KR20050118219A - 파파니콜라우 염색방법 - Google Patents

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사이틱 코포레이션
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis

Abstract

본 발명은 파파니콜라우 염색방법에 의한 생물학적 샘플을 처리하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 임의의 다양한 단계에서 세정제 처리를 염색과정내로 혼입하는 것을 포함한다. 상기 방법은 파파니콜라우 염색중에 생성된 인공산물의 수를 유리하게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 또한 그러한 방법에 의해 염색된 샘플이 제공된다.

Description

파파니콜라우 염색방법{PAPANICOLAU STAINING PROCESS}
본 발명은 생물학적 샘플 염색에 유용한 방법, 약품 및 조성물에 관한 것이다.
의학적 진단 실험방법은 병리적 상태의 조기 발견에 중요한 검사 수단이다. 조기 발견은 성공적인 치료 가능성이 높은 단계에서 질병을 확인하게 한다. 조기 치료는 손상이 적은 치료방법을 포함하며 환자에 대한 충격을 감소시킨다. 정기적인 검사외에, 진단 실험은 생검분석 및 진행중인 의학적 치료의 결과를 모니터링하는 것을 포함하여 다양한 다른 적용에 또한 사용된다.
진단 실험에 특별히 유용한 한가지 수단은 파파니콜라우 염색방법이다. 이 방법은 초기에 부인과 표본을 염색하기 위해 개발되어 자궁경부 암의 치사율을 상당히 감소시켰다. 현재 파파니콜라우 염색은 수많은 상이한 조직 및 기관으로부터 다양한 병리적 상태를 진단하는데 사용된다.
그러나, 파파니콜라우 염색은 처리된 샘플을 성공적으로 판독하는 기술자 또는 기계의 능력에 불리하게 영향을 미칠 수 있는 인공산물(artifact)다. 이들 인공산물은 세포질 분해, 콘플레이킹, 훈증 뉴클리어 디테일(smudged nuclear detail), 저염색성 염색 및 고염색성 염색과 같은 가성의 비-특이적 세포질 염색인 인공산물을 포함한다. 그러한 인공산물은 평가될 수 있는 샘플 부분을 최소로 줄이며, 정확한 진단을 방해하는 잘못된 염색 패턴을 생성할 수 있으며, 샘플을 판독할 수 없게 할 수 있다. 그러한 샘플을 분석하는데 있어서의 어려움은 환자의 불안, 재검사 비용을 증가시키고 진단을 지연시키며 더 중요하게는 잠재적 오진을 초래한다.
진단 표본을 염색하는 향상된 방법 및 그러한 방법에 유용한 조성물 및 약품의 제조에 대한 필요가 있다.
발명의 요약
파파니콜라우 염색 방법에 의한 생물학적 샘플을 처리하는 향상된 방법이 제공된다. 상기 방법은 임의의 다양한 단계에서 세정제를 염색과정내로 혼입시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 파파니콜라우 염색중에 생성된 인공산물의 수를 유리하게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 또한 상기 방법에 의해 염색된 샘플이 제공된다.
발명의 상세한 설명
본 발명자들은 세정제 처리를 파파니콜라우 염색방법내로의 혼입은 상기 방법에서 발생하기 쉬운 인공산물의 생성을 감소시키는 것을 발견하였다. 세정제의 용도는 이 과정에 의해 염색된 세포의 세포질로부터 과도한 염색을 제거하여 증가된 차이 및 세포, 핵 및 염색질 형태를 검출하는 향상된 능력을 제공한다. 또한, 세포질로부터의 과도한 염색의 제거는 기형과 관련된 과염색을 검출하는 능력을 증가시킨다.
용어“파파니콜라우 염색방법”,“팹 염색”,“팹 테스트”등은 예를들면, 팹 스미어와 같이 부인과 검사중에 얻은 샘플내의 세포 핵 및 세포질을 별도로 염색하는 변형된 또는 변형되지 않는 파파니콜라우 염색방법을 의미한다.
상기 실험은 염색 패턴, 염색 강도 및 샘플내의 다른 세포 유형의 핵 및 세포질의 크기 및 모양을 구별하는 능력에 따라 다르다. 파파니콜라우 염색방법은 검게 염색된 핵 및 투명한 세포질을 유리하게 제공하며, 이는 팹 스미어를 비롯하여 특정 샘플 기법에 의해 제공된 다층 샘플내의 비정상적인 세포를 검출하는데 특히 유용하다.
적당한 실험은 샘플내의 세포의 상당한 비율을 판독할 수 있는 능력에 따라 다르며, 그렇지 않으면 실험의 정확성은 포함될 것이며 샘플은 사용할 수 없게 되어 추가적인 재검사 비용 및 환자의 불안 증가를 초래할 것이다.
따라서, 샘플내의 세포의 일정한 염색 패턴을 구별하는 능력을 감소시키는 인공산물의 염색은 팹 테스트의 유용성을 상당히 손상시킬 수 있다. 인공산물은 핵과 세포질의 염색 패턴을 구별하는 능력을 감소시킬 수 있으며, 판독불가능한 세포의 비율 또는 샘플 영역을 증가시킬 수 있으며, 세포질 염색을 증가시킴으로써 팹 테스트의 주요 이점 중 하나인 투명도를 감소시키므로, 샘플내의 비정상적인 세포의 구별을 더욱 어렵게 한다.
본 발명은 본원에 개시된 특정한 방법론, 해결책 또는 장치에 한정되지 않으며, 본원에 사용된 용어는 특정 구체예만을 개시하기 위한 목적이며, 본 발명의 청구범위를 제한하는 것이 아님을 이해해야 한다.
본원에 사용된 단수는 달리 특정되지 않는 한 복수를 포함한다. 예를들면, “샘플”은 다수의 샘플을 포함하며,“세정제”는 다수의 세정제를 포함하며,“대조염색”는 다수의 대조염색을 포함한다. 또한,“두개”,“세개”등과 같은 복수의 사용은 달리 특정되지 않는 한 동일한 대상의 더 큰 수를 의미한다.
“연결된”,“부착된”및 “결합된”용어는 상호교환되어 사용되며, 달리 특정되지 않는 한 간접적 연결, 부착, 결합 및 접합뿐 아니라 직접적인 연결, 부착, 결합 및 접합을 포함한다. 수치의 범위가 열거되며, 임의의 상하한 값은 수치의 범위로부터 제외되거나 또는 포함된다. 예를들면, 성분은 0 내지 100%의 농도로 제시될 수 있으며, 수용액의 pH는 1 내지 14의 범위일 수 있다. 수치는 명확하게 열거되며, 동일한 양의 수치는 본 발명의 범위내임을 이해해야 한다. 조합이 개시되어 있으며, 요소의 각 아조합은 본 발명의 범위내이다. 상이한 요소 또는 요소의 그룹, 조합이 또한 개시되어 있다. 본 발명의 임의의 요소는 다수의 대안, 각각의 대안이 단독으로 또는 다른 대안과 조합하여 배제된 예를 갖는 것으로 개시되어 있으며, 하나 이상의 요소는 그러한 배제 및 그러한 배제를 갖는 요소의 모든 조합을 가질 수 있다.
본원에서 달리 특정되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 갖는다.
용어“선택적인”은 발생하거나 발생하지 않는 경우 또는 상황을 의미한다.
파파니콜라우 염색
파파니콜라우 염색방법은 하나 이상의 헤마토크실렌 염색단계, 오렌지 G 세포질 대조염색 단계 및 에오신 Y-라이트 그린/페스트 그린 대조염색 단계를 포함한다. 상기 방법은“블루잉”단계를 포함할 수 있다. 팹 염색은 팹 스미어로부터 얻은 샘플과 같이 다층을 포함하는 세포를 분석하는데 특히 유용한 투명한 세포질을 갖는 샘플을 유리하게 생성한다.
파파니콜라우 염색방법을 시작하기 전에, 상기 샘플은 고정되어야 한다. 만족할 만한 결과를 가져오는 임의의 고정 방법이 사용될 수 있다. 일반적으로, 팹 염색, 예를들면 95% 알코올, 100% 메탄올, 80% 프로판올 또는 95% 에탄올/에테르(1:1)에 의한 알코올 고정이 사용된다. 시판되는 스프레이 고정제가 또한 사용될 수 있다.
전형적인 파파니콜라우 염색방법은 세포의 염색질을 염색하기 위해 금속 매염제와 조합하여 헤마토크실렌 염색 단계를 포함하며, 진행적으로 또는 퇴행적으로 실시될 수 있다. 상기 염색질 염색은 이 실험에서 중요한 부분이며, 염색질의 크기, 염색 강도 및 염색 패턴은 샘플내의 비정상적인 세포의 분석에 있어서 중요한 요소이다. 해리스(Harris), 실(Cill), 델라필드(Delafield) 또는 메이어(Mayer) 헤마토크실렌을 비롯하여 임의 형태의 헤마토크실렌이 사용될 수 있다. 티오닌, 빅토리아 블루 B, 아주레 B 등과 같은 염료를 사용하는 헤마토크실렌의 대용이 또한 사용될 수 있다.
퇴행적으로 실시된다면, 상기 샘플은 과잉염색되며 이어, 염색강도를 원하는 수준까지 감소시키는 물질(예를들면, 희석된 HCl)에 의해 구별된다. 이는 염색 색깔을 푸른/자주색에서 연어 살빛의 핑크/레드로 변화시킨다. 당해 기술에 공지되어 있는(예를들면, Scott's 탭 워터 대용, 암모니아 워터, 탄산리튬) 물질을 사용하여 푸른색을 회복하기 위한“블루잉”단계가 사용될 수 있다. 블루잉 용액은 분화단계없이 혼입될 수 있다.
다수의 세포질 대조염색이 파파니콜라우 염색에 사용되어 샘플내의 다양한 세포 유형, 이들의 모양 및 이들의 빈도를 확인할 수 있게 한다.
세포질 염색 오렌지 G 및 에오신 Y-라이트 그린/페스트 그린이 알코올에서 제조되었다. 오렌지 G는 케라틴이 존재한다면, 세포질을 노란색 또는 오렌지색으로 염색하는 단일염색질 염료로, 잘 보이지 않는 양성 세포로부터 성숙한 또는 성숙하고 있는 케라틴-생성 악성 세포를 구별하게 한다. 오렌지 G는 OG-6와 같이 세포 염색 기술에 공지되어 있는 용액의 형태로 사용될 수 있다.
통상적으로, 에오신 Y-라이트 그린/페스트 그린은 에오신 Y, 라이트 그린 SF 및/또는 페스트 그린 FCF 및 비스막크 브라운(Bismarck Brown)의 세가지 염료의 혼합물로서 제조된다. 혼합물의 예로는 EA36, EA50 및 EA65를 포함한다. 에오신 Y는 핵, 섬모, 적혈구 및 성숙한 편평상피 세포의 세포질에서 핑크색을 생성한다. 라이트 그린 SF Yellowish 및 페스트 그린 FCF는 대사적으로 활성인 부기저 편평상피 세포의 세포질에서 블루/그린색을 생성하며, 편평상피 세포와 원주세포를 매개한다. 비스막크 브라운은 팹 염색에서 사용가능한 염색 패턴을 생성하지 않으며, 여러가지 방법에서 베제될 수 있다. 페스트 그린 FCF와 같은 라이트 그린 SF Yellowish의 대용이 또한 사용될 수 있다. 세포질 대조염색은, 대조염료로 사용하기 위한 단일 용액을 생성하는 OG 및 에오신 Y-라이트 그린/페스트 그린의 혼합물일 수 있다.
이러한 세포질 대조염료내에서 제조된 알코올은 투명한 세포질을 만들어 파파니콜라우 방법에 의해 염색된 샘플을 분석하는데 매우 유용하다.
수성 및 비수성 용액사이로 이동할 때 수화/탈수 시리즈와 같이, 세척단계는 염색방법에 포함된다. 염색과정이 완결될 때, 상기 샘플은 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 제거 및 고정될 수 있다. 파파니콜라우 방법이전 또는 이후에 샘플에 추가적인 과정이 실시될 수 있다. 상기 샘플은 이어, 수동적으로 및/또는 적절한 장치, 예를들면 자동 화상 시스템에 의해 분석될 수 있다. 자동 화상 시스템의 예로는 Cytyc Corporation의 ThinPrep®Imaging System, TriPath FocalPointTM Profiler, Chroma Vision Acis®System, CompuCyt iCyte Imaging System, Applied Imaging CytoVisionTM System 및 Veracel Verasys Imaging System을 포함한다.
파파니콜라우 염색방법에 대한 다양한 변형이 가능하며 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예를들면, 상기 방법은 미국특허번호 제5,168,066호 및 제6,348,325호(1992년 12월 1일 및 2002년 2월 12일 각각 발행됨)에 개시되어 있는 바와 같이 변형될 수 있다.
샘플
분석될 샘플 부분은 세포, 조직 또는 체액을 비롯하여 직접 또는 간접적으로 살아있는 생물체로부터 얻을 수 있는 생물학적 물질의 임의의 공급원일 수 있다. 그러한 샘플의 예로는 혈액, 소변, 정액, 젖, 객담, 점액, 늑막액, 골반액, 활액, 복수액, 체강세척, 눈 브러싱, 피부 스크래핑, 구강 스웝, 질 스웝, 팹 스미어, 직장 스웝, 흡인물, 니들 생검, 수술 또는 부검에 의해 얻은 조직 부분, 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 피부의 외부 분비물, 호흡기관, 장관 및 생식기관, 눈물, 타액, 종양, 기관 및 시험관내 세포 배양액 성분의 샘플을 포함한다. 일반적으로 상기 샘플은 부인과적 검사중에 일반적으로 수득되는 것과 같은 팹 스미어이거나 또는 비정상 세포를 함유하는 것으로 의심되는 생검일 것이다.
상기 샘플은 비정상 세포를 함유하는 것으로 공지되어 있는 양성 대조용 샘플일 수 있다. 제시된 세트의 염색 조건이 잘못된 양성(샘플내의 비정상 세포의 부재하에서의 양성 신호)을 생성하는지 여부를 판단하는데 사용되는 음성 대조용 샘플이 또한 사용될 수 있다.
일반적으로, 슬라이드 또는 유사한 유리 표면, 예를들면 바이알, 커버슬립 또는 샘플 분석에 사용되는 빛에 투명한 다른 표면상에서 염색을 하기 위해 상기 샘플이 제공된다.
세정제
파파니콜라우 염색과정중에 생성된 인공산물을 감소시키는 임의의 세정제가 사용될 수 있다. 상기 세정제는 그러한 인공산물을 감소시키는데 적절한 양 및 적절한 시간으로 사용될 수 있다. 하나 이상의 그러한 인공산물의 비율은 본원에 개시된 바와 같이 세정제 세척제를 혼입함으로써 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 70%, 90%, 95%, 98% 또는 그 이상을 감소시킬 수 있다. 공지된 바와 같이 임의의 다양한 매개변수를 토대로 분석될 슬라이드의 특정 부분(관심 영역)을 선별하는 화상 시스템에 사용될 때, 본 발명은 잘못 선별된 영역(화상 시스템의 선별 기준을 충족시키는 인공산물 염색을 토대로 하는 분석에 있어서 잘못 선별된)의 수를 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 70%, 90%, 95%, 98% 또는 그 이상을 감소시킨다. 이는 분석용으로 선별된 유용한 영역의 비율을 증가시킨다.
상기 세정제는 비이온, 양이온, 음이온 또는 쯔비터이온일 수 있다. 세정제의 혼합 또한 사용될 수 있다. 세정제 종류의 예로는 황산 알코올 에테르, 황산 알코올, 알카놀아미드, 알킬 술폰에이트, 아민 옥사이드, 양성 세정제, 음이온 세정제, 베타인 유도체, 양이온 세정제, 디술폰에이트, 도데실벤젠 술폰산, 에톡시화 알코올, 에톡시화 알킬 페놀, 에톡시화 지방산, 글리세롤 에스테르 히드로트로프, 라우릴 술페이트, 모노 및 디글리세리드, 비이온성 세정제, 포스페이트 에스테르, 제4급 세정제 및 소르비탄 유도체를 포함한다.
비이온 세정제는 BigCHAP(N,N-비스[3-(D-글루콘아미도)프로필]콜아미드), 비스(폴리에틸렌 글리콜 비스[이미다조일 카르보닐]), Brij®30(폴리옥시에틸렌 4 라우릴 에테르), Brij®35(폴리옥시에틸렌 23 라우릴 에테르), Brij®52(폴리옥시에틸렌 2 세틸 에테르), Brij®56(폴리옥시에틸렌 10 세틸 에테르), Brij®58(폴리옥시에틸렌 20 세틸 에테르), Brij®72(폴리옥시에틸렌 2 스테아릴 에테르), Brij®76(폴리옥시에틸렌 10 스테아릴 에테르), Brij®78(폴리옥시에틸렌 20 스테아릴 에테르), Brij®92(폴리옥시에틸렌 2 올레일 에테르), Brij®97(폴리옥시에틸렌 10 올레일 에테르), Brij®98(폴리옥시에틸렌 20 올레일 에테르), Brij®700(폴리옥시에틸렌 100 스테아릴 에테르), Cremophor®EL(캐스터 오일/에틸렌 옥사이드 폴리에테르), 데카에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 옥탄오일-N-메틸글루카미드(MECA-8), 데칸오일-N-메틸글루카미드(MECA-10), n-옥틸글루코시드, n-도데실글루코시드, 이소트리데실-폴리(에틸렌글리코에테르)n, N-데칸오일-N-메틸글루카민, n-데실 α-D-글루코피라노시드, 데실 β-D-말토피라노시드, n-도데칸오일-N-메틸글루카미드, n-도데실 α-D-말토시드, n-도데실β-D-말토시드, 헵타에틸렌 글리콜 모노데실 에테르, 헵타에틸렌 글리콜 모노테트라데실 에테르, n-헥사데실 β-D-말토시드, 헥사에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 헥사에틸렌 글리콜 모노헥사데실 에테르, 헥사에틸렌 글리콜 모노옥타데실 에테르, 헥사에틸렌 글리콜 모노테트라데실 에테르, Igepal® CA-630(옥틸페닐-폴리에틸렌 글리콜), Igepal® CA-210(폴리옥시에틸렌(2) 이소옥틸페닐 에테르), Igepal® CA-520(폴리옥시에틸렌(5) 이소옥틸페닐 에테르), Igepal® CO-630(폴리옥시에틸렌(9) 노닐페닐 에테르), Igepal® CO-720(폴리옥시에틸렌(12) 노닐페닐 에테르), Igepal® CO-890(폴리옥시에틸렌(40) 노닐페닐 에테르), Igepal® CO-990(폴리옥시에틸렌(100) 노닐페닐 에테르), Igepal® DM-970(폴리옥시에틸렌(150) 디노닐페닐 에테르), 메틸-6-O-(N-헵틸카르바모일)-α-D-글루코피라노시드, 노나에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, N-노나노일-N-메틸글루카민, 옥타에틸렌 글리콜 모노데실 에테르, 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 옥타에틸렌 글리콜 모노헥사데실 에테르, 옥타에틸렌 글리콜 모노옥타데실 에테르, 옥타에틸렌 글리콜 모노테트라데실 에테르, 옥틸-β-D-글루코피라노시드, 펜타에틸렌 글리콜 모노데실 에테르, 펜타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 펜타에틸렌 글리콜 모노헥사데실 에테르, 펜타에틸렌 글리콜 모노헥실 에테르, 펜타에틸렌 글리콜 모노옥타데실 에테르, 펜타에틸렌 글리콜 모노옥틸 에테르, 폴리에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르, 폴리에틸렌 글리콜 에테르 W-1, 폴리옥시에틸렌 10 트리데실 에테르, 폴리옥시에틸렌 100 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 20 이소헥사데실 에테르, 폴리옥시에틸렌 20 올레일 에테르, 폴리옥시에틸렌 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 50 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 8 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 비스(이미다졸일 카르보닐), 폴리옥시에틸렌 25 프로필렌 글리콜 스테아레이트, 사포닌, Span®20(소르비탄 모노라우레이트), Span®40(소르비탄 모노팔미테이트), Span®60(소르비탄 모노스테아레이트), Span®65(소르비탄 트리스테아레이트), Span®80(소르비탄 모노올레이트), Span®85(소르비탄 트리올레이트), 임의 형태의 테르기톨(15-S-5, 15-S-7, 15-S-9, 15-S-12, 15-S-30, NP-4, NP-7, NP-9, NP-10, NP-40, NPX(임벤틴-N/63), TMN-3(폴리에틸렌 글리콜 트리메틸노닐 에테르), TMN-6(폴리에틸렌 글리콜 트리메틸노닐 에테르), TMN-10(폴리에틸렌 글리콜 트리메틸노닐 에테르), MIN FOAM 1x 및 MIN FOAM 2x 유형 포함), 테트라데실-β-D-말토시드, 테트라에틸렌 글리콜 모노데실 에테르, 테트라에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 테트라에틸렌 글리콜 모노테트라데실 에테르, 트리에틸렌 글리콜 모노데실 에테르, 트리에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 트리에틸렌 글리콜 모노헥사데실 에테르, 트리에틸렌 글리콜 모노옥틸 에테르, 트리에틸렌 글리콜 모노테트라데실 에테르, Triton®CF-21, Triton®CF-32, Triton®DF-12, Triton®DF-16, Triton®GR-5M, Triton®N-101(폴리옥시에틸렌 가지 노닐페닐 에테르), Triton®QS-15, Triton®QS-44, Triton®RW-75(폴리에텔렌 글리콜 260 모노(헥사데실/옥타데실) 에테르 및 1-옥타데칸올), Triton®X-100(폴리에틸렌 글리콜 삼차-옥틸페닐 에테르), Triton®X-102, Triton®X-15, Triton®X-151, Triton®X-200, Triton®X-207, Triton®X-114, Triton®X-165, Triton®X-305, Triton®X-405(폴리옥시에틸렌(40) 이소옥틸페닐 에테르), Triton®X-405 환원된(폴리옥시에틸렌(40) 이소옥틸시클로헥실 에테르), Triton®X-15(폴리에틸렌 글리콜 4-삼차-옥틸페닐 에테르), Triton®X-705-70, 임의 형태의 TWEEN®(TWEEN®20(폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트), TWEEN®21(폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트), TWEEN®40(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노팔미테이트), TWEEN®60(폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노스테아레이트), TWEEN®61(폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노스테아레이트), TWEEN®65(폴리옥시에틸렌소르비탄 트리스테아레이트), TWEEN®80(폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레이트), TWEEN®81(폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레이트), TWEEN®85(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 트리올레이트), 티록사폴(포름알데히드 및 옥시랜에 의한 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페놀 중합체) 및 n-운데실 β-D-글루코피라노시드를 포함한다.
음이온 세정제의 예로는 체노데옥시콜산, 콜산, 디히드로콜산, 데옥시콜산, 디기토닌, 디기톡시제닌, N,N-디메틸도데실아민 N-옥시드, 소듐 도쿠세이트, 소듐 글리코체노데옥시콜레이트, 클리코콜산, 글리코데옥시콜산, 글리코리토콜산 3-술페이트 디소듐 염, 글리코리토콜산 에틸 에스테르, N-라우로실사르코신, 리튬 도데실 술페이트, 루골(요오드화칼륨 요오드), 니아프루프(2-에틸헥실 술페이트 소듐 염), 니아프루프 4(7-에틸-2-메틸-4-운데실 술페이트 소듐 염), 경우에 따라 치환된 알킬술폰에이트 염(1-부탄술폰에이트, 펜탄술폰에이트, 헥산술폰에이트, 1-옥탄술폰에이트, 1-데칸술폰에이트, 1-도데칸술폰에이트, 1-헵탄술폰에이트, 1-헵탄술폰에이트, 1-노난술폰에이트, 1-프로판술폰에이트 및 2-브로모에탄술폰에이트의 염, 특히 소듐 염을 포함), 소듐 콜레이트, 소듐 데옥시콜레이트, 경우에 따라 치환된 소듐 도데실 술페이트, 소듐 옥틸 술페이트, 소둠 타우로콜레이트, 소둠 타우로체노데옥시콜레이트, 소듐 타우로히오데옥시콜레이트, 타우로리토콜산 3-술페이트 디소듐 염, 타우로우르소데옥시콜산 소듐 염, Trizma® 도데실 술페이트, 우르소데옥시콜산을 포함한다. 상기 음이온 세정제는 산 또는 염 형태 또는 두가지 모두의 형태로 제공될 수 있다.
양이온 세정제의 예로는 알킬트리메틸암모늄 브로미드, 벤즈알코늄 클로리드, 벤질디메틸헥사데실암모늄 클로리드, 벤질디메틸테트라데실암모늄 클로리드, 벤질도데실디메틸암모늄 브로미드, 벤질트리메틸암모늄 테트라클로로아이오데이트, 디메틸디옥타데실암모늄 브로미드, 도데실에틸디메틸암모늄 브로미드, 도데실트리메틸암모늄 브로미드, 에틸헥사데실디메틸암모늄 브로미드, Girard 시약 T, 헥사데실트리메틸암모늄 브로미드, N,N',N'-폴리옥시에틸렌(10)-N-탈로우-1,3-디아미노프로판, 톤조늄 브로미드 및 트리메틸(테트라데실)암모늄 브로미드를 포함한다.
쯔비터이온 세정제의 예로는 CHAPS(3-{(3-콜아미도프로필)-디메틸암모니오}-1-프로판-술폰에이트), CHAPSO(3-{(3-콜아미도프로필)디메틸-암모니오}-2-히드록시-1-프로판-술폰에이트), 3-(데실디메틸암모니오)프로판술폰에이트, 3-(도데실디메틸암모니오)프로판술폰에이트, 3-(N,N-디메틸미리스틸암모니오)프로판술폰에이트, 3-(N,N-디메틸옥타데실암모니오)프로판술폰에이트, 3-(N,N-디메틸옥틸암모니오)프로판술폰에이트 및 3-(N,N-디메틸팔미틸암모니오)프로판술폰에이트를 포함한다.
상기 세정제는 당해 기술분야에 공지되어 있거나 또는 발견가능한 세정제를 포함한다. 상기 세정제는 합성되거나 또는 임의의 다양한 판매인(예를들면, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA, www.sigmaaldrich.com)으로부터 상업적으로 얻을 수 있다. 벤즈알코늄 클로리드 및 CHAPS는 파파니콜라우 염색중에 인공산물을 줄이는데 특히 유용한 것으로 밝혀졌다.
파파니콜라우 염색방법에서 세척단계내로 혼입함으로써 인공산물을 줄이기 위한 세정제의 능력이 실험될 것이며, 이는 염색된 인공산물을 생성하기 위한 공지된 조건하에서 실시될 것이다. 실험 세정제로 처리된 상기 샘플은 이어, 세정제 처리없이 처리된 샘플에 대해 평가되며 및 벤즈알코늄 클로리드 처리 또는 염색된 인공산물을 줄이기 위한 공지된 다른 양성 대조용 처리에 의해 처리된 샘플에 대해 평가될 것이다.
일반적으로, 사용된 세정제의 양은 사용될 용액의 적어도 약 0.0001% 및 약 10%까지 일 것이며, 용액의 적어도 약 0.0005%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.5% 또는 1% 또는 그 이상일 것이다; 세정제의 양은 용액의 약 5% 또는 그 미만, 약 2.5% 또는 그 미만, 약 2% 또는 그 미만, 약 1% 또는 그 미만, 약 0.5% 또는 그 미만, 약 0.2% 또는 그 미만, 약 0.1% 또는 그 미만, 약 0.05% 또는 그 미만 또는 임의의 이들 범위이다.
상기 세정제 처리는 샘플을 분석하는 능력에 불리하게 영향을 미치지 않으면서 인공산물의 감소를 허용하는 임의의 pH에서 실시될 것이다. 따라서, 상기 세정제처리는 약 pH 1,2,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 또는 임의의 이들 범위내에서 실시될 것이다. 일반적으로 상기 처리는 약 pH 2 내지 10에서 실시될 것이다.
상기 세정제는 파파니콜라우 염색과정의 임의의 시점에서 사용될 수 있다. 예를들면, 상기 세정제는 헤마토크실렌 염색전에 사용되어 헤마토크실렌 염료와 혼합되거나, 헤마토크실렌 염색후 블루잉 용액과 혼합되거나, 블루잉 용액후 오렌지 G, 에오신 Y-라이트 그린/페스트 그린 또는 다른 대조염색 용액과 혼합될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 어떻게 만들고 사용하는지를 완벽하게 기술하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다. 사용된 숫자(예를들면, 양, 온도 등)와 관련하여 정확도를 확실하게 하기 위한 노력을 했지만, 일부 실험적 착오 및 편차는 고려되어야 한다. 달리 특정되지 않는 한 비율은 중량비율이며, 온도는 섭씨온도이며, 압력은 대기압이며 모든 물질은 시판된다.
실시예 1
세포질 균열은 파파니콜라우 염색 실험 조건하에서 처리된 팹 스미어 슬라이드상에서 아주 잘 보이는 것으로 밝혀졌다. 세포질 균열을 감소시키는 방법을 실험하기 위해, 4개의 상이한 샘플 팹 스미어를 수득하고, 상기 샘플로부터 슬라이드를 만들고 고정시켜 하루동안 건조시키고 이어, 하기의 과정에 따른 변형된 팹 염료로 염색하였다.
단계 1 스테이션 개시
2 세척 단계 실험
3 5분 50% 알코올 시약
4 5분 염 용액(50% 알코올중의 10% NaCl)
5 5분 염 용액(50% 알코올중의 10% NaCl)
6 1분 95% 알코올 시약
7 1분 95% 알코올 시약
8-22 1분 핵 염색(15분)
23 20초 이소프로필 알코올
24 20초 이소프로필 알코올
25 30초 이소프로필 알코올
26 20초 이소프로필 알코올
27-34 1분 대조염색(오렌지 G 및 에오신 페스트 그린/라이트 그린의 혼합물)(8분)
35 30초 100% 알코올 시약
36 3분 이소프로필 알코올
37 3분 이소프로필 알코올
38 1분 크실렌
39 3분 크실렌
40 종료 크실렌
최종 크실렌에 슬라이드 제거
Permount를 수동적으로 사용한 커버슬립
상기 4개의 샘플은 세포질 균열을 생성하였으며 인공산물을 감소시키는 조건을 결정하기 위해 세척단계 실험처리 하였다. 각 샘플로부터 10개의 슬라이드를 준비하였다. 5분 및 15분간 물 세척뿐만 아니라, 각 샘플로부터의 10개의 슬라이드상에서 FC120 계면활성제(3M 코퍼레이션) 및 FC170 계면활성제(3M 코퍼레이션)를 사용하여 독립적으로 15분간 세척하였다. 이들 세척 조건 중 어느 것도 세포질 균열의 인공산물의 염색을 현저하게 감소시키지 않았다.
4개의 각 샘플로부터 10개의 추가 슬라이드를 준비하고, FC170, 0.1% pH 6.9, Tween®80 0.1% pH 6.9, Igepal CA-630 0.1% pH 7.0, CHAPS 0.1% pH 7.7, ZEPHIRAN®0.1% pH 7.2, 물, 염 용액 단계 이전에 50% 알코올 단계가 없는 물, 염 용액 단계가 없는 물 및 염 용액 단계 이전에 50% 알코올 단계가 없는 물 및 염 용액 단계가 없는 물에서 15분간 세척을 포함하여 추가 세척 실험하였다.
ZEPHIRAN®(벤즈알코늄 클로리드)는 가성의 푸른 세포질 염색을 현저하게 감소시키고 세포질 균열을 감소시켰다. CHAPS® 또한 이 농도에서 어느 정도까지 두가지 인공산물을 감소시켰다. 표시된 농도에서 다른 처리는 이들 염색된 인공산물에 거의 영향을 미치지 않았다.
실시예 2
세정제 세척 단계를 포함시킨 파파니콜라우 염색 프로토콜의 예는 하기와 같다:

Claims (31)

  1. 샘플을 헤마토크실렌 염료와 접촉시키고;
    샘플을 오렌지 G 대조염료와 접촉시키고;
    샘플을 에오신 Y-라이트 그린/페스트 그린 대조염료와 접촉시키고;
    샘플을 염색된 인공산물을 줄이는데 충분한 양의 세정제와 접촉시키는 것을 포함하는 고정된 생물학적 샘플의 염색방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 세정제는 알코올 에테르 술페이트, 알코올 술페이트, 알칸올아미드, 알킬 술폰에이트, 아민 옥사이드, 양성 세정제, 음이온 세정제, 베타인 유도체, 양이온 유도체, 디술폰에이트, 도데실벤젠 술폰산, 에톡시화 알코올, 에톡시화 알킬 페놀, 에톡시화 지방산, 글리세롤 에스테르 히드로트로프, 라우릴 술페이트, 모노 및 디글리세리드, 비이온성 세정제, 포스페이트 에스테르, 제4 세정제 및 소르비탄 유도체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 세정제는 비이온성 세정제인 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 세정제는 BigCHAP(N,N-비스[3-(D-글루콘아미도)프로필]콜아미드), 비스(폴리에틸렌 글리콜 비스[이미다조일 카르보닐]), Brij®30(폴리옥시에틸렌 4 라우릴 에테르), Brij®35(폴리옥시에틸렌 23 라우릴 에테르), Brij®52(폴리옥시에틸렌 2 세틸 에테르), Brij®56(폴리옥시에틸렌 10 세틸 에테르), Brij®58(폴리옥시에틸렌 20 세틸 에테르), Brij®72(폴리옥시에틸렌 2 스테아릴 에테르), Brij®76(폴리옥시에틸렌 10 스테아릴 에테르), Brij®78(폴리옥시에틸렌 20 스테아릴 에테르), Brij®92(폴리옥시에틸렌 2 올레일 에테르), Brij®97(폴리옥시에틸렌 10 올레일 에테르), Brij®98(폴리옥시에틸렌 20 올레일 에테르), Brij®700(폴리옥시에틸렌 100 스테아릴 에테르), Cremophor®EL(캐스터 오일/에틸렌 옥사이드 폴리에테르), 데카에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 옥탄오일-N-메틸글루카미드(MECA-8), 데칸오일-N-메틸글루카미드(MECA-10), n-옥틸글루코시드, n-도데실글루코시드, 이소트리데실-폴리(에틸렌글리코에테르)n, N-데칸오일-N-메틸글루카민, n-데실 α-D-글루코피라노시드, 데실 β-D-말토피라노시드, n-도데칸오일-N-메틸글루카미드, n-도데실 α-D-말토시드, n-도데실β-D-말토시드, 헵타에틸렌 글리콜 모노데실 에테르, 헵타에틸렌 글리콜 모노테트라데실 에테르, n-헥사데실 β-D-말토시드, 헥사에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 헥사에틸렌 글리콜 모노헥사데실 에테르, 헥사에틸렌 글리콜 모노옥타데실 에테르, 헥사에틸렌 글리콜 모노테트라데실 에테르, Igepal® CA-630(옥틸페닐-폴리에틸렌 글리콜), Igepal® CA-210(폴리옥시에틸렌(2) 이소옥틸페닐 에테르), Igepal® CA-520(폴리옥시에틸렌(5) 이소옥틸페닐 에테르), Igepal® CO-630(폴리옥시에틸렌(9) 노닐페닐 에테르), Igepal® CO-720(폴리옥시에틸렌(12) 노닐페닐 에테르), Igepal® CO-890(폴리옥시에틸렌(40) 노닐페닐 에테르), Igepal® CO-990(폴리옥시에틸렌(100) 노닐페닐 에테르), Igepal® DM-970(폴리옥시에틸렌(150) 디노닐페닐 에테르), 메틸-6-O-(N-헵틸카르바모일)-α-D-글루코피라노시드, 노나에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, N-노나노일-N-메틸글루카민, 옥타에틸렌 글리콜 모노데실 에테르, 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 옥타에틸렌 글리콜 모노헥사데실 에테르, 옥타에틸렌 글리콜 모노옥타데실 에테르, 옥타에틸렌 글리콜 모노테트라데실 에테르, 옥틸-β-D-글루코피라노시드, 펜타에틸렌 글리콜 모노데실 에테르, 펜타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 펜타에틸렌 글리콜 모노헥사데실 에테르, 펜타에틸렌 글리콜 모노헥실 에테르, 펜타에틸렌 글리콜 모노옥타데실 에테르, 펜타에틸렌 글리콜 모노옥틸 에테르, 폴리에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르, 폴리에틸렌 글리콜 에테르 W-1, 폴리옥시에틸렌 10 트리데실 에테르, 폴리옥시에틸렌 100 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 20 이소헥사데실 에테르, 폴리옥시에틸렌 20 올레일 에테르, 폴리옥시에틸렌 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 50 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 8 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 비스(이미다졸일 카르보닐), 폴리옥시에틸렌 25 프로필렌 글리콜 스테아레이트, 사포닌, Span®20(소르비탄 모노라우레이트), Span®40(소르비탄 모노팔미테이트), Span®60(소르비탄 모노스테아레이트), Span®65(소르비탄 트리스테아레이트), Span®80(소르비탄 모노올레이트), Span®85(소르비탄 트리올레이트), 임의 형태의 테르기톨(15-S-5, 15-S-7, 15-S-9, 15-S-12, 15-S-30, NP-4, NP-7, NP-9, NP-10, NP-40, NPX(임벤틴-N/63), TMN-3(폴리에틸렌 글리콜 트리메틸노닐 에테르), TMN-6(폴리에틸렌 글리콜 트리메틸노닐 에테르), TMN-10(폴리에틸렌 글리콜 트리메틸노닐 에테르), MIN FOAM 1x 및 MIN FOAM 2x 유형 포함), 테트라데실-β-D-말토시드, 테트라에틸렌 글리콜 모노데실 에테르, 테트라에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 테트라에틸렌 글리콜 모노테트라데실 에테르, 트리에틸렌 글리콜 모노데실 에테르, 트리에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 트리에틸렌 글리콜 모노헥사데실 에테르, 트리에틸렌 글리콜 모노옥틸 에테르, 트리에틸렌 글리콜 모노테트라데실 에테르, Triton®CF-21, Triton®CF-32, Triton®DF-12, Triton®DF-16, Triton®GR-5M, Triton®N-101(폴리옥시에틸렌 가지 노닐페닐 에테르), Triton®QS-15, Triton®QS-44, Triton®RW-75(폴리에텔렌 글리콜 260 모노(헥사데실/옥타데실) 에테르 및 1-옥타데칸올), Triton®X-100(폴리에틸렌 글리콜 삼차-옥틸페닐 에테르), Triton®X-102, Triton®X-15, Triton®X-151, Triton®X-200, Triton®X-207, Triton®X-114, Triton®X-165, Triton®X-305, Triton®X-405(폴리옥시에틸렌(40) 이소옥틸페닐 에테르), Triton®X-405 환원된(폴리옥시에틸렌(40) 이소옥틸시클로헥실 에테르), Triton®X-15(폴리에틸렌 글리콜 4-삼차-옥틸페닐 에테르), Triton®X-705-70, 임의 형태의 TWEEN®(TWEEN®20(폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트), TWEEN®21(폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트), TWEEN®40(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노팔미테이트), TWEEN®60(폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노스테아레이트), TWEEN®61(폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노스테아레이트), TWEEN®65(폴리옥시에틸렌소르비탄 트리스테아레이트), TWEEN®80(폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레이트), TWEEN®81(폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레이트), TWEEN®85(폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 트리올레이트), 티록사폴(포름알데히드 및 옥시랜에 의한 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페놀 중합체) 및 n-운데실 β-D-글루코피라노시드로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 세정제는 음이온 세정제인 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 세정제는 체노데옥시콜산, 콜산, 디히드로콜산, 데옥시콜산, 디기토닌, 디기톡시제닌, N,N-디메틸도데실아민 N-옥시드, 소듐 도쿠세이트, 소듐 글리코체노데옥시콜레이트, 클리코콜산, 글리코데옥시콜산, 글리코리토콜산 3-술페이트 디소듐 염, 글리코리토콜산 에틸 에스테르, N-라우로실사르코신, 리튬 도데실 술페이트, 루골(요오드화칼륨 요오드), 니아프루프(2-에틸헥실 술페이트 소듐 염), 니아프루프 4(7-에틸-2-메틸-4-운데실 술페이트 소듐 염), 경우에 따라 치환된 알킬술폰에이트 염(1-부탄술폰에이트, 펜탄술폰에이트, 헥산술폰에이트, 1-옥탄술폰에이트, 1-데칸술폰에이트, 1-도데칸술폰에이트, 1-헵탄술폰에이트, 1-헵탄술폰에이트, 1-노난술폰에이트, 1-프로판술폰에이트 및 2-브로모에탄술폰에이트의 염, 특히 소듐 염을 포함), 소듐 콜레이트, 소듐 데옥시콜레이트, 경우에 따라 치환된 소듐 도데실 술페이트, 소듐 옥틸 술페이트, 소둠 타우로콜레이트, 소둠 타우로체노데옥시콜레이트, 소듐 타우로히오데옥시콜레이트, 타우로리토콜산 3-술페이트 디소듐 염, 타우로우르소데옥시콜산 소듐 염, Trizma® 도데실 술페이트, 우르소데옥시콜산, 임의의 그 염 및 임의의 그 산으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 세정제는 양이온 세정제인 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 세정제는 알킬트리메틸암모늄 브로미드, 벤즈알코늄 클로리드, 벤질디메틸헥사데실암모늄 클로리드, 벤질디메틸테트라데실암모늄 클로리드, 벤질도데실디메틸암모늄 브로미드, 벤질트리메틸암모늄 테트라클로로아이오데이트, 디메틸디옥타데실암모늄 브로미드, 도데실에틸디메틸암모늄 브로미드, 도데실트리메틸암모늄 브로미드, 에틸헥사데실디메틸암모늄 브로미드, Girard 시약 T, 헥사데실트리메틸암모늄 브로미드, N,N',N'-폴리옥시에틸렌(10)-N-탈로우-1,3-디아미노프로판, 톤조늄 브로미드 및 트리메틸(테트라데실)암모늄 브로미드로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 세정제는 벤즈알코늄 클로리드인 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 세정제는 쯔비터이온 세정제인 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 세정제는 CHAPS(3-{(3-콜아미도프로필)-디메틸암모니오}-1-프로판-술폰에이트), CHAPSO(3-{(3-콜아미도프로필)디메틸-암모니오}-2-히드록시-1-프로판-술폰에이트), 3-(데실디메틸암모니오)프로판술폰에이트, 3-(도데실디메틸암모니오)프로판술폰에이트, 3-(N,N-디메틸미리스틸암모니오)프로판술폰에이트, 3-(N,N-디메틸옥타데실암모니오)프로판술폰에이트, 3-(N,N-디메틸옥틸암모니오)프로판술폰에이트 및 3-(N,N-디메틸팔미틸암모니오)프로판술폰에이트로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 세정제는 CHAPS인 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 세정제의 혼합물이 사용되는 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 샘플은 헤마토크실렌 염색 이전에 세정제와 접촉되는 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 상기 세정제는 헤마토크실렌 염료와 혼합되는 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 샘플은 헤마토크실렌 염색 이후에 세정제와 접촉되는 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 상기 샘플은 블루잉 용액과 혼합하여 세정제와 접촉되는 것을 포함하는 방법.
  18. 제 1항에 있어서, 상기 샘플은 오렌지 G 대조염색 이전에 세정제와 접촉되는 방법.
  19. 제 1항에 있어서, 상기 샘플은 에오신 Y-라이트 그린/페스트 그린 대조염색 이전에 세정제와 접촉되는 방법.
  20. 제 1항에 있어서, 상기 샘플은 대조염료와 혼합하여 세정제와 접촉되는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 대조염료는 오렌지 G인 방법.
  22. 제 20항에 있어서, 상기 대조염료는 에오신 Y-라이트 그린/페스트 그린인 방법.
  23. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 자동화되는 방법.
  24. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 수동적으로 실시되는 방법.
  25. 제 1항에 있어서, 상기 샘플은 용액의 적어도 약 0.001% 및 약 10% 미만의 농도에서 세정제와 접촉되는 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 세정제는 용액의 적어도 약 0.01%인 방법.
  27. 제 25항에 있어서, 상기 세정제는 용액의 적어도 약 0.1%인 방법.
  28. 제 25항에 있어서, 상기 세정제는 용액의 적어도 약 0.5%인 방법.
  29. 제 1항에 있어서, 상기 세정제는 용액의 약 1% 미만인 방법.
  30. 감소된 수준의 염색된 인공산물을 갖는 고정된 생물학적 샘플에 있어서, 상기 샘플은 헤마토크실렌, 오렌지 G 및 에오신 Y-라이트 그린/페스트 그린으로 처리된 세포를 포함하며, 상기 샘플은 샘플내의 염색된 인공산물의 양을 감소시키는 세정제와 접촉되는 샘플.
  31. 파파니콜라우 염색방법에 의해 염색된 고정된 생물학적 샘플에서 염색된 인공산물을 감소시키기 위한 세정제의 용도.
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