임계온도 내지 60℃의 온도에서 처리하는 것일 수 있으나 이에 제한된 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 10 ~ 500 rpm의 속도를 갖는 롤링바틀 (rolling bottle) 인큐베이터, 10 ~ 500 rpm의 속도를 갖는 진탕기 (shaker) 또는 10 ~ 500 rpm 속도와 30°~ 45°의 기울기를 갖는 락커 (rocker)를 이용하여 생물학적 시료에 처리하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 (d) 단계에서 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 제거는 상기 계면활성제가 처리된 생물학적 시료를, 예를 들어, 증류수 또는 PBS (phosphate-buffered saline)를 함유한 용액에 첨가하여, 상기 시료에 존재하는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 농도를 미셀임계농도 이하로 낮추는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 제거는 교반기 상에서 30°~ 45°의 기울기 및 10 ~ 500 rpm의 속도를 갖는 기울기 이동 (tilt movement) 이나 용액의 이동을 수행하여 제거하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 있어서, 상기 (g) 단계의 투명화 하는 단계는 투명화 용액에 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 각 계면활성제가 갖는 고유 값의 미셀임계농도 이상의 농도로 첨가하여 수행하며, 상기 투명화 하는 단계는 상기 (d) 단계 후 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 조성물은, 생체 시료의 광학적 이미징을 위한 전처리용 조성물이며, 면역조직화학염색 및 조직투명화 둘 모두를 위한 조성물이다.
본 발명은 생물학적 시료의 조직침투용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면 생물학적 분자를 두꺼운 두께를 갖는 생체조직의 심부까지 신속하고 균일하게 침투시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 생체조직을 포함하는 생물학적 시료의 면역화학염색에 이용될 수 있다. 본 발명의 설포-베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용하여 생물학적 시료를 면역화학염색하는 경우, 생물학적 시료에 함유된 막관통단백질만을 선택적으로 제거할 수 있어, 면역염색을 위한 항체나 생체고분자가 분석하고자 하는 생체조직에 효과적으로 신속하게 침투될 수 있고, 시료를 손상 없이 안전하게 보존할 수 있다. 또한, 두꺼운 두께의 시료의 심부까지 염색이 가능하므로, 종래 면역염색화학 방법에 비해 면역염색분석 효율을 현처히 향상시킬 수 있다.
도 1은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 처리하여 생체조직이나 생물학적 시료를 면역화학염색하는 방법에 관한 순서도이다.
도 2는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 뇌조직 절편 (100 ㎛ 두께)에 수행하였을 때, 보다 더 많은 항체가 투과된 것을 나타낸 것이다.
도 3은 인산염완충용액, 이온성 계면 활성제, 쯔비터이온성 계면활성제를 각 각 뇌조직에 처리한 후, 시간에 따른 조직변형 여부를 관찰한 사진으로서, 쯔비터 이온성 계면활성제를 처리한 경우 생체조직이 변형 없이 그대로 보존된 것을 나타낸다.
도 4는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 뇌조직 절편에 처리 시, 미 셀임계농도 이상일 경우, 고농도에서도 생체조직이 그대로 보존되고 변형이 일어나 지 않음을 확인한 결과이다.
도 5는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 종류별로 처리하고 뇌조직 절편을 염색한 결과로서, 공통적으로 항체나 생체고분자 물질이 조직 내로 잘 침투되고 있음을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 전처리 과정을 포 함한 면역화학염색법으로 전체 뇌조직에 반응시켰을 때, 심부 뇌 (deep brain)까지 항체가 침투한 것을 보여주는 결과이다.
도 2는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 뇌조직 절편 (100 ㎛ 두께)에 수행하였을 때, 보다 더 많은 항체가 투과된 것을 나타낸 것이다.
도 3은 인산염완충용액, 이온성 계면 활성제, 쯔비터이온성 계면활성제를 각 각 뇌조직에 처리한 후, 시간에 따른 조직변형 여부를 관찰한 사진으로서, 쯔비터 이온성 계면활성제를 처리한 경우 생체조직이 변형 없이 그대로 보존된 것을 나타낸다.
도 4는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 뇌조직 절편에 처리 시, 미 셀임계농도 이상일 경우, 고농도에서도 생체조직이 그대로 보존되고 변형이 일어나 지 않음을 확인한 결과이다.
도 5는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 종류별로 처리하고 뇌조직 절편을 염색한 결과로서, 공통적으로 항체나 생체고분자 물질이 조직 내로 잘 침투되고 있음을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 전처리 과정을 포 함한 면역화학염색법으로 전체 뇌조직에 반응시켰을 때, 심부 뇌 (deep brain)까지 항체가 침투한 것을 보여주는 결과이다.
본 발명은 생물학적 시료 전체에 대해 항체, 항체단편, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 포함하는 생물학적 분자를 신속하고 고르게 상기 시료의 심부 내로 침투시키는 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하며, 이는 생물학적 시료에 존재하는 단백질-단백질 결합을 유지시키는 반면, 지질간 또는 지질-단백질간의 결합을 약화시키고, 조직 내 세포막에 존재하는 막관통단백질만을 선택적으로 제거할 수 있다. 따라서 분석하고자 하는 조직 내의 항상성 및 항원성은 그대로 유지하면서 막 단백질이나 지질의 변화로 인한 조직의 변형 또는 물러짐이 발생하지 않도록 한다.
이와 같이, 본 발명의 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 분석을 위해 처리하는 생물학적 분자, 예를 들어, 항체, 항체단편, 단백질, 다당류, RNA 및 DNA를 포함하는 핵산, 펩타이드 및 폴리펩타이드가, 분석대상인 생물학적 시료의 단백질이 제거된 막관통단백질 통로를 통해 두꺼운 조직 내 심부까지 신속하고 균일하게 침투할 수 있도록 함으로써, 생물학적 시료의 분석, 예를 들어, 면역화학염색과 같은 분석의 효율을 현저히 증가시키고 분석 시간 또한 효과적으로 단축시킬 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면 활성제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 사용할 수 있다.
<화학식 1>
상기 식에서, R은 탄소 원자수 8 ~ 22개의 알킬기 또는 알케닐기이고, 상기 x는 0 ~ 3의 정수이며, 상기 y는 2 ~ 4의 정수이다.
구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 상기 설포베타인계 쯔비터이 온성 계면활성제로서 3-(N,N-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate; N- Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate; 3-(N,N-
Dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate; 3-(N,N- Dimethyloctadecylammonio)propanesulfonate; 및 3-[(3- Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate을 사용하였다.
본 발명에 따른 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 생물학적 시료의 조직침투 방법은, (a) 생물학적 시료를 고정시키는 단계; (b) 선택적으로 그리고 필요에 따라, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 고정 용액을 제거하는 단계; (c) 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 상기 생물학적 시료에 처리하는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 제거하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계의 생물학적 시료에 항체, 항체단편, 단백질, 다당류, RNA 및 DNA를 포함하는 핵산, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 가하는 단계를 포함한다.
상기 생물학적 시료의 고정은 분석하고자 하는 개체 유래의 생체 외로 분리된 조직 또는 기관을 알데하이드계 화합물이 함유된 용액에 침지하여 고정시킬 수 있으며, 상기 알데하이드계 화합물로는 이에 제한되지는 않으나, 파라포름알데히드 또는 글루타알데히드를 사용할 수 있다. 또한 상기 시료의 고정은 알데하이드계 화합물이 함유된 용액에 시료를 담근 후, 4℃ ~ 10℃의 온도에서 4시간 ~ 12시간 동안 고정시켜, 상기 시료에 존재하는 항원이 파괴 또는 유출되지 않게 보전하도록 한다. 이후 PBS (phosphate- buffered saline) 용액에 4시간 ~ 12시간 동안 넣어두어 고정 과정에 사용되지 않은 알데하이드계 화합물을 생물학적 시료로부터 제거한다.
일반적으로, 고정과정을 거친 생물학적 시료는 시료 내에 지질로 이루어진 복잡한 구조의 존재로 인해 분석시료 또는 염색시료의 침투가 어렵다. 그러나 시료 내에 존재하는 지질을 모두 제거하기 되면 생물학적 시료의 단백질이 손상되거나 조직의 형태가 변형될 수 있어 분석 진행이 어렵다는 문제가 있다. 반면에, 본 발명의 계면활성제는 생물학적 시료에 존재하는 지질과 지질간의 결합 또는 지질-단백질간의 결합을 약화시켜 분석시료 또는 염색시료의 침투가 용이하도록 한다. 따라서, 생물학적 시료의 고정 단계 이후, 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 처리하는 것은 상기 생물학적 시료에 대한 생물학적 분자의 조직 침투성을 현저히 증가시킨다.
본 발명에 따른 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 처리는, 증류수 또는 PBS (phosphate-buffered saline) 용액에 사용하고자 하는 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 미셀임계농도 이상으로 첨가한 용액을 사용 할 수 있다. 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 미셀임계농도 미만으로 사용하게 되면 계면활성제에 의해 미셀이 형성되고 표면장력이 저하되는 문제점이 발생할 수 있기 때문에 생물학적 분자의 효과적인 침투를 위해서는 미셀임계농도 이상으로 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 첨가하여 사용하는 것이 바람직하다.
더욱 바람직하게는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제가 고유의 값으로 갖고 있는 미셀임계농도 내지 50% (w/v)의 농도로 사용하는 것이 좋다. 이때, 50% (w/v)의 농도를 초과하여 사용하게 되면, 생물학적 시료 내의 항원성이 보존되지 않으며, 시료의 조직이 물러서 분석이 어려운 문제점이 있을 수 있다.
또한, 생물학적 시료에 더욱 효과적으로 설포베타인계 쯔비터 이온성 계면활성제를 처리하기 위해, 각 계면활성제가 고유값으로 갖고 있는 미셀임계 온도 이상에서 반응시키는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 미셀임계온도인 10℃에서 60℃의 온도 사이에서 반응시킨다. 보다 더 바람직하게는, 10℃ 에서 42℃의 온도에서 반응시킨다. 이때 60℃의 온도를 초과하여 반응시키게 되면, 단백질의 변성이 발생할 수 있는 문제점이 있으므로 상기 온도 범위 내에서 반응시키는 것이 바람직하다.
또한, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제가 함유된 용액의 생물학적 시료에 대한 처리는 4 ~ 200시간 동안 처리할 수 있다. 4시간 미만으로 처리하게 되면, 상기 계면활성제가 생물학적 시료에 존재하는 지질 등을 제대로 제거하지 못하는 문제점이 생기며, 200시간을 초과하여 처리하게 되면 상기 생물학적 시료의 형태가 변형될 수 있는 문제점이 생길 수 있다. 따라서 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 생물학적 시료에 대한 처리는 크기에 따라 다르며 4 ~ 200시간 동안, 더 바람직하게는 8시간 동안 처리할 수 있다. 물론 처리하고자 하는 생물학적 시료의 종류 및 크기에 따라 상기 처리시간은 더 연장되거나 줄어들 수 있음은 물론이다.
생물학적 시료에 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 처리함에 있어, 0 ~ 500 rpm의 속도를 갖는 롤링바틀 인큐베이터 (rolling bottle incubator), 같은 속도를 갖는 진탕기 배양기 (shaker incubator), 같은 속도와 30°~ 45°의 기울기 이동을 갖는 rocker 등의 교반기가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이런 방법은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제가 생물학적 시료 내에 존재하는 막관통단백질을 선택적으로 제거할 때, 각 계면활성제가 갖고 있는 미셀 임계농도와 온도의 분포가 반응하는 용액 안에서 균일하게 하는 효과를 갖는다.
다음으로, 생물학적 시료를 세척하고 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 제거하는 단계를 수행한다. 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 제거는 상기 계면활성제가 처리된 생물학적 시료로부터 상기 계면활성제의 농도를 감소 또는 제거하는 것을 의미하는 것으로, 상기 계면활성제가 처리된 생물학적 시료를 증류수 또는 PBS (phosphate-buffered saline) 버퍼에 첨가하여 시료에 존재하는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 농도를 미셀임계농도 이하로 낮추도록 하였다. 또한, 상기 계면활성제의 효과적인 제거를 위해 교반기상에서 30°~ 45°의 기울기 및 10 ~ 500 rpm의 속도로 기울기 이동 (tilt movement) 방법을 통해 생물학적 시료에 처리된 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 임계미셀농도 이하로 낮춰 상기 계면활성제의 활성 또는 작용을 정지시킨다. 다음 과정으로, 생물학적 시료에 항체 등의 생물학적 분자를 가하여 생체조직 내로 생물학적 분자를 침투시킨다.
본 발명의 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 조성물은 생물학적 분자를 생체조직에 효과적으로 침투시킬 수 있으므로, 생체조직을 포함하는 생물학적 시료 내의 분석하고자 하는 성분 (항원 또는 물질 등)에 특이적인 항체 또는 염색시료를 첨가하여 반응시킴에 의한 면역화학염색에 이용될 수 있다. 본 발명의 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 이용하여 생물학적 시료의 면역화학염색을 수행하는 방법은 다음을 포함한다: (a) 생물학적 시료를 고정시키는 단계; (b) 선택적이고 그리고 필요에 따라, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 고정 용액을 제거하는 단계; (c) 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 상기 생물학적 시료에 처리하는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 제거하는 단계; (e) 상기 (d) 단계의 생물학적 시료에 항체, 항체단편, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 가하는 단계; (f) 상기 (e) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 반응하지 않은 항체를 제거하는 단계; 및 (g) 상기 면역염색이 완료된 생물학적 시료를 투명화하는 단계. 상기 방법을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
상기 생물학적 시료에 항체를 처리하는 경우, 상기 생물학적 시료에 존재하는 항원 특이적인 항체를 첨가할 수 있고, 용이한 검출을 위해 형광물질 등 프로브 (probe)가 결합한 항체를 사용할 수도 있다. 또한, 상기 항체는 희석하여 사용할 수 있으며, 항체 희석을 위한 용매로는 인산염, 붕산나트륨 및 소혈청 알부민이 함유된 완충용액을 사용할 수 있으나,이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 항체 희석용 완충용액에 추가적으로 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 미셀임계농도 이상의 농도로 첨가하여 사용할 수 있다.
다음 단계로, 상기 면역염색이 완료된 생물학적 시료를 투명화시킨다. 상기 투명화 과정은 염색된 생물학적 시료를 관찰 가능하도록, 조직 깊이를 확보하기 위한 과정으로, 상기 면역화학염색이 완료된 생물학적 시료를 BABB, 3DISCO 등을 포함하는 용매 기반의 투명화 과정을 수행할 수 있고, 또는 SeeDB, ClearT 등을 포함하는 용액에 조직을 넣는 단순 방법을 통한 투명화 과정을 수행할 수 있으며, 또 다른 방법으로 Scale 또는 CUBIC 등을 포함하는 과수화 투명화 방법을 수행할 수 있고, 또는 CLARITY이나 PACT 등을 포함하는 하이드로겔 임베딩 기반의 투명화 방법 등을 사용할 수 있다. 또한 상기 투명화 과정에 사용되는 완충용액에 추가적으로 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 상기 계면활성제의 미셀임계농도 이상의 농도로 첨가하여 사용할 수 있다. 또한 상기 본 발명에 따른 투명화 단계는 생물학적 시료를 항체와 반응시켜 면역염색하는 과정 이전에 수행할 수도 있다.
이와 같이, 본 발명은 상기 본 발명의 설포베타인계 쯔비터이온성 계면 활성제를 유효성분으로 포함하는, 면역화학염색용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 상기 조성물에는 본 발명의 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제 이외에도 생물학적 시료의 보전성 또는 염색시료 침투성 증진을 위한 별도의 첨가제를 더 포함할 수 있다.
이상, 본 발명에서 제공하는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 생물학적 시료의 면역화학염색 방법은, 생물학적 시료 내에 존재하는 막 관통단백질을 선택적으로 제거할 수 있어 면역화학염색 시, 항체 또는 고분자 물질 등과 같은 분석시약이 상기 생물학적 시료 내로 빠르게 물리적 확산이 될 수 있도록 하여, 신속하게 시료 염색이 가능하며 두꺼운 두께의 시료도 면역화학염색이 가능하다. 특히 70 ㎛ 이상의 두께의 시료 분석도 가능할 뿐만 아니라 수 mm 이상의 두께를 갖는 시료의 분석도 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 면역화학 염색방법은 생물학적 시료에 존재하는 항원성을 그대로 유지할 수 있으며, 상기 시료가 물러지는 변형을 발생시키지 않을 뿐만 아니라 안정하고 오랫동안 생물학적 시료를 보존하는 효과가 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
1:
설포베타인계
쯔비터이온성
계면활성제인 SB3-14 (3-(
N
,
N
-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate)을 이용한 뇌절편 조직의 염색
생쥐의 뇌 (8.2 mm x 12.5 mm x 6.0 mm, mouse brain (P1), 한국뇌연구원)를 4% 파라포름알데하이드 용액에 12시간 동안 4℃에서 두었다. 다음, 정화된 뇌를 PBS (phosphate-buffered saline pH7.4, Thermo Fisher Scientific, USA) 용액에 12시간 동안 넣어 파라포름알데히드를 세척하였다. 고정화된 뇌를 PBS 중 30% sucrose (sucrose, Sigma Aldrich, USA) 용액에 넣어 가라앉을 때까지 두었다. 가라앉은 뇌를 동결시킨 후에 100 ㎛ 두께로 절단하였다. 100 ㎛ 뇌조직 절편을 하기 화학식으로 표시되는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제중 하나인 SB3-14 (3-(N,N-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate, Sigma Aldrich, USA)를 4%의 농도로 PBS 용액에 첨가하고 4시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 다음, PBS 용액에 12 시간 동안 담가두어 세척하였다. 1차 항체인 Pan Neuronal Marker (0.5mg/mL,EMD Millipore, USA)를 8시간 동안 반응시키고, 이어서 2차 항체인 Alexa flour 594 (0.5mg/mL, Molecular probes, USA)를 2시간 동안 반응시켜 확산방법을 통해 면역 화학 염색을 수행하였다. 각 면역화학염색동안, 항체와 블로킹 용액을 1:300 으로 혼합하였다. 블로킹 용액은 PBS 용액 중 10% BSA (Bovine Serum Albumins, Sigma Aldrich, USA), 0.2% Triton X-100 (Triton X-100, Sigma Aldrich, USA), 0.001% Sodium azide (Sodium azide, Sigma Aldrich, USA)를 포함하였다. 면역염색 후 염색시간과 동일하게 PBS 용액에 넣어두어 반응하지 않은 항체를 제거하였다. 다음, 공초점 현미경 (A1, Nikon, Japan)을 이용해 10 μm 단위로 염색된 뇌조직 절편을 관찰하였다.
<화학식>
비교예
1
상기 실시예 1에서 SB3-14를 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 동일한 방법으로 면역화학염색을 수행하였다.
비교예
2
상기 실시예 1에서 SB3-14 대신 유이온 계면활성제인 4% 도데실 황산나트륨 (Sodium Dodecyl Sulfate, Sigma Aldrich, USA)를 처리한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 분석하였다.
실험예
1:
설포베타인계
쯔비터이온성
계면활성제를 이용한 면역화학염색 분석결과
상기 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 방법으로 염색된 생쥐의 뇌 조직 절편을 현미경으로 관찰한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1와 비교예 2의 경우 면역염색 신호의 강도가 비교예 1에 비해 더 우수한 발색을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 유의한 신호강도를 보이는 조직의 깊이 또한, 비교예 1은 30 ㎛, 실시예 1은 70 ㎛ 이상임을 알 수 있었고, 뇌조직 절편의 깊이를 Z축 기준으로 볼 때, 실시예 1은 비교예들에 비해 염색된 깊이와 효과가 더 우수한 것이 확인되었다(도 5 참조).
실시예
2:
설포베타인계
쯔비터이온성
계면활성제인 SB3-14 (3-(
N
,
N
-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate) 처리 시간별 뇌조직 염색수행
100 ㎛ 두께의 생쥐 뇌 조직 절편을 SB3-14를 4% 농도로 하여 37℃의 온도에서 처리하였다. SB3-14 처리 후, 시간별 (1시간, 2시간, 4시간, 8시 간) 뇌조직 절편을 현미경 (SMZ745T, Nikon, Japan)을 이용해 관찰하였다. 계면활성제 처리를 통한 뇌조직 염색법은 상기 실시예 1과 동일하게 수행하되, 처리 시간을 달리하여 관찰하였다. 또한 분석과정에서 동일한 조직을 시간에 따라서 관찰하기 때문에, 시간에 따른 관찰 광학적 특성이 다를 수 있음을 고려하여 비교를 위해 2.5 ㎜ × 2.5 ㎜의 모눈종이 바탕 위에서 관찰하였다.
비교예
3
상기 실시예 2에서 SB3-14를 첨가하지 않은 것을 제외하고는, 동일한 방법으로 면역화학 염색을 수행하였다.
비교예
4
상기 실시예 2에서 SB3-14 대신 유이온 계면활성제인 4% 도데실 황산 나트륨 (Sodium Dodecyl Sulfate, Sigma Aldrich, USA)를 처리한 것을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 분석하였다.
실험예
2:
설포베타인계
쯔비터이온성
계면활성제 처리 시간에 따른 면역화학염색 분석결과
상기 실시예 2, 비교예 3 및 비교예 4의 방법으로 염색된 뇌조직 절편을 분석하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 계면활성제 처리 시간이 경과할수록 실시예 2의 조직 또는 생체시료의 안전성이 다른 비교예들에 비해 우수한 것으로 나타났다. 또한, 투과되어 확인되는 눈금도 계면활성제 처리 시간이 경과되어도 눈금이 변형되지 않고 있다는 것을 볼 때, 분석하고자 하는 조직의 표면이나 두께에 거의 변화가 없다는 것을 알 수 있었다. 반면, 유이온 계면활성제인 SDS를 처리한 군 (비교예 4)의 경우, 점점 조직의 크기가 커지는 것으로 나타났고, 시간이 지날수록 눈금이 왜곡되어 보이는 것으로 나타나, 설포베타인계 쯔비터이온성 계면 활성제가 아닌 다른 계면활성제를 사용할 경우, 조직의 표면과 두께에 변화를 초래 하는 문제점이 생길 수 있음을 확인하였다.
실시예
3:
설포베타인계
쯔비터이온성
계면활성제인 SB3-14 (3-(
N
,
N
-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate)의 처리 농도별 뇌조직 염색수행
100 ㎛ 뇌조직 절편을 SB3-14를 4시간 동안 37℃에서 처리하여 면역 화학염색을 수행하였다. 상기 SB3-14 계면활성제를 각각 10%, 20% 및 50% 농도로 하여 뇌조직 절편을 염색한 후, 현미경 (SMZ745T, Nikon, Japan)으로 관찰하였다. 분석 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 미셀임계농도를 초과하여 고농도 (50%)로 처리하더라도 조직의 표면이나 투과성에 거의 변화가 없는 것으로 나타났다. 또한, 도 3과 마찬가지로 시간이 지난 후에도 눈금이 변형되지 않고, 눈금에 따른 조직의 크기 또한 변형되지 않았다. 이러한 결과는 본 발명의 설포베타인계 쯔위터이온성 계면활성제를 조직 염색에 사용하는 경우, 생체 조직이나 생물학적 시료에 변화가 유발되지 않고 항원성이 잘 보존되는 것을 뒷받침한다.
실시예
4: 다양한 종류의
설포베타인계
쯔비터이온성
계면활성제를 이용한 뇌조직 염색 수행
100 ㎛ 두께를 가진 생쥐 뇌조직 절편을 다양한 설포베타인계 쯔위터 이온성 계면활성제를 이용하여 4% 농도로 37℃에서 4시간 처리하여 면역화학염색을 수행하였다. 이때 사용한 설포베타인계 쯔위터이온성 계면활성제는 SB3-12 (N- Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, Sigma aldrich, USA), SB3-16 (3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate, Sigma aldrich, USA), SB3-18 (3-(N,N-Dimethyloctadecylammonio)propanesulfonate, Sigma aldrich, USA), CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, Sigma aldrich, USA)을 사용하였다. 상기 계면활성제들을 각각 처리하여 반응이 완료된 후, 세척하고 1차 항체 Pan Neuronal Marker (0.5 ㎎/㎖, EMD Millipore, USA)를 8시 간 동안 처리하여 반응시킨 다음, 2차 항체 Alexa flour 594 (0.5mg/mL, Molecular probes, USA)를 2시간 동안 처리하고 확산 방법을 통해 면역화학 염색을 수행하였 다. 다음 공초점 현미경 (A1, Nikon, Japan)을 이용해 10 ㎛ 단위로 측정하였다. 분석 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 실험에서 사용한 설포베타인계 쯔위터이온성 계면활성제 처리군은 염색의 강도가 우수한 발색을 나타내는 것으로 나타났다. 또한, 유의한 신호의 강도가 보이는 조직의 깊이 또한, 70 ㎛ 이상이 됨을 알 수 있었다.
실시예
5:
설포베타인계
쯔비터이온성
계면활성제인 SB3-14 (3-(
N
,
N
-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate)을 이용한 뇌조직의 염색
생쥐의 뇌 (8.2 mm x 12.5 mm x 6.0 mm, mouse brain (P1), 한국뇌연구원)를 4% 파라포름알데하이드에 12시간 동안 4℃에서 두었다. 다음 고정화된 뇌를 PBS 용액에 12시간 동안 상온에 넣어 파라포름알데히드를 세척하였다. 고정화 과정을 거친 뇌조직을 SB3-14 (3-(N,N-Dimethylmyristylammonio propanesulfonate, Sigma Aldrich, USA)를 4%의 농도로 포함하는 PBS 용액에 넣고 12시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 이때, 100 rpm의 속도와 37℃ 온도를 갖는 롤링바틀 인큐베이터를 이용하여 상기 뇌조직에 설포베타인계 쯔비터 이온성 계면활성제를 처리하였다. 다음,상기 뇌조직을 PBS 용액에 12시간 동안 담가두고 세척하였다. 30°의 기울기와 100 rpm의 속도의 기울기 운동을 갖는 락커 (rocker) 상에서 세척을 수행 하였다. 이후 뇌조직에 대한 면역항체 염색반응을 위해, Alexa Fluor 488이 결합된 Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody (0.5 ㎖/mg, abcam, USA)를 8시간 동안 자연 확산방법을 통해 적용하여 면역화학염색을 수행하였다. 항체는 상기 실시예 1에서 사용한 블로킹 용액과 1:200으로 혼합하여 사용하였다. 면역염색 후, 염색시간과 동일하게 PBS 용액에 넣어두어 반응하지 않은 항체를 제거하였다. 면역화학염색 반응과 세척은 100 rpm 및 37℃의 온도를 갖는 진탕 배양기에 넣어 처리하였다. 면역염색화학반응이 종료된 뇌조직을 투명화 처리를 하였으며, 투명화는 과수화 투명화 방법을 사용하였다. 50% 수크로스와 25% 우레아를 포함한 PBS 용액에 상온에서 24시간 동안 뇌조직을 넣어두었으며, 뇌조직을 투명화 용액에 넣은 후, 30°의 기울기와 100 rpm 속도의 기울기 운동을 갖는 락커를 이용 하여 수행하였다. 다음, 빛 시트 현미경 (UltraMicroscopeⅡ, LaVision BioTec, German)을 이용해 관찰하였다. 그 결과, 면역염색화학반응에 사용된 Tyrosine Hydroxylase 항체는 뇌조직 표면으로부터 수 mm 떨어진 심부 뇌에 존재하는 도파민성 신경세포까지 염색할 수 있음을 확인하였다 (도 6 참조).
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 조성물이 생물학적 시료 내로 항체 등의 생물학적 분자를 침투시키는데 이용할 경우, 분석대상의 생물학적 시료를 안정적으로 유지할 수 있는 효과를 얻을 수 있는 동시에, 염색시료를 신속하고 균일하게 심부까지 상기 시료 내로 침투시킬 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 대하여 상기 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (25)
- 생물학적 분자를 생물학적 시료의 조직 (tissue) 내로 침투시키는 방법으로서,
(a) 생물학적 시료를 고정용액으로 고정시키고;
(b) 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 상기 (a)의 생물학적 시료에 처리하되, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제가 고유의 값으로 갖고 있는 미셀임계농도 이상의 농도로 1시간 ~ 200시간 동안 상기 생물학적 시료에 처리하며;
(c) 상기 (b)의 생물학적 시료에 생물학적 분자를 가하는 것을 포함하고,
상기 생물학적 시료는 생체 외 분리된 조직 (tissues), 기관 (organ) 또는 이것의 일부이며, 상기 생물학적 분자는 항체, 항체단편, 단백질, 다당류, RNA 또는 DNA를 포함하는 핵산, 펩타이드 및 폴리펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것인,
생물학적 분자를 생물학적 시료의 조직 내로 침투시키는 방법. - 제 1항에 있어서,
상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 하기 화학식 1로 표시되는 것인, 생물학적 분자를 생물학적 시료의 조직 내로 침투시키는 방법:
<화학식 1>
상기 식에서, R은 탄소 원자수 8 ~ 22개의 알킬기, 알케닐기, 또는 NHCO의 아실기이고, 상기 x 는 0 ~ 3의 정수이며, 상기 y는 2 ~ 4의 정수이다. - 제 2항에 있어서,
상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-
propanesulfonate; Sodium 3,3′-[(1,2-diphenylethene-1,2-diyl)bis(4,1- phenylene)]bis(oxy)bis(propane-1-sulfonate); 3-(4-Heptyl)phenyl-3- hydroxypropyl)dimethylammoniopropanesulfonate; 3-(Decyldimethylammonio) propanesulfonate; 3-[Dimethyl-(2-hydroxyethyl)ammonio]-1-propanesulfonate; 3-(1-Methylpiperidinio)-1-propanesulfonate; 3-(Triphenylphosphonio)propane-1- sulfonate; 3-(Di-tert-butylphosphonium)propane sulfonate; 3-(N,N- Dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate; 3-[N,N-Dimethyl(3- myristoylaminopropyl)ammonio]propanesulfonate; 3-(N,N-
Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate; 3-(N,N-Dimethyloctadecylammonio)propanesulfonate; 3-([3-Cholamidopropyl]dimethylammonio)-2-hydroxy-1-propanesulfonate; 및 3-[(3- Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 생물학적 분자를 생물학적 시료의 조직 내로 침투시키는 방법. - 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 (c)의 생물학적 시료에 생물학적 분자를 가하는 것이, (b)의 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 상기 생물학적 시료에 처리하는 것과 동시에 수행되거나 그 이전에 수행되는 것인, 생물학적 분자를 생물학적 시료의 조직 내로 침투시키는 방법. - 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 고정용액은 알데하이드계 화합물을 포함하는 것인, 생물학적 분자를 생물학적 시료의 조직 내로 침투시키는 방법. - 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 두께가 0.1 mm 이상인 것인, 생물학적 분자를 생물학적 시료의 조직 내로 침투시키는 방법. - 삭제
- 삭제
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 상기 계면활성제의 미셀임계 온도 내지 60℃의 온도에서 처리하는 것인, 생물학적 분자를 생물학적 시료의 조직 내로 침투시키는 방법. - 삭제
- 삭제
- 생체외 분리된 조직, 기관 또는 이것의 일부로 구성 된 생물학적 시료의 면역조직화학염색 방법으로서,
(a) 생물학적 시료를 고정용액으로 고정시키고;
(b) 생물학적 시료를 전기적 또는 화학적 방법으로 투명화 시키고;
(c) 하기 화학식 1로 표시되는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을, 상기 (b)의 투명화된 생물학적 시료에 처리하되, 상기 조성물을 증류수 또는 PBS (phosphate-buffered saline)를 함유하는 용액에 상기 계면활성제가 갖는 고유 미셀임계농도 이상의 농도로 용해시킨 용액으로, 1 ~ 200시간 동안 생물학적 시료에 처리하며;
(d) 상기 (c)의 생물학적 시료를 항체와 반응시켜 면역염색 하고; 및
(e) 상기 (d)의 생물학적 시료를 세척하고 반응하지 않은 항체를 제거하는 것을 포함하는, 생물학적 시료의 면역조직화학염색 방법:
<화학식 1>
상기 식에서, R은 탄소 원자수 8 ~ 22개의 알킬기, 알케닐기, 또는 NHCO의 아실기이고, 상기 x 는 0 ~ 3의 정수이며, 상기 y는 2 ~ 4의 정수이다. - 제 12항에 있어서,
상기 (d)의 생물학적 시료를 항체와 반응시키는 것이, 상기 (c)의 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을 상기 생물학적 시료에 처리하는 것과 동시에 수행되거나 그 이전에 수행되는 것인, 생물학적 시료의 면역조직화학염색 방법. - 제 12항에 있어서,
상기 고정용액은 알데하이드계 화합물을 포함하는 것인, 생물학적 시료의 면역조직화학염색 방법. - 제 12항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 두께가 0.1 ㎜ 이상인 것인, 생물학적 시료의 면역조직화학염색 방법. - 삭제
- 제 12항에 있어서,
상기 (c)에서 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 조성물을, 상기 계면활성제의 미셀임계온도 내지 60℃의 온도에서 처리하는 것인, 생물학적 시료의 면역조직화학염색 방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180004121A KR102200618B1 (ko) | 2018-01-12 | 2018-01-12 | 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 생물학적 분자의 조직침투용 조성물 및 이의 용도 |
| PCT/KR2018/012369 WO2019078655A1 (ko) | 2017-10-19 | 2018-10-19 | 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 생물학적 분자의 조직침투용 조성물 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180004121A KR102200618B1 (ko) | 2018-01-12 | 2018-01-12 | 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 생물학적 분자의 조직침투용 조성물 및 이의 용도 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20190086068A KR20190086068A (ko) | 2019-07-22 |
| KR102200618B1 true KR102200618B1 (ko) | 2021-01-08 |
Family
ID=67468968
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020180004121A KR102200618B1 (ko) | 2017-10-19 | 2018-01-12 | 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 생물학적 분자의 조직침투용 조성물 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102200618B1 (ko) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011132234A (ja) | 2003-10-23 | 2011-07-07 | Novartis Vaccines & Diagnostics Inc | 安定化組成物 |
| WO2014069519A1 (ja) | 2012-10-30 | 2014-05-08 | 学校法人金沢医科大学 | 透明化生物標本作製用キット及び透明化生物標本作製方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7186522B2 (en) | 2003-03-31 | 2007-03-06 | Cytyc Corporation | Papanicolau staining process |
| EP2883030B1 (en) * | 2012-08-09 | 2022-08-31 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for preparing biological specimens for microscopic analysis |
| KR20170119936A (ko) * | 2016-04-20 | 2017-10-30 | (주)로고스바이오시스템스 | 생체조직의 굴절률 균질화 조성물 |
-
2018
- 2018-01-12 KR KR1020180004121A patent/KR102200618B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011132234A (ja) | 2003-10-23 | 2011-07-07 | Novartis Vaccines & Diagnostics Inc | 安定化組成物 |
| WO2014069519A1 (ja) | 2012-10-30 | 2014-05-08 | 学校法人金沢医科大学 | 透明化生物標本作製用キット及び透明化生物標本作製方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20190086068A (ko) | 2019-07-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bird et al. | The tylenchid (Nematoda) egg shell: structure, composition and permeability | |
| Huxley et al. | Preferential staining of nucleic acid-containing structures for electron microscopy | |
| Heuser et al. | Filament organization revealed in platinum replicas of freeze-dried cytoskeletons. | |
| JP5843085B2 (ja) | バイオマーカーの収集のためのスマートヒドロゲル粒子 | |
| Bernhard et al. | Improved techniques for the preparation of ultrathin frozen sections | |
| CN110139922B (zh) | 用于澄清组织的组合物和方法 | |
| Harris et al. | Negative staining: A brief assessment of current technical benefits, limitations and future possibilities | |
| Lasser et al. | Biochemical and fine structure studies on the water-insoluble components of the calf lens | |
| CN110763661B (zh) | 处理液组合物、试剂盒和生物器官透明化同时进行免疫标记的方法 | |
| US11022528B2 (en) | Composition for biological tissue transparency and method for biological tissue transparency using same | |
| Hall et al. | The apical lamina of the sea urchin embryo: Major glycoproteins associated with the hyaline layer | |
| KR102296381B1 (ko) | 생체 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법 | |
| CN106211762B (zh) | 向带电基质中、在带电基质中和/或从带电基质中主动转运带电分子 | |
| JP2020513573A (ja) | 生体組織透明化用組成物及びそれを用いた生体組織の透明化方法 | |
| JP7053860B2 (ja) | スフェロイドを透明化するための組成物、これを使用するスフェロイドを透明化するための方法、およびこれを備えるキット | |
| KR102200618B1 (ko) | 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 생물학적 분자의 조직침투용 조성물 및 이의 용도 | |
| WO2019078655A1 (ko) | 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 포함하는 생물학적 분자의 조직침투용 조성물 및 이의 용도 | |
| KR102085373B1 (ko) | 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직 투명화 키트 및 이를 이용한 투명화 방법 | |
| EP0214909A1 (fr) | Moyens et procedes de transfert de proteines et/ou d'acides nucleiques sur une surface receptrice supportee | |
| US11391653B2 (en) | Composition for immunostaining cleared large tissues and method for immunostaining cleared large biological tissues | |
| KR20190043886A (ko) | 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 유효성분으로 포함하는 생물학적 시료의 면역화학염색용 조성물 및 이를 이용한 면역화학염색 방법 | |
| CN106596876B (zh) | 一种油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法 | |
| KR102477568B1 (ko) | 1 mm 이하 크기 생체 시료의 투명화 전처리 방법 및 이를 포함하는 생체 시료의 투명화 방법 | |
| Khurshid et al. | In situ mapping of biomineral skeletal proteins by molecular recognition imaging with antibody-functionalized AFM tips | |
| Vanický et al. | Formaldehyde–hardened albumin as a non-penetrating embedding matrix for frozen and vibratome sectioning |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| X091 | Application refused [patent] | ||
| AMND | Amendment | ||
| E90F | Notification of reason for final refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |