CN104744967B

CN104744967B - 一种伊红染色液及其含伊红染色液的he染色液

Info

Publication number: CN104744967B
Application number: CN201310751124.9A
Authority: CN
Inventors: 吴军; 邹霈; 吴昊; 谢敏浩; 王洪勇; 刘娅灵
Original assignee: Jiangsu Institute of Nuclear Medicine
Current assignee: Wuxi Jiangyuan industrial technology and Trade Co.,Ltd.
Priority date: 2013-12-31
Filing date: 2013-12-31
Publication date: 2018-01-02
Anticipated expiration: 2033-12-31
Also published as: CN104744967A

Abstract

本发明提供一种伊红染色液，包括如下组分：伊红、比布列西猩红、焰红、乙醇、水。本发明还提供了所述伊红染色液的制备方法、含伊红染色液的HE染色液及其染色方法。本发明的伊红染色液对切片进行染色时，背景清晰、层次分明、染色效果好、易于读片，且不易褪色，便于长期存放。

Description

一种伊红染色液及其含伊红染色液的HE染色液

技术领域

本发明涉及一种体外诊断试剂，具体涉及一种伊红染色液及其制备方法，以及含伊红染色液的HE染色液以及其染色方法。

背景技术

苏木素伊红染色方法，简称HE染色法，是组织学、胚胎学、病理学中使用最为广泛的技术方法。HE染色是将组织切片或细胞涂片等分别浸入苏木素染色液和伊红染色液中，经过适当的时间和处理，使组织、细胞及其他成分染上不同深浅的颜色，产生不同的折射率，从而便于光学显微镜下进行观察和研究。

苏木素是一种碱性染料，由洋苏木中提取，被氧化后生成苏木因，同媒染剂共同使用，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色。苏木素的分子式为C₁₆H₁₄O₆，结构式如下：

常用的苏木素染色液主要有Ehrlich苏木素染色液、Harris苏木素染色液、Cole苏木素染色液、Mayer苏木素染色液、Carazzi苏木素染色液、改良Lillie-Mayer苏木素染色液以及Gill改良苏木素染色液等。

伊红，为酸性染料，分为水溶性和醇溶性两种，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。

水溶性伊红的结构式为：

醇溶性伊红的结构式为：

伊红染色液在水中可离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷结合，从而使细胞质染成深浅不一的红色。目前，采用的伊红染色液主要为：水溶性伊红的水溶液、醇溶性伊红的95%乙醇溶液以及水溶性伊红和焰红B的80%乙醇溶液。美国专利文献US2011053279A1中，还公开了一种检测在聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质的染色方法及其有机染色剂，其中，公开的染色剂为伊红Y或焰红B中的一种。然而，上述所有采用伊红作为染色剂的染色液中，均存在以下问题：1）染料的组成单一，造成对细胞质以及细胞外基质染色时，层次不够清晰；2）由于伊红染色强度较低，上述伊红染色液中均需加入乙酸作为促染剂，以加强染色强度，而促染剂的加入会导致染色色彩层次的弱化，进一步加剧了染色层次不够清晰的问题；同时，加入促染剂后，不仅在后续对切片的处理过程中，需洗涤酸性物质，且残留的酸性物质过多时，会造成切片保存过程中易于褪色，得到的切片无法长期存放。

现有的HE染色液，即苏木素伊红染色液，由于伊红染色液染色层次不清晰、着色效果不好，进而造成了染色后的组织切片或细胞涂片等的背景模糊，读片困难。

发明内容

为此，本发明所要解决的第一个技术问题在于现有的伊红染色液染色层次不清晰、着色效果不好，进而提供一种层次清晰、着色效果好的伊红染色液。

本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种背景清晰、层次分明、染色效果好、易于读片的HE染色液。

本发明提供了所述HE染色液的制备方法。

本发明还提供了所述HE染色液的染色方法

为解决上述技术问题，本发明的伊红染色液，每100ml所述伊红染色液中包括如下组分：伊红0.3-0.5g；比布列西猩红0.03-0.05g；焰红0.15-0.25g；乙醇5-60ml；余量为水。

每100ml所述伊红染色液中还包括苯扎氯铵0.05-1g。

优选的，所述伊红染色液，每100ml所述伊红染色液中包括如下组分：

伊红0.5g；比布列西猩红0.04g；焰红0.21g；苯扎氯铵0.1g；乙醇20ml；余量为水。

其中，所述伊红为水溶性伊红Y；

所述焰红，优选焰红B，所述焰红B的CAS登录号为18472-87-2，结构式为：

所述比布列西猩红，其CAS登录号为4196-99-0，结构式为：

所述水为去离子水或蒸馏水中的一种；

本发明还提供了所述伊红染色液的制备方法，具体为：将伊红、比布列西猩红、焰红溶解于水中，加入所述醇，过滤，即得伊红染色液。

所述伊红染色液的配制还包括在向所述水中加入所述伊红、所述比布列西猩红、所述焰红、所述乙醇后，再加入按选定的比例称取的所述苯扎氯铵的步骤。

本发明提供一种HE染色液，包括上述伊红染色液，还包括苏木素染色液。

所述苏木素染色液，至少包括苏木素，可以是Ehrlich苏木素染色液、Harris苏木素染色液、Cole苏木素染色液、Mayer苏木素染色液、Carazzi苏木素染色液以及改良Lillie-Mayer苏木素染色液、Gill改良苏木素染色液中的任意一种。

本发明还提供了所述的HE染色液的染色方法，包括以下步骤：

1）切片预处理：取待染色石蜡切片按常规方式脱蜡、水化；

2）苏木素伊红染色：将步骤1）中得到的经预处理后切片置于所述苏木素染色液中染色3-15min；取出后水洗，分化，水洗，返蓝后，再水洗；取所述伊红染色液对切片染色10-60s；

3）切片脱水、透明、封片：将步骤2）得到的染色后的切片采用常规方式脱水，透明处理，封片，即可。

进一步的，所述的HE染色液的染色方法，所述步骤1）为：取石蜡切片置于二甲苯中脱蜡2-3次，每次5-10min；将上述石蜡切片依次置于无水乙醇中2-3次、每次3-5min，体积分数为90%-95%的乙醇中1-2次、每次1-3min，体积分数为60%-80%的乙醇中1-3min，再水洗1-5min。

优选的，所述步骤1）为：取石蜡切片置于二甲苯中脱蜡3次，每次5min；将上述石蜡切片依次置于无水乙醇中2次、每次3min，体积分数为95%的乙醇中2次、每次3min，体积分数为70%的乙醇中3min，再用蒸馏水水洗5min。

所述步骤2）为：将步骤1）中得到的经预处理后切片置于所述苏木素染色液中染色3-15min；取出后水洗1-20min，用0.1%-1%盐酸乙醇分化1-60s后，水洗1-5min，用0.2%氨水或饱和碳酸锂水溶液返蓝30s-60s后，水洗1-5min；取所述伊红染色液对切片染色10s-60s。

优选的，所述步骤2）为：将步骤1）中得到的经预处理后切片置于所述苏木素染色液中染色；取出后水洗5min，用0.25%盐酸乙醇分化30s后，水洗5min，用1.36%的碳酸锂水溶液中返蓝30s后，水洗5min；取所述伊红染色液对切片染色15s。

所述步骤3）为：将步骤2）得到的染色后的切片分别用体积分数为60-80%的乙醇脱水10-30s，体积分数为95%的乙醇脱水2-3次、每次1-5min，无水乙醇脱水2-3次，每次1-5min；再置于二甲苯中透明2-3次，每次2-5min；封片，即可。

优选的，所述步骤3）为：将步骤2）得到的染色后的切片分别用体积分数为80%的乙醇脱水30s，体积分数为95%的乙醇脱水2次、每次3min，无水乙醇脱水2次，每次3min；再置于二甲苯中透明2次，每次5min；封片，即可。

其中，所述的二甲苯可以是邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯中的一种或多种的混合物。不同的二甲苯在对所述石蜡切片进行染色过程中，效果并无差异。

需要说明的是，采用所述苏木素染色液及所述伊红染色液进行染色时，本领域技术人员可根据染色情况及染色要求对染色、分化、返蓝时间做适当调整。

本发明的HE染色液可按照上述步骤对石蜡切片进行染色，但是，需要说明的是，本发明的苏木素伊红染色液的染色对象包括但不限于石蜡切片，本领域技术人员也可采用常规手段对冰冻切片、培养基细胞等进行染色操作。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

（1）本发明的伊红染色液，包括伊红、比布列西猩红、焰红B、苯扎氯铵以及水。采用伊红、比布列西猩红、焰红B三种不同深浅的染料组成，可使染色的层次分明，色彩鲜艳，并且，以上三种染料联用，相较于单独使用伊红或焰红，具有较为理想的着色强度，可保证足够的染色强度，不需加入促染剂，从而避免了促染剂对染色色彩层次的弱化的问题，也避免了洗涤促染剂的操作，简化了使用伊红染色液染色时的操作步骤，使用更为方便，同时，也不存在促染剂残留而使染色后的切片易褪色、不易长期保存的问题。

（2）本发明的伊红染色液，所述伊红染色液还包括0.05-1g/100ml的苯扎氯铵，苯扎氯铵的添加，避免染料残渣的产生污染切片，具有一定的匀染作用，防止伊红染色过染、染色不均，并起到良好的抑菌、杀菌作用，使所述伊红染色液不易污染切片，且具有较长的有效期。

（3）本发明的HE染色液，所述伊红染色液对细胞质和细胞外基质染色，层次丰富，着色清晰，由此得到的切片背景清晰、层次分明、染色效果好、易于读片，且不易褪色，便于长期存放。

（4）本发明的HE染色液的染色方法，采用所述伊红染色液染色后无需水洗即可脱水、透明、封片。节省了操作步骤，使用更为方便。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。

图1是采用本发明实施例1得到的所述苏木素伊红染色液对甲状腺乳头状癌亚型进行染色的病理切片图；

图2是采用本发明实施例2得到的所述苏木素伊红染色液对甲状腺乳头状癌细胞涂片进行染色的病理切片图；

图3是采用本发明实施例3得到的所述苏木素伊红染色液对甲状腺乳头状癌细胞涂片（核内包含体）进行染色的病理切片图；

图4是采用本发明实施例4得到的所述苏木素伊红染色液对甲状腺滤泡癌瘤栓转移进行染色的病理切片图；

具体实施方式

本发明下述各实施例中，所述的水溶性伊红Y、乙醇、冰乙酸、苯扎氯铵、比布列西猩红以及焰红可以选用现有技术中常规采用的产品进行苏木素伊红染色液的制备，以下仅给出其中一种型号的产品予以阐述本发明的效果，市售各型号的产品之间效果并无差异。其中：

水溶性伊红Y，上海沪试化工有限公司，BS，纯度90%

比布列西猩红，CAS编码为4196-99-0，上海沃凯生物技术有限公司，BS，纯度70%

焰红，CAS编码为18472-87-2，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，BS，纯度85%。

实施例1

本实施例的伊红染色液，每100ml所述伊红染色液中包括如下组分：

伊红Y0.5g；比布列西猩红0.04g；焰红B0.21g；苯扎氯铵0.1g；乙醇20ml；余量为去离子水。

其制备方法如下：

按选定的比例取水溶性伊红Y、比布列西猩红、焰红B、苯扎氯铵、水、乙醇，向所述水中加入所述水溶性伊红Y、所述比布列西猩红、所述焰红B、苯扎氯铵，混合均匀，再加入所述乙醇，过滤，即得伊红染色液。

本实施例的HE染色液，包括上述制得的伊红染色液，还包括苏木素染色液。

每100ml所述苏木素染色液中包括如下组分：

苏木素1g；铝盐：硫酸铝铵10g；氧化剂：红色氧化汞0.25g；苯扎氯铵0.1g；醇：乙醇10ml；弱酸：冰乙酸2.1g；余量为去离子水。

取上述HE染色液，对石蜡切片进行染色操作，具体包括以下步骤：

1）切片预处理：取石蜡切片置于二甲苯中脱蜡3次，每次5min；将上述石蜡切片依次置于无水乙醇中2次、每次3min，体积分数为95%的乙醇中2次、每次3min，体积分数为70%的乙醇中3min，再用蒸馏水水洗5min；

2）苏木素伊红染色：将步骤1）中得到的经预处理后切片置于所述苏木素染色液中染色5min；取出后水洗5min，用0.25%盐酸乙醇分化30s后，水洗5min，用1.36%的碳酸锂水溶液中返蓝30s后，水洗5min；取所述伊红染色液对切片染色15s；

3）切片脱水、透明、封片：将步骤2）得到的染色后的切片分别用体积分数为80%的乙醇脱水30s，体积分数为95%的乙醇脱水2次、每次3min，无水乙醇脱水2次，每次3min；再置于二甲苯中透明2次，每次5min；封片，即可。

实施例2

醇溶性伊红0.4g；比布列西猩红0.03g；焰红0.25g；苯扎氯铵1g；乙醇5ml；余量为蒸馏水。

其制备方法如下：

按选定的比例取水溶性伊红、比布列西猩红、焰红、苯扎氯铵、水、乙醇，向所述水中加入所述水溶性伊红、所述比布列西猩红、所述焰红、苯扎氯铵，混合均匀，再加入所述乙醇，过滤，即得伊红染色液。

每100ml所述苏木素染色液中包括如下组分：

苏木素0.3g；铝盐：硫酸铝钾10g；氧化剂：碘酸钠0.03g；苯扎氯铵0.525g；醇：乙二醇5ml；弱酸：水杨酸0.03g；余量为蒸馏水。

1）切片预处理：取石蜡切片置于二甲苯中脱蜡2次，每次10min；将上述石蜡切片依次置于无水乙醇中3次、每次4min，体积分数为90%的乙醇中1次、每次2min，体积分数为60%的乙醇中2min，再用蒸馏水水洗1min；

2）苏木素伊红染色：将步骤1）中得到的经预处理后切片置于所述苏木素染色液中染色10min；取出后水洗1min，用1%盐酸乙醇分化1s后，水洗3min，用0.2%氨水溶液返蓝30s后，水洗3min；取所述伊红染色液对切片染色10s；

3）切片脱水、透明、封片：将步骤2）得到的染色后的切片分别用体积分数为60%的乙醇脱水10s，体积分数为95%的乙醇脱水3次、每次1min，无水乙醇脱水3次，每次1min；再置于二甲苯中透明2次，每次2min；封片，即可。

实施例3

水溶性伊红0.3g；比布列西猩红0.05g；焰红0.15g；苯扎氯铵0.525g；乙醇60ml；余量为蒸馏水。

其制备方法同实施例2中的制备方法。

每100ml所述苏木素染色液中包括如下组分：苏木素0.65g；铝盐：硫酸铝6.25g；氧化剂：高锰酸钾0.11g；苯扎氯铵0.05g；醇：丙三醇32.5ml；弱酸：柠檬酸0.2g；余量为去离子水。

1）切片预处理：取石蜡切片置于二甲苯中脱蜡3次，每次7.5min；将上述石蜡切片依次置于无水乙醇中2次、每次5min，体积分数为93%的乙醇中2次、每次1min，体积分数为80%的乙醇中1min，再用蒸馏水水洗3min；

2）苏木素伊红染色：将步骤1）中得到的经预处理后切片置于所述苏木素染色液中染色10min；取出后水洗20min，用0.1%盐酸乙醇分化16s后，水洗1min，用饱和碳酸锂水溶液返蓝30s后，水洗1min；取所述伊红染色液对切片染色60s；

3）切片脱水、透明、封片：将步骤2）得到的染色后的切片分别用体积分数为70%的乙醇脱水20s，体积分数为95%的乙醇脱水2次、每次5min，无水乙醇脱水2次，每次5min；再置于二甲苯中透明3次，每次3min；封片，即可。

实施例4

伊红Y0.5g；比布列西猩红0.04g；焰红B0.2g；苯扎氯铵0.05g；乙醇32.5ml；余量为水。

其制备方法同实施例2中的制备方法。

每100ml所述苏木素染色液中包括如下组分：苏木素1g；铝盐：氯化铝0.5g；氧化剂：过氧化氢2.3g；苯扎氯铵1g；醇：甲醇60ml；弱酸：冰乙酸2.1g、柠檬酸0.2g；余量为水。

1）切片预处理：取石蜡切片置于二甲苯中脱蜡3次，每次5min；将上述石蜡切片依次置于无水乙醇中2次、每次3min，体积分数为95%的乙醇中2次、每次3min，体积分数为70%的乙醇中3min，再水洗5min；

2）苏木素伊红染色：将步骤1）中得到的经预处理后切片置于所述苏木素染色液中染色6.5min；取出后水洗11min，用0.5%盐酸乙醇分化30s后，水洗5min，用0.2%稀氨水返蓝30s后，水洗5min；取所述伊红染色液对切片染色15s；

实施例5

伊红Y0.5g；比布列西猩红0.04g；焰红B0.21g；苯扎氯铵0.1g；乙醇20ml；余量为水。

其制备方法同实施例2中的制备方法。

所述苏木素染色液，为Gill改良苏木素染色液，具体包括以下组分：2g苏木素；200ml无水乙醇；9.04g硫酸铝；750ml蒸馏水；0.2g碘酸钠；20ml冰醋酸。

1）切片预处理：取待染色石蜡切片按常规方式脱蜡、水化；

2）苏木素伊红染色：将步骤1）中得到的经预处理后切片置于所述苏木素染色液中染色10min；取出后水洗，分化，返蓝后，再水洗；取所述伊红染色液对切片染色12s；

实施例6

其制备方法同实施例2中的制备方法。

所述苏木素染色液，为Carazzi苏木素染色液，具体包括以下组分：0.5g苏木素；100ml丙三醇；17.41g硫酸铝钾；400ml蒸馏水；0.1g碘化钾。

1）切片预处理：取待染色石蜡切片按常规方式脱蜡、水化；

2）苏木素伊红染色：将步骤1）中得到的经预处理后切片置于所述苏木素染色液中染色10min；取出后水洗，用返蓝剂返蓝后，再水洗；取所述伊红染色液对切片染色10s；

实施例7

其制备方法同实施例2中的制备方法。

所述苏木素染色液，为改良Lillie-Mayer苏木素染色液，具体包括以下组分：5g苏木素；34.82g硫酸铝钾；0.5g碘酸钠；700ml蒸馏水；20ml冰醋酸。

1）切片预处理：取待染色石蜡切片按常规方式脱蜡、水化；

2）苏木素伊红染色：将步骤1）中得到的经预处理后切片置于所述苏木素染色液中染色6.5min；取出后水洗，分化，返蓝后，再水洗；取所述伊红染色液对切片染色10s；

实施例8

其制备方法同实施例2中的制备方法。

所述苏木素染色液为Ehrlich苏木素染色液，具体包括如下组分：1g苏木素；100ml无水乙醇；40.94g硫酸铝铵；100ml甘油；100ml蒸馏水；10ml冰醋酸。

取上述HE染色液，采用常规方式对冰冻切片进行染色操作。

实施例9

其制备方法同实施例2中的制备方法。

所述苏木素染色液，为Harris苏木素染色液，具体包括1g苏木素；10ml无水乙醇；13.93g硫酸铝钾；0.5g氧化汞；190ml蒸馏水；10ml冰醋酸。

取上述HE染色液，采用常规方式对培养基细胞进行染色操作。

实施例10

其制备方法同实施例2中的制备方法。

所述苏木素染色液，为Cole苏木素染色液，具体包括以下组分：1.5g苏木素；50ml1%的碘的95%乙醇溶液；700ml饱和的十二水合硫酸铝钾溶液；250ml蒸馏水。

实施例11

其制备方法同实施例2中的制备方法。

所述苏木素染色液，至少包括0.1%（w/v)的苏木素。

取上述HE染色液，采用常规方式对冰冻切片进行染色操作。

对比例1

本对比例中的伊红染色液，不包括苯扎氯铵、比布列西猩红、焰红，其余组分均与实施例1相同，并按照实施例1的制备方法制备。

取本对比例制得的所述苏木素伊红染色液，按照实施例1的染色方法染色。

对比例2

本对比例中的伊红染色液，不包括苯扎氯铵、比布列西猩红，其余组分均与实施例1相同，并按照实施例1的制备方法制备。

对比例3

本对比例中的伊红染色液，不包括苯扎氯铵，其余组分均与实施例1相同，并按照实施例1的制备方法制备。

对比例4

本对比例中的伊红染色液，不包括比布列西猩红、焰红，其余组分均与实施例1相同，并按照实施例1的制备方法制备。

效果对比例

为说明本发明的效果，将实施例1-11及对比例1-4中得到的所述伊红染色液，在20℃下用于常规染色两周，观察染色液情况。

取实施例1-11及对比例1-4中得到的所述苏木素染色液及所述伊红染色液，分别按照实施例1-11及对比例1-4中所述的染色方法进行染色，观察得到的切片或培养基细胞。

观察结果如下：

结论：

本发明所述的伊红染色液，对切片进行染色时，背景清晰、层次分明、染色效果好、易于读片，且不易褪色，便于长期存放。包含本发明所述的伊红染色液的所述HE染色液，可实现良好的染色效果。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种伊红染色液，其特征在于，每100ml所述伊红染色液中由如下组分组成：

伊红0.3-0.5g；比布列西猩红0.03-0.05g；焰红0.15-0.25g；苯扎氯铵0.05-1g；乙醇5-60ml；余量为水。

2.根据权利要求1所述的伊红染色液，其特征在于，每100ml所述伊红染色液中包括如下组分：

3.根据权利要求1或2所述的伊红染色液，其特征在于，

所述水为去离子水或蒸馏水中的一种；

所述伊红为水溶性伊红Y。

4.根据权利要求1-3任一所述的伊红染色液的制备方法，其特征在于，将伊红、比布列西猩红、焰红溶解于水中，加入所述醇，过滤，即得伊红染色液。

5.根据权利要求4所述的伊红染色液的制备方法，其特征在于，所述伊红染色液的配制还包括在向所述水中加入所述伊红、所述比布列西猩红、所述焰红、所述乙醇后，再加入按选定的比例称取的所述苯扎氯铵的步骤。

6.一种HE染色液，包含权利要求1-3任一项所述的伊红染色液。

7.权利要求6所述的HE染色液，其特征在于，还包括苏木素染色液。

8.根据权利要求6或7所述的HE染色液的用于非诊断目的的染色方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)切片预处理：取待染色石蜡切片按常规方式脱蜡、水化；

2)苏木素伊红染色：将步骤1)中得到的经预处理后切片置于所述苏木素染色液中染色3-15min；取出后水洗，分化，水洗，返蓝后，再水洗；取所述伊红染色液对切片染色10-60s；

3)切片脱水、透明、封片：将步骤2)得到的染色后的切片采用常规方式脱水，透明处理，封片，即可。

9.根据权利要求8所述的HE染色液的用于非诊断目的的染色方法，其特征在于，所述步骤1)为：取石蜡切片置于二甲苯中脱蜡2-3次，每次5-10min；将上述石蜡切片依次置于无水乙醇中2-3次、每次3-5min，体积分数为90％-95％的乙醇中1-2次、每次1-3min，体积分数为60％-80％的乙醇中1-3min，再水洗1-5min。

10.根据权利要求9所述的HE染色液的用于非诊断目的的染色方法，其特征在于，所述步骤1)为：取石蜡切片置于二甲苯中脱蜡3次，每次5min；将上述石蜡切片依次置于无水乙醇中2次、每次3min，体积分数为95％的乙醇中2次、每次3min，体积分数为70％的乙醇中3min，再用蒸馏水水洗5min。

11.根据权利要求8-10任一所述的HE染色液的用于非诊断目的的染色方法，其特征在于，所述步骤2)为：将步骤1)中得到的经预处理后切片置于所述苏木素染色液中染色3-15min；取出后水洗1-20min，用0.1％-1％盐酸乙醇分化1-60s后，水洗1-5min，用0.2％氨水或饱和碳酸锂水溶液返蓝30s-60s后，水洗1-5min；取所述伊红染色液对切片染色10s-60s。

12.根据权利要求11所述的HE染色液的用于非诊断目的的染色方法，其特征在于，所述步骤2)为：将步骤1)中得到的经预处理后切片置于所述苏木素染色液中染色5min；取出后水洗5min，用0.25％盐酸乙醇分化30s后，水洗5min，用1.36％的碳酸锂水溶液中返蓝30s后，水洗5min；取所述伊红染色液对切片染色15s。

13.根据权利要求8-12任一所述的HE染色液的用于非诊断目的的染色方法，其特征在于，所述步骤3)为：将步骤2)得到的染色后的切片分别用体积分数为60-80％的乙醇脱水10-30s，体积分数为95％的乙醇脱水2-3次、每次1-5min，无水乙醇脱水2-3次，每次1-5min；再置于二甲苯中透明2-3次，每次2-5min；封片，即可。

14.根据权利要求13所述的HE染色液的用于非诊断目的的染色方法，其特征在于，所述步骤3)为：将步骤2)得到的染色后的切片分别用体积分数为80％的乙醇脱水30s，体积分数为95％的乙醇脱水2次、每次3min，无水乙醇脱水2次，每次3min；再置于二甲苯中透明2次，每次5min；封片，即可。