KR20180060494A - 생체 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법 - Google Patents

생체 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20180060494A
KR20180060494A KR1020160160031A KR20160160031A KR20180060494A KR 20180060494 A KR20180060494 A KR 20180060494A KR 1020160160031 A KR1020160160031 A KR 1020160160031A KR 20160160031 A KR20160160031 A KR 20160160031A KR 20180060494 A KR20180060494 A KR 20180060494A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
biotissue
composition
tissue
transparency
present
Prior art date
Application number
KR1020160160031A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101866249B1 (ko
Inventor
박순현
Original Assignee
박순현
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 박순현 filed Critical 박순현
Priority to KR1020160160031A priority Critical patent/KR101866249B1/ko
Priority to PCT/KR2017/013168 priority patent/WO2018101663A2/ko
Priority to EP17876444.5A priority patent/EP3550029B1/en
Priority to JP2019548842A priority patent/JP6945881B2/ja
Priority to CN201780073234.0A priority patent/CN109996887A/zh
Priority to US16/462,973 priority patent/US11726012B2/en
Publication of KR20180060494A publication Critical patent/KR20180060494A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101866249B1 publication Critical patent/KR101866249B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/45—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C07C233/46—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/47—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to a hydrogen atom or to a carbon atom of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C07C235/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C235/12—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F1/00—Compounds containing elements of Groups 1 or 11 of the Periodic Table
    • C07F1/04—Sodium compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G01N2001/305—Fixative compositions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 생체 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 생체 조직의 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법은 고가의 전기 영동 장치와 고가의 용액을 필요로 하지 않고, 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 혈관 등의 다양한 생체 조직에 손상 없이 적용 가능할 뿐만 아니라, 버블 형성, 변색 및 검은 퇴적물이 나타나지 않고 생체 조직의 투명성이 향상되고, 투명화된 조직 내 항체 염색이 가능한 바, 생체 조직의 구조적 이미지화를 통하여 다양한 질환의 원인을 규명하고 치료법을 찾아내는 데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

생체 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법{COMPOSITION FOR CLREARING OF BIOTISSUE AND CLARITY METHOD FOR BIOTISSUE USING THEREOF}
본 발명은 생체 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법에 관한 것이다.
x-ray를 통한 의료 진단 기술은 CT나 MRI와 같은 2차원 스캐닝 후 3차원으로 재구성하는 기술에 의하여 입체적으로 관찰, 정교하게 진단할 수 있는 기술로 발전하여 왔다. 광원이 아니라 초음파 등을 활용하는 경우 역시 3차원적 영상을 구현하는 기술이 진단에 활발하게 이용되고 있다. 그러나 현재 개발된 기술 대부분은 밀리미터 수준의 상대적으로 마크로 해상력을 가진 기술들로, 세포 수준에서의 분석이 가능한 마이크로 수준의 3차원 측정하는 기술은 상대적으로 그 발전이 미흡하여, 현재 대부분의 세포 수준 분석은 전통적인 2차원 기술을 이용하고 있다. 즉, 생검 또는 부검 조직 등 생체조직을 고정액으로 고정한 후, 파라핀 또는 폴리머로 포매한 후 수 마이크로미터 또는 나노미터 두께로 절편을 만들어 빛이나 전자파가 투과할 수 있도록 한 후, 투과 이미지를 광학 또는 전자현미경을 이용하여 취득하는 기술을 사용하여 미세구조를 분석한다.
이러한 미세 이미징 기술을 이용하여 3차윈 이미지를 획득하기 위해서는 콘포칼 현미경 등을 이용해야 하며, 이 경우 일반적으로 수십 마이크로미터 수준의 두께 정보를 획득할 수 있다. 대략적으로 이 두께는 광원이 침투할 수 있는 깊이에 의하여 그 한계가 그어진다. 그러나 대부분의 생체 조직 내 유의미한 구조물들이 수백 마이크로미터 이상의 크기를 가지고 있으므로, 이와 같은 방법으로는 일부의 정보만을 취득할 수 있다. 따라서, 보다 두꺼운 조직 내 이미지를 획득하기 위해서는 수십 마이크로 두께의 연속적인 절편을 제작하고, 이를 일일이 현미경으로 통하여 이미징 한 후, 다시 재구성하는 일련의 과정을 필요로 한다. 특히 뇌조직의 경우 하나의 뉴런 전체를 이미징한다고 할 때, 경우에 따라서는 하나의 뉴런이 수 ｍ까지도 그 액손(Axon)을 뻗기 때문에, 조직을 자르고 붙이는 일련의 과정을 진행하면서 일어날 수 있는 문제점이 기하급수적으로 발생한다.
조직 투명화 기술은 조직의 손상없이 조직 내부 구조 및 단백질 분포를 확인할 수 있어 기존의 기술의 관찰 한계를 뛰어넘어 더 깊은 곳까지 조직 구조를 관찰하고 다양한 기관계(system)로부터 통합적인 구조와 분자 정보의 접근을 가능하게 하므로 최근 다양한 방법으로 조직을 투명화하는 기술이 개발되었다.
종래 조직 투명화 기술로는 유기용매를 이용한 조직투명화 과정인 Spatleholz, BABB, Scale S, iDISCO법과, 폴리머 주입법인 ACT(active CLARITY technology)법에 의해 처리된 조직의 항원 보존성이 보고된 바 있다. ACT를 제외한 다른 방법의 경우 형광과 항원의 보존성이 감소하는 문제를 가지고 있다. ACT경의 경우 90% 이상의 항원 보존성이 있으며, 이는 CLARITY와 같이 고정된 단백질에 추가로 하이드로젤 폴리머와의 결합을 필요로 하는 방법에 비하면 보다 높은 보존성을 보인다. 그러나 강한 조직 고정 과정은 항원성의 손실을 유발하므로, 사용할 수 있는 항체가 감소하는 등의 문제점을 고려해야 하므로, 여러 가지 기술의 개선이 필요하다.
또한, 최근에 개발된 조직 투명화 방법인 'CLARITY' 기반 기술은 조직 내 Hydrogel을 추가하여 DNA나 단백질 등 진단에 중요한 중요 물질들을 붙잡아주는 일종의 조직 내 그물망 지지체를 만든 뒤 지질만을 선택적으로 제거하는 방법을 이용한다(비특허문헌 1 참조).
그러나, 상기 방법은 하이드로젤 지지체를 조직에 침투시키게 되는데, 하이드로젤의 농도가 높아지면 단백질과의 결합도가 많아지며 보다 촘촘한 그물형 구조가 만들어지기 때문에 조직이 더 단단해진다. 반면 조직이 단단해지면 계면활성제에 의해서 지질이 빠져나가기 어려워지기 때문에 투명화에 걸리는 시간이 길어진다. 또한, 상기 방법은 조직 표면에 공기 및 검은 입자 침착을 야기하거나, 조직을 노랗게 변색시키는 문제점이 있다.
또한, 상기 방법은 과정이 너무나 복잡하고 부가적인 장비가 많이 필요하다. 예를 들면 뇌 하나를 투명화하기 위해서는 적어도 30,000,000만원 이상이 필요하다. 뿐만 아니라 한번에 하나의 뇌만 투명화하는 것이 가능하므로 경제적, 시간적으로 많은 손실이 유발된다. 보다 큰 문제는 항체을 이용한 염색이 그물망 구조를 이루는 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide)의 사이를 투과하기에 어려움이 있다.
따라서, 조직 내 단백질의 분포정보를 얻기 위해서는 조직 투명화 이후 항원성의 보존 정도와 항체의 조직 내 침투력을 고려하여 항체의 물리적인 확산 능력을 향상시켜야하나, 결합조직이 많은 단단한 조직들의 경우 항체의 확산 속도는 현저히 떨어지므로, 이들을 보완하기 위한 새로운 기법이 요구 된다.
상술한 바와 같이, 종래 연구에서는 조직 투명화를 위해 그 과정의 복잡할 뿐만 아니라 많은 비용과 시간이 필요하다. 따라서, 과정의 단순화, 비용절감은 물론 항체 염색까지 최적화하여 뇌 뿐만 아니라 다양한 조직의 투명화할 수 있는 기술이 필요하다.
이에, 본 발명자는 생체 조직의 투명화 기술을 연구하던 중, 본 발명에 따른 생체 조직 투명화 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법은 고가의 전기 영동 장치와 고가의 용액을 필요로 하지 않고, 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 혈관 등의 다양한 생체 조직에 손상 없이 적용 가능할 뿐만 아니라, 버블 형성, 변색 및 검은 퇴적물이 나타나지 않고 생체 조직의 투명성이 향상되고, 투명화된 조직 내 항체 염색이 가능한 바, 생체 조직의 구조적 이미지화를 통하여 다양한 질환의 원인을 규명하고 치료법을 찾아내는 데 유용하게 사용될 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.
국제특허공개공보 WO2016108359
Chung K, et al. (2013) Nature 497(7449):332-337. Lee H, et al. BMC Developmental Biology 2014 14:781
본 발명의 목적은 생체 조직 투명화용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 생체 조직의 투명화 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 아미노산 또는 이의 염을 포함하는 생체 조직 투명화용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
(상기 화학식 1에서,
R1은 수소 또는 C1-C2알킬이고,
R2는 수소 또는 직쇄 또는 측쇄의 C8-C20알킬카보닐 또는 C8-C20알케닐카보닐이고,
R3는 수소 또는 필수아미노산의 곁가지를 의미한다).
또한, 본 발명은 고정화된 생체 조직을 상기 조성물과 접촉시켜 투명화시키는 단계를 포함하는 생체 조직의 투명화 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 생체 조직의 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법은 고가의 전기 영동 장치와 고가의 용액을 필요로 하지 않고, 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 혈관 등의 다양한 생체 조직에 손상 없이 적용 가능할 뿐만 아니라, 버블 형성, 변색 및 검은 퇴적물이 나타나지 않고 생체 조직의 투명성이 향상되고, 투명화된 조직 내 항체 염색이 가능한 바, 생체 조직의 구조적 이미지화를 통하여 다양한 질환의 원인을 규명하고 치료법을 찾아내는 데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 조직 투명화 방법을 통하여 투명화된 마우스 전체 조직에 대한 이미지이다.
도 2(a)는 투명화 전 마우스 뇌(half brain)이고, (b)는 실험예 1로 투명화된 마우스 뇌이다.
도 3(a)는 투명화 전 마우스 뇌(half brain)이고, (b)는 실험예 3에서 40 w/v% N-라우릴사코신 용액의 전처리 후 마우스 뇌이고, (c)는 실험예 3으로 최종 투명화된 마우스 뇌이다.
도 4(a)는 마우스 췌장(pancreas)이고, (b)는 실험예 3으로 최종 투명화된 마우스 췌장이다.
도 5(a) 투명화 전의 PBS 용액에서 전체 뇌이고, (b)는 실험예 3의 40 w/v% N-라우릴사코신 용액에서의 마우스 전체 뇌이고, (c)는 실험예 3으로 최종 투명화된 마우스 전체 뇌이다.
도 6(a)는 Lectin-488의 마우스 뇌 이미지이고, (b)는 Lectin-488의 마우스 췌장 이미지이다.
도 7(a)는 Lectin-488의 뇌 혈관 이미지이고, (b)는 Lectin-488의 소뇌 혈관 이미지이고, (c)는 Lectin-488의 췌장 혈관 이미지이다.
도 8(a)는 투명화된 마우스 전체 뇌 이미지이고, (b)는 투명화된 전체 뇌에 TH-항체에 대한 5X 현미경 렌즈 이미지이고, (c)는 hippocampus의 주변에 있는 inhibitory neuron-GFP 20X 현미경 렌즈 이미지이다.
도 9는 TH-neuron의 비디오 영상 자료의 일부 이미지이다.
도 10은 inhibitory neuron-GFP 비디오 영상 자료의 일부 이미지이다.
이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 아미노산 또는 이의 염을 포함하는 생체 조직 투명화용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00002
상기 화학식 1에서,
R1은 수소 또는 C1-C2알킬이고,
R2는 수소 또는 직쇄 또는 측쇄의 C8-C20알킬카보닐 또는 C8-C20알케닐카보닐이고,
R3는 필수아미노산의 곁가지를 의미한다.
이하, 본 발명에 따른 생체 조직 투명화용 조성물에 대하여, 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따른 생체 조직 투명화용 조성물은 빛과 다른 분자의 투과를 막는 지질 성분을 생체 조직으로부터 제거하고 단백질의 구조적 변성을 일으키지 않으며 조직을 단단하게 하는 역할을 하는 상기 화학식 1로 표시되는 아미노산 또는 이의 염을 포함한다.
이때, 상기 화학식 1에서, R1은 수소 또는 C1-C2알킬이고, R2는 수소 또는 직쇄 또는 측쇄의 C8-C20알킬카보닐 또는 C8-C20알케닐카보닐이고, R3는 필수아미노산의 곁가지를 나타낸다.
여기서, 상기 "직쇄 또는 측쇄의 C8-C20알케닐카보닐"은 적어도 하나의 이중결합을 가지는 탄소수 8 내지 20의 알킬사슬의 카보닐을 의미하고, 상기 "필수아미노산의 곁가지"는 통상적으로 필수아미노산이라고 불리는 20개의 아미노산, 즉, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파리긴, 글루탐산, 아스파르트산, 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 프롤린, 글루타민, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 티로신, 트립토판에서 NH2(COOH)CH-를 모체로 하는 경우의 치환기를 의미한다. 예를 들면, 발린의 곁가지는 수소이고, 알라닌의 곁가지는 메틸이다.
보다 바람직하게 본 발명에 따른 생체 조직 투명화용 조성물은 상기 화학식 1에 있어서, R1은 메틸이고, R2는 직쇄 또는 측쇄의 C8-C20알킬카보닐이고, R3는 수소인 아미노산 또는 염을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 생체 조직 투명화용 조성물에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 아미노산 또는 이의 염이 4 - 55 w/v%(중량/부피%)의 농도로 포함될 수 있으며, 10 - 50 w/v% 농도가 바람직하고, 35 - 45 w/v% 농도가 보다 바람직하다.
이때, 상기 농도를 나타내기 위한 용액으로는 통상의 분야에 사용하는 유사 생체 용액(simulated body fluid)일 수 있으나, PBS(phosphate buffer saline), TBS(tris buffer solution), 증류수 등이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 화학식 1로 표시되는 아미노산 또는 이의 염이 4 w/v% 미만으로 포함되는 경우에는 생체 조직의 투명화 속도가 현저히 느려질 수 있고, 55 w/v% 초과로 포함되는 경우에는 상기 화학식 1로 표시되는 아미노산 또는 염이 완전히 용해되지 않을 수 있다.
나아가, 본 발명에 따른 생체 조직 투명화용 조성물은 삼투압을 조절하여 생체 조직의 투명화를 빠르게 촉진시키는 역할을 하는 물질을 더 포함할 수 있다. 바람직하게는 우레아(urea), CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트)), CHAPSO(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-2-하이드록시-1-프로판설포네이트)), 수크로오스(sucrose), 프룩토오스(fructose), 글리세롤, 다이아트라이조산(Diatrizoic acid), t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(Triton X-100), 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄 모노라우레이트(Tween-20), 2-2-싸이오디에탄올, 이오헥솔(Iohexol) 등을 들 수 있다.
이때, 상기 생체 조직의 투명화를 빠르게 촉진시키는 물질은 20 - 60 w/v%의 농도로 포함될 수 있으며, 30 - 50 w/v% 농도로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 농도가 20 w/v% 미만인 경우 조직의 투명화 속도가 느려지며 60 w/v% 초과인 경우 결정이 유발되거나 용액에 녹지 않을 수 있다.
또한, 상기 생체 조직의 투명화를 빠르게 촉진시키는 물질의 농도는 화학식 1로 표시되는 아미노산 또는 이의 염의 바람직한 농도 범위와 적절하게 조절할 수 있다.
종래의 투명화 방법을 사용하기 위해서는 조직과 용액의 굴절률을 맞추기 위해 mounting 용액을 따로 추가로 구입 및 제작이 필요하였으나, 본 발명에 따른 생체 조직 투명화용 조성물은 굴절률을 ?추는 용액이 필요없으며, 이는 비용절감의 효과를 나타낸다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 생체 조직의 투명화용 조성물은 고가의 전기 영동 장치와 고가의 용액을 필요로 하지 않고, 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 혈관 등의 다양한 생체 조직에 손상 없이 적용 가능할 뿐만 아니라, 버블 형성, 변색 및 검은 퇴적물이 나타나지 않고 생체 조직의 투명성이 향상되므로 생체 조직의 투명화용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 고정화된 생체 조직을 상기 조성물과 접촉시켜 투명화시키는 단계를 포함하는 생체 조직의 투명화 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 따른 생체 조직의 투명화 방법을 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따른 생체 조직의 투명화 방법은 고정화된 생체 조직을 상기 조성물과 접촉시켜 투명화시키는 단계를 포함한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 생체 조직의 투명화 방법은 고정화된 생체 조직을 상기 화학식 1로 표시되는 아미노산 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써, 생체 조직의 물리화학적 특성을 변형하여 투명하게 함으로써 보다 깊이 빛이 침투할 수 있도록 만들어 투명하게 하는 것이다.
본 발명에 따른 생체 조직의 투명화 방법은 버블 형성, 변색 및 검은 퇴적물이 나타나지 않고 생체 조직의 투명성을 향상시키며 단백질 변성 등에 의하여 원하는 조직 내 정보가 손실 또는 왜곡되지 않아, 특히 GFP단백질 등 다양한 형광원(Fluorophore)을 조직 내 정보 검출 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 생체 조직의 투명화 방법에 있어서, 생체 조직은 투명화 하기 전에 통상적으로 항원성의 손실을 유발하지 않으면서 생체 조직을 고정화하는 방법이라면 특별한 제한없이 적용하여 고정화할 수 있나, PFA(paraformaldehyde), 에텔렌글리콜 디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether), 디프로필렌 글리콜 디글리시딜에테르(dipropylene glycol diglycidyl ether), 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether), 글리세롤 폴리글리시딜 에테르(glycerol polyglycidyl ether), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 폴리아크릴아마이드 등을 사용하여 통상적인 방법으로 고정화될 수 있다.
나아가, 본 발명에 따른 생체 조직의 투명화 방법에 있어서, 생체 조직을 탈수분시키기 위한 전처리 단계를 더 수행할 수 있으며, 통상적으로 생체 조직을 탈수분시키는 전처리 방법이라면 특별한 제한없이 사용할 수 있으나, 고정화된 생체 조직을 상기 화학식 1로 표시되는 아미노산을 20 - 50 w/v% 농도의 용액에 담지하는 것이 바람직하고, 35 - 45 w/v% 농도의 용액에 담지하는 것이 보다 바람직하다. 전처리 용액의 농도가 20 w/v% 미만으로 포함되는 경우에는 탈수분이 효과적으로 수행되지 않아 조직 투명화 과정에서 나타나는 조직의 부풀어 오름 현상이 생길 수 있고 50 w/v% 초과로 포함되는 경우에는 상기 화학식 1로 표시되는 아미노산 또는 염이 완전히 용해되지 않고 더 이상 탈수 효과가 증대되지 않는다.
이때, 상기 농도를 나타내기 위한 용액으로는 통상의 분야에 사용하는 유사 생체 용액(simulated body fluid)일 수 있으나, PBS(phosphate buffer saline), TBS(tris buffer solution), 증류수, t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(Triton X-100), 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄 모노라우레이트(Tween-20), CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트)), CHAPSO(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-2-하이드록시-1-프로판설포네이트)) 등이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 담지의 온도는 40 - 60 ℃인 것이 적절하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이러한 전처리 과정을 통하여 고정화 물질과 단백질의 구조적 결합력을 증가시키고 변성을 일으키지 않으며, 조직을 더 단단하게 할 뿐만 아니라, 조직 투명화 과정에서 나타나는 조직의 부풀어 오름을 방지하고 항체 처리과정, 세척(washing) 과정 등에서 일어나는 조직의 갈라짐을 방지할 수 있다.
본 발명에 따른 생체 조직의 투명화 방법은 다양한 척추 동물의 조직(tissue)에 적용할 수 있으며, 특히, 뇌(brain), 혈관(blood vessel), 간(liver), 폐(lung), 신장(kidney), 췌장(pancreas), 장(intestine) 등에 적용하는 것이 바람직하고, 상기 생체 조직의 전체 부분을 한번에 투명화할 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 투명화된 생체 조직 내 중요 정보, 즉, DNA, RNA, 단백질, 형광신호 등의 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 투명화된 생체 조직은 GFP 형광, 면역 염색을 통하여 단백질 또는 mRNA를 검출할 수 있다. 단백질의 경우 고정 과정동안 아미노산에 존재하는 아미노기 끼리의 공유결합을 이루면서 서로 네트워크를 이루기 때문에, 매우 안정적인 반면, RNA나 DNA와 같은 핵산의 경우 아미노기가 존재하지 않기 때문에, 고정된 조직에서도 상대적으로 불안정하다. 특히, 전기영동 과정이 포함되는 경우, 핵산이 가진 전기적 성질에 의해 조직 내 위치가 바뀔 우려가 있다. 반면, 본 발명에 따른 투명화된 생체 조직은 GFP(Green Fluorescent Protein) 세포 및 도파민 활성 뉴런 마커 항체인 티로신하이드록시아제(Tyrosine Hydroxylase) 등에 대한 형광 염색이 우수하게 수행된다.
본 발명에 따른 생체 조직 투명화 방법은 손상되지 않은 생체 조직의 세포와 분자의 3차원 분포를 이미지화하여 관찰할 수 있으므로, 복잡한 구조를 가지는 다양한 생체 조직에 대하여 하나의 완전한 구조로 수백 마이크로미터 이상의 크기로 관찰 연구를 수행할 수 있으므로 조직 내의 유용한 정보를 취득하여 뇌질환 등의 다양한 질환의 원인을 규명하는데 효과적으로 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실험예 1> 생체 조직의 투명화 1
본 발명에 따른 조성물로 생체 조직을 투명화하기 위하여 다음과 같이 수행하였다.
모든 동물 실험 과정은 계명대학교 동물 자원 대학위원회의 지침서(Approval No. KM-2014-20R1)에 따라 수행하였다.
먼저, 틸레타민(Tiletamine)-졸라제팜(zolazepam)-자이라신(xylazine) 혼합물을 이용하여 성인 생쥐 (8주령)를 마취시키고, 쥐의 혈관을 염색하기 위해 tail vein으로 Lectin-488 (Cat# DL1174)을 주입하였다. Lectin 주입 후 5분 동안 기다린 후 경심 관류로 얼음처럼 차가운 1X 인산완충용액 (phosphate-buffered saline) 50 mL을 관류시킨 후, 얼음처럼 차가운 4% PFA가 포함된 PBS를 관류시켰다. 그 다음 기관을 적출하고 4%의 PFA용액에 담근 후 4℃에서 12 h 동안 인큐베이션 하였다.
다음으로, 상기 샘플을 실온으로 옮겨 2시간 동안 더 인큐베이션을 하였고, 50ml의 PBS로 2번 Washing을 하였다. 상기 고정화된 샘플을 4 w/v% N-라우릴사코신 소둠염과 60 w/v% 우레아의 혼합용액에서 55℃ 온도에서 220 rpm으로 3일 동안 인큐베이션하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2(a)는 투명화 전 마우스 뇌(half brain)이고, (b)는 실험예 1로 투명화된 마우스 뇌(half brain)이다.
따라서, 본 발명에 따른 N-라우릴사코신 소듐염과 우레아의 혼합용액은 생체 조직을 투명하게 함을 알 수 있다.
< 실험예 2> 생체 조직의 투명화 2
본 발명에 따른 조성물로 생체 조직을 투명화하기 위하여 다음과 같이 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 1에서 고정화된 샘플을 4 w/v% N-라우릴사코신 소둠염과 60 w/v% 우레아의 혼합용액에서 55℃ 온도에서 220 rpm으로 3일 동안 인큐베이션하고, 15 w/v% N-라우릴사코신 소듐염와 50 w/v% 우레아의 혼합용액에서 55℃ 온도에서 220 rpm으로 2일 동안 더 인큐베이션하였다.
상기 실험예1의 투명화된 조직보다 더욱 단단하고 투명하게 됨을 알 수 있었다.
< 실험예 3> 생체 조직의 투명화 3
본 발명에 따른 조성물로 생체 조직을 투명화하기 위하여 다음과 같이 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 1에서 고정화된 샘플을 미리 준비된 40 w/v% N-라우로릴사코신 소듐염으로 12시간 처리하는 전처리 과정을 더 수행하는 것을 제외하고는 실험예 1과 동일하게 수행하여 그 결과를 도 1, 도 3- 5에 나타내었다.
도 1은 투명화된 마우스 전체 조직에 대한 이미지이다.
도 3(a)는 투명화 전 마우스 뇌(half brain)이고, (b)는 실험예 3에서 40 w/v% N-라우릴사코신 용액의 전처리 후 마우스 뇌이고, (c)는 실험예 3으로 최종 투명화된 마우스 뇌이다.
도 4(a)는 마우스 췌장(pancreas)이고, (b)는 실험예 3으로 최종 투명화된 마우스 췌장이다.
도 5(a) 투명화 전의 PBS 용액에서 전체 뇌이고, (b)는 실험예 3의 40 w/v% N-라우릴사코신 용액에서의 마우스 전체 뇌이고, (c)는 실험예 3으로 최종 투명화된 마우스 전체 뇌이다.
도 1, 도 3-5에 나타난 바와 같이, 마우스의 투명화된 전체 조직 및 투명화된 뇌, 췌장을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 투명화 방법은 생체 조직을 완벽히 투명하게 하는데 최적임을 알 수 있다.
< 실험예 4> 투명화된 성인 마우스 뇌 및 췌장 이미지 확인
본 발명에 따른 투명화 방법으로 투명화된 뇌 및 췌장의 혈관을 확인하기 위해 가변평면레이저현미경(Selective Plane Illumination MicroscopyLightsheet Z.1)에서 5X 및 20X 대물렌즈를 이용하여 마우스 뇌와 췌장을 면역 염색 이미지화하여 GFP 신호를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 2에서 투명화된 조직을 50 mL 증류수에 3번 교체해줌으로써 12시간 인큐베이션하였다. 그 후 샘플을 도파민 활성 뉴런 마커 항체인 트립신 하이드록시아제(Tyrosine Hydroxylase (Cat# ab112))를 1% Triton X-100과 PBS용액의 혼합 용액에 넣고 4℃에서 3일 동안 인큐베이션 하였다. 3일 후 다시 증류수에 12h 동안 세척 후 2차 항체 Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor-594에 3일 동안 4℃에서 인큐베이션하고, 1X PBS에서 6시간 세척하였다. Washing을 마치 샘플은 다시 N-라우릴사코신과 우레아의 혼합용액에 담고 12시간 인큐베이션 후 가변평면레이저 현미경으로 측정하고, 3차원 이미지는 Zeiss software에서 재건하여 면역 염색이미지와 GFP신호를 확인하였으며 그 결과는 도 6 내지 도 10에 나타내었다. 이미지화(Z-stack volume)는 0.6 mm-3 mm 까지 관찰이 가능하였다.
도 6(a)는 Lectin-488의 마우스 뇌 이미지이고, (b)는 Lectin-488의 마우스 췌장 이미지이다.
도 7(a)는 Lectin-488의 뇌 혈관 이미지이고, (b)는 Lectin-488의 소뇌 혈관 이미지이고, (c)는 Lectin-488의 췌장 혈관 이미지이다.
도 8(a)는 투명화된 마우스 전체 뇌 이미지이고, (b)는 투명화된 전체 뇌에 TH-항체에 대한 5X 현미경 렌즈 이미지이고, (c)는 hippocampus의 주변에 있는 inhibitory neuron-GFP 20X 현미경 렌즈 이미지이다.
도 9는 TH-neuron의 비디오 영상 자료의 일부 이미지이다.
도 10은 inhibitory neuron-GFP 비디오 영상 자료의 일부 이미지이다.
도 6 내지 10에서 알 수 있는 바와 같이, 조직의 활성화된 구조를 투명화 한 후 단일 광자 현미경을 사용하여 시각적으로 확인이 가능하였으며, 3 차원적으로 혈관 패턴을 재건할 수 있었다. 특히, 이미지화된 췌장의 혈관 패턴의 경우, 일반적인 이미지화 및 3차원 재건으로 전체적인 패턴을 추적하는 것에 매우 어려움이 따르나, 본 발명의 조직 투명화 방법은 3 차원적 혈관계 재건과 시각적인 이미지를 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 생체 조직 투명화 방법은 손상되지 않은 생체 조직의 세포와 분자의 3차원 분포를 이미지화하여 관찰할 수 있으므로, 복잡한 구조를 가지는 다양한 생체 조직에 대하여 하나의 완전한 구조로 관찰 연구를 수행할 수 있으므로 조직 내의 유용한 정보를 취득하여 췌장 기능 및 뇌질환 연구에 효과적으로 사용될 수 있다.

Claims (7)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 아미노산 또는 이의 염을 포함하는 생체 조직 투명화용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00003

    (상기 화학식 1에서,
    R1은 수소 또는 C1-C2알킬이고,
    R2는 수소 또는 직쇄 또는 측쇄의 C8-C20알킬카보닐 또는 C8-C20알케닐카보닐이고,
    R3는 필수아미노산의 곁가지를 의미한다).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R1은 메틸이고,
    R2는 직쇄 또는 측쇄의 C8-C20알킬카보닐이고,
    R3는 수소인 것을 특징으로 하는 생체 조직 투명화용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 우레아(urea), CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트)), CHAPSO(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-2-하이드록시-1-프로판설포네이트)), 수크로오스(sucrose), 프룩토오스(fructose), 글리세롤, 다이아트라이조산(Diatrizoic acid), t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올, 폴리옥시에틸렌(20)소르비탄 모노라우레이트, 2-2-싸이오디에탄올 및 이오헥솔(Iohexol) 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 조직 투명화용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 생체 조직은 뇌(brain), 혈관(blood vessel), 간(liver), 폐(lung), 신장(kidney), 췌장(pancreas) 또는 장(intestine)인 것을 특징으로 하는 생체 조직 투명화용 조성물.
  5. 고정화된 생체 조직을 제1항의 조성물과 접촉시켜 투명화시키는 단계를 포함하는 생체 조직의 투명화 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 고정화된 생체 조직은 파라포름알데하이드(paraformaldehyde), 에텔렌글리콜 디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether), 디프로필렌 글리콜 디글리시딜에테르(dipropylene glycol diglycidyl ether), 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether), 글리세롤 폴리글리시딜 에테르(glycerol polyglycidyl ether), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 및 폴리아크릴아마이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상으로부터 고정화된 생체 조직인 것을 특징으로 하는 생체 조직의 투명화 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 방법은 고정화된 생체 조직을 제1항의 화학식 1로 표시되는 아미노산으로 전처리하는 단계를 더 수행할 수 있는 것을 특징으로 하는 생체 조직의 투명화 방법.
KR1020160160031A 2016-11-29 2016-11-29 생체 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법 KR101866249B1 (ko)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160160031A KR101866249B1 (ko) 2016-11-29 2016-11-29 생체 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법
PCT/KR2017/013168 WO2018101663A2 (ko) 2016-11-29 2017-11-20 생체 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법
EP17876444.5A EP3550029B1 (en) 2016-11-29 2017-11-20 Composition for biotissue clearing and biotissue clearing method using same
JP2019548842A JP6945881B2 (ja) 2016-11-29 2017-11-20 生体組織透明化用組成物及びそれを用いた生体組織の透明化方法
CN201780073234.0A CN109996887A (zh) 2016-11-29 2017-11-20 用于清除生物组织的组合物和使用其清除生物组织的方法
US16/462,973 US11726012B2 (en) 2016-11-29 2017-11-20 Composition for biotissue clearing and biotissue clearing method using same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160160031A KR101866249B1 (ko) 2016-11-29 2016-11-29 생체 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180060494A true KR20180060494A (ko) 2018-06-07
KR101866249B1 KR101866249B1 (ko) 2018-06-12

Family

ID=62241633

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160160031A KR101866249B1 (ko) 2016-11-29 2016-11-29 생체 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11726012B2 (ko)
EP (1) EP3550029B1 (ko)
JP (1) JP6945881B2 (ko)
KR (1) KR101866249B1 (ko)
CN (1) CN109996887A (ko)
WO (1) WO2018101663A2 (ko)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180118514A (ko) * 2017-04-21 2018-10-31 한국화학연구원 생체 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법
CN110763661A (zh) * 2018-07-25 2020-02-07 中国科学院合肥物质科学研究院 处理液组合物、试剂盒和生物器官透明化同时进行免疫标记的方法
WO2020159264A1 (ko) * 2019-02-01 2020-08-06 주식회사 바이나리 뇌 조직 투명화를 이용한 시냅스 기능 장애 평가 방법
WO2020166974A1 (ko) * 2019-02-14 2020-08-20 주식회사 바이나리 뇌 조직 투명화를 이용하여 약물의 뇌혈관장벽 통과 여부를 모니터링 하는 방법
KR20210007496A (ko) * 2019-07-11 2021-01-20 주식회사 바이나리 뇌 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 우울증 약리 효능의 평가 방법

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110139922B (zh) * 2016-12-22 2021-05-25 香港大学 用于澄清组织的组合物和方法
WO2021060373A1 (ja) * 2019-09-24 2021-04-01 国立大学法人大阪大学 細胞適合性組織透明化組成物
KR102477568B1 (ko) * 2020-06-16 2022-12-15 서울대학교산학협력단 1 mm 이하 크기 생체 시료의 투명화 전처리 방법 및 이를 포함하는 생체 시료의 투명화 방법

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003066035A (ja) * 2001-08-06 2003-03-05 Anse Ko 水溶性組織清澄溶液
EP2199774A1 (en) * 1997-08-20 2010-06-23 The University Of Miami Apparatus for histoprocessing of tissue samples
WO2014025392A1 (en) * 2012-08-09 2014-02-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for preparing biological specimens for microscopic analysis
WO2014115206A1 (ja) * 2013-01-28 2014-07-31 独立行政法人科学技術振興機構 組織透明化方法、組織透明化試薬及び組織観察方法
KR101563826B1 (ko) * 2014-12-31 2015-10-28 계명대학교 산학협력단 조직 투명화 방법

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2774988B1 (fr) * 1998-02-16 2000-05-05 Commissariat Energie Atomique Procede de purification de la prpres a partir d'un echantillon biologique et ses applications
FR2801106B1 (fr) * 1999-11-12 2007-10-05 Commissariat Energie Atomique Procede de diagnostic d'une esst provoquee par une souche d'atnc dans un echantillon biologique et son utilisation dans le diagnostic differentiel des differentes souches d'atnc
JP2007097508A (ja) 2005-10-05 2007-04-19 Tohoku Univ 哺乳動物組織材料の前処理方法
FR2893952B1 (fr) * 2005-11-25 2008-02-22 Bio Rad Pasteur Sa Procede d'identification du genotype en position 171 de la proteine prion d'ovin ainsi que trousses de mise en oeuvre de ce procede.
WO2007084429A2 (en) * 2006-01-13 2007-07-26 Ventana Medical Systems, Inc. Biological sample processing composition and method
JP2012518171A (ja) * 2009-02-13 2012-08-09 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 組織に基づいた診断のためのシステム、方法及びデバイス
CN102859344A (zh) * 2010-03-12 2013-01-02 独立行政法人理化学研究所 用于生物材料的澄清试剂和其用途
CN103492852B (zh) * 2011-04-28 2016-08-17 独立行政法人理化学研究所 生物材料的透明化方法、及其利用
ES2915263T3 (es) * 2011-06-17 2022-06-21 Roche Diagnostics Hematology Inc Solución y procedimiento para el histoprocesamiento de muestras biológicas
JP6118523B2 (ja) * 2012-08-22 2017-04-19 学校法人慶應義塾 エチレングリコール及び界面活性剤を含む溶液を用いた細胞分画法
US11035763B2 (en) 2012-10-30 2021-06-15 Kanazawa Medical University Kit for producing cleared biological specimens and method for producing cleared biological specimens
ES2881079T3 (es) * 2013-03-15 2021-11-26 Univ Florida Método de descelularización de injertos de tejidos
JP2015049101A (ja) * 2013-08-30 2015-03-16 オリンパス株式会社 生体透明化剤
WO2015041755A1 (en) * 2013-09-20 2015-03-26 California Institute Of Technology Methods for phenotyping of intact whole tissues
EP2865685A1 (en) 2013-10-24 2015-04-29 Westfälische Wilhelms-Universität Münster Electrophoretic analysis of a sample using N-Lauroylsarcosine
WO2016023009A1 (en) * 2014-08-07 2016-02-11 Wake Forest University Health Sciences Compositions and methods for clearing a biological sample
JP6601842B2 (ja) * 2015-12-17 2019-11-06 国立大学法人名古屋大学 植物組織透明化剤
JP6979408B2 (ja) * 2016-03-18 2021-12-15 ベックマン コールター， インコーポレイテッド 標的検体の細胞内局在
JP6818346B2 (ja) * 2016-04-28 2021-01-20 国立大学法人浜松医科大学 電子顕微鏡によるナノ粒子の直接的な同定・定量のための検出キットおよび方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2199774A1 (en) * 1997-08-20 2010-06-23 The University Of Miami Apparatus for histoprocessing of tissue samples
JP2003066035A (ja) * 2001-08-06 2003-03-05 Anse Ko 水溶性組織清澄溶液
WO2014025392A1 (en) * 2012-08-09 2014-02-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for preparing biological specimens for microscopic analysis
WO2014115206A1 (ja) * 2013-01-28 2014-07-31 独立行政法人科学技術振興機構 組織透明化方法、組織透明化試薬及び組織観察方法
KR101563826B1 (ko) * 2014-12-31 2015-10-28 계명대학교 산학협력단 조직 투명화 방법
WO2016108359A1 (ko) 2014-12-31 2016-07-07 계명대학교 산학협력단 조직 투명화 방법

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cell. 2015 July 16; 162(2): 246-257 *
Chung K, et al. (2013) Nature 497(7449):332-337.
Lee H, et al. BMC Developmental Biology 2014 14:781
Nat. Protoc., Vol. 9, No. 7, pp. 1682-1697 (2014.07.) *
Nature Protocols 7, 1983-1995 (2012) *
Sci Rep. 2016; 6: 18631. *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180118514A (ko) * 2017-04-21 2018-10-31 한국화학연구원 생체 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법
CN110763661A (zh) * 2018-07-25 2020-02-07 中国科学院合肥物质科学研究院 处理液组合物、试剂盒和生物器官透明化同时进行免疫标记的方法
WO2020159264A1 (ko) * 2019-02-01 2020-08-06 주식회사 바이나리 뇌 조직 투명화를 이용한 시냅스 기능 장애 평가 방법
WO2020166974A1 (ko) * 2019-02-14 2020-08-20 주식회사 바이나리 뇌 조직 투명화를 이용하여 약물의 뇌혈관장벽 통과 여부를 모니터링 하는 방법
KR20210124468A (ko) * 2019-02-14 2021-10-14 주식회사 바이나리 뇌 조직 투명화를 이용하여 약물의 뇌혈관장벽 통과 여부를 모니터링 하는 방법
KR20210007496A (ko) * 2019-07-11 2021-01-20 주식회사 바이나리 뇌 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 우울증 약리 효능의 평가 방법

Also Published As

Publication number Publication date
EP3550029A2 (en) 2019-10-09
KR101866249B1 (ko) 2018-06-12
JP2020513573A (ja) 2020-05-14
US20200271553A1 (en) 2020-08-27
CN109996887A (zh) 2019-07-09
WO2018101663A2 (ko) 2018-06-07
JP6945881B2 (ja) 2021-10-06
WO2018101663A3 (ko) 2018-08-09
EP3550029A4 (en) 2020-07-29
EP3550029B1 (en) 2024-07-10
US11726012B2 (en) 2023-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101866249B1 (ko) 생체 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법
CN108061677B (zh) 用于生物材料的澄清试剂和其用途
CN107209093B (zh) 生物材料用透明化试剂、体系及其利用
KR102296381B1 (ko) 생체 조직 투명화용 조성물 및 이를 이용한 생체 조직 투명화 방법
US10267714B2 (en) Composition for preparing biomaterial with excellent light-transmitting property, and use thereof
KR101849704B1 (ko) 생체 조직의 투명화 전처리 방법 및 이를 포함하는 생체 조직의 투명화 방법
US11022528B2 (en) Composition for biological tissue transparency and method for biological tissue transparency using same
JPWO2012147965A1 (ja) 生物材料を透明化する方法、及びその利用
US20170108414A1 (en) High-resolution three-dimensional imaging of mammalian hearts
US11365213B2 (en) Composition for clearing spheroids, method for clearing spheroids using same, and kit comprising same
KR102085373B1 (ko) 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직 투명화 키트 및 이를 이용한 투명화 방법
JP6878704B2 (ja) 透明化大型組織の免疫染色用組成物、及び透明化大型生体組織の免疫染色方法
WO2021015196A1 (ja) 生体組織の処理方法及び処理用組成物
KR20210119210A (ko) 오가노이드 투명화 키트, 이를 이용한 오가노이드 투명화 방법 및 3차원 이미지화를 위한 면역염색 방법
JP6964674B2 (ja) 生体組織サイズを調整するための組成物、及び前記組成物を使用して生体組織のサイズを調整する方法
KR102477568B1 (ko) 1 mm 이하 크기 생체 시료의 투명화 전처리 방법 및 이를 포함하는 생체 시료의 투명화 방법
KR102591021B1 (ko) 오가노이드용 투명화 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 투명화 방법
KR102354092B1 (ko) 스페로이드 투명화용 조성물, 이를 이용한 스페로이드 투명화 방법 및 이를 포함하는 키트
KR20240000007A (ko) 생체조직 투명화 조성물 및 이를 이용한 전기영동 투명화 방법
Jalufka et al. Hydrophobic and hydrogel-based methods for passive tissue clearing

Legal Events

Date Code Title Description
GRNT Written decision to grant