ES2340569T3

ES2340569T3 - Uso de medio de montaje mejorado para portaobjetos para microscopio.

Info

Publication number: ES2340569T3
Application number: ES00203405T
Authority: ES
Inventors: Wilhelmus Hermanus Hendrikus Maria Kieftenbeld
Original assignee: Mallinckrodt Baker BV
Current assignee: Avantor Performance Materials BV
Priority date: 2000-10-02
Filing date: 2000-10-02
Publication date: 2010-06-07
Anticipated expiration: 2020-10-02
Also published as: US6709836B2; ATE458189T1; US20020064810A1; DE60043845D1; DK1195594T3; US20040152152A1; US6913902B2; EP1195594B1; EP1195594A1; PT1195594E

Abstract

Uso de un medio comprendiendo una solución de resina de metacrilato de isobutilo, en al menos un solvente orgánico seleccionado del grupo que consiste en hidrocarburos saturados, opcionalmente mezclados con uno o más alcoholes, como un medio de montaje para preparar portaobjetos de microscopía.

Description

Uso de medio de montaje mejorado para portaobjetos para microscopio.

La presente invención se refiere al uso de un medio en la preparación de portaobjetos para la investigación por técnicas de microscopía.

El medio se usa en particular en histoquímica, inmunoquímica y/o citoquímica, es decir, para proporcionar portaobjetos de muestras de sangre, tejido de células u otros fluidos biológicos o materiales, incluyendo pero no limitándose a muestras/materiales que han sido teñidas para facilitar el examen microscópico, p. ej. con objetivos científicos y/o diagnósticos.

Otros aspectos de la invención se pondrán de manifiesto en la descripción dada a continuación.

Generalmente, en microscopía, un portaobjeto de un material o de una muestra a investigar se prepara poniendo dicha muestra o dicho material sobre un portaobjeto (inferior) y después cubriendo dicha muestra con una cubierta (superior). Generalmente, para la microscopía óptica o técnicas similares, se usan portaobjetos y cubiertas de vidrio u otros materiales transparentes adecuados.

También, en la preparación de tales portaobjetos, el cubreobjeto normalmente está adherido/fijado al portaobjeto inferior. Este "montaje" asegura que la muestra y el cubreobjeto permanecen en su sitio sobre el portaobjeto inferior, lo que facilita la manipulación, el almacenamiento y/o el transporte de los portaobjetos. También, tal montaje asegura que los portaobjetos se conservan durante períodos prolongados de tiempo, es decir, hasta cinco años o más, sin deterioro sustancial de la muestra o del material.

Generalmente, en histoquímica, citoquímica, inmunoquímica o técnicas de microscopía médicas o biológicas similares, el montaje de los portaobjetos es la última fase antes del examen del espécimen por microscopio. Así, para proporcionar una mejor comprensión de la presente invención, las técnicas convencionales para la preparación de tales portaobjetos ahora serán discutidas en más detalle.

Primero, una o más muestras del material a investigar, que pueden por ejemplo ser muestras de sangre, células, tejido, u otros fluidos biológicos o materiales de interés, se ponen sobre el portaobjeto inferior. La(s) muestra(s) es/son entonces teñida(s), es decir para hacer (más) visible uno o más de los componentes de la muestra o del material, tal como núcleos de célula, citoplasma de célula, tejido y estructuras celulares. Tales técnicas de tinción y composiciones/agentes para el uso allí dentro resultarán claros para el experto en la materia, y pueden por ejemplo incluir:

-: colorantes tales como hematoxilina y eosina (histoquímica);

-: inmunoperoxidasa (inmunoquímica);

-: Papanicolaou (citoquímica) y otras manchas de histo-, inmuno- y citoquímica.

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Después de eso, se lava el exceso de colorante, p. ej. usando una o más fases de lavado con agua del grifo y/o agua destilada/desionizada, alcohol (etanol, alcohol de isopropilo, alcohol bencílico, etc ...) u otro medio adecuado. Después de eso, los portaobjetos generalmente se lavan con un solvente orgánico o una mezcla de solvente, antes de que el cubreobjeto se fije sobre el portaobjeto inferior usando el medio de montaje. Estas últimas fases de lavado también están previstas para eliminar/reemplazar cualquier agua y/o alcohol (etanol, alcohol de isopropilo, alcohol bencílico, etc ...) restante de las primeras fases de lavado con el medio orgánico, es decir, para preparar la muestra para la aplicación del medio de montaje. Al hacerlo, el solvente orgánico actúa como un "intermediario" entre el agua/alcohol y el medio de montaje orgánico apolar.

Por ejemplo, el régimen para preparar/montar un portaobjeto puede ser esencialmente como se describe en la
tabla 1

TABLA 1 Esquema de montaje de un portaobjeto (no limitativo)

1

De forma convencional, como se indica en la tabla 1, se han usado solventes xilenos o solventes orgánicos aromáticos para las últimas fases de lavado. No obstante, puesto que el uso de tales solventes ya no es deseado, p. ej. por cuestiones de salud y seguridad, hoy en día se usan frecuentemente (mezclas de) hidrocarburos saturados, un ejemplo comercialmente disponible del cual es UltraClear® vendido por Mallinckrodt Baker B.V., Deventer, Países Bajos, que es una mezcla de nonanos, decanos, undecanos y dodecanos.

Después de lavar con la (mezcla) del solvente orgánico, unas gotas de medio de montaje se aplican a la muestra o al material, como se muestra en la Figura 1 (tres gotas en la figura 1). Después, se aplica el cubreobjeto, que está fijado/adherido (sobre el) al portaobjeto inferior por el medio de montaje. El montaje de un cubreobjetos es aplicado bien manualmente o por una máquina de cubreobjetos.

Medios de montaje convencionales normalmente comprenden una resina, tal como una resina acrilada en un hidrocarburo aromático tal como xileno o tolueno como solvente orgánico (véase GB 2155943). No obstante, en la práctica, sucede frecuentemente que los medios de montaje convencionales, y en particular la(s) resina(s) acrilada(s) presente(s)
en ellos, interfieren y/o reaccionan con la mezcla del solvente orgánico usada para lavar el portaobjeto, resultando en la formación de una capa turbia en el portaobjeto y/o llevando a otros efectos indeseados que pueden disminuir la calidad del portaobjeto obtenido y/o del examen microscópico de éste. Se ha descubierto que estos problemas en particular pueden ocurrir cuando la(s) última(s) fase(s) de lavado ha(n) sido realizada(s) con (una mezcla de) hidrocarburos saturados, tal como UltraClear.

Por consiguiente, es un objetivo de la invención proporcionar el uso de un medio que pueda estar en conjunción con solventes orgánicos, tales como hidrocarburos aromáticos y alcoholes, es decir como los usados en la preparación de los portaobjetos, y en particular con hidrocarburos saturados, sin ninguno de los problemas indicados arriba.

Ahora se ha descubierto que tal medio de montaje puede ser proporcionado por el uso de una resina acrilada o resina de metacrilato como se describe abajo.

Así, en un primer aspecto, la invención se refiere al uso de un medio para la preparación de portaobjetos, dicho medio de montaje comprendiendo una solución, en al menos un solvente orgánico seleccionado del grupo que consiste en hidrocarburos saturados opcionalmente mezclados con uno o más alcoholes, de al menos una resina de (met)acrilato basada en uno o más monómeros teniendo la fórmula I:

Fórmula I:

3

donde R es hidrógeno o un grupo metilo y n tiene un valor de 0-19.

En particular, el grupo -(CH_{2})_{n}-CH_{3} puede comprender una "columna vertebral" lineal de entre 1 y 10 átomos de carbono, que pueden ser sustituida en cualquier posición(es) por uno o más sustituyentes de hidrocarburos saturados tales como metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, 1-butilo, 2-butilo, i-butilo, etc.; de tal manera que la cantidad total de átomos de carbono en el grupo -(CH_{2})_{n}-CH_{3} es de entre 1 y 20.

También, y/o alternativamente, el grupo -(CH_{2})_{n}-CH_{3} puede comprender/contener un anillo de hidrocarburo saturado y/o un anillo de hidrocarburo aromático, que puede por ejemplo ser conectado al grupo de (met)acrilato mediante uno (otro) residuo de hidrocarburo saturado, y/o que de nuevo puede ser sustituido en cualquier posición(es) por uno o más sustituyentes de hidrocarburos saturados tales como metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, 1-butilo, 2-butilo, i-butilo, etc.; de nuevo tan largos como la cantidad total de átomos de carbono en el grupo -(CH_{2})_{n}-CH_{3} es de entre 1 y 20.

Algunos ejemplos particularmente preferidos del grupo -(CH_{2})_{n}-CH_{3} incluyen, pero no se limitan a:

-: metilo

-: etilo

-: isopropilo;

-: isobutilo;

-: bencilo

-: isohexilo

-: isodecilo.

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Por ejemplo, la resina de (met)acrilato de la fórmula I puede ser resina de metacrilato de isobutilo, metacrilato metílico, metacrilato etílico, metacrilato de isopropilo, metacrilato de isohexilo, metacrilato de bencilo, metacrilato de isodecilo, al igual que las resinas acriladas correspondientes.

Generalmente, el medio de montaje usado según la presente invención comprenderá una solución de una o más de tales resinas de (met)acrilato en un solvente orgánico de mezcla de solvente, de tal manera que la cantidad de resinas de (met)acrilato constituye entre el 10 y el 60% en peso de la composición total.

Como el solvente orgánico, cualquier solvente adecuado o mezcla adecuada de solventes puede ser usado, siempre que estos solventes no reaccionen con la resina de (met)acrilato y/o interfieran con la acción prevista del medio de montaje. Preferiblemente, un solvente aprótico o mezcla de solventes apróticos se usa, tal como una (mezcla de) solvente(s) aprótico(s) apolar(es). Algunos ejemplos adecuados, pero no limitativos de solventes adecuados incluyen:

-: hidrocarburos saturados, tales como (iso)parafinas C_{5}-C_{20} lineales y/o ramificadas, en particular (iso)parafinas C_{8}-C_{12}, p. ej. nonanos, decanos, undecanos, dodecanos y sus mezclas; y

-: dichos hidrocarburos saturados, mezclados con uno o más alcoholes C_{1-6}.

En una forma de realización particularmente preferida, el solvente orgánico o la mezcla de solventes orgánicos usado/a en (la preparación de) el medio de montaje es el/la mismo/a que el/los solvente(s) orgánico(s) que se usa(n) en las fases finales de lavado del portaobjeto. Por ejemplo, en un aspecto preferido de la invención, el solvente orgánico usado en el medio de montaje es UltraClear®.

El medio de montaje opcionalmente puede contener uno o más otros componentes adecuados tal como (iso)parafinas C_{8}-C_{12}.

El medio de montaje puede simplemente ser preparado mezclando resina(s) de (met)acrilato con (la mezcla de) el solvente orgánico usado/a en las cantidades indicadas arriba, y normalmente estará entonces listo para el uso. El medio de montaje puede también ser provisto/vendido como un producto o una formulación propietario/comercial, p. ej. envasado en un contenedor adecuado tal como un matraz, una botella o una botella cuentagotas, opcionalmente marcado y/o con instrucciones para el uso.

Preferiblemente, el medio de montaje se prepara de tal manera que tiene una viscosidad final de entre 2 y 6 Stokes - p. ej. aproximadamente 4 Stokes - a 25ºC, como medido en un viscosímetro Gardner Bubble. Este instrumento se basa en el principio de que la viscosidad es directamente proporcional a la velocidad de la burbuja.

Además, el medio de montaje es más preferiblemente de tal manera que pueda ser mezclado con un hidrocarburo saturado o una mezcla de hidrocarburos saturados sin resultar en turbidez u otros efectos indeseados. Esto puede ser fácilmente constatado por el experto en la materia, p. ej. mezclando una cantidad del medio de montaje de la invención con una cantidad de un hidrocarburo saturado o una mezcla de hidrocarburos (p. ej. en un portaobjeto o en un frasco), seguido de una inspección visual.

El medio de montaje puede ser usado en cierto modo conocido per se y/o esencialmente análogo a la manera en la que se usan medios de montaje convencionales, es decir, como se ha descrito anteriormente.

Conforme a lo anterior, el medio de montaje es compatible/miscible con alcoholes (alcohol de isopropilo, alcohol bencílico), y UltraClear®. Por lo tanto, tiene un enfoque muy amplio.

Además, el uso de la invención puede también proporcionar una o más de las siguientes ventajas:

-: el medio de montaje de la invención puede prepararse con ventaja de manera que no contenga ningún compuestos aromáticos y por lo tanto sea menos peligroso;

-: el medio de montaje tiene propiedades de fluidez muy ventajosas, tales como una viscosidad optimizada (aprox. 4 Stokes). Esto facilita el montaje de los portaobjetos;

-: después del montaje del cubreobjeto, un portaobjeto montado ya puede ser examinado tras 1 hora y el día siguiente el cubreobjeto se fija firmemente;

-: después de la tinción, los tintes de las soluciones de tinción se enlazan al núcleos celulares basados en agua y a especies de citoplasma. En este aspecto, el medio de montaje de la invención es muy apolar, cuando se compara con medios de montaje convencionales basados en xileno/tolueno. Esto significa que la migración de tintes de partes de tejido se reduce a una extensión muy baja;

-: el solvente usado en el medio de montaje de la invención tiene una volatibilidad muy baja, lo cual no produce efectos de secado de los portaobjetos;

-: el medio de montaje de la invención no espesa cuando se usa. A partir de medios de montaje convencionales, el xileno/tolueno se evapora y espesa los medios de montaje durante el uso;

-: un medio de montaje humedecido puede ser fácilmente eliminado con un solvente orgánico tal como Ultra- Clear®, mientras que algunos medios de montaje convencionales tienen que ser enjugados completamente.

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El medio de montaje puede ser usado para todas las aplicaciones conocidas per se para aplicaciones convencionales, y tales usos estarán claros para el experto en la materia. Por ejemplo, el medio de montaje puede ser usado esencialmente para preparar portaobjetos de la forma indicada anteriormente.

Como se desprende de lo anterior, el medio de montaje es particularmente adecuado para la preparación de portaobjetos en histoquímica, inmunoquímica y citoquímica, p. ej. muestras de sangre (teñidas), tejidos, células u otros materiales biológicos para el examen por técnicas de microscopía óptica.

No obstante, cabe señalar que la invención no está limitada a este campo específico, no a la preparación de portaobjetos para el examen por microscopía óptica. Por ejemplo, el medio de montaje también puede ser usado para la preparación de muestras para microscopía fluorescente, tecnología de procesamiento de imágenes; y/o generalmente para fijar/conservar muestras (biológicas) en (sobre) un portador adecuado.

En otros aspectos, la invención también se refiere a los portaobjetos obtenidos por el uso de la invención.

La invención será ahora ilustrada mediante el siguiente ejemplo no limitativo.

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Ejemplo

Un medio de montaje fue preparado mezclando 25 gramos de resina de metacrilato de isobutilo (vendido por Röhm GmbH bajo el nombre de PLEXIGUM® PQ 611) y 75 ml de UltraClear®.

El medio de montaje así obtenido fue usado en la preparación de un portaobjeto de una muestra de (células) de sangre teñida, esencialmente según las fases expuestas en la tabla 1 arriba. El portaobjeto resultante fue de calidad excelente, no mostrando ninguna turbidez o neblina. Los resultados se ilustran en las figuras 2a y 2b, donde las muestras fueron teñidas con hematoxilina/eosina y cubiertas con un cubreobjeto con el medio de montaje (UltraKitt).

Figura 2a: Una vesícula biliar normal tiene una mucosa con células columnares recubriendo las proyecciones ramificadas en forma de dedo vistas aquí a gran ampliación.

Figura 2b: El glomérulo normal del riñón a alta potencia tiene capilares finos y delicados.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector y no forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad por eventuales errores u omisiones.

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Documentos de patente citados en la descripción

\bullet GB 2155943 A [0012]

Claims

1. Uso de un medio comprendiendo una solución de resina de metacrilato de isobutilo, en al menos un solvente orgánico seleccionado del grupo que consiste en hidrocarburos saturados, opcionalmente mezclados con uno o más alcoholes, como un medio de montaje para preparar portaobjetos de microscopía.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que al menos un solvente orgánico es una (iso)parafina saturada lineal o ramificada C_{5}-C_{20}.

3. Uso según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que al menos un solvente orgánico es una (iso)parafina saturada lineal o ramificada C_{8}-C_{12}.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el solvente orgánico es un solvente aprótico, o una mezcla de solventes apróticos.

5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el solvente orgánico es un solvente aprótico no polar o una mezcla de solventes apróticos no polares.

6. Uso según la reivindicación 2 ó 3, en el que el solvente orgánico se mezcla con - uno o más alcoholes C_{1}-C_{6}.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el solvente orgánico es una mezcla de nonanos, decanos, undecanos, y dodecanos.

8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio esencialmente tiene la composición:

-: resinas de metacrilato de isobutilo: entre el 10 y el 60% en peso;

-: uno o más solventes orgánicos: entre el 40 y el 90% en peso;

hasta un total del 100% en peso de la composición total.

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9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio tiene una viscosidad de entre 2 y 6 Stokes, p. ej. de aproximadamente 4 Stokes, a 25ºC, según se ha medido en un viscosímetro Gardner Bubble.

10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, incluyendo al menos las fases de:

a): poner una muestra a investigar sobre un portaobjeto inferior;

b): opcionalmente teñir dicha muestra;

c): al menos una fase de lavado con agua y/o un solvente orgánico prótico tal como un alcohol como etanol, alcohol de isopropilo, y alcohol bencílico;

d): al menos una fase de lavado con un solvente orgánico aprótico o una mezcla de solventes orgánicos apróticos;

e): montar el cubreobjeto usando dicho medio de montaje.

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11. Uso según la reivindicación 10, en el que dicho medio de montaje contiene, como el o los solvente(s) orgáni-
co(s), el mismo solvente orgánico aprótico o la misma mezcla de solventes orgánicos apróticos como se usa en la
fase d).

12. Uso según la reivindicación 10 ó 11, en el que la muestra es una muestra biológica, tal como una muestra de sangre, tejido, células u otra muestra biológica o material.

13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en el que la muestra ha sido teñida.

14. Portaobjeto de microscopía de una muestra a investigar, obtenible por el uso de cualquiera de las reivindicaciones 10-13.