CN101371125A - 生物样品处理组合物与方法 - Google Patents
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Abstract
公开了对于用于处理生物样品的方法和组合物。在一个方面,使用组织化学技术处理生物样品,比如组织切片,在过程中用生物样品接触脂质化合物,使在用显微镜观察时,样品中可观察的细胞和亚细胞特征的分辨率增强。在其它方面,公开了包括脂质化合物的盖玻片组合物,和使用盖玻片组合物将样品盖玻片的方法。
Description
相关申请
本发明要求美国专利申请号为60/759,240的临时申请的优先权,所述临时申请于2006年1月13日提出申请,通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及用于处理生物样品的组合物和方法,所述样品比如细胞和组织,用于显微镜观察。更特定地,本发明涉及组合物和方法,其能增加染色细胞或组织样品中可观察的细胞细节的对比度、色彩平衡和数量。此外,本发明涉及组合物和方法,对于在促进其中溶剂蒸发的条件下以较高温度处理的生物样品,所述组合物和方法能够保持和/或恢复生物样品。
背景技术
大多数细胞和组织都缺乏充足的固有颜色和对比度来进行其形态的详细显微镜分析。结果通常用一种或多种彩色染料将细胞和组织染色,以增强细胞之间和亚细胞特征之间的对比度。用通过染色显示的特征可以诊断各种不同的疾病和状况。
作为很多通常染色过程的辅助,将细胞或组织样品与各种溶剂和溶剂混合物接触。使用溶剂,例如将蜡包埋(paraffin-embodded)样品脱蜡,制备可以用非极性染料处理的样品,或者制备用于盖玻片(coverslip)的样品。很多溶剂,如乙醇、柠檬烯、二甲苯和含水清洁剂溶液易于从细胞膜中提取脂质化合物。结果在处理过程中,特别是如果在较高温度处理以帮助蒸发溶剂时,细胞形态改变,而且细胞变得更易于受到损害。因此,需要方法和组合物,其可以帮助保护细胞和组织样品在处理过程中免受损害,并帮助恢复受损或改变的细胞结构。此外,需要方法和组合物,其可以通过增加样品中可观察的细胞细节的对比度、色彩平衡和数量来增加组织染色细胞的临床效用。
发明内容
公开了组合物和方法,其包括用于促进保持、恢复和/或增强染色的生物样品中可观察的细胞和组织形态的脂质化合物。例如,所述组合物和方法能够提供透明度和分辨率增加的细胞和亚细胞结构,使观察者可以更容易地分辨不同的组织元素,并显现样品中细微的微解剖学细节。细胞结构,比如膜和核特征,在H&E染色的组织部分中能够变得清晰可见,所述组织部分接触过脂质化合物。此外,H&E染色的样品中的对比度和色彩平衡能够根据本公开而改善。细节的增强和对比度与色彩平衡的改善对根据染色的生物样品做出诊断有帮助。
在一个方面,公开了用于处理生物样品的方法,其可以增加细胞和亚细胞分辨率,并改进样品的对比度和色彩平衡。在一个特定实施方案中,所述方法包括向染色样品施加盖玻片组合物,其中所述盖玻片组合物包括盖玻片溶剂和脂质化合物。一旦应用盖玻片组合物,就将盖玻片置于样品上。因为盖玻片组合物中包括脂质化合物,所以与只使用盖玻片溶剂进行盖片(coverslipping)的基本近似的样品相比,能够观察到对比度和细胞与亚细胞分辨率增加,对比度增加和色彩平衡得到改善。在与自动染色技术组合使用时,所述技术对每个染色载玻片都使用新鲜试剂,在自动化过程(比如在盖片步骤)之中使样品与脂质化合物接触能够使载玻片的临床效用增加。
在另一方面,公开了包括盖玻片溶剂和脂质化合物的盖玻片组合物。盖玻片组合物中的脂质化合物可以是清洁剂脂质化合物或非清洁剂脂质化合物。有用的非清洁剂脂质化合物包括脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪胺、脂肪醚、聚硅氧烷、聚醚和类异戊二烯中的一种或多种。
在还更进一步的方面,公开了方法,当在促进样品中溶剂蒸发的条件下,将样品置于较高温度时,所述方法用于处理显微镜载玻片上的生物样品。在这个方面,所述方法包括:用组织化学过程处理样品,提供染色样品;在促进样品中溶剂蒸发的条件下,将样品置于较高温度;和使样品与脂质化合物接触。在特定实施方案中,在组织化学过程中,使样品接触一种或多种脂质提取溶剂,并在处理过程中用脂质化合物处理生物样品,用该脂质化合物取代样品中去除的脂质含量的至少一部分。样品的“重脂质化”可以恢复在处理过程中变得不清晰的组织形态,并提供很多益处,包括防止(和/或去除)由于将样品置于较高温度和蒸发条件而导致的假象(artifact)和形态变化。加入脂质化合物还能够同时增加由量视野显微镜可观察的细胞和亚细胞的分辨率。
附图简述
图1是示意图,表示盖片步骤中包含脂质化合物的自动H&E过程。
图2A-2I是一系列显微照片,表示在盖片步骤中,用脂质化合物接触的自动H&E染色的肝组织样品中的分辨率增加,而且核干燥假象减少,同时以未与脂质化合物接触的H&E染色的样品作为参照(2A)。
图3是示意图,阐述在醇或柠檬烯溶液其一或者两者中包含脂质化合物的自动H&E染色过程。
图4是示意图,阐述在盖玻片溶液中引入脂肪醇的自动H&E染色过程。
图5A和5B是一对显微照片,阐述通过用脂肪醇接触H&E染色样品,增加了细胞和亚细胞特征的分辨率。
图6是示意图,阐述自动H&E染色过程,其用于评价在所公开方法的实施方案中使用的各种脂质化合物/组合物。
图7是一系列代表性的显微照片,证明所公开方法的实施方案使分辨率、对比度和色彩平衡增加。
几个示例性实施方案的详述
通过下述非限定性的描述和实例阐述本发明的更多方面,所述描述和实例使用下面的总述后提供的缩写和术语。
1.总述
在一个方面公开了方法,其用于增加染色生物样品中可观察的细胞和亚细胞的分辨率,和/或减少因为将样品置于较高温度而引入的假象数目,特别是在样品还置于促进溶剂从样品蒸发的条件下时。所述方法包括:使样品与脂质化合物接触,所述化合物可以是清洁剂脂质化合物或非清洁剂脂质化合物。
在一个实施方案中,公开将生物样品染色的方法,其包括用一种或多种组织染色剂接触样品,和用脂质化合物组合物接触样品(比如在盖片步骤中),其中脂质化合物组合物基本上由脂质化合物和低级烷醇或盖玻片溶剂(在某些染色程序中,其还能,例如,用于清洁步骤,而不是盖片步骤)组成。组合物中的脂质化合物,在特定实施方案中,在约20℃时的水溶性小于约1.0g/mL,更特定地,可以是非清洁剂脂质化合物。在其它特定实施方案中,生物样品可以是蜡包埋的生物样品,用脂质化合物组合物接触该样品可以在将样品脱蜡后进行。在其它特定的实施方案中,用一种或多种组织染色剂接触样品可基本上由用苏木精和曙红接触生物样品组成。所述方法可以手动或自动进行,并且当将大量样品染色时,可以对每个样品使用新鲜试剂。有用的脂质化合物类的特定实例包括清洁剂、脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪胺、脂肪醚、聚硅氧烷、聚醚和类异戊二烯。在特定实施方案中,脂质化合物可以是一种或多种C8至C20的脂肪醇,例如,一种或多种C8至C20的不饱和脂肪醇。通常,脂质化合物组合物将包括约0.5%至约35%的脂质化合物。在其它特定实施方案中,将脂质化合物溶于脂肪烃、芳香烃或萜(比如柠檬烯)中的一种或多种。
在另一个实施方案中,公开的方法是在显微镜载玻片上将染色的生物样品(比如组织染色的组织或细胞样品)进行盖片的方法,使在样品中观察到的对比度、细胞和亚细胞的分辨率增加。在公开的方法的特定实施方案中,脂质化合物包含脂肪醇、清洁剂、脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪胺、脂肪醚、聚硅氧烷、聚醚和类异戊二烯中的一种或多种。在特定实施方案中,脂质化合物是非清洁剂脂质化合物。
公开的盖玻片实施方案包括对样品应用盖玻片组合物,并将应用了组合物的样品进行盖片。盖玻片组合物包含盖玻片溶剂(比如脂肪烃、芳香烃和萜中的一种或多种)和脂质化合物。当用这种方法处理时,与只用盖玻片溶剂进行盖片的基本近似的样品比较,盖玻片后样品的对比度和细胞与亚细胞分辨率增加。在特定实施方案中,盖玻片溶剂包括烷烃、烷烃混合物、柠檬烯、二甲苯和甲苯中的一种或多种。脂质化合物以约0.5%至约50%之间的任何浓度溶于盖玻片溶剂,但通常脂质化合物以约0.5%至约35%之间的浓度溶于盖玻片溶剂,例如从约1%至约25%的浓度。在特定实施方案中,脂质化合物可以是在约20℃时水溶性小于约1g/L的脂质化合物。在其它特定实施方案中,脂质化合物的沸点高于约200℃。
所述方法可以手动进行,引入自动过程中,或者以其任何组合进行,而且所述方法可以使用“预粘合”的盖玻片,或者盖玻片组合物中进一步包括粘合剂。通常,盖玻片组合物的折射率接近组织的折射率。合适的盖玻片粘合剂包括氰基丙烯酸酯粘合剂和可光固化粘合剂聚合物(比如可见光和UV可固化粘合剂)。可以从,例如Ted Pella、Inc.(Redding,CA)获得市场出售的盖玻片胶。可UV固化粘合剂包括可从Instrumendics、Inc.(St.Louis、MO)获得的CureMountTM和可从HenkelLoctite Corporation(Rocky Hill,CT)获得的各种UV和可见光可固化聚合物。
在另一方面,公开了盖玻片组合物,其包括盖玻片溶剂和脂质化合物,每种都如上所述。在特定实施方案中,盖玻片组合物基本上由盖玻片溶剂和脂质化合物组成。在另一个特定实施方案中,盖玻片溶剂包括盖玻片粘合剂。在另一个特定实施方案中,盖玻片组合物基本上由盖玻片溶剂、脂质化合物和盖玻片胶组成。
在另一方面,公开了处理生物样品的方法,其包括使用组织化学技术处理样品(例如,组织染色过程,比如H&E染色过程)来提供染色的生物样品,在促进溶剂从样品蒸发的条件下将样品置于较高温度,并在将样品置于较高温度和蒸发条件之前、之中或之后,使样品与脂质化合物接触。可以将样品放置一段时间,其时间使其足以去除至少部分样品上覆盖的至少部分溶剂,和/或可以将样品放置一段时间,其时间使其足以去除至少部分在处理过程中吸收进样品的溶剂。脂质化合物如上所述,可以充分保留在样品上或样品内,在蒸发过程中帮助防止损伤,或者可以在蒸发过程后加入脂质化合物,将蒸发过程中对样品的损伤逆转。当挥发溶剂,比如低级烷醇,如乙醇,从样品快速蒸发时,在较高温度,在蒸发过程之中或之后,可以使用脂质化合物保护或恢复样品。
通过任何类型的烘箱或加热设备与被动(比如空气对流)或主动的气体交换方法结合,可以为置于显微镜载玻片上的样品提供高温和促进溶剂从样品蒸发的条件。促进溶剂从样品蒸发的条件通过蒸发手段,使样品中和/或样品上的溶剂量净减少。在特定实施方案中,样品在对流烘箱中和/或使用辐射加热器干燥,可选地与主动促进样品表面间气体流动(比如空气流动)的方法(比如扇子或压缩空气源)组合,促进蒸发过程的进行。
通常,在促进溶剂从样品蒸发的条件下将样品置于较高温度包括从样品去除至少25%的溶剂,例如,至少50%溶剂,至少90%溶剂,或至少95%溶剂。覆盖样品处于液相的溶剂可以充分去除,而样品吸收的溶剂中只有一部分可以去除。当通过蒸发过程(其导致样品的“干燥”以及可能地相关人为现象)从样品本身显著去除溶剂时,使样品与脂质化合物接触对保护或恢复样品的细胞和亚细胞结构特别有用。加热的温度和时间对从样品去除一定量的溶剂有用,可以简单地通过经验手段确定。
在特定实施方案中,在蒸发过程中从样品蒸发的溶剂包含低级烷醇(C1-C5伯醇、仲醇或叔醇,比如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇或新戊醇)和/或萜(比如挥发萜,如柠檬烯)。当样品中和/或样品上存在多种特定溶剂化合物时,可能优选根据它们的相对挥发性(蒸汽压)去除一种或多种特定溶剂,优选去除具有较高挥发性(在指定温度的蒸汽压)的那些溶剂。通过这种过程也能够去除样品内包含的水,但是通常将水去除的程度较低,使得在样品处理方法中,可以使用更多的挥发溶剂。脂质化合物本身通常具有显著低于水和要去除的溶剂的蒸汽压,因此,如果在蒸发过程中存在脂质化合物,将保留在样品上和/或样品中。
对置于较高温度和促进溶剂蒸发条件下的样品,用来保护或恢复样品的脂质化合物通常以溶液形式使用,例如,有机溶剂,比如烷醇(例如,乙醇),和脂肪烃(例如,烷烃)、萜(比如柠檬烯)或芳香烃(例如,甲苯或二甲苯)中的脂质化合物溶液。其它有机溶剂,比如挥发醚和酯可以在某些实施方案中使用。
通常,有各种原因期望使用将一定量脂质化合物留在样品上的过程,以提供样品覆盖和一种或多种保护、恢复和分辨率增强,但是这不会干扰盖玻片固化过程(例如,通过阻止盖玻片胶的正常固化)或在载玻片上留下不期望的脂质残基。因此,在某些实施方案中,根据本公开的方法将在盖片时在载玻片上留下至少约1μL但少于约30μL(例如,小于约20μL,比如少于约10μL或小于约5μL)的脂质化合物,而无论在在盖片之前或之中,脂质化合物过程中的哪个阶段加入,也无论以多少量加入。因此,如果在染色过程中某点加入大量的脂质化合物,可能合意的是使用溶剂(脂质化合物溶于该溶剂),通过一个或多个漂洗步骤去除一些脂质化合物,比如乙醇/水溶液、表面活性剂溶液、乙醇、柠檬烯等。在包括脱蜡(de-paraffinization)的过程中,可能合意的是在脱蜡后使样品与脂质化合物接触,因为脱蜡溶剂可以从样品去除脂质化合物。相似地,在将样品用乙醇脱水的过程中,可能合意的是在脱水步骤后使样品与脂质化合物接触,使加入的脂质化合物不会由脱水溶剂去除。在特定实施方案中,对样品应用脂质化合物可以在将含石蜡样品脱蜡之后,在清除脱蜡样品中的脱蜡溶剂(比如用清洁剂溶液、柠檬烯、烷烃或烷烃混合物)之后,在使用组织化学技术将样品染色之后,在盖片前的溶剂交换步骤中,或在盖片过程中发生。
在蒸发过程中放置样品的所述较高温度通常在约35℃和约140℃之间,更通常地在约45℃和约100℃之间,例如在约45℃和约70℃之间。脂质化合物将通常在较高温度具有低蒸汽压(例如,低于约200torr的蒸汽压,低于约100torr的蒸汽压,或低于约50torr的蒸汽压)。
在另一个方面,公开了用于增强已脱蜡(原先含石蜡)的组织样品的组织染色的方法,其包括用组织染色溶液接触组织样品,和使样品与脂质化合物接触。在一个实施方案中,用组织染色溶液接触样品包括用基本由苏木精染料组成的溶液接触样品,和用基本由曙红组成的溶液接触样品。
在所公开方法的一些实施方案中观察到分辨率增加,这使观察者更好地分化组织元素,使细微的解剖细节可见。染色的对比度和色彩平衡方面也有总体改善,使组织特征具有清晰的轮廓,产生清楚的视觉效果。分辨率增加的效果在所有组织和细胞类型中都很明显,但是在用于H&E染色的下述组织背景中特别突出:
1.细胞膜:所有细胞的细胞质膜都突出而且清晰可见,能够清楚地分辨细胞边界。在上皮细胞中,效果特别突出,比如前列腺核和外分泌腺的分泌细胞和胆管上皮细胞。
诊断应用:副神经节瘤和嗜铬神经瘤,肾嫌色细胞癌。
2.核细节:染色质和异染色质表现出了细微的细节,从而增强核特征。当存在时,核仁尖而易碎,具有适当的染色性质(例如霍金斯淋巴瘤中的嗜曙红细胞核)。有丝分裂的发生清晰可见而且非常明显。
诊断应用:高级前列腺上皮内瘤(PIN)、前列腺癌、对发育异常(比如食道发育异常和子宫颈发育异常)的评价和分级、甲状腺乳状癌。
3.平滑肌和胶原纤维:平滑肌和胶原显示出平滑颤动,使个体纤维(例如胃肠平滑肌、皮肤毛囊周围的松散胶原基质)清晰可见。基膜胶原特别突出而且轮廓清晰(例如外分泌腺基膜)。
诊断应用:从原位癌分化成微浸润癌。
4.角蛋白:增强嗜曙红细胞的染色和角蛋白的可见度。染色提供对早期角质化的更敏感检测。
诊断应用:诊断分化较差的扁平细胞癌。
5.亚细胞结构:突出了下述亚细胞结构,使其可以清楚地与其它细胞组分相分化:
a.纤毛
诊断应用:输卵管癌、输卵管化生。
b.刷状缘
诊断应用:十二指肠活组织切片检查的评价。
c.鳞片状细胞间桥
诊断应用:分化较差的扁平细胞癌。
d.核沟
诊断应用:乳状甲状腺癌核卵巢粒层细胞肿瘤。
II.缩写与术语
H&E-苏木精和曙红
TNC-数量太多无法计数
术语“a”、“an”和“the”同时包括单数和复数,除非文中明确说明单数还是复数。
术语“生物样品”指任何从生物实体获得或源自生物实体,比如动物的样品。生物样品的实例包括细胞样品、组织样品和生物流体。生物样品的非限定性特定实例包括血液、尿液、预精液(pre-ejaculate)、乳头抽吸液、精液、乳汁、唾液、粘液、胸腔积液、骨盆积液、关节液、腹水积液、体腔积液、眼睫毛(brushings)、皮屑、颊拭子、阴道拭子、帕氏载玻片、直肠拭子、抽吸液、针穿刺活检、获得的组织部分,例如通过外科手术或尸体解剖获得的组织、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、汗、眼泪、口水、肿瘤、器官和从体外细胞或组织培养物中获得的样品。通常,样品将是固定的活组织样品,经过处理去除水并嵌于石蜡或其它合适的蜡状物质中,以切开组织部分。
术语“盖片”指将盖玻片置于粘在显微镜载玻片上的样品上的行为,或者手动或者以自动的形式进行。
术语“盖玻片液体”指溶解粘合剂的液体(比如基本上非极性的有机液体),所述粘合剂用于将盖玻片粘到显微镜载玻片的表面。在一些实施方案中,盖玻片溶剂可进一步包括盖玻片粘合剂(比如胶或可光固化聚合物,比如可见光或UV可固化聚合物粘合剂),以形成盖玻片组合物(在某些实施方案中进一步包括脂质化合物),但是如果使用“预粘合”的盖玻片,则不需要在盖玻片溶剂中预先包括粘合剂,因为盖玻片溶剂会把粘合剂溶解到预粘合的盖玻片上,形成原位盖玻片组合物。盖玻片溶剂的实例包括芳香烃(比如二甲苯和甲苯)、脂肪烃(例如,烷烃和烯烃,比如C6-C10烷烃和烯烃及其混合物)、萜(比如柠檬烯),及其组合。有利地,盖玻片溶剂是挥发性的,表示在室温或者高于室温时具有较高的蒸汽压,使其从包括粘合剂(其可以包括在溶剂中,或通过用粘合在预粘合盖玻片上的粘合剂接触溶剂而形成)的盖玻片组合物中蒸发,留下盖玻片粘合剂(在一些实施方案中是脂质化合物),粘合剂可将盖玻片粘到底物上。盖玻片溶剂的上述实例都是挥发性的。
术语“清洁剂”指除了肥皂(其为脂肪酸的碱金属盐)之外的表面活性化合物,其具有好的水溶性(比如20℃时大于约0.05g/L,例如,20℃时大于约0.5g/L,或20℃时大于约1g/L),并表现出显著的去污力(在水中溶解大量非极性物质,比如油的清洁性能或能力)。与肥皂相反,在钙离子存在时,比如“硬”水中,清洁剂通常不会沉淀。清洁剂可以是非离子、阳离子、阴离子或两性离子的,而且可以是几种清洁剂的混合物。示例性的清洁剂类包括醇醚硫酸酯、醇硫酸酯、烷醇酰胺、烷基磺酸酯、氧化胺、两性清洁剂、阴离子清洁剂、甜菜碱衍生物、阳离子清洁剂、二磺酸酯、十二烷基苯磺酸、乙氧基化醇、乙氧基化烷基酚、乙氧基化脂肪酸、甘油酯水溶助长剂、月桂醇硫酸酯、甘油单酯和甘油二酯、非离子清洁剂、磷酸酯、季(quaternary)清洁剂和脱水山梨糖醇衍生物。示例性的非离子清洁剂包括BigCHAP(N,N-双[3-(D-葡萄糖-酰氨基)丙基]胆酰胺(cholamide))、双(聚乙二醇双[咪唑羰基])、30(聚氧乙烯4月桂基醚)35(聚氧乙烯23月桂基醚)、52(聚氧乙烯2十六烷基醚)、56(聚氧乙烯10十六烷基醚)、58(聚氧乙烯20十六烷基醚)、72(聚氧乙烯2十八烷基醚)、76(聚氧乙烯10十八烷基醚)、78(聚氧乙烯20十八烷基醚)、92(聚氧乙烯2油基醚)、97(聚氧乙烯10油基醚)、98(聚氧乙烯20油基醚)、700(聚氧乙烯100十八烷基醚)、EL(蓖麻油/环氧乙烷聚醚)、十乙二醇单十二烷基醚、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺(MECA-8)、癸酰基-N-甲基葡糖酰胺(MECA-10)、正辛基葡萄糖苷、正十二烷基葡萄糖苷、异十三烷基-聚(乙二醇醚)n、N-癸酰基-N-甲基葡糖胺、正癸基-α.-D-吡喃葡萄糖苷、癸基-β-D-吡喃麦芽糖苷、正月桂酰基-N-甲基葡糖胺、正十二烷基-α.-D-麦芽糖苷、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、七乙二醇单癸基醚、七乙二醇单十四烷基醚、正十六烷基-β-D-麦芽糖苷、七乙二醇单十二烷基醚、七乙二醇单十六烷基醚、七乙二醇单十八烷基醚、七乙二醇单十四烷基醚、 CA-630(辛基苯基-聚乙二醇)、 CA-210(聚氧乙烯(2)异辛基苯基醚)、 CA-520(聚氧乙烯(5)异辛基苯基醚)、 CO-630(聚氧乙烯(9)壬基苯基醚)、CO-720(聚氧乙烯(12)壬基苯基醚)、 CO-890(聚氧乙烯(40)壬基苯基醚)、CO-990(聚氧乙烯(100)壬基苯基醚)、 DM-970(聚氧乙烯(150)二壬基苯基醚)、甲基-6-O-(N-庚基氨基甲酰-)-α-D-吡喃葡萄糖苷、九乙二醇单十二烷基醚、N-壬酰-N-甲基葡糖胺、八乙二醇单癸基醚、八乙二醇单十二烷基醚、八乙二醇单十六烷基醚、八乙二醇单十八烷基醚、八乙二醇单十四烷基醚、辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、五乙二醇单癸基醚、五乙二醇单十二烷基醚、五乙二醇单十六烷基醚、五乙二醇单己基醚、五乙二醇单十八烷基醚、五乙二醇单辛基醚、五乙二醇单甘油二醚、聚乙二醇醚W-1、聚氧乙烯10十三烷基醚、聚氧乙烯100硬脂酸酯、聚氧乙烯20异十六烷基醚、聚氧乙烯20油基醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯8硬脂酸酯、聚氧乙烯双(咪唑基羰基)、聚氧乙烯25丙二醇硬脂酸酯、皂角苷、 20(脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、 40(脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)、 60(脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)、 65(脱水山梨糖醇三硬脂酸酯)、 80(脱水山梨糖醇单油酸酯)、 85(脱水山梨糖醇三油酸酯)、任何形式的壬基酚聚氧乙烯醚(Tergitol)(包括类型15-S-5、15-S-7、15-S-9、15-S-12、15-S-30、NP-4、NP-7、NP-9、NP-10、NP-40、NPX(Imbentin-N/63)、TMN-3(聚乙二醇三甲基壬基醚)、TMN-6(聚乙二醇三甲基壬基醚)、TMN-10(聚乙二醇三甲基壬基醚)、MINFOAM 1x和MIN FOAM 2x)、十四烷基-β-D-麦芽糖苷、四乙二醇单癸基醚、四乙二醇单十二烷基醚、四乙二醇单十四烷基醚、三乙二醇单癸基醚、三乙二醇单十二烷基醚、三乙二醇单十六烷基醚、三乙二醇单辛基醚、三乙二醇单十四烷基醚、 CF-21、 CF-32、 DF-12、 DF-16、GR-5M、 N-101(聚氧乙烯支链的壬基苯基醚)、 QS-15、 QS-44、 RW-75(聚乙二醇260单(十六烷基/十八烷基)醚和1-十八醇)、 X-100(聚乙二醇叔辛基苯基醚)、 X-102、 X-15、 X-151、 X-200、 X-207、X-114、 X-165、 X-305、 X-405(聚氧乙烯(40)异辛基苯基醚)、还原的 X-405(聚氧乙烯(40)异辛基环己基醚)、 X-45(聚乙二醇4-叔辛基苯基醚)、 X-705-70、任何形式的(包括 20(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、 21(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、 40(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)、 60(聚乙二醇脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)、 61(聚乙二醇脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)、 65(聚氧乙烯脱水山梨糖醇三硬脂酸酯)、 80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)、 81(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)和 85(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇三油酸酯))、Tyloxapol(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯酚与甲醛和环氧乙烷的聚合物)和正十一烷基β-D-吡喃葡萄糖苷。示例性的阴离子清洁剂包括鹅去氧胆酸、胆酸、去氢胆酸、去氧胆酸、毛地黄皂苷、毛地黄毒苷配基、N,N-二甲基十二烷基胺N-氧化物、多库酯钠、甘氨鹅去氧胆酸钠、甘氨胆酸、甘氨去氧胆酸、甘氨石胆酸3-硫酸二钠盐、甘氨石胆酸乙酯、N-月桂酰肌氨酸、十二烷基硫酸锂、Lugol(碘化碘钾)、Niaproof(2-乙基己基硫酸钠盐)、Niaproof 4(7-乙基-2-甲基-4-十一烷基硫酸钠盐)、可选取代的烷基磺酸盐(包括1-丁磺酸盐、戊磺酸盐、己磺酸盐、1-辛磺酸盐、1-癸磺酸盐、1-十二烷磺酸盐、1-庚磺酸盐、1-庚磺酸盐、1-壬磺酸盐、1-丙磺酸盐和2-溴乙基磺酸盐,特别是钠盐)、胆酸钠、去氧胆酸钠、可选取代的十二烷基硫酸钠、辛基硫酸钠、牛磺胆酸钠、牛磺鹅去氧胆酸钠、猪磺去氧胆酸钠、牛磺石胆酸3-硫酸二钠盐、牛磺熊去氧胆酸钠盐、十二烷基硫酸酯、熊去氧胆酸。阴离子清洁剂以酸或盐形式提供,或者以两者组合的形式提供。示例性的阳离子清洁剂包括溴化烷基三甲铵、氯化苯甲羟铵、氯化苯甲基二甲基十六烷基铵、氯化苯甲基二甲基十四烷基铵、溴化苯甲基十二烷基二甲铵、四氯碘酸苯甲基三甲铵、溴化二甲基双十八烷基铵、溴化十二烷基乙基二甲铵、溴化十二烷基三甲铵、溴化乙基十六烷基二甲铵、Girard试剂T、溴化十六烷基三甲铵、N,N′,N′-聚氧乙烯(10)-N-牛脂-1,3-二氨基丙烷、通佐溴铵和溴化三甲基(十四烷基)铵。示例性的两性离子清洁剂包括CHAPS(3-{(3-胆酰氨基丙基)-二甲铵}-1-丙烷-磺酸酯)、CHAPSO(3-{(3-胆酰氨基丙基)二甲铵}-2-羟基-1-丙烷-磺酸酯)、3-(癸基二甲铵)丙磺酸酯、3-(十二烷基二甲铵)丙磺酸酯、3-(N,N-二甲基十四烷基铵)丙磺酸酯、3-(N,N-二甲基十八烷基铵)丙磺酸酯、3-(N,N-二甲基辛基铵)丙磺酸酯和3-(N,N-二甲基棕榈基铵)丙磺酸酯。也期望两种或更多种清洁剂的组合,一种或多种清洁剂与一种或多种其它脂质化合物的组合。清洁剂可以使用已知程序合成,或者购得,例如,从Sigma-Aldrich、St.Louis、Mo。
术语“较高温度”指高于约25℃的温度,更通常地为高于约35℃的温度,比如高于约40℃的温度,或甚至高于约45℃。在特定实施方案中,较高温度指从约35℃至约140℃的温度,例如从约40℃至约120℃的温度。在特定实施方案中,较高温度是从约40℃至约90℃的温度。
短语“在促进溶剂从样品蒸发的条件下将样品置于较高温度”等指较高温度和促进溶剂从样品去除的气体流动(例如,空气在样品表面被迫或被动的流动)的组合。可以将样品在这样的条件下置于较高温度并持续充足的时间(在特别升高的温度)来去除样品上面至少部分溶剂和/或去除至少部分在处理过程中渗透进样品的溶剂。在促进溶剂从样品蒸发的条件下将样品置于较高温度可以通过,例如用辐射加热器或对流烘箱来实现。用来促进溶剂从样品蒸发的辐射加热器或对流烘箱能够促进样品表面上被动的气体对流和/或可包括迫使气体流过样品的方法(比如扇子或压缩空气来源)。
术语“脂肪酸”指具有从约6至约35个碳原子的脂肪族羧酸(可以以直链、支链和/或环状结构排列,有或没有额外的杂原子,比如氧或氮),或其盐(其中,碱金属盐是肥皂)。脂肪酸包括饱和和不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸包括单烯脂肪酸、多烯脂肪酸(包括亚甲基间断的、多亚甲基间断的、共轭的和丙二烯型酸)和炔属脂肪酸(比如塔日酸、硬脂炔酸、檀子油酸(santalbic acid)、西门木炔酸、6,9-十八碳炔酸、丙酮炔酸(pyrulic acid)、还阳参油酸和heisteric酸)。脂肪酸的实例包括肉豆蔻酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、山萮酸、羊毛酸、异硬脂酸、十一烯酸(undecyleic acid)、氢化动物脂肪酸、氢化植物脂肪酸和三压(triple-press)脂肪酸。饱和脂肪酸的实例包括辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、十九烷酸、二十烷酸、二十二烷酸、二十四烷酸、二十六烷酸、二十七烷酸、二十九烷酸、三十烷酸、三十二烷酸、三十三烷酸、三十四烷酸和三十五烷酸。不饱和脂肪酸的实例包括钝叶酸、亚油酸、γ-亚麻酸、二高(homo)-γ-亚麻酸、花生四烯酸、7,10,13,16-二十二碳四烯酸、4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸、α-亚麻酸、硬脂艾杜糖酸(stearidonic acid)、8,11,14,17-二十碳四烯酸、EPA、DPA、DHA、蜂蜜酸、癸烯酸、月桂烯酸、天台乌药酸、十四碳烯酸、抹香鲸酸、粗租酸(tsuzuic acid)、油酸、棕榈烯酸、岩芹炔酸、异油酸、鳕烯酸、巨头鲸鱼酸、鲸蜡烯酸、芥酸、神经酸、反油酸、反式(t-)异油酸。脂肪酸的其它实例包括羟基脂肪酸、二羧酸、脂肪酸式碳酸、联乙烯醚脂肪酸、含硫脂肪酸、脂肪酸酰胺、甲氧基脂肪酸、醛式脂肪酸、卤代脂肪酸和硝化脂肪酸。支链脂肪酸包括单或多支链脂肪酸(比如结核硬脂酸、phytomonoic酸、laetiporic酸、mycoceranic酸、结核蜡酸、phthioceranic酸、植烷酸、降植烷酸、视黄酸)、支链甲氧基脂肪酸(比如2-甲氧基-14-甲基十五烷酸和2-甲氧基-13-甲基十五烷酸)和支链羟基脂肪酸(分支菌酸)。包含环的脂肪酸包括环丙酸(比如majusculoic酸)、环丙烯酸(比如平婆酸和锦葵酸)、环戊酸和环戊烯酸、呋喃酸、环己酸、环氧酸、环状脂肪过氧化物和硫辛酸。也期望两种或更多种脂肪酸的组合,和一种或多种脂肪酸与一种或多种其它脂质化合物的组合。脂肪酸可以是合成的、从天然来源分离的、或者购得的。通常,本文所用脂肪酸以非盐形式存在,因为在有机溶剂中非盐形式的溶解度更高,特别在非极性溶剂中,如柠檬烯中。
术语“脂肪醇”指具有6和35之间的碳原子的脂肪族伯醇或仲醇(例如,8-30个碳原子,比如12-24个碳原子),该醇可以是饱和或不饱和的,可以是有支链的,或者可以包含环状结构,比如环丙烷环,还可以包括其它的甲基、烷氧基、硫酸根和/或羟基取代基。饱和脂肪醇的特定实例包括正辛醇、正壬醇、正癸醇、正十一醇、正十二醇、正十三醇、正十四醇、正十五醇、正十六醇、正十七醇、正十八醇、正十九醇和正二十醇、山萮醇、异辛醇、异壬醇、异癸醇、异十一醇、异十二醇、异十三醇、异十四醇、异十五醇、异十六醇、异十七醇、异十八醇、异十九醇、异二十醇、异二十二醇、2-辛醇、2-癸醇、2-十二醇、2-十三醇、2-十四醇、2-十五醇、2-十六醇、2-十七醇、2-十八醇、2-十九醇和2-二十醇。不饱和醇的特定实例包括花生醇、瓢儿菜醇、异花生醇、油醇、异油醇、亚麻醇、异亚麻醇、次亚麻醇、异次亚麻醇、obtusilyl醇、辛烯醇、月桂烯醇、linderyl醇、鲸蜡烯醇、抹香鲸醇、粗租烯醇、棕榈烯醇、岩芹烯醇、vaccenyl醇、gadoleyl醇、gondoyl醇、cetoleyl醇、瓢儿菜醇、神经烯醇、反油醇和t-vaccenyl醇。支链脂肪醇的特定实例包括2-丁基-1-癸醇、2-丁基-1-癸醇、2-癸基-1-十四醇、2-十二烷基-1-十六醇、2-十六烷基-1-二十醇、2-十六烷基-1-十八醇、2-己基-1-辛醇、2-己基-1-癸醇、2-己基-1-十二醇、2-辛基-1-癸醇、2-辛基-十二醇、2-十四烷基-1-二十醇和2-十四烷基-1-十八醇(例如,可从Jarchem Industries、Inc.,Newark,NJ获得)。包含环的脂肪醇的实例包括包含环丙环、环丙烯环或环戊烯环的醇。包含环的脂肪醇的特定实例包括majusculyl醇、sterculyl醇、malvalyl醇、晃模醇和vernolyl醇。脂肪醇还包括环氧醇,比如coronaryl醇和vernolyl醇。此外,脂肪醇包括炔属醇,比如塔日醇、白檀子炔醇、丙酮酸炔醇、crepenynyl醇、heisteryl醇和orpheyl醇。脂肪醇包括单甲基化醇(结核菌醇)、聚异戊二烯醇(比如isopranol,如降植烷醇和植烷醇)、聚戊烯醇(比如香叶醇、金合欢醇、香叶醇基香叶醇、香叶醇基金合欢醇、茄尼醇、castaprenol、ficaprenol、长醇和植醇),和芳香族类萜醇(比如生育酚、类固醇、三萜化合物、黄酮、类胡萝卜素和delatanoid)。也期望两种或更多种脂肪醇的组合,和一种或多种脂肪醇与一种或多种其它脂质化合物的组合。脂肪醇可以通过还原从相应的脂肪酸制备、从天然来源分离或从市场购得。
术语“脂肪胺”指具有6-35个碳原子的脂肪族胺或其盐。脂肪胺包括伯胺、仲胺、叔胺和乙氧基化或丙氧基化的胺。实例包括油胺、1-十二胺、二-正十八胺、三(异癸基)胺、二甲基-正癸胺、双(2-羟乙基)十二胺、双(2-羟丙基)十二胺、双(2-羟乙基)牛油胺。其它的实例包括正辛胺、正癸胺、正十三胺、正十六胺、正十八胺。脂肪胺的其它实例包括市场销售的脂肪胺,比如胺(可从Akzo Chemicals,Chicago,I11.购得),比如Akzo′s Armeen C、Armeen O、Armeen OL、Armeen T、Armeen HT、Armeen S和Armeen SD,其中字母与脂肪基团有关,比如椰油基、油基、牛油或硬脂基团。脂肪胺可以根据有机合成领域中众所周知的方法,从相应的脂肪酸或脂肪醇制备。因此,期望源自其它特别说明的脂肪醇和脂肪酸的胺。也期望两种或更多种脂肪胺的组合,和一种或多种脂肪胺与一种或多种其它脂质化合物的组合。通常,本文所使用的脂肪胺以非盐形式存在,因为在有机溶剂中,特别时在非极性溶剂如柠檬烯中,非盐形式具有较高的溶解度。
术语“脂肪酯”指醇(脂肪族或其它)和羧酸(脂肪族或其它)的具有总碳原子数从约6至约100个的酯,例如,从约8至约50个碳原子,比如从约10至约35个碳原子。醇部分可以是伯或仲醇,或是多元醇,比如甘油或糖。脂肪酸部分可以是单羧酸或多羧酸,比如二羧酸,如己二酸。醇和羧酸均可以是饱和或不饱和的,直链或支链的,而且可以是用其它基团如羟基基团和烷氧基基团(例如甲氧基或乙氧基基团)取代或非取代的。本文公开的任何特定脂肪醇可以与羧酸结合,比如乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸或新戊酸,以提供脂肪酯。同样地,本文公开的任何特定的脂肪酸可以与醇结合,比如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇、异戊醇或新戊醇,以提供脂肪酯。制备这种酯的方法在本领域中众所周知。在特定实施方案中,脂肪酯是直链脂肪伯醇和直链脂肪酸的酯,具有式RCOOR’,其中R和R’是脂族基团,比如烷基或链烯基基团,而且R和R’各自独立地具有1-50个碳原子,例如,1-30个碳原子,比如1-20个碳原子。脂肪酯的特定实例包括抗棕榈酸坏血酸酯、乳酸鲸蜡酯、三酸甘油辛酯/癸酯、二辛酸丙二醇酯/二癸酸丙二醇酯、乳酸肉豆蔻酯、肉豆蔻酸肉豆蔻酯、四油酸季戊四酯、四硬脂酸季戊四酯、豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、十六烷基酯、硬脂酸十八酯、硬脂酸丁酯、肉豆蔻醇聚醚(myreth)-3肉豆蔻酸酯、四山萮酸季戊四醇酯、己二酸二异丙酯、二聚季戊四醇六辛酸酯/六癸酸酯、新戊二醇二辛酸酯/二癸酸酯、dridecyl硬脂酸酯、偏苯三酸十三烷基酯、PEG-4二庚酸酯、季戊四醇四辛酸酯/四癸酸酯、硬脂酸异十六酯、棕榈酸乙基己酯、苯甲酸C12-15烷基酯、蓖麻醇酸鲸蜡酯、硬脂酸乙二醇酯、二硬脂酸乙二醇酯、硬脂酸丙二醇酯、硬脂酸甘油酯、椰油酸甘油酯、山萮酸甲酯(trigehenin)、甘油三月桂酸酯(trilaurin)、乙酸硬脂醇酯、二乳酸棕榈酯、异丁酸椰油酯、马来酸油酯、二马来酸油酯、丙酸牛油酯、2-乙基己基棕榈酸酯、2-乙基己基硬脂酸酯、辛酸十六酯、月桂酸己酯、牛油酸异丁酯、棕榈酸异硬脂基酯、油酸正丁酯、硬脂酸正丁酯、油酸正丙酯、硬脂酸十三酯、肉豆蔻酸异丁酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸异丙酯、异硬脂酸异丙酯、硬脂酸异丁酯、乙酸芳樟酯。其它脂肪酸酯包括木糖醇棕榈酸单酯、季四戊醇硬脂酸单酯、蔗糖硬脂酸单酯、甘油硬脂酸单酯、聚乙二醇硬脂酸单酯、脱水山梨糖醇酯。合适的脱水山梨糖醇酯包括脱水山梨糖醇硬脂酸单酯、脱水山梨糖醇棕榈酸酯、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单肉豆蔻酸酯、脱水山梨糖醇单山萮酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇二月桂酸酯、脱水山梨糖醇二硬脂酸酯、脱水山梨糖醇二山萮酸酯、脱水山梨糖醇二油酸酯,还有混合的牛油烷基脱水山梨糖醇单酯和二酯。也期望两种或更多种脂肪酯的组合,和一种或多种脂肪酯与一种或多种脂质化合物的组合。脂肪酯可以合成,从天然来源分离或在市场购得。润肤酯类比如酯可以从Lipo Chemicals、Patterson、NJ获得。
短语“与基本相似的样品相比,对比度和细胞与亚细胞分辨率增加”指这种情况:两种基本相似的生物样品以基本相同的方式处理,通过显微镜观察。然而,一个样品根据本公开与脂质化合物接触,而另一个没有接触脂质化合物,且用脂质化合物接触的样品表现出细胞和亚细胞特征的分辨率更清晰。在一些实施方案中,不仅样品中的细胞和亚细胞特征的视觉分辨率增加,而且观察者能够更容易地观察用脂质化合物处理的样品,其表现出更大的对比度。在其它实施方案中,分辨率的增加和特异性地增加对比度指样品总体增加,而不是离散的、局部的信号增加(比如离散的荧光信号)。在特定实施方案中,在用亮视野显微镜观察时,用组织染色剂染色和用脂质化合物处理的样品的细胞和亚细胞分辨率和对比度增加。在一个方面,增加的分辨率可以帮助病理学者做出诊断。在另一方面,增加的分辨率包括,与未用脂质化合物处理的H&E染色样品比较时,用脂质化合物处理的H&E染色样品的对比度和细胞清晰度有整体的增加。
术语“组织化学”指用于提供信号或图案的任何技术,所述信号或图案能用来检测特定分子或结构和/或它们在生物样品,比如组织部分或细胞样品中的位置。组织化学技术包括免疫组织化学技术、细胞化学技术、组织学技术、酶组织化学技术、特定的染色技术和原位杂交技术。由组织化学技术提供的图案和信号不受限制地包括在白光透过样品时吸收一些白光时产生的互补颜色的图案、在激发样品中的荧光团后检测到的荧光信号、由酶反应沉淀得到的彩色物质的图案和由放射性标记探针,比如抗体和核酸探针产生的闪烁信号。
如本文所使用的,术语“组织染色剂”(“组织染色”)指优先与某类细胞/和或细胞组分结合的染料或物质(或染料或物质的应用)。组织染色剂与细胞或细胞组分的优先结合不涉及特定分子识别,比如在抗体-抗原结合相互作用中(例如,在免疫组织化学染色中)或互补核酸杂交中(例如,在原位杂交中)发生的。组织染色剂能通过在宽带光经过样品时(或从样品反射)吸收特定波长的宽带光(比如可见白光的光谱),使样品产生颜色,从而保留互补的颜色用于检测(例如,在亮视野光学显微镜中可见地检测)。组织染色剂包括染料,比如吖啶染料、蒽醌染料、芳基甲烷染料、偶氮染料、重氮染料、硝基染料、酞菁染料、奎宁亚胺染料、四唑染料、噻唑染料和呫吨染料。组织染色剂包括苏木精和曙红,两者均为常用的组织染色剂,还包括用于特定的诊断设置中的“特异性染色剂”。对组织染色有用的染色剂的实例包括乙酰黄、酸性黑1、酸性蓝22、酸性蓝93、酸性品红(fuchsin)、酸性绿、酸性绿1、酸性绿5、酸性洋红(magenta)、酸性橙10、酸性红4、酸性红26、酸性红29、酸性红44、酸性红51、酸性红66、酸性红73、酸性红87、酸性红91、酸性红92、酸性红94、酸性红101、酸性红103、酸性玫瑰红、酸性复红(rubin)、酸性紫19、酸性黄1、酸性黄9、酸性黄23、酸性黄24、酸性黄36、酸性黄73、酸性黄S、酸性黄T、吖啶橙、吖啶黄、阿尔新蓝、阿尔新黄、醇溶性曙红、茜素、茜素蓝、茜素蓝2RC、茜素胭脂红、茜素花青(cyanin)BBS、茜酚花青R、茜素红S、茜素紫、试铝灵、酰胺黑10B、酰胺萘酚红、氨基黑(amidoschwarz)、苯胺蓝WS、苯胺紫、蒽蓝SWR、蒽蓝SWX、金胺O、偶氮曙红、偶氮胭脂红B、偶氮胭脂红G、偶氮曙红G、偶氮重氮(azoic diazo)5、偶氮重氮48、偶氮红、偶氮蓝、天青A、天青B、天青C、碱性蓝8、碱性蓝9、碱性蓝12、碱性蓝15、碱性蓝17、碱性蓝20、碱性蓝26、碱性棕1、碱性品红、碱性绿4、碱性绿5、碱性橙14、碱性红2、碱性红5、碱性红9、碱性紫2、碱性紫4、碱性紫10、碱性紫14、碱性黄1、碱性黄2、比不列西猩红、比不列西猩红R、俾斯麦棕Y、氧化巴西木素、巴西木素、亮番藏花精、亮结晶猩红6R、钙红、洋红、品红酸淡红(carmoisine)6R、天青石蓝B、中国蓝、氯冉亭坚牢红5B、胭脂虫洋红、天青石蓝、芝加哥蓝4B、铬紫CG、铬变素2R、依来铬氰蓝R、刚果紫、刚果红、棉花蓝、棉花红、藏红猩红、藏红猩红3B、藏红猩红MOO、藏花素、结晶丽春红6R、结晶猩红、结晶紫、大丽花、孔雀绿B、直接蓝14、直接蓝58、直接红、直接红10、直接红28、直接红80、直接红81、直接黄7、耐尔晒(Durazol)蓝4R、耐尔晒蓝8G、曙红B、蓝光曙红、曙红、曙红Y、黄光曙红、醇溶曙红、紫酱色B、羊毛铬青R、赤藓红B、乙基曙红、乙基绿、乙基紫、伊文思蓝、牢固蓝B、牢固绿FCF、牢固红B、牢固黄、特殊牢固黄、牢固黄G、油溶黑(fat black)HB、荧光素、食用色素绿3、帆船色(galleon)、三碘季铵酚(gallamine)蓝、花青、龙胆紫、苏木红、苏木精、苏木素、日光牢固红(helio fast rubin)BBL、甲蓝、霍夫曼紫、联氨黄、印度红、酞菁蓝1、酞菁黄1、INT、胭脂、胭脂酸、核固红(kernechtrot)、紫胶(Lac)、虫漆酸、劳氏紫、亮绿、丽丝安牢固黄、丽丝安绿SF、Luxol牢固蓝、洋红0、洋红I、洋红II、洋红III、孔雀石绿、曼彻斯特棕、马修黄、紫红、苯胺紫、汞溴红、汞红药水、间胺黄、亚甲基天蓝A、亚甲基天蓝B、亚甲基天蓝C、亚甲基蓝、亚甲基绿、甲基蓝、甲基绿、甲基紫、甲基紫2、甲基紫10B、研磨黄(milling yellow)3G、媒介(mordant)蓝3、媒介蓝10、媒介蓝14、媒介蓝23、媒介蓝32、媒介蓝45、媒介红3、媒介红11、媒介紫25、媒介紫39、萘蓝黑、萘酚蓝黑、萘酚绿B、萘酚黄S、自然黑1、自然红、自然红3、自然红4、自然红8、自然红16、自然红24、自然红25、自然红28、自然黄6、NBT、中性红、新品红、尼亚加拉蓝3B、夜蓝、耐尔蓝、耐尔蓝A、硫酸耐尔蓝、耐尔红、硝基BT、四唑硝基蓝、核牢固红、油红O、橙G、地衣红、副品红、帕金斯紫、焰红B、苦味酸、丽春红2R、丽春红6R、丽春红B、二甲苯胺丽春红、丽春红S、滂胺蓝5B、樱草、报春花灵、红紫素、焦宁(pyronin)B、焦宁G、焦宁Y、罗丹明B、玫瑰苯胺、孟加拉玫红、藏红花(saffron)、番红O、猩红R、苝猩红(scarlet red)、猩红R、虫漆、天狼猩红F3B、天狼猩红4B、天狼蓝F3R、单铬青R、可溶蓝、溶剂黑3、猩红蓝38、猩红红23、猩红红24、猩红红27、猩红红45、猩红黄94、醇溶性曙红(spiritsoluble eosin)、苏丹III、苏丹IV、苏丹黑B、苏丹红BK、硫黄S、瑞士蓝、酒石黄、硫代黄素S、硫代黄素T、硫堇(thionin)、甲苯胺蓝、toluyline红、金莲橙G、吖啶黄素、台盼蓝、荧光素钠、维多利亚蓝4R、维多利亚蓝B、维多利亚蓝R、维多利亚绿B、水蓝I、水溶曙红、木曙红、二甲苯胺丽春红和黄曙红,及其组合物。明矾染色的苏木精组织染色剂的特定实例包括安德森(Anderson)氏、阿帕塞(Apathy)氏、贝克(Baker)氏、贝内特(Bennett)氏、伯默(Bohmer)氏、伯斯马(Bosma)氏、巴拉德(Bullard)氏、卡若兹(Carazzi)氏、柯尔(Cole)氏、德比登(Debiden)氏、德格鲁特(de Groot)氏、德拉菲尔德(Delafield)氏、杜瓦(Duval)氏、欧利希(Ehrlich)氏、弗里德兰德(Friedlander)氏、盖德斯东(Gadsdon)氏、盖基(Gage)氏、盖里格尔(Galigher)氏、伽威(Garvey)氏、基尔(Gill)氏、格兰汉姆(Graham)氏、汉密尔顿(Hamilton)氏、哈里斯(Harris)氏、哈里斯(Harris)&鲍尔(Power)氏、霍格(Haug)氏、贺尼欧德(Horneyold)氏、克雷恩伯格(Kleinenberg)氏、克鲁特塞(Krutsay)氏、兰格伦(Langeron)氏、劳诺(Launoy)氏、李(Lee)氏、利里(Lillie)氏、卢戈(Lugol)氏、麦克拉彻兰(McLachlan)氏、马洛里(Mallory)氏、曼(Mann)氏、马尔提诺蒂(Martinotti)氏、马森(Masson)氏、迈尔(Mayer)氏、密契尔(Mitchell)氏、莫纳(Molnar)氏、帕帕米尔蒂斯(Papamiltiades)氏、普西(Pusey)氏、若威茨(Rawitz)氏、雷蒂(Reddy)氏、塞斯(Sass)氏、施莫尔(Schmorl)氏、斯利德(Slidders)氏、乌纳(Unna)氏、沃森(Watson)氏,以及魏格特(Weigert)&怀特(Wright)氏染色剂。铁染色的苏木精染色剂的特定实例包括安德森(Anderson)氏、克雷汀(Cretin)氏、福尔(Faure)氏、勾德曼(Goldman)氏、汉森(Hansen)氏、海登海因(Heidenhain)氏、简森(Janssen)氏、克发拉斯(Kefalas)氏、克腊晏(Krajian)氏、克鲁特塞(Krutsay)氏、拉曼娜(La Manna)氏、利里(Lillie)氏、利里(Lillie)&(遏勒Earle)氏、马森(Masson)氏、莫尔(More)&巴塞尔(Bassal)氏、穆雷(Murray)氏、帕坤(Paquin)&戈达德(Goddard)氏、雷果(Regaud)氏、若扎斯(Rozas)氏、赛德林(Seidelin)氏、托马斯(Thomas)氏、魏格特(Weigert)和雅思沃因(Yasvoyn)氏苏木精。铋染色的苏木精是罗奇(Roach)&史密斯(Smith)氏苏木精。铜染色的苏木精包括本斯利(Bensley)氏、库克(Cook)氏和福尔(Faure)氏苏木精。钼染色的苏木精是海尔德(Held)氏苏木精。钒染色的苏木精包括赫登海因(Hedenhain)氏和史密斯(Smith)氏苏木精。锆染色的苏木精是麦克努蒂(McNulty)&史密斯(Smith)氏苏木精。使用一种或多种特定染料的组织染色技术无限制地包括:斯科特(Scott)氏CEC;海乐(Hale)氏胶体铁;莫利(Mowry)氏胶体铁;瑞特(Ritter)&欧勒松(Oleson)氏胶体铁;史密斯(Smith)&麦克努蒂(McNulty)氏氧锆苏木精;麦克法兰德(MacFarland)和达温颇特(Davenport)氏的银蛋白盐;阿基塔(Akita&肯科(Kaneko氏钩状木霉(hamalum);楞德努姆(Lendrum)、斯利德(Slidders)&福拉瑟(Fraser)的阿尔新兰;盖贝(Gabe)的乙醛品红;果莫里(Gomori)乙醛品红;勒沃林(Lewelyn)的乙醛蓝;麦克吉努塞尔(McGhee Russel)的用于钙的茜素蓝S;肖科尔(Shokeir)&艾尔拜戈里(Elbagoury)的Alloxan Schiff;本霍德(Benhold)氏刚果红;伯恩斯(Burns)、宾诺克(Pennock)&斯托华德(Stoward)氏硫代黄素T;伊斯特伍德(Eastwood)和柯尔斯(Coles)的刚果红;海曼(Highman)的刚果红;勒威林(Llewellyn)的天狼红;普彻勒(Puchtler)、斯威特(Sweat)和勒温(Levine)的刚果红;斯托克斯(Stokes)的刚果红;斯威特(Sweat)和(普彻勒Puchtler)的天狼红;瓦萨(Vassar)和卡令(Culling)的硫代黄素T;罗奇(Roach)&史密斯(Smith)的铋苏木精;阿库什(Arkush)&普罗斯彻(Proescher)的铁铝-媒介蓝;诺丁汉姆(Nottingham)技术;哈努堪(Hurukian)-斯根克(Schenk)的革兰氏染色剂;贝克(Baker)的铝苏木精;史密斯(Smith)的钒苏木精;鲍尔(Baure)反应;贝内特(Bennett)的铝苏木精;本侯德(Bennhold)的刚果红;本斯利(Bensley)氏PTAB;布恩(Boone)&椎佛(Drijver)氏三铬;本斯利(Bensley)氏PTAB;布利莫耶(Brillmeyer)氏三铬;伯恩斯(Burns)、宾诺克(Pennock)&斯托华德(Stoward)氏硫代黄素T;CAB;冯科萨(VonKossa);卡若兹(Carrazzi)氏;利里隆(Lillie’lon)PAS;利里(Lilli)e氏短PAS;标准PAS;过碘酸硫胺脲;卡松(Cason)氏三铬;奇弗勒(Chiffelle)&普特(Putt);艾纳逊(Einarson);赫诺威奇(Herovici);苦(Picro)-品红;普彻勒(Puchtler)氏;范季松(van Gieson)氏;霍哈希(Hohashi)氏三色;莫利尔(Mollier)氏三色;帕坤(Paquin)&戈达德(Goddard)氏三色;帕希尼(Pasini)氏三色;华尔特(Walter)氏三色;伽威(Garvey);伽威(Garvey)-莫法特(Movat)五色;罗奎斯(Roques)氏三色;希尔弗曼(Silverman)-莫法特(Movat)五色;霍兰德(Hollande)氏三色;本斯利(Bensley)氏三色;卡松(Cason)氏三色;戈莫里(Gomori)氏三色;赫登海因(Hedenhain)氏偶氮(Azan)三色;克里彻斯基(Kricheski)氏三色;雷德维格(Ladewig)氏三色;李(Lee)-布朗(Brown)氏三色;利里(Lillie)氏三色;马洛里(Mallory)氏三色;马森(Masson)氏三色和变型;米利根(Milligan)氏三色;莫冷德(Mollendor)氏三色;帕忑(Patay)氏三色;苏布雷季(Shoobridge)氏三色;克罗斯曼(Crossman)氏三色;豪威尔(Howell)氏二硫代草酰胺;库令(Culling)&瓦萨(Vassar氏硫代黄素T;库宁汉姆(Cunningham &恩格尔(Engel氏;帕帕尼克拉乌(Papanicolou)氏醇三色;帕帕尼克拉乌(Papanicoloaou)氏三色;道斯(Daws)氏三色;福伊耳根(Feulgen)氏;杜普雷斯(Dupres)洋红;恩纳松(Enarson)氏花青铬;哈特(Hart)铁间苯二酚洋红;哈姆贝斯通(Humberstone)氏铁间苯二酚;滕泽(Taenzer)-乌纳(Unna)地衣红;乌纳(Unna)氏地衣红-苯胺蓝;韦赫特(Weighert)氏铁间苯二酚洋红;科哈希(Kohashi)氏三色;帕坤(Paquin)&戈达德(Goddard)氏三色;华尔特斯(Walters)氏三色;道(Dawe)氏三色;米特(Meter)氏曙红;奇弗勒(Chiffelle)&(普特Putt);珀尔斯(Perls)普鲁士蓝;德曼斯戈米耳泽特纳(Dirmann Schmelzer Turnull)氏蓝;MSB;马森(Masson)44/41;俄巴底亚(Obadiah);匹克诺(Picro)-马洛里(Mallory);格里德利(Gridley);勒沃林(Lewellyn)氏双氧化氨基硫脲;施莫尔(Schmorl);范德比尔特(Vanderbilt);海瑟隆(Haythorne)氏三色;海登海因(Heidenhain)氏偶氮(Azan三色;梁(Leung)&吉布(Gibbon)氏阿尔新黄甲苯胺蓝;瑟伊德(Sayeed)氏PAS-甲苯胺蓝;甲苯胺蓝;可内弗(Koneff)氏三色;科斯陶维基(Kostowiecki)氏三色;李(Lee)-布朗(Brown)氏三色;楞德努姆(Lendrum)氏焰红酒石黄;罗奎斯(Roques)氏三色;迈尔(Mayer)氏粘液素卡红;迈尔(Mayer)氏mucihematein;勒威林(Llewellyn)氏媒介蓝3;诺丁汉姆(Nottingham)技术;核牢固红复染剂;斯利德(Slidders)OFG;丙二醇中的奇弗勒(Chiffelle)&普特(Putt)油红O;帕姆格伦(Palmgren)氏银浸渍;帕忑(Patay)氏三色;路易斯(Lewis)&米勒(Miller)氏三色;范季松(van Gieson)和使用上述特定苏木精的技术。对于本领域的那些技术人员,将特定细胞和细胞组分染色所用的染色方案、染料和染色剂众所周知,在Stainsfile(由Bryan Llewellyn为组织化学学家维护的网络资源);Kiernan、“Histological and Histochemical methods:Theory and Practice,”3rd Ed.Butterworth Heinemann、Oxford、UK;and inHorobin and Kiernan、“Conn’s biological stains:a handbook of dyes、stainsand fluorochromes for us in biology and medicine,”10th ed.、Oxford:BIOS、ISBN 1859960995、2002中可以发现其它实例,所述文献通过引用并入本文。染色可以递增或递减地进行。用媒染剂处理的染料可以应用onchrome、偏媒染色或后媒染色法。
如本文所使用的术语“脂质化合物”广义地指在有机溶剂(比如二乙醚、丙酮、氯仿、柠檬烯、甲醇或乙醇)中具有较大溶解度(比如溶解度在20℃时高于约0.1g/L,20℃时高于约0.5g/L,或20℃时高于约1.0g/L)的化合物。更特定地,脂质化合物可以在有机溶剂,比如在柠檬烯中比在水中更易溶解。在一些实施方案中,脂质化合物的溶解度在20℃时低于约5.0g/L(比如20℃时低于约1.0g/L,20℃时低于约0.5g/L,或者20℃时甚至低于约0.1g/L)。在特定实施方案中,脂质化合物在水中完全不溶。脂质化合物可以是清洁剂脂质化合物或非清洁剂脂质化合物。脂质化合物包括脂肪醇、脂肪胺(及其盐)、脂肪酸(及其盐)、脂肪酸酯、类异戊二烯(包括萜和萜烯醇,比如三萜和萜烯醇,以及分子量更高的萜和萜烯醇)、膜脂、糖脂(比如甘油磷脂,比如卵磷脂)、磷脂(比如鞘脂,如鞘磷脂)、固醇(比如胆固醇)、石蜡(比如C8-C20的烷烃和烯烃)和清洁剂(阴离子、阳离子、两性离子或非离子)。其它脂质化合物包括酰基甘油(比如单酰基甘油、二酰基甘油、三酰基甘油、脂肪和油、多酯及其混合物)、酰基甘油或磷脂的缩醛磷脂类似物、含氨基化合物的脂质(比如与氨基酸、肉毒碱、多巴胺或氨基醇比如氨基乙醇结合的脂肪酸)、氨基醇、类胡萝卜素、神经酰胺、氰类脂、苯酚脂、前列腺素及相关化合物、奎宁、类固醇(例如,固醇,比如胆固醇、油菜固醇、蟾蜍二烯羟酸内酯、强心苷、葫芦素、蜕皮激素、皂角苷配基、甾族生物碱、withasteroid和胆汁酸)、藿烯、霉菌酸、类二十烷酸、cholanoid、含醚脂质、维生素醇(比如维生素A、D和E)、维生素K、卵磷脂、烃(比如C6至C30的烷烃和烯烃)和蜡。可以在例如Cyberlipid网站和Lipid Bank网页上找到特定脂质化合物的实例。脂质化合物可以合成、从天然来源分离,或从例如Sigma-Aldrich Co.、St.LouisMO购得。术语“脂质化合物”也指两种或更多种脂质化合物的组合。
术语“低级烷醇”指具有R-OH结构的化合物,其中R是具有1至5个碳的烷基基团。低级烷醇可以是伯、仲或叔醇。低级烷醇的实例包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、仲丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇和新戊醇。
术语“聚醚”指包含多个醚键接的化合物,更特定地指聚环氧烷(比如聚乙二醇化合物、聚丙二醇化合物,或聚丁二醇化合物,或其共聚物),其可以是非官能性的(比如聚醚二元醇)、单官能的(例如,具有烷基基团,比如甲基、乙基、丙基、丁基等,以形成聚醚)或多官能的(例如,具有烷基基团和脂肪酸,比如油酸,以形成聚醚酯)。因此,在一些实施方案中,聚醚具有式R1-(x)y-R2,其中R1和R2独立地是氢、烷基基团或脂肪酸,X指重复的聚亚烷基单体单元(比如乙二醇单元、丙二醇单元、聚丁二醇单元或其组合),而y=2-50(例如,y=2-30,比如y=3-20)。
术语“聚硅氧烷”指包含可替代的硅和氧原子的任何不同化合物,其中所述硅和氧原子以直链、支链或环状排列,每个硅原子附着一个或多个有机基团。聚硅氧烷化合物的实例包括非官能性和有机金属官能的聚硅氧烷,其中包括二甲基聚硅氧烷、甲基氢聚硅氧烷、甲基烷基聚硅氧烷、甲基芳基聚硅氧烷、甲基氟烷基聚硅氧烷和有机金属官能的甲基聚硅氧烷,比如氨基烷基甲基聚硅氧烷、氰烷基甲基聚硅氧烷、卤烷基甲基聚硅氧烷和乙烯基甲基聚硅氧烷。环状聚硅氧烷的实例包括六甲基环三硅氧烷(D3)、八甲基环四硅氧烷(D4)、十甲基环五硅氧烷(D5)和十二甲基环六硅氧烷(D6)。聚硅氧烷的其它特定实例包括六甲基二硅氧烷(L2)、八甲基三硅氧烷(L3)、十甲基四硅氧烷(L4)和十二甲基五硅氧烷(L5),1,3,5-三甲基-1,3,5-三(3,3,3-三氟丙基)环三硅氧烷和1,3,5,7-四甲基-1,3,5,7-四(3,3,3-三氟丙基)环四硅氧烷。其它实例包括硅油(比如二甲基聚硅氧烷、甲基氢聚硅氧烷和甲基苯基硅油)、氟改性硅油、氨基改性硅油、环氧改性硅油、醇改性硅油和有机物质改性硅油,比如烷基改性硅油。聚硅氧烷可以是单一的聚硅氧烷或两种或更多种聚硅氧烷的混合物,而且每种聚硅氧烷可以具有任何排列的硅氧烷单元,比如直链、环状、支链或其组合。聚硅氧烷可从例如Sigma-Aldrich、St.Louis、MO购得。也期望两种或更多种聚硅氧烷的组合,和一种或多种聚硅氧烷与一种或多种其它脂质化合物的组合。
术语“蜡”指各种物质组成的不溶于水的材料,其包括,例如,烃(正构或支链烷烃和烯烃)、酮、二酮、伯和仲醇、醛、固醇酯、烷酸、萜(比如鲨烯)和单酯(moonester)(蜡酯)和源自其中的单独组分。更特定地,蜡是醇而不是甘油酯(比如脂肪醇、固醇、氢氧类胡萝卜素或维生素A)和脂肪酸的酯。蜡的实例包括角质、软木脂、表皮蜡、结核菌醇蜡(比如二分枝菌酸酯)、蜂蜡、中国蜡、虫胶蜡、鲸油、羊毛脂、巴西棕榈蜡、小冠椰子蜡、荷荷巴油、小烛树蜡、茅草蜡、日本蜡、米糠油、地蜡、褐煤蜡和合成蜡(和蜡组分,比如脂肪酯及其混合物)。也期望两种或更多种蜡的组合,和一种或多种蜡与一种或多种其它脂质化合物的组合。
当物质在室温是溶于液体的固体时,给出的所有百分比指重量/体积百分比;而当物质在室温是溶于另一种液体的液体时,给出的所有百分比指体积/体积百分比。组分在应用于样品之前可以混合,或者可以分别应用于样品,然后混合,混合被动或者主动进行。
IV.实施例
已经描述了本公开的一些较为普通的特征,在下述非限定性实例中将阐述更多的特征和方面。
实施例1-在盖片步骤中引入脂质化合物
在这个实施例中,表明了在自动H&E过程中脂质化合物的用途。使用自动H&E自动染色过程将置于显微镜载玻片上的含石蜡肝脏组织染色,所述过程引入了溶于盖玻片溶剂中的脂质化合物。向用来将组织样品盖片的盖玻片溶剂中加入几种代表不同化学类型的脂质化合物。一旦将盖玻片加到载玻片上并将盖玻片放好,病理学家就可以观察载玻片,并评价样品中观察到的分辨率水平。病理学家还观察载玻片,并评价由于在较高温度干燥样品而产生的假象是否存在。这个实施例证明,在促进溶剂蒸发的条件下置于较高温度中的组织样品的形态可以得到恢复且可见度增强,而且可以通过在盖片步骤中使样品与脂质化合物接触,防止或去除由较高温度和蒸发条件引起的假象。
尽管本公开的方法和组合物可以应用于任何组织染色过程(手动或自动)或任何载玻片染色设备,但是在这个实施例中,将方法和组合物引入自动H&E染色过程中,所述过程开发用于美国专利申请公开号20040002163和20050186114中描述的大体积的载玻片处理系统(两项申请均通过引用并入本文)。简而言之,前述申请中所述的自动载玻片处理系统是大体积载玻片处理系统,可以在对载玻片进行各种载玻片处理操作的工作站之间往返运送基本上处于水平位置(为了将交叉污染降至最小)且负载多个载玻片的托盘。在处理中可以对每个载玻片使用新鲜试剂,能够充分消除试剂在载玻片之间引起的交叉污染,因为载玻片在托盘上以相互隔离的方式单独处理。在一种布局中,系统包括辐射加热器、组合的脱蜡器/染色器/溶剂交换器工作站、对流烘箱和盖玻片装置。可以在系统的辐射加热器下将载有含石蜡组织样品的载玻片的托盘加热,使样品中的石蜡扩散从而更容易去除,还可以将样品附着于载玻片上。然后将托盘转移到多功能脱蜡器/染色器/溶剂交换器工作站,在工作站中将载玻片脱蜡、染色和交换溶剂。然后将装有准备好进行盖片的染色载玻片的托盘穿梭(shuttle)至系统的盖玻片装置,在此向载玻片加上盖玻片。一旦将载玻片盖片,即将托盘转移至对流烘箱,去除染色载玻片上的盖玻片。
尽管能配置刚刚所述的染色系统,使其进行任何组织染色过程,但是在这个实施例中,配置系统使其进行递减的H&E染色。图1给出了表示全过程的示意图,其中过程包括:烘烤步骤,以将样品附着于载玻片上;脱蜡步骤,以从含石蜡样品中去除石蜡;苏木精染色步骤;染蓝步骤,其提高pH并将苏木精变蓝,以使得下游加入曙红能得到更好的对比度;曙红染色步骤;分化步骤,用来去除过量的曙红,并使曙红更红;脱水步骤,使用100%乙醇从样品中去除水;将载玻片置于较高温度并通过空气流动去除乙醇的步骤;盖片步骤,其中使柠檬烯(在某些情况下向柠檬烯中加入脂质化合物)分布于样品中;和固化步骤。
在这个实施例所用的H&E过程中,对流烘箱还用来在紧邻盖片之前消除或降低溶剂交换过程的程度。将托盘传送至对流烘箱几分钟,从样品中蒸发过量的醇,然后将托盘传送至盖玻片装置,在盖玻片装置中向载玻片加入盖玻片溶剂(有或者没有脂质化合物溶于其中),将载玻片盖片。
如图1所示,将每种脂质化合物以20%的浓度溶于柠檬烯中,使用柠檬烯混合物(约30μL/片载玻片)用于盖片。在自动过程中,以20%的浓度使用代表各种化学物质类别的几种脂质化合物中的每种化合物。使用每种不同的脂质化合物获得H&E染色载玻片的亮视野显微照片,示于图2B-I中,同时有对照载玻片(图2A),其在没有溶于柠檬烯中的脂质化合物时制备。特定地,图2A表示对照载玻片,图2B表示使用柠檬烯中20%的十甲基环五硅氧烷(聚硅氧烷)制备的组织样品,图2C表示使用柠檬烯中20%的二辛醚(脂肪醚)制备的组织样品。图2D表示使用柠檬烯中20%的雪松油[萜的混合物,特定地,雪松醇(萜烯醇)和雪松烯(萜烯)及其衍生物,比如其酯的混合物]制备的组织样品,图2E表示使用柠檬烯中20%的辛酸(脂肪酸)制备的组织样品,图2F表示使用柠檬烯中20%的乙酸芳樟酯(脂肪酯)制备的组织样品,图2G表示使用柠檬烯中20%的Triton X-100(清洁剂)制备的组织样品。图2H表示使用柠檬烯中20%的角鲨烯(类异戊二烯)制备的组织样品,而图2I表示使用柠檬烯中20%的1-十一醇(脂肪醇)制备的组织样品。
图2中每张图的比较表明,与图2A中所示的对照载玻片相比,每种脂质化合物都增加了对比度、色彩平衡和细胞与亚细胞结构的分辨率,并降低了由于在促进乙醇从样品蒸发的条件下于较高温度处理而诱导的核干燥假象的数目(在图2A中用箭头指出了两处此类假象)。3位病理学家的评审组一致认为,与未用脂质化合物处理的样品相比,在用脂质化合物处理的所有样品中,分辨率均得到提高。
病理学家还确定了用指定脂质化合物处理的几个载玻片中每个载玻片上核干燥假象的数量,并计算了平均值。下面的表1中给出了核干燥假象数量的结果。对于比较而言,在使用自动过程制备的肝脏组织样品中观察到的假象数量太多,难以计数,所述过程涉及在较高温度蒸发乙醇,并且没有使样品与脂质化合物接触。通常,对于在组织部分有500个或更多的这种核干燥假象的样品,其假象数目都太大而不能计数。
表1
盖玻片溶剂中的化合物 | 每片上核干燥假象的数量 |
无/阳性对照 | 太多而难以计数(TNC) |
十甲基环五硅氧烷 | 5 |
二辛醚 | 1 |
雪松油 | 2 |
辛酸 | 2* |
乙酸芳樟酯 | 0 |
Triton X-100 | 5 |
角鲨烯 | 2 |
1-十一醇 | 1 |
*其在盖玻片下主要为空气气泡,因此将其表现出的核干燥假象TNC排除在外,表明盖玻片溶剂在组织样品中的分布不均匀。
实施例2-在H&E染色程序中向醇和/或柠檬烯中添加脂质化合物
在这个实施例中,将油醇(不饱和脂肪醇)以不同浓度溶于100%乙醇和柠檬烯中的一种或两种中。并在干燥之前或在自动H&E染色过程的盖片步骤中,分别将这些试剂应用于组织样品。如实施例1,使用肝脏组织部分,并使用如上所述的自动载玻片处理系统将其染色。
图3表示针对这个实施例的自动过程的示意图,标明了过程中将油醇分布于载玻片上的点,是在将载玻片移至对流烘箱以将醇在较高温度蒸发之前于醇中和/或是在用于盖片的柠檬烯中。如实施例1,将样品置于较高温度(在这个例子中,不同时间有不同的温度),用于在盖片前从组织样品中去除过量的醇(醇-特别是乙醇-沸点远低于油醇,可以选择性地从载玻片去除,而将加入醇中的任何油醇保留)。
由病理学家计算核干燥假象的平均数。结果示于表2中。在表2中,100%乙醇中油醇的浓度表示为“预浓度”,而盖玻片溶剂(柠檬烯)中油醇的浓度表示为“盖玻片浓度”。也给出了盖玻片溶剂的量(含或不含油醇),以及用于干燥样品的烘箱温度和盖片前干燥载玻片的时间。
表2
运行 | 烘箱温度(℃) | 预浓度1 | 盖玻片浓度2 | 烘箱时间(s) | 盖玻片体积3 | 平均假象/片 |
1 | 70 | 2 | 0 | 60 | 100 | 6 |
2 | 70 | 2 | 10 | 60 | 100 | 17 |
3 | 70 | 2 | 10 | 60 | 100 | 23 |
4 | 70 | 5 | 0 | 60 | 50 | 5 |
5 | 70 | 8 | 0 | 60 | 50 | 1 |
6 | 70 | 8 | 5 | 60 | 50 | 1 |
7 | 85 | 8 | 5 | 60 | 50 | 6 |
8 | 85 | 2 | 0 | 60 | 50 | 39 |
9 | 85 | 2 | 5 | 30 | 50 | 135 |
10 | 85 | 5 | 0 | 30 | 100 | 90 |
11 | 85 | 5 | 10 | 60 | 50 | 57 |
12 | 85 | 8 | 5 | 30 | 50 | 80 |
13 | 85 | 8 | 10 | 60 | 100 | 4 |
14 | 100 | 2 | 0 | 30 | 50 | 26 |
15 | 100 | 2 | 5 | 60 | 50 | 4 |
16 | 100 | 2 | 10 | 30 | 50 | 45 |
17 | 100 | 5 | 0 | 60 | 50 | 18 |
18 | 100 | 5 | 5 | 30 | 100 | 1 |
19 | 100 | 5 | 5 | 60 | 100 | 2 |
20 | 100 | 8 | 0 | 30 | 100 | 1 |
21 | 100 | 8 | 0 | 30 | 100 | 0 |
22 | 100 | 8 | 5 | 60 | 100 | 2 |
23 | 100 | 8 | 10 | 30 | 100 | 2 |
24 | 100 | 8 | 10 | 30 | 50 | 48 |
阳性对照 | 70 | 0 | 0 | 300 | 50 | TNC* |
1(%v/v;油醇/在60℃于对流烘箱中用2分钟去除溶剂前所用的乙醇)
2(%v/v;油醇/在盖玻片过程中所用的柠檬烯)
3(微升柠檬烯或油醇/盖片过程中分布于每片上的柠檬烯)
*太多难以计数
如表2中所示,相对于未用油醇接触的阳性对照,在干燥前使用100%醇中的油醇,或在盖片过程中使用柠檬烯中的油醇,在所有例子中都对减少干燥假象很有效。这个实施例证明,通过向过程中加入脂质化合物,可以充分减少或消除核干燥假象。也证明了在促进溶剂蒸发的条件下将样品置于较高温度时,脂质化合物能保护组织样品免受损伤,或者脂质化合物能帮助由于在较高温度从样品蒸发溶剂而发生改变的样品。
实施例3-用油醇盖片
在这个实施例中,展示了使用各种以不同浓度和量的溶于柠檬烯中的油醇用于自动H&E染色过程中的盖片步骤。使用实施例1中所述的自动载玻片处理系统将肝脏和前列腺组织部分H&E染色。图4中以示意图形式说明了针对这个实施例的特定过程。
在盖片步骤中,以表3所示的浓度和量使用柠檬烯中的油醇。由病理学家检验已染色的肝脏组织样品,确定核干燥假象的数目,评价前列腺组织样品中由该过程提供的分辨率的量(以0-3的尺度,其中0代表由不包含脂质化合物的典型H&E染色过程产生的分辨率。)
表3
运行# | %(v/v)柠檬烯中的油醇 | 用于盖片的柠檬烯体积(μL) | 核干燥假象/肝脏组织的平均数目 | 增加的分辨率(0-3)/前列腺组织 |
1 | 15 | 30 | 0* | 3 |
2 | 20 | 30 | 0 | 3 |
3 | 25 | 30 | 0 | 3 |
4 | 15 | 40 | 4 | 3 |
5 | 20 | 40 | 12 | 3 |
6 | 15 | 50 | 0 | 3 |
7 | 25 | 50 | 0* | 3 |
*在载玻片托盘上一个特定位置具有大量假象的一个组织部分,因为试剂覆盖的不均匀,所以排除在外。
如表3中所示,在盖片过程中使用柠檬烯中的油醇对降低相对于典型阳性对照物的干燥假象数有效,所述对照物仅与柠檬烯接触(通常获得的核干燥假象太多而难以计数)。在图5中,亮视野显微镜的显微照片表明了阳性对照载玻片(图5A)与用30μL的20%柠檬烯处理的代表性载玻片(图5B)之间的比较。图5B中的显微照片证明用脂质化合物,能够使观察的分辨率增加,而且减少假象数目。图5A中用箭头表明了核干燥假象。
实施例4-特殊染色剂
在这个实施例中,展示了将溶于柠檬烯中的油醇用于将使用各种特殊染色剂进行染色的样品进行盖片。使用自动载玻片染色系统(Ventana Medical Systems、Inc、Tucson、AZ)的标准程序,用TrichromeIII Blue染料(Ventana Medical Systems、Inc、Tucson、AZ)将载有肝脏组织部分的载玻片染色。相似地,使用设备和标准程序,用GMS真菌染料(Ventana Medical Systems、Inc、Tucson、AZ)将载有包含真菌的肺组织样品的载玻片染色,用Giemsa染料(Ventana MedicalSystems、Inc、Tucson、AZ)将载有骨髓样品的载玻片染色,和用CongoRed(Ventana Medical Systems、Inc、Tucson、AZ)将载有心脏样品部分的载玻片染色。
将载有肝脏、肺、骨髓和心脏组织部分的已染色载玻片放在托盘中,使用实施例1中所述的系统进行盖片,在该实施例中将所述过程设定为直接将载玻片托盘送至盖玻片装置。在盖玻片装置中,将柠檬烯溶液中的20%油醇应用于载玻片,向每片加入预粘合盖玻片。由病理学家检验染色样品。
实施例5-在自动H&E染色过程中使用脂质化合物增加分辨率、色彩平衡和对比度的作用
在这个实施例中,展示了各种脂质化合物可以增加H&E染色载玻片的分辨率、色彩平衡和对比度。在使用实施例1中所述的自动染色系统的商业实施方案染色的载玻片上观察到了“高分辨率”效果,其中将染色的载玻片在自动盖片步骤中用脂质化合物处理。用20%油醇/80%柠檬烯混合物作为基线阳性对照,测试了共17个脂质化合物(见实施例3)。每种试剂对三种多组织块进行三次运行,所述组织块中包含组织部分,其包括展示高分辨率效果有用的特征。这些多组织块包括甲状腺乳状癌、前列腺癌、扁平细胞癌、正常肺和乳癌。用阳性对照增强的甲状腺乳状癌特征包括“毛玻璃”核外观、核沟和核假包涵体。用阳性对照处理的前列腺癌展示出巨大核仁的外观改善,而且基膜和基底细胞的外观更好。扁平细胞癌中由阳性对照物增强的特征是核分辨率、细胞质角质化、鳞片珠、胞内桥和凋亡细胞与有丝分裂细胞之间的区别。在正常肺中,阳性对照改善了纤毛内衬支气管上皮细胞的外观。由阳性对照增强的乳癌特征包括染色质组织、核仁隆起和分裂象的清晰程度,在将乳癌分级中关键的核细节。
材料与方法
染色系统:
所用试剂(所有都从Ventana Medical Systems、Inc、Tucson、AZ购得):
Symphony B P/N 900-204
Symphony W P/N 900-203
Symphony C P/N 900-202
Symphony Clear P/N 900-209
Symphony E P/N 900-212
试剂级醇
所用的多组织块:
MTB 1:
甲状腺块# 0204-192-02929 的#9项
甲状腺块# 0206-341-01309 1-2
甲状腺块# 0104-192-00504 的#6项
前列腺块# 0205-341-01954 2-2
前列腺块# 0205-341-001954-1-2
前列腺块# 0207-315-01329的#3项
MTB2:
扁平细胞癌A603
扁平细胞癌A395
扁平细胞癌0106-192-01531的#3项
扁平细胞癌B603
肺B763
肺B750
肺B666
MTB3:
乳癌0112-192-01649的#6项
乳癌0206-192-02108的#7项
乳癌0112-192-1567的#6项
乳癌(原位)0204-192-02897的#7项
乳癌(原位)0204-192-02887的#7项
乳癌(原位)0204-192-02859的#7项
测试的试剂(以20%v/v或w/v溶于d-柠檬烯中,其中所有试剂组分都可以从Sigma-Aldrich、St.Louis、MO购得,除了化合物J,其从Degussa GmbH,Dusseldorf,Germany购得):
A:十甲基环戊硅氧烷[硅氧烷]
B:辛醚[C16醚]
C:雪松油[香精油/天然油]
D:油胺[C18胺]
E:生育酚[酚]
F:辛酸[C18羧酸]
G:Triton X-100[非离子清洁剂]
H:乙酸芳樟酯[酯]
I:角鲨烯[不饱和脂肪族]
J:ABIL EM90[硅氧烷聚合物]
K:聚丙二醇[聚醚多醇]
L:壬基酚聚氧乙烯醚[清洁剂]
M:三(丙二醇)丁基醚[聚醚]
N:油酸甲酯[C18酯]
O:油酰胺[C18酰胺]
P:单油酸聚乙二醇酯[聚醚酯]
阳性对照:油醇
阴性对照:纯d-柠檬烯
染色方法:
图6中示意性阐述了这个实施例中所用的优化过程。如前所提及的,Symphony过程可对每一载玻片都使用新鲜试剂。在染色过程的盖片步骤测试了每种脂质化合物。在盖片之前将测试试剂应用于载玻片。如下所详述的,在Symphony系统的完整染色程序中对载玻片进行实验。
将载玻片载于通用的载玻片托盘上,并置于设备入口中。选择合适的染色程序(标准核染色、标准细胞质染色),使用触摸屏界面启动运行。在Symphony染色系统,扫描载玻片,确定它们在通用载玻片托盘中的位置。在载玻片干燥模块将载玻片烘干,以进行组织附着。在烘干步骤后,将载玻片转移至染色模块进行脱蜡、染色和清洗。脱蜡使用Symphony清洗试剂,然后通过乙醇冲洗来去除过量的试剂。在脱蜡后进行的标准核染色和细胞质染色过程的步骤在下面列出:
1.将Symphony W试剂应用于载玻片。
2.应用Symphony N1试剂,然后进行培育时期。
3.用Symphony W溶液冲洗载玻片。
4.将Symphony B试剂应用于载玻片并培育。
5.用Symphony W溶液冲洗载玻片。
6.将梯度醇沉积在载玻片上。
7.分配Symphony C溶液并培育。
8.通过加入梯度醇和试剂级醇冲洗载玻片。
9.用Symphony Clear试剂清洁载玻片,并将载玻片传送至载玻片制备模块,进行最终的脱水步骤。
10.将载玻片移至OptiSure盖片模块。
11.在OptiSure盖片之前,将Symphony Clear沉积载玻片上,用于保证光学清晰度和盖玻片粘合。
12.将载玻片传送至载玻片固化模块,以保护盖玻片。
13.将通用载玻片托盘置于IntelliQue中来冷却一段时期,然后退出托盘。
在步骤11,作为盖片过程的一部分,用各种脂质化合物组合物接触组织样品。
评价方法:
由两名委员会认定的病理学家进行所有的评价。评价用每种可选化合物制备的载玻片。根据前述组织/癌症特异性评价指标,评价了5种组织类型(扁平细胞癌、正常肺、前列腺癌、乳状甲状腺癌、乳癌)。所有评价都相对于用油醇以如下方式制备的阳性对照片而做出:
‘>’表示与阳性对照相比,评价指标增加。
‘<’表示与阳性对照相比,评价指标减小。
‘0’表示评价指标与阳性对照相当。
由两位病理学家确定的评价结果分别示于下面的表4和5中:
表4
表5
图7中给出了代表性的亮视野显微镜图片(60×),其表明根据本公开处理的前列腺癌样品的膜和核的细节以及对比度得到强化,而且色彩平衡也得到了改善。图7A是阴性对照,图7B是阳性对照(油醇,一种脂肪醇),图7C是化合物H(乙醇芳樟酯,一种脂肪酯),而图7D是化合物O(油酰胺,一种脂肪胺)。
结论:
总体来讲,16种可选化合物中,在与阳性对照,油醇比较时,展示每种的性能都相当。尽管由特定病理学家对个别组织/癌症类型会注意到某些差别,但是对任何可选化合物,在所有组织/癌症类型中没有发现一致的变化。
尽管已经参考几个示例性的实施方案描述了本发明的原理,但是对本领域的普通技术人员显而易见是,实施方案的细节可以在不背离这些原理的情况下进行修正。例如,尽管示例性实例包括在染色过程的特定步骤用样品接触脂质化合物,但是可以在染色步骤的任何步骤中用样品接触脂质化合物。此外,可以用任何自动染色过程或任何手动染色过程使用公开的方法和组合物。各种特别阐述的染色过程可以使用不同的醇试剂(比如异丙醇)和其它盖玻片溶剂(比如二甲苯或烷烃溶剂)。本发明包括在权利要求范畴和精髓内的所有修正、改变和相当的内容。
Claims (75)
1.将生物样品染色的方法,包含:
使样品与一种或多种组织染色剂接触;和
使样品与脂质化合物组合物接触,其中该脂质化合物组合物基本上由脂质化合物,以及低级烷醇或盖玻片溶剂组成。
2.权利要求1的方法,其中脂质化合物在约20℃时水溶性小于约1.0g/L。
3.权利要求1的方法,其中脂质化合物包含非清洁剂的脂质化合物。
4.权利要求1的方法,其中生物样品包含蜡包埋的生物样品,并在将样品脱蜡后使样品与脂质化合物组合物接触。
5.权利要求1的方法,其中使生物样品与一种或多种组织染色剂接触基本由用苏木精和曙红接触生物样品组成。
6.权利要求1的方法,其中所述方法自动进行。
7.权利要求6的方法,其中将大量样品染色,且每个样品使用新鲜试剂。
8.权利要求1的方法,其中脂质化合物包含清洁剂、脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪胺、脂肪醚、聚硅氧烷、聚醚和类异戊二烯中的一种或多种。
9.权利要求1的方法,其中脂质化合物包含脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪胺和脂肪醚中的一种或多种。
10.权利要求1的方法,其中脂质化合物包含脂肪醚、脂肪胺、脂肪酸酯和脂肪醇中的一种或多种。
11.权利要求1的方法,其中脂质化合物包含脂肪醇、脂肪醚和脂肪胺中的一种或多种。
12.权利要求1的方法,其中脂质化合物包含C8至C20脂肪醇的一种或多种。
13.权利要求1的方法,其中脂质化合物包含C8至C20不饱和脂肪醇的一种或多种。
14.权利要求1的方法,其中脂质化合物组合物包含约0.5%至约35%的脂质化合物。
15.权利要求1的方法,其中盖玻片溶剂是脂肪烃、芳香烃或萜中的一种或多种。
16.权利要求1的方法,其中盖玻片溶剂是柠檬烯。
17.权利要求1的方法,其中用脂质化合物处理样品由将样品盖片组成。
18.在显微镜载玻片上将染色的生物样品盖片的方法,其包含:
对样品应用盖玻片组合物,其中盖玻片组合物基本上由盖玻片溶剂、溶于盖玻片溶剂中的脂质化合物,和可选地,溶于盖玻片溶剂中的粘合剂组成;和
将应用了上述组合物的样品盖片,其中与只用盖玻片溶剂盖片的基本近似的样品比较,盖片后的样品的对比度、细胞和亚细胞分辨率增加。
19.权利要求18的方法,其中脂质化合物包含清洁剂、脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪胺、脂肪醚、聚硅氧烷、聚醚和类异戊二烯中的一种或多种。
20.权利要求18的方法,其中脂质化合物包含脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪胺和脂肪醚中的一种或多种。
21.权利要求18的方法,其中脂质化合物包含脂肪醚、脂肪胺、脂肪酸酯和脂肪醇中的一种或多种。
22.权利要求18的方法,其中脂质化合物包含脂肪醇、脂肪醚和脂肪胺中的一种或多种。
23.权利要求18的方法,其中脂质化合物包含C8至C20脂肪醇中的一种或多种。
24.权利要求18的方法,其中脂质化合物包含C8至C20不饱和脂肪醇中的一种或多种。
25.权利要求18的方法,其中约20℃时脂质化合物在水中的溶解度小于约1g/L。
26.权利要求18的方法,其中盖玻片组合物包含约0.5%至约35%的脂质化合物。
27.权利要求18的方法,其中盖玻片溶剂包含脂肪烃、芳香烃或萜中的一种或多种。
28.权利要求18的方法,其中盖玻片溶剂包含柠檬烯。
29.权利要求18的方法,其中所述方法是盖片的自动化过程。
30.权利要求18的方法,其中样品包含组织染色的样品。
31.权利要求18的方法,其中盖片包含用预先粘合的盖玻片盖片。
32.权利要求18的方法,其中组合物进一步基本上由盖玻片粘合剂组成。
33.权利要求18的方法,其中使用亮视野显微镜观察到对比度和细胞与亚细胞分辨率增加。
34.盖玻片组合物,其包含盖玻片溶剂和脂质化合物。
35.权利要求34的组合物,其中脂质化合物包含清洁剂、脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪胺、脂肪醚、聚硅氧烷、聚醚和类异戊二烯中的一种或多种。
36.权利要求34的组合物,其中脂质化合物包含脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪胺和脂肪醚中的一种或多种。
37.权利要求34的组合物,其中脂质化合物包含脂肪醚、脂肪胺、脂肪酸酯和脂肪醇中的一种或多种。
38.权利要求34的组合物,其中脂质化合物包含脂肪醇、脂肪醚和脂肪胺中的一种或多种。
39.权利要求34的组合物,其中脂质化合物包含C8至C20脂肪醇中的一种或多种。
40.权利要求34的组合物,其中脂质化合物包含C8至C20不饱和脂肪醇中的一种或多种。
41.权利要求34的组合物,其中在约20℃时,脂质化合物在水中的溶解度小于约1g/L。
42.权利要求34的组合物,其中盖玻片组合物基本上由盖玻片溶剂、溶于盖玻片溶剂中的脂质化合物,和可选地,溶于盖玻片溶剂的盖玻片粘合剂组成。
43.权利要求34的组合物,其中盖玻片溶剂包含柠檬烯、二甲苯、烷烃和甲苯中的一种或多种。
44.在显微镜载玻片上处理生物样品的方法,其包含:
使用组织化学技术处理样品,以提供染色的样品;
在促进溶剂从样品蒸发的条件下,将样品置于较高温度;和
在促进溶剂从样品蒸发的条件下,在将样品置于较高温度之前、过程中或之后,使样品与脂质化合物接触。
45.权利要求44的方法,其中在促进溶剂从样品蒸发的条件下将样品置于较高温度包含用对流烘箱加热样品或用辐射加热器加热样品。
46.权利要求44的方法,其中相对于未与脂质化合物接触的基本相似的样品,使样品与脂质化合物接触可以减少将样品置于较高温度而产生的假象。
47.权利要求44的方法,其中使样品与脂质化合物接触增加了样品中观察到的细胞和亚细胞的分辨率。
48.权利要求44的方法,其中组织化学技术包含组织染色过程。
49.权利要求31的方法,其中组织染色过程基本上由使样品与苏木精和曙红接触组成。
50.权利要求44的方法,其中从样品中蒸发至少25%的溶剂。
51.权利要求44的方法,其中溶剂包含低级烷醇。
52.权利要求44的方法,其中脂质化合物的沸点高于约200℃。
53.权利要求44的方法,其中脂质化合物包含清洁剂、脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪胺、脂肪醚、聚硅氧烷、聚醚和类异戊二烯中的一种或多种。
54.权利要求44的方法,其中脂质化合物包含脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪胺和脂肪醚中的一种或多种。
55.权利要求44的方法,其中脂质化合物包含脂肪醚、脂肪胺、脂肪酸酯和脂肪醇中的一种或多种。
56.权利要求44的方法,其中脂质化合物包含脂肪醇、脂肪醚和脂肪胺中的一种或多种。
57.权利要求44的方法,其中脂质化合物包含C8至C20脂肪醇中的一种或多种。
58.权利要求44的方法,其中脂质化合物包含C8-C20不饱和脂肪醇中的一种或多种。
59.权利要求44的方法,其中在约20℃时,脂质化合物在水中的溶解度小于约1g/L。
60.权利要求44的方法,其中在将样品置于较高温度后使样品与脂质化合物接触。
61.权利要求44的方法,其中较高温度包含约35℃至约140℃之间的温度。
62.权利要求44的方法,其中脂质化合物溶于有机溶剂中。
63.权利要求62的方法,其中脂质化合物以约0.5%至约35%的浓度溶于有机溶剂中。
64.权利要求62的方法,其中有机溶剂包含低级烷醇。
65.权利要求64的方法,其中低级烷醇包含乙醇。
66.权利要求62的方法,其中有机溶剂是萜。
67.权利要求66的方法,其中萜包含柠檬烯。
68.权利要求44的方法,其中所述过程自动进行。
69.权利要求68的方法,其中处理多个样品,且每个样品用新鲜试剂处理。
70.权利要求44的方法,其中在已经使用脱蜡溶剂将样品脱蜡后,使样品与脂质化合物接触。
71.权利要求70的方法,其中在已经从样品充分去除脱蜡溶剂后,使样品与脂质化合物接触。
72.权利要求44的方法,其中在已经用组织化学技术处理样品后,使样品与脂质化合物接触。
73.权利要求44的方法,其中组织化学技术包含组织染色方法。
74.权利要求44的方法,其中当将样品盖片时,样品中存在的脂质化合物的量为约1μL至约30μL。
75.权利要求46的方法,其中假象包含在促进溶剂从样品蒸发的条件下,将样品置于较高温度而导致的核干燥假象。
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