KR20180118514A - 생체 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법 - Google Patents
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- G01N2001/305—Fixative compositions
Abstract
본 발명은 생체 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 생체 조직의 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법은 고가의 전기 영동 장치와 고가의 용액을 필요로 하지 않고, 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 혈관 등의 다양한 생체 조직에 손상 없이 적용 가능할 뿐만 아니라, 버블 형성, 변색 및 검은 퇴적물이 나타나지 않고 생체 조직의 투명성이 향상되고, 투명화된 조직 내 항체 염색이 가능한 바, 생체 조직의 구조적 이미지화를 통하여 다양한 질환의 원인을 규명하고 치료법을 찾아내는 데 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 생체 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법에 관한 것이다.
x-ray를 통한 의료 진단 기술은 CT나 MRI와 같은 2차원 스캐닝 후 3차원으로 재구성하는 기술에 의하여 입체적으로 관찰, 정교하게 진단할 수 있는 기술로 발전하여 왔다. 광원이 아니라 초음파 등을 활용하는 경우 역시 3차원적 영상을 구현하는 기술이 진단에 활발하게 이용되고 있다. 그러나 현재 개발된 기술 대부분은 밀리미터 수준의 상대적으로 마크로 해상력을 가진 기술들로, 세포 수준에서의 분석이 가능한 마이크로 수준의 3차원 측정하는 기술은 상대적으로 그 발전이 미흡하여, 현재 대부분의 세포 수준 분석은 전통적인 2차원 기술을 이용하고 있다. 즉, 생검 또는 부검 조직 등 생체조직을 고정액으로 고정한 후, 파라핀 또는 폴리머로 포매한 후 수 마이크로미터 또는 나노미터 두께로 절편을 만들어 빛이나 전자파가 투과할 수 있도록 한 후, 투과 이미지를 광학 또는 전자현미경을 이용하여 취득하는 기술을 사용하여 미세구조를 분석한다.
이러한 미세 이미징 기술을 이용하여 3차윈 이미지를 획득하기 위해서는 콘포칼 현미경 등을 이용해야 하며, 이 경우 일반적으로 수십 마이크로미터 수준의 두께 정보를 획득할 수 있다. 대략적으로 이 두께는 광원이 침투할 수 있는 깊이에 의하여 그 한계가 그어진다. 그러나 대부분의 생체 조직 내 유의미한 구조물들이 수백 마이크로미터 이상의 크기를 가지고 있으므로, 이와 같은 방법으로는 일부의 정보만을 취득할 수 있다. 따라서, 보다 두꺼운 조직 내 이미지를 획득하기 위해서는 수십 마이크로 두께의 연속적인 절편을 제작하고, 이를 일일이 현미경으로 통하여 이미징 한 후, 다시 재구성하는 일련의 과정을 필요로 한다. 특히 뇌조직의 경우 하나의 뉴런 전체를 이미징한다고 할 때, 경우에 따라서는 하나의 뉴런이 수 ｍ까지도 그 액손(Axon)을 뻗기 때문에, 조직을 자르고 붙이는 일련의 과정을 진행하면서 일어날 수 있는 문제점이 기하급수적으로 발생한다.
조직 투명화 기술은 조직의 손상없이 조직 내부 구조 및 단백질 분포를 확인할 수 있어 기존의 기술의 관찰 한계를 뛰어넘어 더 깊은 곳까지 조직 구조를 관찰하고 다양한 기관계(system)로부터 통합적인 구조와 분자 정보의 접근을 가능하게 하므로 최근 다양한 방법으로 조직을 투명화하는 기술이 개발되었다.
종래 조직 투명화 기술로는 유기용매를 이용한 조직투명화 과정인 Spatleholz, BABB, Scale S, iDISCO법과, 폴리머 주입법인 ACT(active CLARITY technology)법에 의해 처리된 조직의 항원 보존성이 보고된 바 있다. ACT를 제외한 다른 방법의 경우 형광과 항원의 보존성이 감소하는 문제를 가지고 있다. ACT경의 경우 90% 이상의 항원 보존성이 있으며, 이는 CLARITY와 같이 고정된 단백질에 추가로 하이드로젤 폴리머와의 결합을 필요로 하는 방법에 비하면 보다 높은 보존성을 보인다. 그러나 강한 조직 고정 과정은 항원성의 손실을 유발하므로, 사용할 수 있는 항체가 감소하는 등의 문제점을 고려해야 하므로, 여러 가지 기술의 개선이 필요하다.
또한, 최근에 개발된 조직 투명화 방법인 'CLARITY' 기반 기술은 조직 내 Hydrogel을 추가하여 DNA나 단백질 등 진단에 중요한 중요 물질들을 붙잡아주는 일종의 조직 내 그물망 지지체를 만든 뒤 지질만을 선택적으로 제거하는 방법을 이용한다 (특허문헌 1 참조).
그러나, 상기 방법은 하이드로젤 지지체를 조직에 침투시키게 되는데, 하이드로젤의 농도가 높아지면 단백질과의 결합도가 많아지며 보다 촘촘한 그물형 구조가 만들어지기 때문에 조직이 더 단단해진다. 반면 조직이 단단해지면 계면활성제에 의해서 지질이 빠져나가기 어려워지기 때문에 투명화에 걸리는 시간이 길어진다. 또한, 상기 방법은 조직 표면에 공기 및 검은 입자 침착을 야기하거나, 조직을 노랗게 변색시키는 문제점이 있다.
또한, 상기 방법은 과정이 너무나 복잡하고 부가적인 장비가 많이 필요하다. 예를 들면 뇌 하나를 투명화하기 위해서는 적어도 30,000,000만원 이상이 필요하다. 뿐만 아니라 한번에 하나의 뇌만 투명화하는 것이 가능하므로 경제적, 시간적으로 많은 손실이 유발된다. 보다 큰 문제는 항체을 이용한 염색이 그물망 구조를 이루는 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide)의 사이를 투과하기에 어려움이 있다.
따라서, 조직 내 단백질의 분포정보를 얻기 위해서는 조직 투명화 이후 항원성의 보존 정도와 항체의 조직 내 침투력을 고려하여 항체의 물리적인 확산 능력을 향상시켜야하나, 결합조직이 많은 단단한 조직들의 경우 항체의 확산 속도는 현저히 떨어지므로, 이들을 보완하기 위한 새로운 기법이 요구 된다.
상술한 바와 같이, 종래 연구에서는 조직 투명화를 위해 그 과정의 복잡할 뿐만 아니라 많은 비용과 시간이 필요하다. 따라서, 과정의 단순화, 비용절감은 물론 항체 염색까지 최적화하여 뇌 뿐만 아니라 다양한 조직의 투명화할 수 있는 기술이 필요하다.
이에, 본 발명자는 생체 조직의 투명화 기술을 연구하던 중, 본 발명에 따른 생체 조직 투명화 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법은 고가의 전기 영동 장치와 고가의 용액을 필요로 하지 않고, 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 혈관 등의 다양한 생체 조직에 손상 없이 적용 가능할 뿐만 아니라, 버블 형성, 변색 및 검은 퇴적물이 나타나지 않고 생체 조직의 투명성이 향상되고, 투명화된 조직 내 항체 염색이 가능한 바, 생체 조직의 구조적 이미지화를 통하여 다양한 질환의 원인을 규명하고 치료법을 찾아내는 데 유용하게 사용될 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 측면에서의 목적은 조직의 변성 없이 빠른 투명화가 가능한 생체 조직 투명화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 측면에서의 목적은 조직의 변성 없이 빠른 투명화가 가능한 생체 조직의 투명화 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명의 일 측면에서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 수화물을 포함하는 생체 조직 투명화용 조성물이 제공된다:
[화학식 1]
본 발명의 다른 일 측면에서, 고정화된 생체 조직을, 상기 생체 조직 투명화용 조성물과 접촉시켜 생체 조직을 투명화시키는 단계를 포함하는, 생체 조직의 투명화 방법이 제공된다.
본 발명에 따른 생체 조직의 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법은 고가의 전기 영동 장치와 고가의 용액을 필요로 하지 않고, 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 혈관 등의 다양한 생체 조직에 손상 없이 적용 가능할 뿐만 아니라, 버블 형성, 변색 및 검은 퇴적물이 나타나지 않고 생체 조직의 투명성이 향상되고, 투명화된 조직 내 항체 염색이 가능한 바, 생체 조직의 구조적 이미지화를 통하여 다양한 질환의 원인을 규명하고 치료법을 찾아내는 데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 PBS를 단독으로 처리할 경우 마우스 뇌의 투명화가 진행되지 않음을 확인한 사진이다.
도 2는 CHAPS를 단독으로 처리할 경우 마우스 뇌의 투명화가 진행되었음을 확인한 사진이다.
도 3은 본 발명에 따른 조직 투명화 방법을 통해 생쥐 뇌 투명화를 진행하기 전과, 투명화를 진행한 후를 관찰한 사진이며, 도 3의 좌측 사진이 투명화를 진행하기 전 생쥐 뇌를 나타내며, 도 3의 우측 사진이 투명화를 진행한 후 생쥐 뇌를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 조직 투명화 방법을 통해 투명화가 완료된 생쥐의 뇌와, 형광 밝기를 확인한 사진이며, 도 4의 좌측이 투명화를 완료한 생쥐의 뇌이고, 도 4의 우측이 Ultraviolet (UV)를 통해 투명화가 완료된 뇌에 있는 GAD 67-GFP(Glutamic Acid Decarboxylase67-GFP) 형광의 밝기를 확인한 사진이다.
도 5는 <실험예 2>에서 투명화가 완료된 생쥐 뇌에 콜린 아세틸트랜스페라제(Choline Acetyltransferase) 항체를 처리한 후, GAD67-GFP와 Alexa fluor-647 형광을 관찰한 이미지이며, 도 5의 좌측이 GAD67-GFP 형광을 관찰한 이미지이고, 도 5의 우측이 Alexa fluor-647 형광을 관찰한 이미지이다.
도 6, 7과 8은 각각 Microscopy Lightsheet Z.1에서 5X, 20X 대물렌즈를 이용하여, <실험예 2>에서 투명화가 완료된 생쥐 뇌의 면역 염색이미지와 GFP 신호를 확인한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 9는 Microscopy Lightsheet Z.1에서 5X 대물렌즈를 이용하여 생쥐 뇌에 타이로신 수산화 효소(Tyrosine Hydroxylase) 항체를 처리한 후, GAD67-GFP와 Alexa fluor-647 형광을 병합하여 관찰한 이미지이다.
도 10은 <실험예 2>에서 투명화가 완료된 생쥐 뇌에 혈관염색 Lectin-647 항체를 처리한 후, GAD67-GFP 형광을 병합하여 관찰한 이미지이다.
도 11은 <실험예 2>에서 투명화가 완료된 생쥐 뇌에 타이로신 수산화 효소(Tyrosine Hydroxylase) 항체를 처리한 후, Donkey Anti-rabbit IgG Alexa Fluor-647를 염색한 후 관찰한 형광 이미지이다.
도 12는 CHAPS 및 우레아를 포함하는 PBS 혼합용액에서, CHAPS와 우레아의 농도 변화에 따라 생체조직 투명화 정도에 변화가 있는지 평가한 결과를 나타내는 사진이다.
도 13은 어떤 처리도 하지 않은 무처리군 생체조직을 나타내는 이미지이다.
도 14는 20 w/v% CHAPS와 50 w/v% 수크로오스를 사용하여 생체 조직 투명화를 유도한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 15는 20 w/v% CHAPS와 75 w/v% 글리세롤을 사용하여 생체 조직 투명화를 유도한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 16은 20 w/v% CHAPS와 50 w/v% 우레아를 사용하여 생체 조직 투명화를 유도한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 17은 60 w/v% 우레아의 PBS 용액을 사용하여 생체 조직 투명화를 유도한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 2는 CHAPS를 단독으로 처리할 경우 마우스 뇌의 투명화가 진행되었음을 확인한 사진이다.
도 3은 본 발명에 따른 조직 투명화 방법을 통해 생쥐 뇌 투명화를 진행하기 전과, 투명화를 진행한 후를 관찰한 사진이며, 도 3의 좌측 사진이 투명화를 진행하기 전 생쥐 뇌를 나타내며, 도 3의 우측 사진이 투명화를 진행한 후 생쥐 뇌를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 조직 투명화 방법을 통해 투명화가 완료된 생쥐의 뇌와, 형광 밝기를 확인한 사진이며, 도 4의 좌측이 투명화를 완료한 생쥐의 뇌이고, 도 4의 우측이 Ultraviolet (UV)를 통해 투명화가 완료된 뇌에 있는 GAD 67-GFP(Glutamic Acid Decarboxylase67-GFP) 형광의 밝기를 확인한 사진이다.
도 5는 <실험예 2>에서 투명화가 완료된 생쥐 뇌에 콜린 아세틸트랜스페라제(Choline Acetyltransferase) 항체를 처리한 후, GAD67-GFP와 Alexa fluor-647 형광을 관찰한 이미지이며, 도 5의 좌측이 GAD67-GFP 형광을 관찰한 이미지이고, 도 5의 우측이 Alexa fluor-647 형광을 관찰한 이미지이다.
도 6, 7과 8은 각각 Microscopy Lightsheet Z.1에서 5X, 20X 대물렌즈를 이용하여, <실험예 2>에서 투명화가 완료된 생쥐 뇌의 면역 염색이미지와 GFP 신호를 확인한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 9는 Microscopy Lightsheet Z.1에서 5X 대물렌즈를 이용하여 생쥐 뇌에 타이로신 수산화 효소(Tyrosine Hydroxylase) 항체를 처리한 후, GAD67-GFP와 Alexa fluor-647 형광을 병합하여 관찰한 이미지이다.
도 10은 <실험예 2>에서 투명화가 완료된 생쥐 뇌에 혈관염색 Lectin-647 항체를 처리한 후, GAD67-GFP 형광을 병합하여 관찰한 이미지이다.
도 11은 <실험예 2>에서 투명화가 완료된 생쥐 뇌에 타이로신 수산화 효소(Tyrosine Hydroxylase) 항체를 처리한 후, Donkey Anti-rabbit IgG Alexa Fluor-647를 염색한 후 관찰한 형광 이미지이다.
도 12는 CHAPS 및 우레아를 포함하는 PBS 혼합용액에서, CHAPS와 우레아의 농도 변화에 따라 생체조직 투명화 정도에 변화가 있는지 평가한 결과를 나타내는 사진이다.
도 13은 어떤 처리도 하지 않은 무처리군 생체조직을 나타내는 이미지이다.
도 14는 20 w/v% CHAPS와 50 w/v% 수크로오스를 사용하여 생체 조직 투명화를 유도한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 15는 20 w/v% CHAPS와 75 w/v% 글리세롤을 사용하여 생체 조직 투명화를 유도한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 16은 20 w/v% CHAPS와 50 w/v% 우레아를 사용하여 생체 조직 투명화를 유도한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 17은 60 w/v% 우레아의 PBS 용액을 사용하여 생체 조직 투명화를 유도한 결과를 나타내는 이미지이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면에서, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 수화물을 포함하는, 생체 조직 투명화용 조성물이 제공된다:
[화학식 1]
이하, 상기 생체 조직 투명화용 조성물에 대하여 더욱 구체적으로 설명한다.
상기 생체 조직 투명화용 조성물은 빛과 다른 분자의 투과를 막는 지질 성분을 생체 조직으로부터 제거하고, 단백질의 구조적 변성을 일으키지 않으며, 조직을 단단하게 하는 역할을 한다.
상기 생체 조직 투명화용 조성물에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 농도는 2 내지 55 w/v%(중량/부피%)의 농도로 포함될 수 있으며, 4 내지 50 w/v% 농도가 바람직하다. 이때, 상기 농도를 나타내기 위한 용액으로는 통상의 분야에 사용하는 유사 생체 용액(simulated body fluid)일 수 있으며, 보다 구체적으로는 물(증류수), PBS(phosphate buffersaline), TBS(tris buffersolution) 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 농도가 2 w/v% 미만으로 포함되는 경우에는 생체 조직의 투명화 속도가 현저히 느려질 수 있고, 55 w/v% 초과로 포함되는 경우에는 상기 화학식 1로 표시되는 CHAPS가 완전히 용해되지 않을 수 있다.
상기 생체 조직 투명화용 조성물은 삼투압을 조절하여 생체 조직의 투명화를 빠르게 촉진시키는 역할을 하는 물질을 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 생체 조직의 투명화를 빠르게 촉진시키는 물질은 우레아(urea), CHAPSO(3-([3-Cholamidopropyl]dimethylammoni o)-2-hydroxy-1-propanesulfonate), 수크로오스(sucrose), 프룩토오스(fructose), 글리세롤, 다이아트라이조산(Diatrizoic acid), Triton X-100, Tween-20, 2,2'-싸이오디에탄올, 이오헥솔(Iohexol), 클로랄 수화물(Chloral hydrate), 또는 이의 조합을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이때, 상기 생체 조직의 투명화를 빠르게 촉진시키는 물질은 5 내지 80 w/v%의 농도로 포함될 수 있으며, 5 내지 75 w/v%의 농도로 포함될 수 있으며, 10 내지 70 w/v%의 농도로 포함될 수 있으며, 5 내지 50 w/v% 농도로 포함될 수 있으며, 35 내지 60 w/v% 농도로 포함될 수 있다. 이때, 상기 농도가 5 w/v% 미만인 경우 조직의 투명화 속도가 느려지며 80 w/v% 초과인 경우 결정이 유발되거나 용액에 녹지 않을 수 있다. 하나의 구체적인 일례로, 만약 상기 생체 조직의 투명화를 빠르게 촉진시키는 물질로 우레아(urea)를 사용할 경우, 상기 우레아는 10 내지 70 w/v%의 농도가 포함될 수 있으며, 20 내지 60 w/v% 농도가 보다 바람직하다. 또한, 상기 생체 조직의 투명화를 빠르게 촉진시키는 물질의 농도는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 바람직한 농도 범위와 적절하게 조절할 수 있다.
종래의 투명화 방법을 사용하기 위해서는 조직과 용액의 굴절률을 맞추기 위해 mounting 용액을 따로 추가로 구입 및 제작이 필요하였으나, 본 발명에 따른 생체 조직 투명화용 조성물은 굴절률을 맞추는 용액이 필요 없으며, 이는 비용절감의 효과를 나타낸다. 더 나아가 기존의 투명화 방법은 조직이 부풀어지는 현상을 유발하는데 본 발명은 조직의 크기가 전혀 변하지 않는 효과가 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 생체 조직의 투명화용 조성물은 고가의 전기 영동 장치와 고가의 용액을 필요로 하지 않고, 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 혈관 등의 다양한 생체 조직에 손상 없이 적용 가능할 뿐만 아니라, 조직의 부풀어짐, 버블 형성, 변색 및 검은 퇴적물이 나타나지 않고 생체 조직의 투명성이 향상되므로 생체 조직의 투명화용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면에서, 고정화된 생체 조직을, 상기 생체 조직 투명화용 조성물과 접촉시켜 생체 조직을 투명화시키는 단계를 포함하는, 생체 조직의 투명화 방법이 제공된다.
이하, 상기 생체 조직의 투명화 방법을 구체적으로 설명한다.
상기 생체 조직의 투명화 방법은 고정화된 생체 조직을 상기 조성물과 접촉시켜 투명화시키는 단계를 포함한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 생체 조직의 투명화 방법은 고정화된 생체 조직을 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써, 생체 조직의 물리화학적 특성을 변형하여 투명하게 함으로써 보다 깊이 빛이 침투할 수 있도록 만들어 투명하게 하는 것이다.
본 발명에 따른 생체 조직의 투명화 방법은 버블 형성, 변색 및 검은 퇴적물이 나타나지 않고 생체 조직의 투명성을 향상시키며 단백질 변성 등에 의하여 원하는 조직 내 정보가 손실 또는 왜곡되지 않아, 특히 GFP단백질 등 다양한 형광원(Fluorophore)을 조직 내 정보 검출 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 생체 조직의 투명화 방법에 있어서, 생체 조직은 투명화하기 전에 통상적으로 항원성의 손실을 유발하지 않으면서 생체 조직을 고정화하는 방법이라면 특별한 제한없이 적용하여 고정화할 수 있다.
보다 구체적으로 상기 생체 조직의 고정화는 파라포름알데하이드(paraformaldehyde), 에텔렌글리콜 디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether), 디프로필렌 글리콜 디글리시딜에테르(dipropylene glycol diglycidyl ether), 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether), 글리세롤 폴리글리시딜 에테르(glycerol polyglycidyl ether), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 폴리아크릴아마이드 또는 이들의 조합을 사용하여 통상적인 방법을 통해 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 생체 조직의 투명화 방법에 있어서, 구체적인 실시예로서 CHAPS와 Urea 혼합물을 처리하면 단백질의 구조적 결합력이 증가되고, 변성을 일으키지 않으며, 조직을 더 단단하게 할 뿐만 아니라, 조직 투명화 과정에서 나타나는 조직의 부풀어 오름을 방지하고 항체 처리과정, 세척(washing) 과정 등에서 일어나는 조직의 갈라짐을 방지할 수 있다. 상기 농도를 나타내기 위한 용액으로는 통상의 분야에 사용하는 유사 생체 용액(simulated body fluid)일 수 있으나, 증류수, PBS(phosphate buffersaline), TBS(tris buffersolution), 증류수 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 담지의 온도는 10℃ 내지 50℃ 온도 범위에서 수행할 수 있고, 12 내지 48℃ 온도 범위에서 수행할 수 있고, 14 내지 46℃ 범위에서 수행할 수 있고, 16 내지 44℃ 범위에서 수행할 수 있고, 18 내지 42℃ 범위에서 수행할 수 있고, 20 내지 40℃ 범위에서 수행할 수 있고, 24 내지 39℃ 범위에서 수행할 수 있고, 28℃ 내지 38℃에서 수행할 수 있고, 30℃ 내지 37℃에서 수행할 수 있고, 33 내지 34℃에서 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 생체 조직의 투명화 방법은 다양한 척추 동물의 조직(tissue)에 적용할 수 있으며,
특히, 뇌(brain), 혈관(blood vessel), 간(liver), 폐(lung), 신장(kidney), 췌장(pancreas), 장(intestine) 등에 적용하는 것이 바람직하고, 상기 생체 조직의 전체 부분을 한번에 투명화할 수 있다.
본 발명은 상기 투명화된 생체 조직 내 중요 정보, 즉, DNA, RNA, 단백질, 형광신호 등의 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 투명화된 생체 조직은 GFP 형광, 면역 염색을 통하여 단백질 또는 mRNA를 검출할 수 있다. 단백질의 경우 고정과정 동안 아미노산에 존재하는 아미노기끼리의 공유결합을 이루면서 서로 네트워크를 이루기 때문에, 매우 안정적인 반면, RNA나 DNA와 같은 핵산의 경우 아미노기가 존재하지 않기 때문에, 고정된 조직에서도 상대적으로 불안정하다. 특히, 전기영동 과정이 포함되는 경우, 핵산이 가진 전기적 성질에 의해 조직 내 위치가 바뀔 우려가 있다. 반면, 본 발명에 따른 투명화된 생체 조직은 GFP(Green Fluorescent Protein) 세포 및 cholinergic neuron 마커 항체인 Choline Acetyltransferase 등에 대한 형광 염색이 우수하게 수행된다.
본 발명에 따른 생체 조직 투명화 방법은 손상되지 않은 생체 조직의 세포와 분자의 3차원 분포를 이미지화하여 관찰할 수 있으므로, 복잡한 구조를 가지는 다양한 생체 조직에 대하여 하나의 완전한 구조로 수백 마이크로미터 이상의 크기로 관찰 연구를 수행할 수 있으므로 조직 내의 유용한 정보를 취득하여 뇌질환 등의 다양한 질환의 원인을 규명하는데 효과적으로 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실험예 1> CHAPS에 의한 생체조직 투명화 평가
CHAPS를 단독으로 포함하는 생체 조직 투명화제를, 생체 조직에 접촉시킬 경우, 생체조직 투명화가 용이하게 유도되는지 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 단, 본 명세서 내에서 모든 동물 실험 과정은 안전성평가연구소 동물 자원 대학위원회의 지침서(Approval No. RS17003)에 따라 수행하였다.
먼저, 흡입 마취제인 이소푸루란(Isoflurane) (1cc/min) 을 사용하여 성인 생쥐(8주령)를 마취시켰다. 쥐의 혈관을 염색하기 위해 꼬리 정맥(tail vein)으로렉틴-488(Lectin-488, Cat# DL1174)을 주입하였다. 렉틴을 주입하고 5분 경과 후, 경심 관류로 얼음처럼 차가운 1X 인산완충용액 (phosphate-buffered saline) 50 mL을 관류시킨 후, 얼음처럼 차가운 4% PFA(Paraformaldehyde)가 포함된 PBS를 관류시켰다. 그 다음 기관을 적출하고 4%의 PFA(Paraformaldehyde)용액에 담근 후, 4℃에서 12 h 동안 인큐베이션 하였다. 이때, 상기 얼음처럼 차가운 온도 범위는 특별히 제한되는 것은 아니지만 -20℃ 내지 40℃ 범위일 수 있다.
다음으로, 상기 샘플(3mm 두께)을 50ml의 PBS로 2번 세척하였다. 상술한 과정에 의해 고정화된 샘플을, 40% CHAPS 수용액(40% CHAPS in DW)에서, 37℃ 온도 하에 120 rpm으로 5일 동안 인큐베이션하였다. 대조군으로는 상기 고정화된 샘플을 PBS에서, 37℃ 온도 하에 120 rpm으로 5일 동안 인큐베이션하였다. 그 결과를 도 1, 2에 나타내었다.
도 1은 PBS를 단독으로 처리할 경우 마우스 뇌의 투명화가 진행되지 않음을 확인한 사진이다.
도 2는 CHAPS를 단독으로 처리할 경우 마우스 뇌의 투명화가 진행되었음을 확인한 사진이다.
도 1, 도 2에 나타난 바와 같이,
CHAPS가 단독으로 마우스 뇌에 처리될 경우 마우스의 뇌 투명화가 현저히 유도됨을 알 수 있다. 뿐만 아니라, 조직의 크기에 변화가 없는 점으로부터 CHAPS는 조직의 변성과 손상 없이 투명화를 유도할 수 있음을 알 수 있다.
<실험예 2> CHAPS 및 우레아에 의한 생체조직 투명화 평가
CHAPS 및 우레아를 포함하는 생체 조직 투명화제를, 생체 조직에 접촉시킬 경우, 생체조직 투명화가 용이하게 유도되는지 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 단, 본 명세서 내에서 모든 동물 실험 과정은 안전성평가연구소 동물 자원 대학위원회의 지침서(Approval No. RS17003)에 따라 수행하였다.
먼저, 흡입 마취제인 이소푸루란(Isoflurane) (1cc/min) 을 사용하여 성인 생쥐(8주령)를 마취시켰다. 쥐의 혈관을 염색하기 위해 꼬리 정맥(tail vein)으로렉틴-488(Lectin-488, Cat# DL1174)을 주입하였다. 렉틴을 주입하고 5분 경과 후, 경심 관류로 얼음처럼 차가운 1X 인산완충용액 (phosphate-buffered saline) 50 mL을 관류시킨 후, 얼음처럼 차가운 4% PFA(Paraformaldehyde)가 포함된 PBS를 관류시켰다. 그 다음 기관을 적출하고 4%의 PFA(Paraformaldehyde)용액에 담근 후, 4℃에서 12 h 동안 인큐베이션 하였다. 이때, 상기 얼음처럼 차가운 온도 범위는 특별히 제한되는 것은 아니지만 -20℃ 내지 40℃ 범위일 수 있다.
다음으로, 상기 샘플을 50ml의 PBS로 2번 세척하였다. 상술한 과정에 의해 고정화된 샘플을, 20% CHAPS w/v% 및 60 w/v% 우레아의 PBS 혼합용액에서, 37℃ 온도 하에 220 rpm으로 3일 동안 인큐베이션하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 본 발명에 따른 조직 투명화 방법을 통해 생쥐 뇌 투명화를 진행하기 전과, 투명화를 진행한 후를 관찰한 사진이며, 도 3의 좌측 사진이 투명화를 진행하기 전 생쥐 뇌를 나타내며, 도 3의 우측 사진이 투명화를 진행한 후 생쥐 뇌를 나타낸다.
이후, 20% CHAPS w/v% 및 60 w/v% 우레아의 PBS 혼합용액으로부터 생쥐 뇌를 3차 증류수로 옮기고, 50ml의 3차 증류수로 12 h 동안 3번 세척한 후, 마운팅(mounting) 용액인 CHAPS와 Urea의 혼합용액에 뇌를 옮긴 후, 뇌의 투명화를 관찰하였였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4는 본 발명에 따른 조직 투명화 방법을 통해 투명화가 완료된 생쥐의 뇌와, 형광 밝기를 확인한 사진이며, 도 4의 좌측이 투명화를 완료한 생쥐의 뇌이고, 도 4의 우측이 Ultraviolet (UV)를 통해 투명화가 완료된 뇌에 있는 GAD 67-GFP(Glutamic Acid Decarboxylase67-GFP) 형광의 밝기를 확인한 사진이다.
도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, CHAPS 및 우레아를 포함하는 생체 조직 투명화제는 생체 조직을 조직의 변성 없이 빠른 시간 내 투명화시킬 수 있음을 알 수 있다.
<실험예 3> CHAPS 및 우레아에 의해 투명화된 생체조직의 형광 이미지 평가
본 발명에 따른 투명화 방법으로 투명화된 뇌의 형광을 확인하기 위해 광학 현미경(Leica)에서 1X 대물렌즈를 이용하여 생쥐 뇌의 면역 염색 형광과 Green fluorescent protein(GFP) 신호를 확인하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 상기 <실험예 2>에서 투명화가 완료된 생쥐 뇌에 콜린 아세틸트랜스페라제(Choline Acetyltransferase) 항체를 처리한 후, GAD67-GFP와 Alexa fluor-647 형광을 관찰한 이미지이며, 도 5의 좌측이 GAD67-GFP 형광을 관찰한 이미지이고, 도 5의 우측이 Alexa fluor-647 형광을 관찰한 이미지이다.
도 6, 7, 그리고 8은 각각 Microscopy Lightsheet Z.1에서 5X, 20X 대물렌즈를 이용하여, 상기 <실험예 2>에서 투명화가 완료된 생쥐 뇌의 면역 염색이미지와 GFP 신호를 확인한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 9는 상기 <실험예 2>에서 투명화가 완료된 생쥐 뇌에 타이로신 수산화 효소(Tyrosine Hydroxylase) 항체를 처리한 후, GAD67-GFP와 Alexa fluor-647 형광을 병합하여 관찰한 이미지이다.
도 10은 상기 <실험예 2>에서 투명화가 완료된 생쥐 뇌에 혈관염색 Lectin-647과 GAD67-GFP 형광 이미지이다.
도 11은 상기 <실험예 2>에서 투명화가 완료된 생쥐 뇌에 타이로신 수산화 효소(Tyrosine Hydroxylase) 항체를 처리한 후, Donkey Anti-rabbit IgG Alexa Fluor-647를 염색한 후 관찰한 형광 이미지이다.
상기 결과로부터, 본 발명에 따른 투명화 방법으로 투명화된 뇌는 형광 이미지 확인이 가능함을 알 수 있다.
<실험예 4> CHAPS 및 우레아의 농도 변화에 따른 생체조직 투명화 평가
CHAPS 및 우레아를 포함하는 PBS 혼합용액에서, CHAPS와 우레아의 농도 변화에 따라 생체조직 투명화 정도에 변화가 있는지 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<실험예 2>에서는 20% CHAPS w/v% 및 60 w/v% 우레아의 PBS 혼합용액(20C + 60U%)을 사용하였으며; 본 실험에서는 추가로 10% CHAPS w/v% 및 65 w/v% 우레아의 PBS 혼합용액(10C + 65U%); 40% CHAPS w/v% 및 45 w/v% 우레아의 PBS 혼합용액(40C + 45U%)을 사용하여 <실험예 2>와 동일한 방법으로 생쥐 뇌의 투명화를 유도하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12는 CHAPS 및 우레아를 포함하는 PBS 혼합용액에서, CHAPS와 우레아의 농도 변화에 따라 생체조직 투명화 정도에 변화가 있는지 평가한 결과를 나타내는 사진이다.
도 12에 나타난 바와 같이, CHAPS 및 우레아를 포함하는 PBS 혼합용액에서, CHAPS와 우레아의 농도를 변화시켜도, 생쥐 뇌의 투명화를 조직의 변성 없이 유도할 수 있음을 알 수 있다.
<실험예 5> CHAPS 및 urea를 포함하는 조성물의 투명화 우수성 확인
상기 <실험예 2>와 같이 실험을 수행하여 생체 조직의 투명화를 유도하되, 우레아(urea)를 사용하는 대신 수크로오스(sucrose) 또는 글리세롤(glycerol)을 CHAPS와 함께 사용하여 비교군으로서 생체 조직의 투명화를 유도하였다. 또한, 우레아를 단독으로 사용하여 생체 조직의 투명화를 유도하였다. 나아가, 어떤 처리도 하지 않은 무처리군 생체조직도 관찰하였다. 그 결과를 도 13 내지 17에 나타내었다.
도 13은 어떤 처리도 하지 않은 무처리군 생체조직을 나타내는 이미지이다.
도 14는 20 w/v% CHAPS와 50 w/v% 수크로오스를 사용하여 생체 조직 투명화를 유도한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 15는 20 w/v% CHAPS와 75 w/v% 글리세롤을 사용하여 생체 조직 투명화를 유도한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 16은 20 w/v% CHAPS와 50 w/v% 우레아를 사용하여 생체 조직 투명화를 유도한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 17은 60 w/v% 우레아의 PBS 용액을 사용하여 생체 조직 투명화를 유도한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 13 내지 17에 나타난 바와 같이,
CHAPS와 우레아를 함께 포함하는 생체 조직 투명화제로 생체 조직의 투명화를 유도할 경우,
수크로오스 또는 글리세롤을 더 포함하는 생체 조직 투명화용 조성물, 또는 우레아를 단독으로 포함하는 생체 조직 투명화제에 비해 단백질의 구조 변성 없이 조직의 빠른 투명화가 가능한 것을 알 수 있다.
특히, CHAPS와 우레아를 함께 포함하는 생체 조직 투명화제로 생체 조직의 투명화를 유도할 경우, 조직의 변성 없이, 5일 이내에, 투명화가 완료되는 반면(도 16 참조),
우레아를 단독으로 포함하는 생체 조직 투명화제로 생체 조직의 투명화를 유도할 경우, 뇌 조직 구조에 손상이 발생하고, 20일이 경과하여도 투명화 정도가 상대적으로 떨어짐을 알 수 있다(도 17 참조).
한편, CHAPS를 단독으로 처리한 도 2와, 우레아를 단독으로 처리한 도 17을 비교하면, CHAPS를 단독으로 처리한 경우는 조직이 투명화될 뿐만 아니라 조직의 크기가 유지되므로, 뇌 조직의 구조에 손상이 발생하지 않음을 확인할 수 있으나, 우레아를 단독으로 처리한 경우는 조직의 크기가 커지는 것으로부터 뇌 조직의 구조에 손상이 발생함을 알 수 있다.
Claims (6)
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 수화물을 포함하는,
생체 조직 투명화용 조성물:
[화학식 1]
.
- 제1항에 있어서,
상기 생체 조직 투명화용 조성물은,
우레아(urea), CHAPSO(3-([3-Cholamidopropyl]dimethylammoni o)-2-hydroxy-1-propanesulfonate), 수크로오스(sucrose), 프룩토오스(fructose), 글리세롤, 다이아트라이조산(Diatrizoic acid), Triton X-100, Tween-20, 2,2'-싸이오디에탄올, 이오헥솔(Iohexol) 및 클로랄 수화물(Chloral hydrate)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는,
생체 조직 투명화용 조성물.
- 고정화된 생체 조직을,
제1항의 생체 조직 투명화용 조성물과 접촉시켜 생체 조직을 투명화시키는 단계를 포함하는,
생체 조직의 투명화 방법.
- 제3항에 있어서,
상기 생체 조직은 뇌(brain), 혈관(blood vessel), 간(liver), 폐(lung), 신장(kidney), 췌장(pancreas) 또는 장(intestine)인 것을 특징으로 하는,
생체 조직의 투명화 방법.
- 제3항에 있어서,
상기 고정화된 생체 조직은 파라포름알데하이드(paraformaldehyde), 에텔렌글리콜 디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether), 디프로필렌 글리콜 디글리시딜에테르(dipropylene glycol diglycidyl ether), 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether), 글리세롤 폴리글리시딜 에테르(glycerol polyglycidyl ether), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 및 폴리아크릴아마이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상으로부터 고정화된 생체 조직인 것을 특징으로 하는,
생체 조직의 투명화 방법.
- 제3항에 있어서,
상기 생체 조직의 투명화 방법은 4℃ 내지 50℃ 온도 범위에서 수행하는 것을 특징으로 하는,
생체 조직의 투명화 방법.
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