KR20190043886A - 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 유효성분으로 포함하는 생물학적 시료의 면역화학염색용 조성물 및 이를 이용한 면역화학염색 방법 - Google Patents
설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 유효성분으로 포함하는 생물학적 시료의 면역화학염색용 조성물 및 이를 이용한 면역화학염색 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 설포-베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 면역화학염색 방법 및 설포-베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 유효성분으로 포함하는 면역화학염색용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명에 따른 설포-베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 면역화학염색 방법은 (1) 생물학적 시료를 고정시키는 단계; (2) 상기 (1) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 고정 용액을 제거하는 단계;
(3) 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 상기 생물학적 시료에 처리하는 단계; (4) 상기 (3) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 제거하는 단계; (5) 상기 (4) 단계의 생물학적 시료를 항체와 반응시켜 면역염색하는 단계; (6) 상기 (5) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 반응하지 않은 항체를 제거하는 단계; 및 (7) 상기 면역염색이 완료된 생물학적 시료를 투명화하는 단계를 포함한다.
Description
본 발명은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 유효성분으로 포함하는 생물학적 시료의 면역화학염색용 조성물 및 이를 이용한 면역화학염색 방법에 관한 것이다.
전체 조직(whole-body tissue) 또는 생물학적 시료는 불투명하기 때문에 일반적인 광학현미경으로 관찰할 수 없다. 광학 이미징 기술을 이용해 조직을 관찰할 수 있는 방법인 공초점 현미경 또는 다광자 현미경은 광원이 조직이나 생물학적 시료를 통과할 수 있는 깊이인 수백 마이크로미터 수준의 정보만 얻을 수 있다. 그래서 대부분의 전체 조직이나 깊이가 있는 생물학적 시료를 이미징하는 방법은 전통적인 면역 염색방법을 사용하고 있다.
면역염색방법은 조직을 고정액으로 고정한 후, 파라핀 또는 폴리머로 포매한 후 수 마이크로미터 또는 나노미터 두께로 절편을 만들어 빛이나 전자파가 투과할 수 있도록 한 후, 광학 또는 전자현미경을 이용하여 전체 조직이나 생물학적 시료를 이미징 한다. 하지만, 이런 방법은 전체 조직 또는 두꺼운 조직의 정보를 얻으려고 할 때, 수십 마이크로 두께의 연속적인 절편을 제작해야 하고, 이를 일일이 현미경을 이용하여 이미징 한 후, 다시 재구성하는 일련의 과정을 필요로 한다.
이에 이러한 전통적인 방법의 한계를 극복하고자 최근 다양한 방법으로 조직 및 생물학적 시료를 투명화하는 방법이 개발되고 있다. 현재 개발되고 있는 조직 투명화 방법은 조직의 물리화학적 특성을 변형하여 이미징을 얻을 때 사용하는 빛이 흡수되고 산란, 굴절되는 현상을 억제하여 빛이 조직을 투과할 수 있게 하는 기술이다. 현재는 많은 기술이 개발 및 발전되어, 많은 연구자들이 전기영동 방법 기반, 수용액 및 유기 용매 기반의 여러 투명화 기법 등으로 대부분의 조직 및 장기 또는 생물학적 시료 관찰에 적용할 수 있게 되었고, 대부분의 조직 투명화 방법들은 모두 조직 또는 생물학적 시료 내에서 지질을 제거하고, 시료의 굴절 보상률을 보정하는 방법으로서, 이 과정 동안 단백질 변성 등에 의한 DNA, RNA, 단백질 등 생체 조직의 정보가 왜곡되거나 손실되지 않게 하였다.
한편, 전체 조직의 구조나 분포를 관찰할 수 있도록 돕는 항체, 고분자 등을 조직 또는 생물학적 시료에 염색하는 방법은 현재에도 여전히 개발 중에 있다. 입자는 자연적으로 스스로 불규칙적인 운동을 하고 사방으로 퍼지면서 다른 분자와 섞이는 확산을 통해 이동한다. 특히, 다양한 물질로 구성되어 있고 복잡한 구조로 되어 있는 생체 조직 내에서 항체나 고분자의 확산은 느리기 때문에 조직 전체로 침투하는 데 오랜 시간이 걸린다.
따라서 이러한 문제점을 해결하기 위해, 생체 조직이나 생물학적 시료를 고정하는 고정제를 소량 사용하거나 수화젤의 구조 간격을 넓게 하는 방법도 적용되고 있다. 고분자 확산을 빠르게 하기 위해서 조직을 다공성으로 만드는 방법도 제안된 바 있다. 그러나 이러한 방법은 주로 조직을 얼렸다 녹이는 과정을 반복하거나 탈수 및 재수화를 반복해야 하는 번거로움이 있다. 또 다른 방법으로 항체나 고분자 자체의 확산 속도를 빠르게 하기 위해서 고분자가 담긴 용액의 온도를 높이거나, 마이크로파를 이용하는 방법도 개발된 바 있고, 항체나 고분자의 고른 전달을 위해 혈관을 이용하는 방법도 개발된 바 있다. 또한 최근에는 유기 용매를 이용해 염색하는 방법과 회전하는 용액에서 전기장의 외력을 주는 방법, 고분자를 높은 농도로 사용해 농도 구배를 이용하는 방법, 원심력 등을 이용해 고분자에 압력을 주어 조직을 고속으로 투과하는 방법이 개발된 바 있다.
하지만, 전기장을 이용하는 방법은 60∼100V의 높은 전압 때문에 조직이 훼손이 될 수 있는데, 이는 조직이나 생물학적 시료 내의 구성물이 전하를 갖고 있어 전기장에 따라 움직이기 때문이다. 확률적 전기 수송방법 또한, 전기장의 외력과 함께 유체의 흐름을 주기 때문에 유체 속도에 따라서 조직의 손상이 발생할 수 있다. 원심력을 주어 고분자의 이동속도를 늘리는 방법은 조직의 안정성을 보장하지만, 한쪽 방향으로만 흐르는 단점이 있다. 고분자를 높은 농도로 주어서 농도 구배를 하는 방법은 반응 속도를 조절할 수 있는 장점이 있지만, 많은 양의 고분자를 사용해야하기 때문에 경제적으로 비효율적이다. 특히, 이와 같은 방법들은 특별한 사양의 기계 장치가 필요하다는 단점이 있다. 이와 달리 유기 용매를 이용한 방법은 특별한 장치가 필요 없고, 전기적 방법보다 높은 보존성을 보이지만, 한 조직으로 한 번의 염색밖에 할 수 없는 단점이 있다. 또한, 많은 유기용매들이 그 고유의 특성상 독성 또는 폭발성이 있기 때문에 실험자가 취급하기 어렵다는 문제점도 있다.
따라서 이러한 문제점을 해소하고 조직 또는 장기와 같은 생물학적 시료 전체에 대해 항체 또는 생체고분자를 신속하고 고르게 시료 내로 침투하여 분석 효율을 증진시킬 수 있는 새로운 면역화학염색 방법의 개발이 필요한 실정이다.
따라서 본 발명의 목적은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 생물학적 시료에 처리하는 단계를 포함하는, 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 면역화학 염색방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 유효성분으로 포함하는, 면역화학염색용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 생물학적 시료에 처리하는 단계를 포함하는, 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 면역화학 염색방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다.
<화학식 1>
상기 식에서, R은 탄소 원자수 8∼22개의 알킬기 또는 알케닐기이고, 상기 x는 0∼3의 정수이며, 상기 y는 2∼4의 정수이다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 계면활성제는 Dimethylethylammoniumpropane sulfonate; N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate; Sodium 3,3′-[(1,2-diphenylethene-1,2-diyl)bis(4,1-phenylene)]bis(oxy)bis(propane-1-sulfonate); 3-(4-Heptyl)phenyl-3-hydroxypropyl)dimethylammoniopropanesulfonate; 3-(Decyldimethylammonio)propanesulfonate; 3-[Dimethyl-(2-hydroxyethyl)ammonio]-1-propanesulfonate; 3-(1-Methylpiperidinio)-1-propanesulfonate; 3-(Triphenylphosphonio)propane-1-sulfonate; 3-(Di-tert-butylphosphonium)propane sulfonate; 3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate; 3-[N,N-Dimethyl(3-myristoylaminopropyl)ammonio]propanesulfonate; 3-(N,N-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate; 3-(N,N-Dimethyloctadecylammonio)propanesulfonate; 3-([3-Cholamidopropyl]dimethylammonio)-2-hydroxy-1-propanesulfonate; 및 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 각 계면활성제가 고유의 값으로 갖고 있는 미셀임계농도 이상의 농도로 4시간 ~ 200시간 동안 생물학적 시료에 처리하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 상기 각 계면활성제의 미셀임계온도 내지 60℃ 이내의 온도에서 처리하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 10 ~ 500 rpm의 속도를 갖는 롤링바틀(rolling bottle) 인큐베이터, 10 ~ 500 rpm의 속도를 갖는 진탕기(shaker) 또는 10 ~ 500 rpm 속도와 30°~ 45°의 기울기를 갖는 락커(rocker)를 이용하여 생물학적 시료에 처리하는 것일 수 있다.
또한 본 발명은, 본 발명은 설포-베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 면역화학염색 방법 및 설포-베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 유효성분으로 포함하는 면역화학염색용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명에 따른 설포-베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 면역화학염색 방법은 (1) 생물학적 시료를 고정시키는 단계; (2) 상기 (1) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 고정 용액을 제거하는 단계; (3) 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 상기 생물학적 시료에 처리하는 단계; (4) 상기 (3) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 제거하는 단계; (5) 상기 (4) 단계의 생물학적 시료를 항체와 반응시켜 면역염색하는 단계; (6) 상기 (5) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 반응하지 않은 항체를 제거하는 단계; 및 (7) 상기 면역염색이 완료된 생물학적 시료를 투명화하는 단계를 포함하는, 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 면역화학 염색방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 분석하고자 하는 개체 유래의 세포 또는 조직일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 Dimethylethylammoniumpropane sulfonate; N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate; Sodium 3,3′-[(1,2-diphenylethene-1,2-diyl)bis(4,1-phenylene)]bis(oxy)bis(propane-1-sulfonate); 3-(4-Heptyl)phenyl-3-hydroxypropyl)dimethylammoniopropanesulfonate; 3-(Decyldimethylammonio)propanesulfonate; 3-[Dimethyl-(2-hydroxyethyl)ammonio]-1-propanesulfonate; 3-(1-Methylpiperidinio)-1-propanesulfonate; 3-(Triphenylphosphonio)propane-1-sulfonate; 3-(Di-tert-butylphosphonium)propane sulfonate; 3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate; 3-[N,N-Dimethyl(3-myristoylaminopropyl)ammonio]propanesulfonate; 3-(N,N-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate; 3-(N,N-Dimethyloctadecylammonio)propanesulfonate; 3-([3-Cholamidopropyl]dimethylammonio)-2-hydroxy-1-propanesulfonate; 및 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (3) 단계에서의 처리는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 증류수 또는 PBS(phosphate-buffered saline)를 함유하는 용액에 각 계면활성제가 갖는 고유 미셀임계농도 이상의 농도로 용해시킨 용액으로 4시간 ~ 200시간 동안 생물학적 시료에 처리하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 처리는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제가 갖는 미셀임계온도 내지 60℃의 온도에서 처리하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 10 ~ 500 rpm의 속도를 갖는 롤링바틀(rolling bottle) 인큐베이터, 10 ~ 500 rpm의 속도를 갖는 진탕기(shaker) 또는 10 ~ 500 rpm 속도와 30°~ 45°의 기울기를 갖는 락커(rocker)를 이용하여 생물학적 시료에 처리하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (4) 단계에서 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 제거는 상기 계면활성제가 처리된 생물학적 시료를 증류수 또는 PBS(phosphate-buffered saline)를 함유한 용액에 첨가하여, 상기 시료에 존재하는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 농도를 미셀임계농도 이하로 낮추는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 제거는 교반기 상에서 30°~ 45°의 기울기 및 10rpm ~ 500rpm의 속도를 갖는 기울기 이동(tilt movement) 이나 용액의 이동을 수행하여 제거하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (7) 단계의 투명화하는 단계는 투명화 용액에 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 각 계면활성제가 갖는 고유 값의 미셀임계농도 이상의 농도로 첨가하여 수행하며, 상기 투명화하는 단계는 상기 (4)단계 후 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
나아가 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 유효성분으로 포함하는, 면역화학염색용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 Dimethylethylammoniumpropane sulfonate; N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate; Sodium 3,3′-[(1,2-diphenylethene-1,2-diyl)bis(4,1-phenylene)]bis(oxy)bis(propane-1-sulfonate); 3-(4-Heptyl)phenyl-3-hydroxypropyl)dimethylammoniopropanesulfonate; 3-(Decyldimethylammonio)propanesulfonate; 3-[Dimethyl-(2-hydroxyethyl)ammonio]-1-propanesulfonate; 3-(1-Methylpiperidinio)-1-propanesulfonate; 3-(Triphenylphosphonio)propane-1-sulfonate; 3-(Di-tert-butylphosphonium)propane sulfonate; 3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate; 3-[N,N-Dimethyl(3-myristoylaminopropyl)ammonio]propanesulfonate; 3-(N,N-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate; 3-(N,N-Dimethyloctadecylammonio)propanesulfonate; 3-([3-Cholamidopropyl]dimethylammonio)-2-hydroxy-1-propanesulfonate; 및 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명은 생물학적 시료의 면역화학염색 효율을 증진시킬 수 있는 방법으로, 설포-베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 생물학적 시료의 면역화학염색 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의하면 설포-베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 사용으로 인해 생물학적 시료에 함유된 막관통단백질만을 선택적으로 제거할 수 있어, 면역염색을 위한 항체나 생체고분자가 분석 시료에 효과적으로 빠르게 침투시킬 수 있고, 시료를 손상없이 안전하게 보존할 수 있으며, 두꺼운 두께를 갖는 시료까지도 염색이 가능하므로, 종래 면역염색화학 방법에 비해 면역염색 분석 효율을 향상시킬 수 있으며, 분석 시간도 단축할 수 있다.
도 1은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 처리하여 생체조직이나 생물학적 시료를 면역화학염색하는 방법에 관한 순서도이다.
도 2는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 전처리 과정을 포함한 면역화학염색법으로 뇌조직 절편(100μm 두께)에 수행하였을 때, 더 많은 항체가 투과됨을 보여주는 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 인산염완충용액, 이온성 계면 활성제, 쯔비터이온성 계면활성제를 각각 뇌조직에 처리한 후, 시간에 따른 조직변형 여부를 관찰한 사진으로서, 쯔비터이온성 계면활성제를 처리한 경우 생체조직이 변형 없이 그대로 보존될 수 있음을 나타낸 결과이다.
도 4는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 뇌조직 절편에 처리 시, 미셀임계농도 이상일 경우, 고농도에서도 생체조직이 그대로 보존되고 변형이 일어나지 않음을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 종류별로 처리하고 뇌조직 절편을 염색한 군에 대해, 공통적으로 항체나 생체고분자 물질이 조직 내로 잘 투과되고 있음을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 전처리 과정을 포함한 면역화학염색법으로 전체 뇌조직에 반응시켰을 때, 심부 뇌 (deep brain)까지 항체가 투과됨을 보여주는 결과이다.
도 2는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 전처리 과정을 포함한 면역화학염색법으로 뇌조직 절편(100μm 두께)에 수행하였을 때, 더 많은 항체가 투과됨을 보여주는 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 인산염완충용액, 이온성 계면 활성제, 쯔비터이온성 계면활성제를 각각 뇌조직에 처리한 후, 시간에 따른 조직변형 여부를 관찰한 사진으로서, 쯔비터이온성 계면활성제를 처리한 경우 생체조직이 변형 없이 그대로 보존될 수 있음을 나타낸 결과이다.
도 4는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 뇌조직 절편에 처리 시, 미셀임계농도 이상일 경우, 고농도에서도 생체조직이 그대로 보존되고 변형이 일어나지 않음을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 종류별로 처리하고 뇌조직 절편을 염색한 군에 대해, 공통적으로 항체나 생체고분자 물질이 조직 내로 잘 투과되고 있음을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 전처리 과정을 포함한 면역화학염색법으로 전체 뇌조직에 반응시켰을 때, 심부 뇌 (deep brain)까지 항체가 투과됨을 보여주는 결과이다.
본 발명은 생물학적 시료 전체에 대해 항체 또는 생체고분자를 신속하고 고르게 시료 내로 침투하여 분석 효율을 증진시킬 수 있는 새로운 면역화학염색 방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 생물학적 시료에 처리하는 단계를 포함하는, 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 면역화학 염색방법을 제공함에 특징이 있다.
특히 본 발명에서 면역화학 염색을 위해 사용한 유효성분인 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 생물학적 시료에 존재하는 막관통단백질을 선택적으로 제거할 수 있으며, 반면 단백질-단백질 결합은 제거하지 못하고, 지질간 또는 지질-단백질간의 결합을 약화시켜, 조직내에 세포막에 존재하는 막관통단백질만을 제거할 수 있다. 따라서 분석하고자 하는 조직 내의 항원성은 그대로 유지하면서 막 단백질이나 지질의 변화로 인한 조직의 변형 또는 물러짐이 발생하지 않도록 할 수 있다.
그러므로 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 사용으로 인해 분석 시료는 변형없이 형태를 그대로 보존할 수 있으며, 분석을 위해 처리하는 물질, 예컨대 항체 또는 고분자들이 제거된 막관통단백질의 통로로 두꺼운 조직까지 빠르게 침투할 수 있도록 하여, 면역화학염색 분석능의 효율을 월등히 증진시킬 수 있고, 분석 시간 또한 효과적으로 단축시킬 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 사용할 수 있다.
<화학식 1>
상기 식에서, R은 탄소 원자수 8∼22개의 알킬기 또는 알케닐기이고, 상기 x는 0∼3의 정수이며, 상기 y는 2∼4의 정수이다.
구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제로서 3-(N,N-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate; N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate; 3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate; 3-(N,N-Dimethyloctadecylammonio)propanesulfonate; 및 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate을 사용하였다.
바람직하게 본 발명에 따른 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 생물학적 시료의 면역화학 염색방법은, (1) 생물학적 시료를 고정시키는 단계; (2) 상기 (1) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 고정 용액을 제거하는 단계; (3) 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 상기 생물학적 시료에 처리하는 단계; (4) 상기 (3) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 제거하는 단계; (5) 상기 (4) 단계의 생물학적 시료를 항체와 반응시켜 면역염색하는 단계; (6) 상기 (5) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 반응하지 않은 항체를 제거하는 단계; 및 (7) 상기 면역염색이 완료된 생물학적 시료를 투명화하는 단계를 포함하는, 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 면역화학 염색방법을 제공한다. 상기와 같은 본 발명의 방법에 대한 모식도는 도 1에 나타내었다.
상기 방법을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
먼저 분석하고자 하는 생물학적 시료를 고정시킨다.
생물학적 시료의 고정은 분석하고자 하는 개체 유래의 조직 또는 세포를 알데하이드계 화합물이 함유된 용액에 침지하여 고정시킬 수 있으며, 상기 알데하이드계 화합물로는 이에 제한되지는 않으나, 파라포름알데히드 또는 글루타알데히드를 사용할 수 있다.
또한 상기 시료의 고정은 알데하이드계 화합물이 함유된 용액에 시료를 담근 후, 4℃ ~ 10℃의 온도에서 4시간 ~ 12시간 동안 고정시켜, 상기 시료에 존재하는 항원이 파괴 또는 유출되지 않게 보전하도록 한다. 이후 PBS(phosphate-buffered saline) 용액에 4시간 ~ 12시간 동안 넣어두어 고정 과정에 사용되지 않은 알데하이드계 화합물을 생물학적 시료로부터 제거한다.
한편, 고정과정을 거친 생물학적 시료는 시료 내에 지질로 이루어진 복잡한 구조의 존재로 인해 분석시료 또는 염색시료의 침투가 어렵다. 그러나 시료 내에 존재하는 지질을 모두 제거하기 되면 생물학적 시료의 단백질이 손상되거나 조직의 형태가 변형될 수 있어 분석 진행이 어렵다는 문제가 있다.
이에 본 발명에서는 생물학적 시료에 존재하는 지질과 지질간의 결합 또는 지질-단백질간의 결합을 약화시켜 분석시료 또는 염색시료의 침투가 용이하도록 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 처리하는 기술을 고안하였다.
따라서 생물학적 시료의 고정 단계가 완료되면, 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 상기 생물학적 시료에 처리하는 과정을 수행한다.
본 발명에 따른 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 처리는, 증류수 또는 PBS(phosphate-buffered saline) 용액에 사용하고자 하는 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 미셀임계농도 이상으로 첨가한 용액을 사용할 수 있다.
설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 미셀임계농도 이상으로 사용하는 이유는, 미셀임계농도 미만으로 사용하게 되면 계면활성제에 의해 미셀이 형성되고 표면 장력이 저하되는 문제점이 발생할 수 있기 때문에 염색시료의 효과적인 침투를 위해서는 미셀임계농도 이상으로 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 첨가하여 사용하는 것이 바람직하다.
더욱 바람직하게는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제가 고유의 값으로 갖고 있는 미셀임계농도 내지 50%(w/v)의 농도로 사용하는 것이 좋다.
이때, 50%(w/v)의 농도를 초과하여 사용하게 되면, 생물학적 시료 내의 항원성이 보존되지 않으며, 시료의 조직이 물러서 분석이 어려운 문제점이 있다.
또한, 생물학적 시료에 더욱 효과적으로 설포베타인계 쯔비터 이온성 계면활성제를 처리하기 위해, 각 계면활성제가 고유값으로 갖고 있는 미셀임계온도 이상에서 반응시키는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 미셀임계온도인 10℃에서 60℃의 온도 사이에서 반응시키는 것이 좋으며, 더욱더 바람직하게는, 10℃에서 42℃의 온도에서 반응시키는 것이 좋다.
이때 60℃의 온도를 초과하여 반응시키게 되면, 단백질의 변성이 발생할 수 있는 문제점이 있으므로 앞서 기술된 온도 범위 내에서 반응시키는 것이 좋다.
또한, 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제가 함유된 용액의 생물학적 시료에 대한 처리는 4시간 ~ 200시간 동안 처리할 수 있다.
4시간 미만으로 처리하게 되면, 상기 계면활성제가 생물학적 시료에 존재하는 지질을 제대로 제거하지 못하는 문제점이 생기며, 반면 200시간을 초과하여 처리하게 되면 상기 생물학적 시료의 형태가 변형될 수 있는 문제점이 생길 수 있다. 따라서 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 생물학적 시료에 대한 처리는 크기에 따라 다르며 4시간~ 200시간 동안, 더 바람직하게는 8시간 동안 처리할 수 있다.
뿐만아니라, 생물학적 시료에 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 처리할 때, 0 ~ 500 rpm의 속도를 갖는 롤링바틀 인큐베이터 (rolling bottle incubator), 같은 속도를 갖는 진탕기 배양기(shaker incubator), 같은 속도와 30°~ 45°의 기울기 이동을 갖는 rocker 등의 교반기를 사용한다. 이런 방법은 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제가 생물학적 시료 내에 존재하는 막관통단백질을 선택적으로 제거할 때, 각 계면활성제가 갖고 있는 미셀 임계농도와 온도의 분포가 반응하는 용액 안에서 균일하게 하는 효과를 갖는다.
다음으로, 생물학적 시료를 세척하고 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 제거하는 단계를 수행한다. 상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 제거는 상기 계면활성제가 처리된 생물학적 시료로부터 상기 계면활성제의 농도를 감소 또는 제거하는 것을 의미하는 것으로, 상기 계면활성제가 처리된 생물학적 시료를 증류수 또는 PBS(phosphate-buffered saline) 버퍼에 첨가하여 시료에 존재하는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 농도를 미셀임계농도 이하로 낮추도록 하였다.
또한, 상기 계면활성제의 효과적인 제거를 위해 교반기 상에서 30°~ 45°의 기울기 및 10 ~ 500rpm의 속도로 기울기 이동(tilt movement)방법을 통해 생물학적 시료에 처리된 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 임계미설농도 이하로 낮춰 상기 계면활성제의 활성 또는 작용을 정지시킨다.
다음 과정으로, 생물학적 시료를 항체와 반응시켜 면역염색한다.
앞서 기술된 바와 같이 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제로 전처리를 완료한 생물학적 시료에 분석하고자 하는 성분(항원 또는 물질 등)에 특이적인 항체 또는 염색시료를 첨가하여 반응을 통한 면역화학염색을 수행한다.
상기 생물학적 시료에 항체를 처리하는 경우, 상기 생물학적 시료에 존재하는 항원 특이적인 항체를 첨가할 수 있고, 용이한 검출을 위해 형광물질 등이 결합한 항체를 사용할 수도 있다.
또한, 이때 상기 항체를 희석하여 사용할 수 있는데, 항체 희석을 위한 용매로는 이에 제한되지는 않으나, 인산염, 붕산나트륨 및 소혈청 알부민이 함유된 완충용액을 사용할 수 있다. 또한 상기 항체 희석용 완충용액에 추가적으로 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 미셀임계농도 이상의 농도로 첨가하여 사용할 수 있다.
다음 단계로, 상기 면역염색이 완료된 생물학적 시료를 투명화시킨다.
상기 투명화 과정은 염색된 생물학적 시료를 관찰 가능하도록, 조직 깊이를 확보하기 위한 과정으로, 상기 면역화학염색이 완료된 생물학적 시료를 BABB, 3DISCO 등을 포함하는 용매 기반의 투명화 과정을 수행할 수 있고, 또는 SeeDB, ClearT 등을 포함하는 용액에 조직을 넣는 단순 방법을 통한 투명화 과정을 수행할 수 있으며, 또 다른 방법으로 Scale 또는 CUBIC 등을 포함하는 과수화 투명화 방법을 수행할 수 있고, 또는 CLARITY이나 PACT 등을 포함하는 하이드로겔 임베딩 기반의 투명화 방법 등을 사용할 수 있다. 또한 상기 투명화 과정에 사용되는 완충용액에 추가적으로 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 상기 계면활성제의 미셀임계농도 이상의 농도로 첨가하여 사용할 수 있다.
또한 상기 본 발명에 따른 투명화 단계는 생물학적 시료를 항체와 반응시켜 면역염색하는 과정 이전에 수행할 수도 있다.
나아가 본 발명은 상기 본 발명의 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 유효성분으로 포함하는, 면역화학염색용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 조성물에는 본 발명의 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제 이외에도 생물학적 시료의 보전성 또는 염색시료 침투성 증진을 위한 별도의 첨가제를 더 포함할 수 있다.
이상, 본 발명에서 제공하는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 생물학적 시료의 면역화학 염색방법은, 생물학적 시료 내에 존재하는 막관통단백질을 선택적으로 제거할 수 있어 면역화학염색 시, 항체 또는 고분자 물질 등과 같은 분석시약이 상기 생물학적 시료 내로 빠르게 물리적 확산이 될 수 있도록 하여, 신속하게 시료 염색이 가능하며 두꺼운 두께의 시료도 면역화학염색이 가능하다.
특히 70um 이상의 두께의 시료 분석도 가능할 뿐만 아니라 수 mm 이상의 두께를 갖는 시료의 분석도 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 면역화학 염색방법은 생물학적 시료에 존재하는 항원성을 그대로 유지할 수 있으며, 상기 시료가 물러지는 변형을 발생시키지 않을 뿐만 아니라 안정하고 오랫동안 생물학적 시료를 보존하는 효과가 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1>
설포베타인계
쯔비터이온성
계면활성제인 SB3-14 (3-(
N
,
N
-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate)을 이용한
뇌절편
조직의 염색
생쥐의 뇌(8.2 mm x 12.5 mm x 6.0 mm, mouse brain (P1), 한국뇌연구원)를 4% 파라포름알데하이드 용액에 12시간 동안 4℃에서 넣어둔다. 그리고 고정화된 뇌를 PBS (phosphate-buffered saline pH7.4, Thermo Fisher Scientific, USA) 용액에 12시간 동안 넣어 파라포름알데히드를 세척한다. 고정화된 뇌는 30% sucrose (sucrose, Sigma Aldrich, USA) in PBS 용액에 넣어 가라앉을 때까지 넣어둔다. 가라앉은 뇌는 얼린 후에 100um 두께로 자른다. 100um 의 뇌조직 절편은 하기 화학식으로 표시되는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제중 하나인 SB3-14 (3-(N,N-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate, Sigma Aldrich, USA)를 4%의 농도로 PBS 용액에 첨가하고 4시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 이후 PBS 용액에 12시간 동안 담가두어 세척한다. 1차 항체인 Pan Neuronal Marker (0.5mg/mL,EMD Millipore, USA)를 8시간 동안 반응시키고 이어 2차 항체인 Alexa flour 594 (0.5mg/mL, Molecular probes, USA)를 2시간 동안 반응시켜 확산방법을 통해 면역화학 염색을 수행하였다. 각 면역화학염색동안, 항체와 Blocking solution 용액과 1:300 으로 혼합하였다. Blocking solution 용액은 PBS용액에 10% BSA (Bovine Serum Albumins, Sigma Aldrich, USA), 0.2% Triton X-100 (Triton X-100, Sigma Aldrich, USA), 0.001% Sodium azide (Sodium azide, Sigma Aldrich, USA)로 조성되었다. 면역 염색 후에는 염색시간과 동일하게 PBS 용액에 넣어두어 반응하지 않은 항체를 제거하였다. 이후 공초점 현미경(A1, Nikon, Japan)을 이용해 10μm 단위로 염색된 뇌조직 절편을 관찰하였다.
<화학식>
<
비교예
1>
상기 실시예 1에서 SB3-14를 첨가하지 않은 것으로 제외하고는, 동일한 방법으로 면역화학 염색을 수행하였다.
<비교예 2>
상기 실시예 1에서 SB3-14 대신 유이온 계면활성제인 4% 도데실 황산 나트륨 (Sodium Dodecyl Sulfate, Sigma Aldrich, USA)를 처리한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 분석하였다.
<실험예 1>
설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 면역화학염색 분석결과
상기 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 방법으로 염색된 생쥐의 뇌조직 절편을 현미경으로 관찰한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1와 비교예 2의 경우 면역 염색 신호의 강도가 비교예 1에 비해 더 우수한 발색을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 유의한 신호 강도를 보이는 조직의 깊이 또한, 비교예 1은 30μm, 실시예 1은 70μm 이상임을 알 수 있었고, 뇌조직 절편의 깊이를 Z축 기준으로 볼 때, 실시예 1은 비교예들에 비해 염색된 깊이와 효과가 더 우수하다는 것을 알 수 있었다(도 5 참조).
<실시예 2>
설포베타인계
쯔비터이온성
계면활성제인 SB3-14 (3-(
N
,
N
-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate) 처리 시간별 뇌조직 염색수행
100μm 두께의 생쥐 뇌 조직 절편을 SB3-14를 4% 농도로 하여 37℃의 온도에서 처리하였고, 이때 SB3-14 처리 후, 시간별(1시간, 2시간, 4시간, 8시간) 뇌조직 절편을 실체 현미경 (SMZ745T, Nikon, Japan)을 이용해 관찰하였다. 계면활성제 처리를 통한 뇌조직 염색법은 상기 실시예 1과 동일하게 수행하되, 처리 시간만을 달리하여 관찰하였다. 또한 분석과정에서 동일한 조직을 시간에 따라서 관찰하기 때문에, 시간에 따른 관찰 광학적 특성이 다를 수 있음을 고려하여 비교를 위해 2.5mm × 2.5mm의 모눈종이 바탕 위에서 관찰하였다.
<비교예 3>
상기 실시예 2에서 SB3-14를 첨가하지 않은 것으로 제외하고는, 동일한 방법으로 면역화학 염색을 수행하였다.
<비교예 4>
상기 실시예 2에서 SB3-14 대신 유이온 계면활성제인 4% 도데실 황산 나트륨 (Sodium Dodecyl Sulfate, Sigma Aldrich, USA)를 처리한 점을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 분석하였다.
<실험예 2>
설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제 처리 시간에 따른 면역화학염색 분석결과
상기 실시예 2, 비교예 3 및 비교예 4의 방법으로 염색된 뇌조직 절편을 분석하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 계면활성제 처리 시간이 경과할수록 실시예 2의 조직 또는 생체시료의 안전성이 다른 비교예들에 비해 우수한 것으로 나타났다. 또한, 투과되어 확인되는 눈금도 계면활성제 처리 시간이 경과되어도 눈금이 변형되지 않고 있다는 것을 볼 때, 분석하고자 하는 조직의 표면이나 두께에 거의 변화가 없다는 것을 알 수 있었다. 반면, 유이온 계면활성제인 SDS를 처리한 군(비교예 4)의 경우, 점점 조직의 크기가 커지는 것으로 나타났고, 시간이 지날수록 눈금이 왜곡되어 보이는 것으로 나타나, 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제가 아닌 다른 계면활성제를 사용할 경우, 조직의 표면과 두께에 변화를 초래하는 문제점이 생길 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 3>
설포베타인계
쯔비터이온성
계면활성제인 SB3-14 (3-(
N
,
N
-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate)의 처리 농도별 뇌조직 염색수행
100μm 뇌조직 절편을 SB3-14를 4시간 동안 37℃에서 처리하여 면역화학염색을 수행하였는데, 이때 상기 SB3-14 계면활성제를 각각 10%, 20% 및 50% 농도로 하여 뇌조직 절편을 염색한 후, 실체 현미경 (SMZ745T, Nikon, Japan)을 이용해 관찰하였다.
분석 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 미셀임계농도를 초과하여 고농도(50%)로 처리하더라도 조직의 표면이나 투과성에 거의 변화가 없음을 알 수 있었다. 또한, 앞서 도 3과 마찬가지로 시간이 지난 후에도 눈금이 변형되지 않고, 눈금에 따른 조직의 크기 또한 변형되지 않음을 알 수 있었다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 설포베타인계 쯔위터이온성 계면활성제를 조직 염색을 위한 과정에서 사용하였을 때, 생체 조직이나 생물학적 시료에 변화를 유발시키지 않고 항원성을 잘 보존할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 4>
다양한 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 뇌조직 염색 수행
100μm 두께를 가진 생쥐 뇌조직 절편을 다양한 설포베타인계 쯔위터이온성 계면활성제를 이용하여 4% 농도로 37℃에서 4시간 처리하여 면역화학염색을 수행하였다. 이때 사용한 설포베타인계 쯔위터이온성 계면활성제는 SB3-12 (N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, Sigma aldrich, USA), SB3-16 (3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate, Sigma aldrich, USA), SB3-18 (3-(N,N-Dimethyloctadecylammonio)propanesulfonate, Sigma aldrich, USA), CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, Sigma aldrich, USA)을 사용하였다. 상기 계면활성제들을 각각 처리하여 반응이 완료된 후, 세척하고 1차 항체 Pan Neuronal Marker (0.5mg/mL,EMD Millipore, USA)를 8시간 동안 처리하여 반응시킨 다음, 2차 항체 Alexa flour 594 (0.5mg/mL, Molecular probes, USA)를 2시간 동안 처리하고 확산 방법을 통해 면역화학 염색을 수행하였다. 이후 공초점 현미경(A1, Nikon, Japan)을 이용해 10μm 단위로 측정하였다.
분석 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 실험에서 사용한 설포베타인계 쯔위터이온성 계면활성제 처리군은 염색의 강도가 우수한 발색을 나타내는 것으로 나타났다. 또한, 유의한 신호의 강도가 보이는 조직의 깊이 또한, 70μm 이상이 됨을 알 수 있었다.
<실시예 5>
설포베타인계
쯔비터이온성
계면활성제인 SB3-14 (3-(
N
,
N
-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate)을 이용한 뇌조직의 염색
생쥐의 뇌(8.2 mm x 12.5 mm x 6.0 mm, mouse brain (P1), 한국뇌연구원)를 4% 파라포름알데하이드에 12시간 동안 4℃에서 넣어둔다. 그리고 고정화된 뇌를 PBS 용액 에 12시간 동안 상온에 넣어 파라포름알데히드를 세척한다. 고정화 과정을 한 뇌조직은 이전의 실시예 1에서 사용했던 SB3-14 (3-(N,N-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate, Sigma Aldrich, USA)를 4%의 농도를 갖는 PBS 용액에 넣어 12시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 이 때, 100rpm의 속도와 37℃ 온도를 갖는 롤링바틀(rolling bottle) 인큐베이터에 넣어 뇌조직에 설포베타인계 쯔비터 이온성 계면활성제를 처리하였다. 이후 상기 뇌조직을 PBS 용액에 12시간 동안 담가두어 세척한다. 세척할 때, 30°의 기울기와 100 rpm의 속도의 기울기 운동을 갖는 락커(rocker)를 이용하였고, 상기 락커위에 올려놓고 세척을 수행하였다. 이후 뇌조직에 대해 면역항체 염색 반응을 시키기 위해, Alexa Fluor 488이 결합되어 있는 Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody (0.5mg/mL, abcam, USA)를 8시간 동안 자연 확산방법을 통해 면역화학 염색을 수행하였다. 항체는 실시예 1에서 사용한 blocking solution 용액과 1:200 으로 혼합하여 사용하였다. 면역 염색 후에는 염색시간과 동일하게 PBS 용액에 넣어두어 반응하지 않은 항체를 제거하였다. 면역화학염색 반응과 세척은 100 rpm 및 37℃의 온도를 갖는 진탕 배양기에 넣어 처리하였다. 면역염색화학반응이 끝난 뇌조직은 투명화 처리를 하였으며, 투명화는 과수화 투명화 방법을 사용했으며, 50% 수크로스와 25% 우레아를 포함한 PBS 용액에 상온에서 24시간 동안 뇌조직을 넣어두었으며, 뇌조직을 투명화 용액에 넣은 후, 30°의 기울기와 100 rpm 속도의 기울기 운동을 갖는 락커(rocker)를 이용하여 수행하였다.
이후 빛 시트 현미경(UltraMicroscopeⅡ, LaVision BioTec, German)을 이용해 관찰하였다. 본 결과를 통해 면역염색화학반응에 사용된 Tyrosine Hydroxylase 항체는 뇌조직 표면으로부터 수 mm 떨어진 심부뇌에 존재하는 도파민성 신경세포까지 염색할 수 있음을 알 수 있었다(도 6 참조).
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 생물학적 시료의 효과적인 면역화학염색을 위해 설포베타인계 쯔위터이온성 계면활성제를 이용할 경우, 분석대상의 생체시료 또는 전체조직을 안정적으로 유지할 수 있는 효과를 얻을 수 있는 동시에, 염색시료를 빠르고 골고루 시료에 침투하게 할 수 있으므로 면역화학염색 효율을 증진시킬 수 있는 효과가 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (17)
- 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 생물학적 시료에 처리하는 단계를 포함하는, 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 면역화학 염색방법.
- 제1항에 있어서,
상기는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 하기 화학식 1로 표시되는 것임을 특징으로 하는 방법;
<화학식 1>
상기 식에서, R은 탄소 원자수 8∼22개의 알킬기 또는 알케닐기이고, 상기 x는 0∼3의 정수이며, 상기 y는 2∼4의 정수이다. - 제2항에 있어서,
상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 Dimethylethylammoniumpropane sulfonate; N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate; Sodium 3,3′-[(1,2-diphenylethene-1,2-diyl)bis(4,1-phenylene)]bis(oxy)bis(propane-1-sulfonate); 3-(4-Heptyl)phenyl-3-hydroxypropyl)dimethylammoniopropanesulfonate; 3-(Decyldimethylammonio)propanesulfonate; 3-[Dimethyl-(2-hydroxyethyl)ammonio]-1-propanesulfonate; 3-(1-Methylpiperidinio)-1-propanesulfonate; 3-(Triphenylphosphonio)propane-1-sulfonate; 3-(Di-tert-butylphosphonium)propane sulfonate; 3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate; 3-[N,N-Dimethyl(3-myristoylaminopropyl)ammonio]propanesulfonate; 3-(N,N-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate; 3-(N,N-Dimethyloctadecylammonio)propanesulfonate; 3-([3-Cholamidopropyl]dimethylammonio)-2-hydroxy-1-propanesulfonate; 및 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 각 계면활성제가 고유의 값으로 갖고 있는 미셀임계농도 이상의 농도로 4시간~ 200시간 동안 생물학적 시료에 처리하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제4항에 있어서,
상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 상기 계면활성제의 미셀임계온도 내지 60℃의 온도에서 처리하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제4항에 있어서,
상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 10 ~ 500 rpm의 속도를 갖는 롤링바틀(rolling bottle) 인큐베이터, 10 ~ 500 rpm의 속도를 갖는 진탕기(shaker) 또는 10 ~ 500 rpm 속도와 30°~ 45°의 기울기를 갖는 락커(rocker)를 이용하여 생물학적 시료에 처리하는 것을 특징으로 하는 방법. - (1) 생물학적 시료를 고정시키는 단계;
(2) 상기 (1) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 고정 용액을 제거하는 단계;
(3) 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 상기 생물학적 시료에 처리하는 단계;
(4) 상기 (3) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 제거하는 단계;
(5) 상기 (4) 단계의 생물학적 시료를 항체와 반응시켜 면역염색하는 단계;
(6) 상기 (5) 단계의 생물학적 시료를 세척하고 반응하지 않은 항체를 제거하는 단계; 및
(7) 상기 면역염색이 완료된 생물학적 시료를 투명화하는 단계를 포함하는,
설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 이용한 면역화학 염색방법. - 제7항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 분석하고자 하는 개체 유래의 세포 또는 조직인 것을 특징으로 하는 방법. - 제7항에 있어서,
상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 Dimethylethylammoniumpropane sulfonate; N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate; Sodium 3,3′-[(1,2-diphenylethene-1,2-diyl)bis(4,1-phenylene)]bis(oxy)bis(propane-1-sulfonate); 3-(4-Heptyl)phenyl-3-hydroxypropyl)dimethylammoniopropanesulfonate; 3-(Decyldimethylammonio)propanesulfonate; 3-[Dimethyl-(2-hydroxyethyl)ammonio]-1-propanesulfonate; 3-(1-Methylpiperidinio)-1-propanesulfonate; 3-(Triphenylphosphonio)propane-1-sulfonate; 3-(Di-tert-butylphosphonium)propane sulfonate; 3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate; 3-[N,N-Dimethyl(3-myristoylaminopropyl)ammonio]propanesulfonate; 3-(N,N-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate; 3-(N,N-Dimethyloctadecylammonio)propanesulfonate; 3-([3-Cholamidopropyl]dimethylammonio)-2-hydroxy-1-propanesulfonate; 및 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법. - 제7항에 있어서,
상기 (3) 단계에서의 처리는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 증류수 또는 PBS(phosphate-buffered saline)를 함유하는 용액에 각 계면활성제가 갖는 고유 미셀임계농도 이상의 농도로 용해시킨 용액으로 4시간 ~ 200시간 동안 생물학적 시료에 처리하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제10항에 있어서,
상기 처리는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 미셀임계온도 내지 60℃의 온도에서 처리하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제10항에 있어서,
상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 10 ~ 500 rpm의 속도를 갖는 롤링바틀(rolling bottle) 인큐베이터, 10 ~ 500 rpm의 속도를 갖는 진탕기(shaker) 또는 10 ~ 500 rpm 속도와 30°~ 45°의 기울기를 갖는 락커(rocker)를 이용하여 생물학적 시료에 처리하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제7항에 있어서,
상기 (4) 단계에서 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 제거는 상기 계면활성제가 처리된 생물학적 시료를 증류수 또는 PBS(phosphate-buffered saline)를 함유한 용액에 첨가하여, 상기 시료에 존재하는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 농도를 미셀임계농도 이하로 낮추는 것을 특징으로 하는 방법. - 제13항에 있어서,
상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제의 제거는 교반기 상에서 30°~ 45°의 기울기 및 10rpm ~ 500rpm의 속도를 갖는 기울기 이동(tilt movement) 이나 용액의 이동을 수행하여 제거하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제7항에 있어서,
상기 (7) 단계의 투명화하는 단계는 투명화 용액에 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 각 계면활성제가 갖는 고유 값의 미셀임계농도 이상의 농도로 첨가하여 수행하며, 상기 투명화하는 단계는 상기 (4)단계 후 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 하기 화학식 1로 표시되는 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제를 유효성분으로 포함하는, 면역화학염색용 조성물;
<화학식 1>
상기 식에서, R은 탄소 원자수 8∼22개의 알킬기 또는 알케닐기이고, 상기 x는 0∼3의 정수이며, 상기 y는 2∼4의 정수이다. - 제16항에 있어서,
상기 설포베타인계 쯔비터이온성 계면활성제는 Dimethylethylammoniumpropane sulfonate; N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate; Sodium 3,3′-[(1,2-diphenylethene-1,2-diyl)bis(4,1-phenylene)]bis(oxy)bis(propane-1-sulfonate); 3-(4-Heptyl)phenyl-3-hydroxypropyl)dimethylammoniopropanesulfonate; 3-(Decyldimethylammonio)propanesulfonate; 3-[Dimethyl-(2-hydroxyethyl)ammonio]-1-propanesulfonate; 3-(1-Methylpiperidinio)-1-propanesulfonate; 3-(Triphenylphosphonio)propane-1-sulfonate; 3-(Di-tert-butylphosphonium)propane sulfonate; 3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate; 3-[N,N-Dimethyl(3-myristoylaminopropyl)ammonio]propanesulfonate; 3-(N,N-Dimethylmyristylammonio)propanesulfonate; 3-(N,N-Dimethyloctadecylammonio)propanesulfonate; 3-([3-Cholamidopropyl]dimethylammonio)-2-hydroxy-1-propanesulfonate; 및 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 면역화학염색용 조성물.
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