JP4535396B2 - パパニコロー染色法 - Google Patents

Description

本発明は生体サンプルの染色に有効な方法、物体および組成物に関する。

医学診断検査方法は病的状態の早期発見にとって重要なスクリーニング手段である。早期発見により、このような状態を治療の成功率がより高い段階で特定することができる。早期治療もまた多くの場合、損傷がより小さく、または侵襲性のより低い治療法につながり、さらに患者への影響も小さくする。通常のスクリーニングに加えて、診断検査は生検分析および進行中の治療の結果をモニタリングすることを含め、その他様々に使用されている。

診断検査に特に有効な手段の一つは、パパニコロー染色法である。この方法は、当初婦人科検体の染色用として開発され、子宮頸癌による致死率を劇的に下げた。現在パパニコロー染色は、多くの種類の組織および器官の様々な病的状態の診断に用いられている。

しかしながらパパニコロー染色は、処理されたサンプルを正しく判読する技師または機器の能力に不利な影響を及ぼすことがあるアーチファクトを起こしやすい。これらアーチファクトとしては、誤った、非特異的な細胞質の染色、細胞質の亀裂、フレーク化、不鮮明な核細部、低色素性染色および過色素性染色といったアーチファクトを挙げることができる。このようなアーチファクトは、少なくとも評価可能なサンプルの画分を減らし、正確な診断を干渉する誤った染色パターンを生じ、サンプルを判読不能にすることもある。このようなサンプル分析の困難は、患者の不安、再スクリーニングのコスト、診断の遅れおよび、より重要なことには、起こりうる誤診断の増大につながる。

当分野では診断試料染色について改良された処置、ならびにこのような方法で有効な組成物および製品が必要とされている。

発明の概要
パパニコロー染色法を用いて生体サンプルを処理するための、改良された方法を提供する。この方法は様々な段階のいずれかにある染色法に洗剤処理を組み込むことで構成される。この方法は、パパニコロー染色中に生成するアーチファクトの数を効果的に減らすことが分かっている。また、このような方法で染色したサンプルも提供する。

発明の詳細な説明
発明者は、パパニコロー染色工程に洗剤処理を組み込むと、方法に影響を及ぼすアーチファクトの発生が低減することを都合よく発見した。洗剤を使用すると、この方法により染色した細胞の細胞質から過剰な染色剤を除去し、コントラストを上げ、細胞、核および染色体の形態を検出する能力を改善できることが見出されている。さらに、細胞質からの過剰な染色剤の除去により、異常を伴った過染色症を検出する能力を上げることもある。

用語“パパニコロー染色法”、“パパニコロー染色”、“パパニコロー検査”等は、サンプル、例えば子宮頸部細胞のような婦人科スクリーニング検査時に得たサンプルの細胞核と細胞質を分染する、改良型または非改良型パパニコロー染色法を指す。

検査は、サンプル内の各種タイプの細胞の染色パターン、染色度ならびに核および細胞質の大きさおよび形態の識別能力に拠っている。パパニコロー染色法は、濃く染まった核および透明な細胞質を都合よく提供するが、これは子宮頸部細胞を含む特定サンプリング技術が提供する多層サンプル内の異常細胞の検出に特に有効である。

使用可能な検査は、サンプル中の相当な割合の細胞を読取ることができるものであり、そうでない場合には検査の正確性が問題になること、およびサンプルが使用できなくなることもあり、再スクリーニングの追加コストおよび患者の不安の増大につながる。

その結果、サンプル内にある細胞の真の染色パターンを識別する能力を下げる染色時のアーチファクトがパパニコロー検査の有効性を大きく損なうことがある。アーチファクトは、核と細胞質との染色パターンを区別する能力を下げ、判読不能な細胞またはサンプル領域の割合を増やし、そして細胞質の染色度を上げることがあり、その結果としてパパニコロー検査の主たる利点の一つである透明性を下げ、それによりサンプル内の異常細胞の識別をより困難にすることがある。

本発明を更に詳しく記載する前に、本発明が記載する特定の方法論、溶液および装置に限定されず、このような方法、溶液または装置は、もちろん変えることができることを理解しなければならない。さらに、ここに用いる用語は、特定の実施形態を記載する目的だけのものであり、本発明の範囲を限定するものではないことも理解しなければならない。

単数形“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”を使用する場合は、特に前後関係が明らかに指示しない限り、複数形の表示も包含している。即ち、例えば“（１つの）サンプル”と表した場合、複数のサンプルも包含し、“（１つの）洗剤”と表す場合は、複数のそのような洗剤も包含し、“（１つの）対比染色”と表す場合は、複数の対比染色も包含する。さらに、特定の複数形表現、たとえば“２”、“３”等を使用する場合、特に前後関係が明瞭に指示しない限り、そのものより大きな数も包含する。

“接続した”、“取付けた”および“連結した”といった用語は、ここでは互換的に用いられ、特に前後関係が明瞭に指示しない限り、直接的だけでなく間接的な接続、取付け、連結および結合を包含する。数値範囲が挙げられる場合、挙げられているその範囲の上限値と下限値の間にある各整数およびその各分数も、それら値の間にある副領域と共に、明確に開示されている。いずれの領域の上限および下限も独立にその領域に含める、または排除することができ、限界のいずれか一方を含む、またはいずれも含まない、または両方とも含む各領域も本発明に包含される。論じられる数値に元々限界がある場合、例えば成分が０〜１００％の濃度で表すことができる場合、または水溶液のｐＨが１〜１４の範囲で変化する場合、これら固有の限界は具体的に開示される。数値を明示的に挙げる場合、それに基づく範囲と同様に挙げられた数値とほぼ同一の数または量である数値もまた本発明の範囲内である。組合せが開示されている場合、組合せの要素の各小組合せも同時に明瞭に開示されるものとし、本発明の範囲内である。逆に、異なる要素または要素群が開示されている場合、その組合せも開示されたものとする。本発明のいずれかの要素が複数の代替物を有するものとして開示されている場合は、それにより、各代替物だけを除いた場合、または他の代替物と組合せた場合のその発明の例も同時に開示されている。即ち、発明の１以上の要素がそのような除外を有することができ、したがって、そのような除外を有する要素のあらゆる組合せが開示される。

定義されるか、または前後関係が特に明確に指示しない限り、ここに用いる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。ここに記した方法および材料に類似なまたは均等な方法および材料を発明の実施または検査に使用できるが、好ましい方法および材料をここに記載する。

用語“任意の”または“任意に”は、続いて記載される事象または状況が起こっても、または起こらなくともよいこと、ならびにその事象または状況が起こる事例およびそれが起こらない事例を含むことを意味する。

パパニコロー染色
パパニコロー染色法は、少なくともヘマトキシリン染色段階、オレンジＧ細胞質対比染色段階およびエオシンＹ−ライトグリーン／ファーストグリーン対比染色段階を含む。方法は、パパニコロー染色が、子宮頸部細胞から得た細胞のように多層に覆われた細胞の分析に特に有効である、透明な細胞質を持つサンプルを生成する“ブルーイング”段階を含んでもよい。

パパニコロー染色法を開始する前に、サンプルを固定しなければならない。満足できる結果を生ずるのであれば、いずれの固定法を用いてもよい。一般的には、パパニコロー染色ではアルコール固定、例えば９５％エタノール、１００％メタノール、８０％プロパノール、または９５％エタノール／エーテル（１：１）を用いる。市販のスプレー固定剤を用いてもよい。

典型的なパパニコロー染色法は、細胞の染色質を染色する金属媒染剤と組合せたヘマトキシリン染色段階を含むが、この染色段階は漸進性または逆行性に行ってもよい。染色質染色はこの検査の重要部分であり、染色質の大きさ、染色度および染色パターンは、サンプル中にある異常細胞の分析の重要要素である。ヘマトキシリンは、ハリス、ジル、デラフィルド、エーリッヒまたはマイヤーのヘマトキシリを含むいずれのものを使用してもよい。ヘマトキシリンの代用物として用いられる色素、例えばチオニン、ビクトリアブルーＢ、アズールＢ等も用いることができる。

逆行的に行う場合は、サンプルを一度過染色してから、染色度を希望レベルまで下げることができる薬剤（例えば希塩酸）を用いて分染する。こうすると染色の色が青／紫からサーモンピンク／赤に変化する。“ブルーイング”段階を用いて、当分野周知の薬剤（例えばスコットの水道水代用物、アンモニア水、炭酸リチウム）で再度青色にしてもよい。ブルーイング溶液は、分染段階なしに組入れることもできる。

パパニコロー染色では、細胞質対比染色を複数回行うことで、サンプル内の各種細胞の種類、それらの形態およびその頻度を知ることができる。

細胞質染料のオレンジＧおよびエオシンＹ−ライトグリーン／ファーストグリーンは、アルコールで調製する。オレンジＧは、ケラチンが存在する場合に、細胞質を黄色またはオレンジ色に染める単色性染料であり、これによって、成熟した、または成熟中のケラチンを生成する悪性の細胞と、より明白でない良性の細胞とを見分ける。オレンジＧは、細胞染色分野周知のいずれの形態の溶液で使用でき、例えばＯＧ−６として使用できる。

伝統的にエオシンＹ−ライトグリーン／ファーストグリーンは、３種類の染料、エオシンＹ、ライトグリーンＳＦおよび／またはファーストグリーンＦＣＦ、ならびにビスマルクブラウンの混合物として調製する。混合物例としては、ＥＡ３６、ＥＡ５０およびＥＡ６５が挙げられる。エオシンＹは核小体、繊毛、赤血球細胞、および成熟扁平上皮細胞の細胞質の中でピンク色になる。ライトグリーンＳＦイエロウィシュおよびファーストグリーンＦＣＦは、代謝が活発な傍基底扁平上皮細胞、中間扁平上皮細胞、および柱細胞の細胞質中で青／緑色を発する。ビスマルクブラウンはパパニコロー染色においては有益な染色パターンを生じることなく、各種の方法例から排除することができる。ライトグリーンＳＦイエロウィシュの代替物、例えばファーストグリーンＦＣＦを用いてもよい。細胞質対比染料は、対比染料として用いるための単一溶液となるＯＧおよびエオシンＹ−ライトグリーン／ファーストグリーンの混合物でもよい。

細胞質対比染料を調合するアルコールは細胞質を透明にするが、これはパパニコロー染色法により染色したサンプルの分析にとって有益である。

染色手順の中には、水性液と非水性液との間を行き来させて水和／脱水を繰り返す形で洗浄段階が適切に組込まれる。染色終了後は、当分野周知のように、サンプルをきれいにしてマウントすることができる。パパニコロー染色作業の前、またはそれに続いて追加の作業をサンプルに行ってもよい。そうした後サンプルは、手動でおよび／または好適な装置、例えば自動画像化システムを使って分析できる。自動画像化システムの例としてはサイティックコーポレーションのＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、ＴｒｉＰａｔｈ ＦｏｃａｌＰｏｉｎｔ^ＴＭ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ、Ｃｈｒｏｍａ Ｖｉｓｉｏｎ Ａｃｉｓ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ、ＣｏｍｐｕｔＣｙｔｉＣｙｔｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ ＣｙｔｏＶｉｓｉｏｎ^ＴＭ ＳｙｓｔｅｍおよびＶｅｒａｃｅｌ Ｖｅｒａｓｙｓ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを挙げることができる。

パパニコロー染色手順には様々な変更が加えることができ、また当技術分野周知でもある。例えば、本方法は、米国特許第５，１６８，０６６号および第６，３４８，３２５号（それぞれ１９９２年１２月１日および２００２年２月１９日発行）に記載されているように変更して、チオニンの使用を組込んでもよい。その他のチアジン色素およびトリアリールメタン色素も使用できる。

サンプル
分析対象となるサンプル部分は細胞、組織または体液を含む、生きている個体から直接または間接的に得ることができる生物材料である。サンプルの非限定例としては、血液、尿、精液、乳、唾液、粘液、胸膜液、骨盤液、滑液、腹水、体腔洗浄液、眼濯ぎ液、皮膚擦過物、口腔内スワブ、膣スワブ、子宮頸部細胞、直腸スワブ、吸引液、針生検、例として手術または解剖によりサンプルとして得た組織切片、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外分泌物、呼吸器や腸、尿生殖器官、涙液、唾液、腫瘍、臓器ならびにインビトロ細胞培養成分のサンプルを挙げることができる。一般に、そのサンプルは、婦人科検査や異常細胞を含むことが疑われる生検で通常得られるような子宮頸部細胞であろう。

このサンプルは、異常な細胞を含むことが分かっている陽性コントロールサンプルでもよい。陰性コントロールサンプルも使用できるが、これは与えられた一連の染色条件が偽陽性（サンプル中にまさに異常細胞がない状態での陽性信号）を生ずるか判定するのに用いる。

一般に、サンプルはスライド等のガラス表面、例えばバイアル瓶やカバースリップ、または分析に用いられる入射光に対し透明であるそのほかの表面の上で染色することが規定されている。

洗剤
パパニコロー染色手順中に生成するアーチファクトを目に見える形で低減する、いずれの洗剤も用いることができる。洗剤は、このようなアーチファクトを認められるほど低減するのに相応しい量および時間用いられる。このようなアーチファクトの少なくとも１つの割合は、ここに記載した洗剤洗浄を組込むことによって、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７０％、９０％、９５％、９８％またそれ以上望ましく低減することができる。当発明は、この技術分野で知られるようなあらゆる各種パラメータに基づいて分析対象とする特定のスライドの領域（研究分野）を選択する画像化システムで用いた時、誤って選択された領域の数（画像化システムの選択基準に合致する染色時のアーチファクトに基づき、分析対象として誤って選択された領域）を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７０％、９０％、９５％、９８％、またはそれ以上望ましく低減する。これにより、分析対象として選択される有効領域の割合が増加する。

洗剤は、非イオン性、陽イオン性、陰イオン性、または両性イオン性でもよい。洗剤の混合物を用いてもよい。例示的な洗剤の種類は、アルコールエーテル硫酸塩、アルコール硫酸塩、アルカノールアミド、アルキルスルホン酸、アミンオキシド、両性洗剤、陰イオン性洗剤、ベタイン誘導体、陽イオン性洗剤、二硫酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸、エトキシル化アルコール、エトキシル化アルキルフェノール、エトキシル化脂肪酸、グリセロールエステルハイドロトロープ、ラウリル硫酸塩、モノおよびジグリセリド、非イオン性洗剤、リン酸エステル、第４級洗剤ならびにソルビタン誘導体を含む。

非イオン性洗剤の例としては、ＢｉｇＣＨＡＰ（Ｎ，Ｎ−ビス［３−（Ｄ−グルコンアミド）プロピル］コールアミド）、ビス（ポリエチレングリコールビス［イミダゾリルカルボニル］）、Ｂｒｉｊ（登録商標）３０（ポリオキシエチレン４ラウリルエーテル）、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５（ポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル）、Ｂｒｉｊ（登録商標）５２（ポリオキシエチレン２セチルエーテル）、Ｂｒｉｊ（登録商標）５６（ポリオキシエチレン１０セチルエーテル）、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８（ポリオキシエチレン２０セチルエーテル）、Ｂｒｉｊ（登録商標）７２（ポリオキシエチレン２ステアリルエーテル）、Ｂｒｉｊ（登録商標）７６（ポリオキシエチレン１０ステアリルエーテル）、Ｂｒｉｊ（登録商標）７８（ポリオキシエチレン２０ステアリルエーテル）、Ｂｒｉｊ（登録商標）９２（ポリオキシエチレン２オレイルエーテル）、Ｂｒｉｊ（登録商標）９７（ポリオキシエチレン１０オレイルエーテル）、Ｂｒｉｊ（登録商標）９８（ポリオキシエチレン２０オレイルエーテル）、Ｂｒｉｊ（登録商標）７００（ポリオキシエチレン１００ステアリルエーテル）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ（ヒマシ油／エチレンオキシドポリエーテル）、デカエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＣＡ−８）、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＣＡ−１０）、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグコシド、イソトリデシル−ポリ（エチレングリコールエーテル）_ｎ、Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミン、ｎ−デシルα−Ｄ−グルコピラノシド、デシルβ−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−ドデシルα−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド、ヘプタエチレングリコールモノデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、ｎ−ヘキサデシルβ−Ｄ−マルトシド、ヘキサエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ−６３０（オクチルフェニル−ポリエチレングリコール）、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ−２１０（ポリオキシエチレン（２）イソオクチルフェニルエーテル）、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ−５２０（ポリオキシエチレン（５）イソオクチルフェニルエーテル）、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＯ−６３０（ポリオキシエチレン（９）ノニルフェニルエーテル）、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＯ−７２０（ポリオキシエチレン（１２）ノニルフェニルエーテル）、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＯ−８９０（ポリオキシエチレン（４０）ノニルフェニルエーテル）、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＯ−９９０（ポリオキシエチレン（１００）ノニルフェニルエーテル）、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＤＭ−９７０（ポリオキシエチレン（１５０）ジノニルフェニルエーテル）、メチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシド、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、オクタエチレングリコールモノデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ペンタエチレングリコールモノデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクチルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールエーテルＷ−１、ポリオキシエチレン１０トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン１００ステアレート、ポリオキシエチレン２０イソヘキサデシルエーテル、ポリオキシエチレン２０オレイルエーテル、ポリオキシエチレン４０ステアレート、ポリオキシエチレン５０ステアレート、ポリオキシエチレン８ステアレート、ポリオキシエチレンビス（イミダゾリルカルボニル）、ポリオキシエチレン２５プロピレングリコールステアレート、サポニン、Ｓｐａｎ（登録商標）２０（ソルビタンモノラウレート）、Ｓｐａｎ（登録商標）４０（ソルビタンモノパルミテート）、Ｓｐａｎ（登録商標）６０（ソルビタンモノステアレート）、Ｓｐａｎ（登録商標）６５（ソルビタントリステアレート）、Ｓｐａｎ（登録商標）８０（ソルビタンモノオレート）、Ｓｐａｎ（登録商標）８５（ソルビタントリオレイン酸塩）、いずれかの形のタージトール（タイプ１５−Ｓ−５、１５−Ｓ−７、１５−Ｓ−９、１５−Ｓ−１２、１５−Ｓ−３０、ＮＰ−４、ＮＰ−７、ＮＰ−９、ＮＰ−１０、ＮＰ−４０、ＮＰ−Ｘ（Ｉｍｂｅｎｔｉｎ−Ｎ／６３）、ＴＭＮ−３（ポリエチレングリコールトリメチルノニルエーテル）、ＴＭＮ−６（ポリエチレングリコールトリメチルノニルエーテル）、ＴＭＮ−１０（ポリエチレングリコールトリメチルノニルエーテル）、ＭＩＮ ＦＯＡＭ１ｘ、およびＭＩＮ ＦＯＡＭ２ｘを含む）、テトラデシル−β−Ｄ−マルトシド、テトラエチレングリコールモノデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノドデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、トリエチレングリコールモノデシルエーテル、トリエチレングリコールモノドデシルエーテル、トリエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、トリエチレングリコールモノオクチルエーテル、トリエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、トリトン（登録商標）ＣＦ−２１、トリトン（登録商標）ＣＦ−３２、トリトン（登録商標）ＤＦ−１２、トリトン（登録商標）ＤＦ−１６、トリトン（登録商標）ＧＲ−５Ｍ、トリトン（登録商標）Ｎ−１０１（ポリオキシエチレン分岐ノニルフェルニエーテル）、トリトン（登録商標）ＱＳ−１５、トリトン（登録商標）ＱＳ−４４、トリトン（登録商標）ＲＷ−７５（ポリエチレングリコール２６０モノ（ヘキサデシル／オクタデシル）エーテルおよび１−オクタデカノール）、トリトン（登録商標）Ｘ−１００（ポリエチレングリコールｔ−オクチルフェニルエーテル）、トリトン（登録商標）Ｘ−１０２、トリトン（登録商標）Ｘ−１５、トリトン（登録商標）Ｘ−１５１、トリトン（登録商標）Ｘ−２００、トリトン（登録商標）Ｘ−２０７、トリトン（登録商標）Ｘ−１１４、トリトン（登録商標）Ｘ−１６５、トリトン（登録商標）Ｘ−３０５、トリトン（登録商標）Ｘ−４０５（ポリオキシエチレン（４０）イソオクチルフェニルエーテル）、トリトン（登録商標）Ｘ−４０５還元（ポリオキシエチレン（４０）イソオクチルシクロヘキシルエーテル）、トリトン（登録商標）Ｘ−４５（ポリエチレングリコール４−ｔ−オクチルフェニルエーテル）、トリトン（登録商標）Ｘ−７０５−７０、いずれかの形のトゥイーン（登録商標）（トゥイーン（登録商標）２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、トゥイーン（登録商標）２１（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、トゥイーン（登録商標）４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、トゥイーン（登録商標）６０（ポリエチレングリコールソルビタンモノステアレート）、トゥイーン（登録商標）６１（ポリエチレングリコールソルビタンモノステアレート）、トゥイーン（登録商標）６５（ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート）、トゥイーン（登録商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート）、トゥイーン（登録商標）８１（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート）、およびトゥイーン（登録商標）８５（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレイン酸）を含む）、チロキサポール（ホルムアルデヒドおよびオキシランを含む４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノールポリマー）ならびにｎ−ウンデシルβ−Ｄ−グルコピラノシドを含む。

例示的な陰イオン洗剤は、ケノデオキシコール酸、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、ジギトニン、ジギトキシゲニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミンＮ−オキシド、ドキュセートナトリウム、グリコケノデオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸、グリコデオキシコール酸、グリコリトコール酸３−硫酸２ナトリウム、グリコリトコール酸エチルエステル、Ｎ−ラウロイルサルコシン、ドデシル硫酸リチウム、ルゴール（ヨウ素ヨウ化カリウム）、Ｎｉａｐｒｏｏｆ（２−エチルヘキシル硫酸ナトリウム）、Ｎｉａｐｒｏｏｆ４（７−エチル−２−メチル−４−ウンデシル硫酸ナトリウム）、場合により置換アルキルスルホン酸塩（１−ブタンスルホン酸、ペンタンスルホン酸、ヘキサンスルホン酸、１−オクタンスルホン酸、１−デカンスルホン酸、１−ドデカンスルホン酸、１−ヘプタンスルホン酸、１−ノナンスルホン酸、１−プロパンスルホン酸および２−ブロモエタンスルホン酸の塩、特にナトリウム塩を含む）、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、場合により置換ドデシル硫酸ナトリウム、オクチル硫酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム、Sodium hyodeoxycholate、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸トリズマ（登録商標）、ウルソデオキシコール酸を含む。陰イオン性洗剤は、酸または塩、あるいはその両方の形で提供されうる。

例示的な陽イオン洗剤は、臭化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム、塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、臭化ベンジルドデシルジメチルアンモニウム、テトラクロロアイオデートベンジルトリメチルアンモニウム、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、臭化ドデシルエチルジメチルアンモニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化エチルヘキサデシルジメチルアンモニウム、ジラード試薬Ｔ、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ポリオキシエチレン（１０）−Ｎ−タロー−１，３−ジアミノプロパン、臭化トンゾニウムおよび臭化トリメチル（テトラデシル）アンモニウムを含む。

例示的な両性イオン洗剤は、ＣＨＡＰＳ（３−｛（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ｝−１−プロパン−スルホン酸）、ＣＨＡＰＳＯ（３−｛（３−コラミドプロピル）ジメチル−アンモニオ｝−２−ヒドロキシ−１−プロパン−スルホン酸）、３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホン酸、３−（ドデシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホン酸、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホン酸、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデシルアンモニオ）プロパンスルホン酸、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホン酸、および３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホン酸を含む。

洗剤は、当技術分野で周知な、または見出すことができる洗剤を包含する。洗剤は合成でき、または様々な売り主（例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ、ｗｗｗ．Ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）から商業的に得ることができる。塩化ベンザルコニウムおよびＣＨＡＰＳは、パパニコロー染色時のアーチファクト低減に特に有効であることが見出されている。

与えられた洗剤は、パパニコロー染色法の洗浄段階に組込むことにより、そのアーチファクト低減能力を試験されるが、それは染色時のアーチファクトを生ずることが分かっている条件の下で行われる。試験洗剤を用いて取り扱われるサンプルは、次に洗剤処置なしで処理されたサンプル、および塩化ベンザルコニウム処理もしくは染色時のアーチファクトを低減することが知られているその他陽性コントロール処理が施されたサンプルと対比して評価してもよい。

典型的には、使用する洗剤の量は、使用される溶液の少なくとも約０．０００１％から最大で約１０％であり、そして溶液の少なくとも０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．５％もしくは１％またはそれ以上でよい。即ち洗剤の量は、溶液の約５％以下、約２．５％以下、約２％以下、約１％以下、約０．５％以下、約０．２％以下、約０．１％以下、約０．０５％以下、またはその間の範囲もしくは部分範囲でよい。

洗剤処理はサンプル分析能力に不利な影響を及ぼさずにアーチファクトを低減できるｐＨで実施できる。即ち洗剤処理は、約ｐＨ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３またはその間の範囲もしくは部分範囲内で実施できる。典型的には、処理はｐＨ約２〜約１０で行われる。

洗剤はパパニコロー染色法のいずれかの時点で使用できる。例えば、洗剤は、ヘマトキシリン染料の前、ヘマトキシリン染料と混合して、ヘマトキシリン染料の後、ブルーイング溶液と組合せても、ブルーイング溶液の後、またはオレンジＧ、エオシンＹ−ライトグリーン／ファーストグリーンもしくはその他対比染色溶液と組合せて使用してもよい。

実施例
当業者に本発明の実施および使用の方法について完全に説明するために以下実施例を記載するが、これらは本発明と見なされる範囲を制限するものではない。用いる数値（例えば量、温度等）に関しては正確性を確保する努力を払ったが、実験誤差および偏差は考慮されるべきである。特記されない限り、割合は重量比であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力であり、全ての材料は市販されているものである。

実施例１
試験したパパニコロー染色条件で処理したパパニコロー塗抹標本スライドでは細胞質の亀裂がよく見られることが分かった。細胞質の亀裂を低減するための方法を試験するために、４種類のパパニコロー塗抹標本サンプルを得て、サンプルからスライドを作成し、固定して、１日乾燥した後、以下の手順に従って修正したパパニコロー染色で染色した：
段階１ 開始ステーション
２ 試験洗浄段階
３ ５分間 ５０％アルコール試薬
４ ５分間 塩溶液（１０％ＮａＣｌの５０％アルコール溶液）
５ ５分間 塩溶液（１０％ＮａＣｌの５０％アルコール溶液
６ １分間 ９５％アルコール試薬
７ １分間 ９５％アルコール試薬
８〜２２ １分間 核染料（１５分間）
２３ ２０秒間 イソプロピルアルコール
２４ ２０秒間 イソプロピルアルコール
２５ ３０秒間 イソプロピルアルコール
２６ ２０秒間 イソプロピルアルコール
２７〜３４ １分間 対比染色（オレンジGおよびエオシンファーストグリーン／ライトグリーンの混合物）（８分間）
３５ ３０秒間 １００％アルコール試薬
３６ ３分間 イソプロピルアルコール
３７ ３分間 イソプロピルアルコール
３８ １分間 キシレン
３９ ３分間 キシレン
４０ 終了 キシレン
スライドを最後のキシレンに移す
パーマウントを使って、手作業で封入する

４つのサンプルが細胞質の亀裂を生じ、これを試験洗浄段階にかけて、アーチファクトが低減する条件を決定した。サンプル毎に１０枚のスライドを調製した。各サンプルの１０枚のスライドについて、５分および１５分の水洗浄ならびにＦＣ１２０界面活性剤（３Ｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびＦＣ１７０界面活性剤（３Ｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）による１５分間の洗浄を別々に行った。これら洗浄条件はいずれも、細胞質に亀裂を生じる染色時のアーチファクトを劇的に低減しないことが分かった。

４種類のサンプルそれぞれについて更に１０枚のスライドを調製して、０．１％、ｐＨ６．９のＦＣ１７０、０．１％、ｐＨ６．９のトゥイーン（登録商標）８０、０．１％、ｐＨ７．０のＩｇｅｐａｌＣＡ−６３０、０．１％、ｐＨ７．７のＣＨＡＰＳ、０．１％、ｐＨ７．２のゼフィラン（登録商標）、水、塩溶液段階の前の５０％アルコール段階を行わずに水、塩溶液段階を行わずに水、および塩溶液段階前の５０％アルコール段階と塩溶液段階を行わずに水で行う１５分間の洗浄のいずれかを含む別の試験洗浄段階にかけた。

ゼフィラン（登録商標）（塩化ベンザルコニウム）は細胞質の誤った青色染色を大きく低減し、細胞質の亀裂も低減した。ＣＨＡＰＳ（登録商標）も、この濃度で、両アーチファクトをある程度まで低減した。示した濃度での他の処理は、これら染色時のアーチファクトに殆ど影響しなかった。

実施例２
洗剤洗浄段階を組入れたパパニコロー染色法の例を以下に示す。

Claims (22)

1. 固定生体サンプルを染色する方法であって：
   サンプルをヘマトキシリン染料に接触させるステップと；
   サンプルをオレンジＧ対比染料に接触させるステップと；
   サンプルをエオシンＹと、ライトグリーン及び／又はファーストグリーンとからなる対比染料に接触させるステップと；
   サンプルを、染色時のアーチファクトを低減するのに十分な量の塩化ベンザルコニウム及びＣＨＡＰＳ（３−｛（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ｝−１−プロパン−スルホン酸）から選択される洗剤に接触させるステップと；
   を具えることを特徴とする方法。
2. 前記洗剤が塩化ベンザルコニウムであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記洗剤がＣＨＡＰＳであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 前記洗剤の混合物を使用することを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 前記サンプルを、ヘマトキシリン染料の前に前記洗剤と接触させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 前記洗剤をヘマトキシリン染料と組合せることを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 前記サンプルを、ヘマトキシリン染料の後で前記洗剤と接触させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. 前記サンプルを、ブルーイング溶液と組合せて前記洗剤と接触させるステップを具えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
9. 前記サンプルを、オレンジＧ対比染料の前に前記洗剤と接触させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
10. 前記サンプルをエオシンＹと、ライトグリーン及び／又はファーストグリーンとからなる対比染料の前に前記洗剤と接触させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
11. 前記サンプルを、対比染料と組合せた前記洗剤と接触させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
12. 前記対比染料がオレンジＧであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. 前記対比染料がエオシンＹと、ライトグリーン及び／又はファーストグリーンとからなることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
14. 前記方法が自動化されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
15. 前記方法を手で行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
16. 前記サンプルを、溶液の少なくとも０．０００１％から１０％未満の濃度の前記洗剤の溶液と接触させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
17. 前記洗剤が溶液の少なくとも０．０１％であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
18. 前記洗剤が溶液の少なくとも０．１％であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
19. 前記洗剤が溶液の少なくとも０．５％であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
20. 前記洗剤が溶液の１％未満であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
21. 低レベルの染色時のアーチファクトを有する固定生体サンプルであって、前記サンプルがヘマトキシリンと、オレンジＧと、エオシンＹと、ライトグリーン及び／又はファーストグリーンとの混合物で処理された細胞を含んでおり、前記サンプルをサンプル中の染色時のアーチファクトの量を低減する、塩化ベンザルコニウム及びＣＨＡＰＳ（３−｛（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ｝−１−プロパン−スルホン酸）から選択される洗剤と接触させたことを特徴とする固定生体サンプル。
22. パパニコロー染色法によって染色した固定生体サンプル中の染色時のアーチファクトを低減するための、塩化ベンザルコニウム及びＣＨＡＰＳ（３−｛（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ｝−１−プロパン−スルホン酸）から選択される洗剤の使用。