PT1195594E - Uso de um meio de montagem aperfeiçoado para lâminas de microscópio - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
USO DE UM MEIO DE MONTAGEM APERFEIÇOADO PARA LÂMINAS DE
MICROSCÓPIO A presente invenção refere-se ao uso de um meio na preparação de lâminas para a investigação com técnicas de microscopia.
Particularmente, o meio é usado em histoquímica, imunoquímica e/ou citoquimica, isto é para prover lâminas de amostras de sangue, tecido de células ou outros fluidos biológicos ou materiais, incluindo mas não limitados a amostras/materiais que foram coradas para facilitar o exame microscópico, por exemplo para fins científicos e/ou de diagnóstico.
Outros aspectos da invenção tornar-se-ão evidentes da descrição dada à continuação.
Geralmente, em microscopia, uma lâmina de um material ou de uma amostra a ser investigada é preparada pondo a dita amostra ou material na lâmina (inferior) e seguidamente cobrir a dita amostra com uma lamela (superior). Geralmente, para a microscopia óptica ou técnicas similares, são usadas as lâminas e as lamelas de vidro ou outros materiais transparentes adequados.
Também, na preparação destas lâminas, a lamela de vidro está normalmente aderida/fixada na lâmina inferior. Esta "montagem" garante que a amostra e a lamela de vidro fique em posição na lâmina inferior, o que facilita a manipulação, o armazenamento e/ou o transporte das lâminas. Também, esta montagem garante que as lâminas são preservadas durante grandes períodos de tempo -isto é durante cinco anos ou mais - sem uma substancial deterioração da amostra ou do material. 1/11
Geralmente, em histoquímica, citoquímica, imunoquímica ou técnicas de microscopia médica ou biológica similares, A montagem das lâminas é a última fase antes do exame do espécime por microscópio. Assim, para prover uma melhor compreensão da presente invenção, as técnicas convencionais para a preparação destas lâminas serão agora discutidas mais detalhadamente.
Primeiro, uma ou mais amostras do material a ser investigado, que pode por exemplo ser amostras de sangue, células, tecidos, ou outros fluidos biológicos ou materiais de interesse, são postos por cima da lâmina inferior. A(s) amostra(s) é/são seguidamente tingidas, isto é para que seja (mais) visível um ou mais dos componentes da amostra ou material, tais como núcleos celulares, citoplasma celular, tecido e estruturas celulares. Estas técnicas de coloração e composições/agentes para serem usadas na presente invenção serão óbvias a um técnico especializado, e pode por exemplo incluir: - corantes tais como a hematoxilina e a eosina (histoquímica); - imunoperoxidase(imunoquímica); - Papanicolau (citoquímica) e outros corantes para histoquímica, imunoquímica e citoquímica.
Depois disso, o excesso do agente de coloração é retirado, usando por exemplo uma ou mais fases de lavagem com água da torneira e/ou água destilada/desionizada, álcool (etanol, álcool isopropílico, álcool benzílico etc ...) ou outro meio adequado.
Posteriormente, as lâminas são geralmente lavadas com um solvente orgânico ou mistura de solvente, antes de que lamela de vidro seja fixada sobre a lâmina inferior usando o meio de montagem. Estas últimas fases de lavagem têm também a finalidade de remover/substituir qualquer resto de água e/ou álcool (etanol, álcool isopropílico, álcool benzílico etc ...) das primeiras fases de lavagem com o meio orgânico, isto é com o fim 2/11 de preparar a amostra para a aplicação do meio de montagem. Ao fazê-lo, o solvente orgânico age como um "intermediário" entre a água/álcool e o meio de montagem orgânico apoiar.
Por exemplo, o regime para preparar/montar uma lâmina pode ser essencialmente como o descrito no quadro 1
Quadro 1: esquema de montagem de uma lâmina (nao limitativo:
Sequência Tempo em minutos Corando o espécime na lâmina 1 Áqua dest. 1 Etanol 100% 1 Etanol 100% 1 Etanol 100% 1 UltraClear/--Xileno/To lueno 1 UltraClear/-Xileno/Tolueno 1 UltraClear/—Xileno/Tolueno 1 Encaixando-os com o meio d e montagem
Convencionalmente, como o indicado no quadro 1, o xileno ou os solventes orgânicos aromáticos têm sido usados para as últimas fases de lavagem. No entanto, dado que o uso destes solventes já não é desejável - por exemplo por razões de saúde e de segurança - hoje em dia muitas vezes são usados (misturas de) hidrocarbonetos saturados um exemplo de um destes solventes que é comercializado é o UltraClear® vendido por Mallinckrodt Baker B.V., Deventer, Netherlands, que é uma mistura de nonanos, decanos, undecanos e dodecanos.
Depois da lavagem com a (mistura) do solvente orgânico, algumas gotas do meio de montagem são aplicadas à amostra ou ao material, como o mostrado na figura 1 (três gotas na figura 1). Seguidamente, a lamela de vidro é aplicada, que é fixada/aderids (na) lâmina inferior pelo meio de montagem. A montagem de uma lamela de vidro tanto é aplicada manualmente como com uma máquina de lamelas. 3/11
Os meios de montagem convencional compreendem normalmente uma resina, tais como uma resina acrilada num hidrocarboneto aromático tais como o xileno ou o tolueno como solvente orgânico (ver Pedido de Patente GB 2155943). No entanto, na prática, na maioria das vezes sucede que os meios de montagem convencional -e em particular a(s) resina(s) acriladas neles existentes -interferem e/ou reagem com a mistura de solvente orgânico usada para a lavagem da lâmina, resultando na formação de uma camada turva na lâmina e/ou levando a outros efeitos indesejados que podem diminuir a qualidade da lâmina obtida e/ou do seu exame microscópico. Foi descoberto que estes problemas podem em particular ocorrer quando a(s) última(s) fase(s) de lavagem foi (foram) executadas com (uma mistura de) hidrocarbonetos saturados, tais como UltraClear.
Consequentemente, é um objecto da invenção o de prover o uso de um meio que possa ser usado em conjunto com solventes orgânicos, tais como hidrocarbonetos aromáticos e álcoois - isto é como os usados na preparação das lâminas - e em particular com hidrocarbonetos saturados, sem qualquer um dos problemas acima indicados.
Foi agora descoberto que este meio de montagem pode ser provido com o uso de uma resina acrilada ou resina de metacrilato como o abaixo descrito.
Assim, num primeiro aspecto, a invenção refere-se ao uso de um meio para a preparação de lâminas, compreendendo o dito meio de montagem uma solução, em pelo menos um solvente orgânico seleccionado do grupo constituído por hidrocarbonetos saturados opcionalmente misturados com um ou mais álcoois, de pelo menos uma resina de (met)acrilato à base de um ou mais monómeros com a fórmula I 4/11 Fórmula I:
em que R é hidrogénio ou um grupo de metilo e n tem um valor de 0-19.
Em particular, o grupo -(CH2)n-CH3 pode compreender uma "estrutura" linear entre 1 e 10 átomos de carbono, que podem ser substituídos em qualquer(quaisquer) posição(posições) com um ou mais substituintes de hidrocarbonetos saturados tais como metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, 1-butilo, 2-butilo, i-butilo, etc.; de maneira a que a quantidade total de átomos de carbono no grupo -(CH2)n_CH3 esteja entre 1 e 20.
Também, e/ou alternativamente, o grupo -(CH2)n-CH3 pode compreender/conter um anel de hidrocarboneto saturado e/ou um anel de hidrocarboneto aromático, que pode por exemplo ser conectado ao grupo (met)acrilato via um (outro) resíduo de hidrocarboneto saturado, e/ou pode de novo ser substituído em qualquer(quaisquer) posição(posições) com um ou mais substituintes de hidrocarboneto saturados tais como metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, 1-butilo, 2-butilo, i-butilo, etc.; novamente desde que a quantidade total de átomos de carbono no grupo -(CH2)n-CH3 esteja entre 1 e 20.
Alguns exemplos particularmente preferidos do grupo -(CH2)n-CH3 incluem, mas não estão limitados a: - metilo - etilo 5/11 - isopropilo; - isobutilo; - benzil - isohexilo - isodecilo;
Por exemplo, a resina de (met) acrilato da fórmula I pode ser resina de metacrilato de isobutilo, metacrilato de metilo, metacrilato de etilo, metacrilato de isopropilo, metacrilato de isohexilo, metacrilato de benzilo, metacrilato, de isodocilo, assim como as suas correspondentes resinas acriladas.
Geralmente, o meio de montagem usado de acordo com a presente invenção compreenderá uma solução de uma ou mais destas resinas de (met)acrilato num solvente orgânico de mistura de solvente, de maneira a que a quantidade de resinas de (met)acrilato constituam entre 10 e 60% em peso da composição total.
Como o solvente orgânico, pode ser usado qualquer solvente adequado ou mistura de solventes, desde que estes solventes não reajam com a resina de (met)acrilato e/ou interfiram com a acção pretendida do meio de montagem. Preferencialmente, um solvente aprótico ou mistura de solventes apróticos são usados, tais como um(uns) solvente(s) aprótico (s) apoiar(es) (mistura de). Alguns exemplos adequados, mas que não limitativos de solventes adequados incluem: - hidrocarbonetos saturados, tais como (iso)parafinas lineares e/ou ramificadas C5-C20, em particular (iso) parafinas C8-Ci2, por exemplo nonanos, decanos, undecanos, dodecanos e misturas destes; e 6/11 - ditos hidrocarbonetos saturados, misturados com um ou mais álcoois Ci-6.
Numa forma particularmente preferida de realizar a invenção, o solvente orgânico ou mistura de solventes orgânicos usadas na (preparação do) meio de montagem é a mesma do(s) solvente(s) orgânico(s) a serem usados nas fases de lavagem final da lâmina. Por exemplo, num aspecto preferido da invenção, o solvente orgânico usado no meio de montagem é UltraClear®. 0 meio de montagem pode opcionalmente conter um ou mais componentes adicionais adequados tais como (iso)parafinas C8-Ci2. 0 meio de montagem pode ser simplesmente preparado misturando as resinas de (met)acrilato com a (mistura) do solvente orgânico usado nas quantidades acima indicadas, e ele normalmente ficará preparado para ser usado. 0 meio de montagem pode também ser provido/vendido como um produto ou formulação de proprietário/comercial, por exemplo embalada num recipiente adequado tal como um matrás, um frasco ou frasco conta gotas, opcionalmente etiquetado e/ou com as instruções de uso.
Preferencialmente, o meio de montagem é preparado de maneira a que ele tenha uma viscosidade final entre 2 e 6 stokes - por exemplo aproximadamente 4 stokes - a 25 °C, como medido num viscosimetro Gardner Bubble. Este instrumento está baseado no principio de que a viscosidade é directamente proporcional à velocidade da bolha.
Também, o meio de montagem é mais preferivelmente de maneira a que ele possa ser misturado com um hidrocarboneto saturado ou uma mistura de hidrocarbonetos saturados sem que resulte na sua turvação ou outros efeitos indesejados. Este pode ser facilmente verificado pelo técnico especializado, misturando por exemplo uma quantidade do meio de montagem da invenção com uma 7/11 quantidade de um hidrocarboneto saturado ou mistura de hidrocarboneto (por exemplo numa lâmina ou num frasco), de inspecção visual. 0 meio de montagem pode ser usado de maneira conhecida per se e/ou essencialmente análoga à maneira em que os meios de montagem convencional são usados, isto é como o acima descrito.
De acordo com o anterior, o meio de montagem é compatível/misturável com álcoois (álcool isopropílico, álcool benzílico), e UltraClear®. Portanto ele é muito abrangente.
Adicionalmente, o uso da invenção pode também prover uma ou mais das vantagens seguintes: - o meio de montagem da invenção pode ser preparado com vantagem para que não contenha quaisquer compostos aromáticos e por isso é menos perigoso; o meio de montagem tem propriedades de fluidez muito vantajosas, tais como uma viscosidade optimizada (aproximadamente 4 stokes). Esta facilita a montagem das lâminas; - depois da montagem da lamela de vidro, uma montagem de lâmina pode já ser examinada passada 1 hora e no dia seguinte a lamela de vidro está fixada firmemente; - depois da coloração os corantes das soluções de coloração estão ligadas ao núcleo celular e espécies de citoplasma à base de água. Neste aspecto, o meio de montagem da invenção é muito apoiar, quando comparado com os meios de montagem convencional à base de xileno/tolueno. Isto significa que a migração dos corantes desde as partes de tecido é reduzida a uma extensão muito baixa; 8/11 o solvente usado no meio de montagem da invenção tem uma volatilidade muito baixa, a qual não produz efeitos de secagem das lâminas; - o meio de montagem da invenção não engrossa quando é usado. Os meios de montagem convencionais, xileno/tolueno secam e engrossam os meios de montagem quando em uso; - o meio de montagem humedecido pode ser facilmente removido com um solvente orgânico tais como UltraClear®, enquanto que alguns meios de montagem convencionais têm de ser completamente limpa. 0 meio de montagem pode ser usado para todas as aplicações conhecidas per se para aplicações convencionais, e estes usos serão evidentes para os técnicos especializados. Por exemplo, o meio de montagem pode ser usado para essencialmente preparar as lâminas da maneira descrita supra.
Como será óbvio do anterior, o meio de montagem é particularmente adequado para a preparação de lâminas em histoquimica, imunoquimica e citoquímica, por exemplo amostras (coradas) de sangue, tecidos, células ou outros materiais biológicos para o exame com técnicas de microscopia óptica.
No entanto deverá ser salientado que a invenção não está limitada a este campo especifico, nem à preparação de lâminas para exame por microscopia óptica. Por exemplo, o meio de montagem pode também ser usado para a preparação de amostras para microscopia de fluorescência, tecnologia do tratamento de imagem; e/ou geralmente para a fixação/conservação das amostras (biológicas) em (para) um veiculo adequado.
Noutros aspectos, a invenção refere-se ainda às lâminas obtidas com o uso da invenção. 9/11 A invenção será agora ilustrada com o exemplo nao limitativo seguinte.
Exemplo:
Um meio de montagem foi preparado misturando 25 gramas de resina de metacrilato de isobutilo (vendida por Rohm GmbH com o nome PLEXIGUM® PQ 611) e 75 ml de UltraClear®. 0 meio de montagem assim obtido foi usado na preparação de uma lâmina de uma amostra corada de (células) de sangue, essencialmente de acordo com as fases descritas no quadro 1 supra. A lâmina resultante foi de excelente qualidade, não mostrando turvação ou embaciamento. Os resultados são ilustrados nas figuras 2a e 2b, em que as amostras estavam coradas com Hematoxilina/Eosina e cobertas com uma lamela com o meio de montagem (UltraKitt).
Figura 2a: A vesicula biliar normal tem uma mucosa com as células colunares revestindo as projecções ramificadas em forma de dedo vistas aqui muito ampliadas.
Figura 2b: 0 glomérulo normal do rim a alta potência, tem capilares finos e delicados.
Lisboa, 29 de Abril de 2010 10/11
Claims (14)
- REIVINDICAÇÕES 1. Uso de um meio que compreende uma solução de resina de metacrilato de isobutilo, caracterizado por pelo menos um solvente orgânico seleccionado do grupo constituído por hidrocarbonetos saturados, opcionalmente misturados com um ou mais álcoois, como um meio de montagem para preparar as lâminas de microscopia.
- 2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo menos um solvente orgânico ser uma (iso)parafina saturada linear ou ramificada C5-C2o·
- 3. Uso de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por pelo menos um solvente orgânico ser uma (iso)parafina saturada linear ou ramificada Cs-Ci2.
- 4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o solvente orgânico ser um solvente aprótico, ou uma mistura de solventes apróticos.
- 5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o solvente orgânico ser um solvente não polar aprótico ou uma mistura de solventes apróticos não polares.
- 6. Uso de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado por o solvente orgânico ser misturado com - um ou mais álcoois Ci-C6.
- 7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o solvente orgânico ser uma mistura de nonanos, decanos, undecanos, e dodecanos.
- 8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o meio essencialmente ter a composição: - resinas de metacrilato de isobutilo: entre 10 e 60% em peso; 1/3 - um ou mais solventes orgânicos: entre 40 e 90% em peso; para um total de 100% em peso da composição total.
- 9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o meio ter uma viscosidade entre aproximadamente 2 e 6 stokes - por exemplo aproximadamente 4 stokes - a 25° C, como medido num viscosimetro Gardner Bubble.
- 10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por este pelo menos compreender as fases de: a) por uma amostra a ser investigada na lâmina inferior b) opcionalmente corar a dita amostra; c) pelo menos uma fase de lavagem com água e/ou com um solvente aprótico orgânico tal como um álcool como o etanol, o álcool isopropilico, e o álcool benzílico; d) pelo menos uma fase de lavagem com um solvente orgânico aprótico ou uma mistura de solventes orgânicos apróticos; e) montar a lamela de vidro usando o dito meio de montagem.
- 11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o dito meio de montagem conter, como um ou mais solvente(s) orgânico(s), o mesmo solvente orgânico aprótico ou a mesma mistura de solventes orgânicos apróticos como os usados na fase d) .
- 12. Uso de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado por a amostra ser uma amostra biológica, tais como uma amostra 2/3 de sangue material. tecido células ou outra amostra biológica ou
- 13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 12, caracterizada por a amostra ter sido tingida.
- 14. Lâmina de microscopia de uma amostra a ser investigada, pode ser obtida com o uso de qualquer uma das reivindicaçõe 10 a 13. Lisboa, 29 de Abril de 2010 10 a que s de 3/3
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