ES2329355T3 - Composicion para la preparacion de muestras histologicas, citologicas y de autopsia. - Google Patents

Composicion para la preparacion de muestras histologicas, citologicas y de autopsia. Download PDF

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Abstract

Procedimiento para el procesamiento de una muestra histológica, citológica o de autopsia, caracterizado por tratar dicha muestra, a temperatura ambiente y presión ambiente, con una composición que comprende el 60% en volumen de octano, el 10% en volumen de alcohol isopropílico y el 30% en volumen de alcohol etílico.

Description

Composición para la preparación de muestras histológicas, citológicas y de autopsia.
Objeto de la invención
La presente invención se refiere a una composición y a su uso para la preparación de muestras histológicas, citológicas, de autopsia y similares para examen.
Estado de la técnica
Tal como se conoce, el análisis de muestras histológicas, citológicas, de autopsia y similares es de fundamental importancia en la medicina moderna, no solamente porque garantiza el diagnóstico preciso y temprano de numerosas patologías, sino también porque permite que se realicen estudios complejos que contribuyen al progreso en el sector. Naturalmente las muestras que van a analizarse deben tratarse y prepararse según protocolos precisos, con el fin de garantizar la conservación, reproducibilidad de análisis y fiabilidad óptimas de los resultados.
Actualmente, en el caso de una muestra tomada de una parte que se ha operado o de una autopsia, fijada previamente, (por ejemplo una muestra de tejido) la primera etapa en la preparación de la muestra para examen consiste en una denominada fase de procesamiento diseñada para preparar la muestra para inclusión en un medio de consistencia apropiada para conferir la rigidez necesaria para cortar por medio de cuchillas. El material de inclusión que mejor satisface hoy en día estas características es parafina, pero no puede mezclarse con la mayoría de los fijadores usados. Por esta razón, con el fin de incluir el tejido en parafina y luego cortar según los requisitos, debe someterse a diversos tratamientos, estando relacionados todos con la fase de procesamiento, que puede resumirse tal como
sigue:
-
Fase de deshidratación, en la que el agua contenida en la muestra se sustituye por reactivos anhidros.
-
Fase de clarificación, en la que el reactivo anhidro se sustituye por un componente (medio clarificante) que puede mezclarse tanto con el reactivo anhidro como con el medio de inclusión.
-
Fase de impregnación, en la que el medio clarificante se sustituye por el medio de impregnación (o medio de inclusión).
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La primera fase proporciona la eliminación de los reactivos acuosos usados en la fase inicial para fijar la muestra tan pronto como se tome la misma. Pueden usarse numerosos agentes deshidratantes, pero preferiblemente se usa alcohol etílico en concentraciones crecientes, es decir, la muestra se trata en primer lugar con alcohol etílico al 70%, luego con alcohol etílico al 95% y luego de nuevo al 100%. Puesto que los agentes deshidratantes más comúnmente usados no son solubles en parafina (el medio en el que debe incluirse la muestra), deben sustituirse por un componente que sea soluble tanto en el agente deshidratante como en el agente impregnante. En esta fase se usa comúnmente xileno (o xilol, dimetilbenceno) que es un hidrocarburo aromático que consiste en una mezcla de orto, meta y para isómeros, en forma de líquido inflamable, muy volátil y de manera potencial altamente tóxico. La toxicidad potencial del xileno es un problema constante para los usuarios. El efecto específico en el sistema nervioso central se manifiesta inicialmente por nauseas y problemas gastrointestinales y, si la intoxicación persiste, mareo, estupor y vómitos. La inhalación provoca irritación de las membranas mucosas respiratorias y probable edema pulmonar. En el caso de exposición crónica, se han observado alteraciones en el sistema nervioso central, la fórmula leucocítica, funciones cardiacas y, sobretodo, se ha observado una carcinogenicidad potencial. De nuevo según la técnica conocida, la fase de procesamiento va seguida generalmente por una fase de inclusión en parafina, una fase de corte y una fase de tinción. La última proporciona la eliminación de la parafina (que se ha usado solamente como soporte para el corte) mediante tratamiento con xileno, una fase de rehidratación con alcoholes en títulos variables (100%, 95%, 70%), tinción de la muestra, otra etapa de deshidratación (70%, 95%, 100%) y, por último, tratamiento adicional con xileno para eliminar el agente deshidratante.
También en el caso de análisis de muestras citológicas, en el que la inclusión en parafina no está prevista o es necesaria, se requiere el uso repetido de xileno puesto que, también en estos casos, la muestra experimenta numerosas fases de hidratación y deshidratación. Por tanto es evidente que el uso repetido de xileno dentro de una secuencia para la preparación de muestras histológicas y/o de autopsia para examen implica un cierto riesgo para el operario, también en los casos en los que la mayoría de las secuencias se realiza mediante un sistema automatizado.
Se han llevado a cabo numerosos estudios para encontrar alternativas para el xileno.
El documento EP 1195594 describe un método de montaje para muestras para análisis en microscopio que comprende una disolución de al menos una resina de metacrilato en un disolvente orgánico. El disolvente orgánico puede elegirse ventajosamente de hidrocarburos saturados, si necesario mezclados con uno o más alcoholes. El medio de tratamiento se usa en particular para la aplicación en recubrimientos sobre portaobjetos para análisis en microscopio y para mejorar la conservación de material almacenado en los archivos. El documento EP 0822403 describe un procedimiento para el procesamiento de tejidos orgánicos para análisis, que proporciona la deshidratación y la clarificación de la muestra realizadas simultáneamente usando una mezcla que consiste en un agente deshidratante y un agente de clarificación. Según la descripción, el agente deshidratante puede ser una mezcla de etanol e isopropanol, por ejemplo, mientras que el agente clarificante puede ser un hidrocarburo alifático, tal como octano. Las fases de deshidratación y de clarificación simultáneas de la muestra se realizan bajo presión, por ejemplo de 300-500 mbar, y a una temperatura de entre 70ºC y 90ºC. El documento EP 0822403 describe también el uso de un dispositivo de microondas para realizar las fases indicadas anteriormente en las condiciones de presión y temperatura apropiadas. También describe un equipo para realizar dicho procedimiento que comprende un dispositivo de calentamiento por microondas.
Según la invención a la que se ha hecho referencia, el calentamiento de la muestra que va a analizarse a las temperaturas especificadas durante las fases de deshidratación y de clarificación simultáneas es suficiente para generar una presión que proporciona un buen resultado al final del ciclo de tratamiento. Es evidente, sin embargo, que el calentamiento de la muestra no debe realizarse a temperaturas superiores a las indicadas, de otro modo la muestra se secará y sus células se destruirán; asimismo, por la misma razón, no debe realizarse a presiones que son demasiado altas. Por otra parte, temperaturas y presión por debajo de los valores indicados no permiten un procesamiento eficaz de las muestras y dan resultados no satisfactorios, con muestras que son difíciles de analizar y resultados poco fiables. Además del uso de un equipo de microondas específico, esencial para el éxito de la fase de procesamiento, el procedimiento tal como se describe en el documento EP 0822403 requiere por tanto que el operario preste particular atención a las condiciones de presión y temperatura en las que se realizan las operaciones y el tratamiento de la muestra.
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Objetivo de la invención
El objetivo de la presente invención es hacer disponible una composición para la preparación de muestras histológicas, citológicas, de autopsia y similares que no sea carcinogénica, que tenga un bajo nivel de toxicidad y que sea rápida y fácil de implementar. Otro objetivo de esta invención es hacer disponible una composición para la preparación de muestras histológicas, citológicas, de autopsia y similares que elimine numerosas etapas que eran obligatorias hasta ahora en la preparación de la muestra para examen, que no implique el uso de ningún equipo adicional con respecto al método tradicional y que, en algunos casos, también permita ahorrar en tiempo de preparación. Un objetivo adicional de la presente invención es hacer disponible una composición para la preparación de muestras histológicas, citológicas, de autopsia y similares que sustituya los diversos reactivos con un riesgo reducido de confusión y por tanto error por parte del operario, y que no implique ninguna fase de calentamiento o tratamiento de la muestra con equipo adicional en las fases de deshidratación y clarificación. Otro objetivo de la presente invención es hacer disponible un método para la preparación de muestras histológicas, citológicas y de autopsia para examen que sea rápido, eficaz y fiable, que no implique riesgos para los operarios y que garantice la conservación óptima de la muestra con la consiguiente reproducibilidad y fiabilidad de los resultados que derivan del examen de la muestra.
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Descripción
Estos y otros objetivos y ventajas relacionadas que se ilustrarán mejor mediante la siguiente descripción se logran mediante una composición para la preparación de muestras histológicas, citológicas, de autopsia y similares para examen que comprende el 60% en volumen de octano, el 10% en volumen de alcohol isopropílico y el 30% en volumen de alcohol etílico. Se pretende que el porcentaje global de los componentes se refiera al 100 considerando el total de la composición. En este caso, la composición permite la deshidratación y clarificación de la muestra que va analizarse sin requerir el uso de ningún equipo adicional y sin tener que aplicar a la muestra tratada tal como anteriormente condiciones de temperatura y/o presión particulares. De hecho, a las concentraciones anteriores, la composición según la invención puede usarse a temperatura y presión ambientes y proporciona muestras perfectamente tratables con la consiguiente alta fiabilidad de resultados y considerable conveniencia y simplicidad de uso. Puesto que no se prevé equipo adicional, las fases son fáciles de implementar e incluso un operario no experto pude realizar fácilmente y con éxito el procesamiento de la muestra para análisis.
Un procedimiento para la preparación de la composición según la invención proporciona el mezclado de los componentes hasta de que combinen totalmente.
La composición anterior según la presente invención se usa ventajosamente en la preparación de muestras histológicas, citológicas, de autopsia y similares en vez de alcohol etílico en diversos títulos y xileno que, tal como ya se ha dicho, es altamente tóxico y potencialmente carcinogénico. Los componentes de la composición según la invención no son altamente tóxicos y no existen indicaciones de supuesta carcinogenicidad. En la práctica, por ejemplo en el caso de preparación de una muestra de autopsia y/o histológica, puede usarse la composición según la invención en vez de la secuencia de alcohol etílico en diversos títulos y también en lugar del xileno en todas las fases de preparación de la muestra y es posible realizar la fase de deshidratación y clarificación usando solamente la composición. Además, tal como ya se ha dicho, el uso de la composición según la presente invención no requiere el uso de equipo adicional o condiciones de temperatura y/o presión particulares. Las fases de deshidratación y clarificación se realizan a presión y temperatura ambientes sin ser necesario ningún tratamiento adicional y por tanto pueden realizarse fácilmente en cualquier entorno de trabajo y por operarios que no son particularmente expertos. Además, puesto que no es necesaria la aplicación de temperaturas y presiones particulares, se reduce el riesgo de error y el resultado es más
fiable.
De nuevo según la presente invención debe destacarse que el alcohol isopropílico es un componente esencial de la composición objeto de la invención.
En particular para la fase de procesamiento, a partir de las siguientes tablas que se refieren al procesamiento de las denominadas muestras "grandes", es posible destacar las ventajas obtenidas del uso de la composición según la presente invención.
En las tablas facilitadas a continuación, se usó una composición indicada como composición A.
La composición A puede obtenerse mezclando los componentes indicados anteriormente. Cuando se haga referencia a la composición A en los siguientes ejemplos, pretenderá decirse cualquier composición posible obtenida según la invención, mezclando los componentes tal como se indicó anteriormente.
Con referencia a las tablas adjuntas, la tabla 1 muestra el procedimiento comúnmente adoptado para el procesamiento de una muestra según la técnica conocida, mientras que la tabla 2 muestra el mismo procedimiento usando la composición A y la tabla 2A muestra una variación del procedimiento, de nuevo según la presente invención.
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TABLA 1
1
TABLA 2
2 
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TABLA 2A
3 
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Tal como puede verse, aunque el tiempo global necesario para la preparación de las muestras no haya cambiado, las etapas en las diversas disoluciones de alcohol a diferentes concentraciones y las etapas posteriores en xileno se han sustituido por etapas en la composición A solamente. Alternativamente, el protocolo de procesamiento según la presente invención proporciona una etapa inicial muy rápida que implica el lavado de la muestra, antes de la deshidratación y clarificación, en un reactivo intermedio que recoge la formalina en exceso que queda de la fase de fijación de la muestra, de la que todavía pueden estar presentes trazas en la muestra. Según la invención, dicho reactivo intermedio es alcohol etílico al 95%.
Por tanto, la composición según esta invención permite la deshidratación y clarificación con un único componente, a temperaturas y presión ambientes. De esta manera la fase de procesamiento puede realizarse en menos etapas usando una sustancia no tóxica y no carcinogénica, a diferencia de xileno que es necesario en el procedimiento según la técnica conocida. Además no es necesario realizar las operaciones de deshidratación y clarificación a altas temperaturas y/o presiones o, al menos, a temperaturas y/o presiones diferentes de los valores ambientes y por tanto no es necesario usar un equipo adicional.
De nuevo con referencia al procedimiento para la preparación de muestras histológicas y de autopsia para examen, tal como ya se ha dicho, la muestra debe incluirse en un soporte que permita que se corte en secciones adecuadas para examen. El medio de inclusión más comúnmente usado es parafina, tanto porque es barata como porque puede manipularse fácilmente y pueden obtenerse secciones de tejido muy finas.
Las etapas posteriores que consisten en inclusión de la muestra en parafina, el corte en la sección requerida, la eliminación de la parafina de soporte y el procedimiento la para tinción de la muestra que va analizarse se describen a continuación. También para estas fases posteriores, el uso de la composición según la invención es fundamental en la sustitución de las etapas que implican el tratamiento de la muestra con alcohol en diversos títulos y con xileno.
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- Inclusión
Una vez se han procesado las muestras que van examinarse, se incluyen en bloques de parafina con punto de fusión de 56-58ºC por medio de moldes de acero.
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- Corte
Se cortan las secciones usando micrótomos para obtener secciones de 3-5 \mum de grosor. Estos cortes de tejido se recogen con cepillos y se colocan en un baño que contiene agua a 35ºC para permitirles que se expandan.
Posteriormente, se recogen las secciones en portaobjetos.
Se deja que los últimos se sequen en una estufa durante tiempos variables y a temperaturas variables dependiendo del protocolo de tinción aplicado posteriormente.
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- Fase de eliminación de parafina
Para una sección de tejido que va teñirse, la capa de parafina que incluye debe eliminarse para permitir que los diferentes reactivos actúen directamente sobre el tejido.
Por esta razón se adopta el protocolo a continuación; la tabla 3 muestra el procedimiento comúnmente seguido según la técnica conocida, la tabla 4 muestra el procedimiento que usa la composición A según la invención y la tabla 4A muestra un variación del procedimiento según la invención.
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TABLA 3
4 
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Sustituyendo el tratamiento con alcohol y xileno, la composición según la invención permite la eliminación de la parafina en dos etapas solamente:
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TABLA 4
5 
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TABLA 4A
7 
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En esta variación, se elimina la parafina en tres etapas solamente, una de cuales
-
la etapa de reactivo intermedio - es rápida y simple.
-
Diafanización
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Tras realizar cualquier protocolo de tinción, la sección debe deshidratarse de nuevo para la aplicación de recubrimiento por medio de un medio de montaje resinoso. Esto garantiza una vida más larga de la sección conservada.
Para realizar esta etapa adicional se aplica normalmente el protocolo a continuación, que muestra el procedimiento según la técnica conocida, en comparación con las fases mostradas en la tabla 6 en el que se usa la composición A según la presente invención.
TABLA 5
8 
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Sustituyendo los alcoholes y xileno, la composición según la presente invención permite también la realización de la fase de diafanización en dos etapas solamente:
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TABLA 6
9 
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Además de lo anterior, también puede usarse la composición según la invención en cualquier protocolo de tinción histológica que requiera etapas intermedias en alcoholes a diferentes porcentajes junto a cualquier tratamiento con xileno, en tiempos que mantienen la misma duración de etapa pero que garantizan una clara mejora con respecto al aspecto manual del método y la facilidad de ejecución.
Las tablas 7, 8 y 8A muestran los métodos de tinción con hematoxilina/eosina según la técnica conocida y usando la composición según la presente invención, en dos diferentes variaciones.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 7
11
TABLA 8
12 
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TABLA 8A
13
En este caso, además de las ventajas ya descritas, también se ahorra un tiempo considerable cuando se realiza el procedimiento usando la composición según la invención. Además, según la variación mostrada en la tabla 8A, el lavado breve en reactivo intermedio evita cualquier exceso de tinción.
- Muestras citológicas
Puede emplearse ventajosamente la composición según la invención también en la preparación de muestras citológicas, fijadas en alcohol y éter por ejemplo y no incluidas en parafina u otros agentes de inclusión, tales como orina, citologías vaginales, esputo y otros líquidos u otros tipos de muestras.
La composición según la invención sustituye:
1.
Todos los procedimientos de lavado en alcohol a diferentes concentraciones, mientras que mantiene el mismo tiempo de lavado global o lo reduce si es necesario, tal como se requiere.
2.
El procedimiento de diafanización final.
Las tablas 9, 10 y 10A muestran ejemplos de tinción con PAPANICOLAOU según la técnica conocida y usando la composición según la presente invención, en dos posibles variaciones.
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TABLA 9
14
TABLA 10
15 
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TABLA 10A
16
También en este caso, puede eliminarse cualquier exceso de tinción mediante lavado rápido en el reactivo intermedio.
En este caso, incluso si no existe ahorro de tiempo significativo, el ahorro en cuanto a menos etapas realizadas y menos reactivos usados es obvio.
En todos los casos anteriores que se dan como ejemplo en las tablas, la expresión "reactivo intermedio" se refiere a alcohol etílico al 95%.
Tal como ya se ha dicho anteriormente, la composición según la presente invención permite la preparación de muestras histológicas, citológicas y de autopsia sin las etapas de xileno y alcohol, evitando así el uso repetido de diferentes reactivos en momentos diferentes y según secuencias fijadas. Es obvio que cuando el operario está obligado a usar muchos reactivos diferentes según un orden preestablecido, puede confundirse fácilmente y puede cometer errores que afecten al resultado final del análisis.
La composición según la presente invención también permite la reducción de los tiempos de eliminación de parafina en la etapa correspondiente, gracias a la considerable afinidad entre la propia composición, la parafina y los otros reactivos usados.
La misma composición no altera las características morfológicas ni la expresión antigénica del tejido al que confieres luminosidad.
Tal como ya se ha dicho, el uso de la composición según la presente invención permite que las fases descritas se realicen a temperatura y presión ambientes y por tanto no requiere un equipo particular ni procedimientos adicionales.
Si se realiza la preparación en una muestra adecuada, puede recuperarse la composición usada y que deriva de las diversas fases del procedimiento y, tras la purificación adecuada, reutilizarse si es necesario. Naturalmente, cualquier reciclado tras la purificación debe ser compatible con el tipo de contaminación potencial de la composición, lo que depende principalmente de las patologías encontradas en los sujetos de los que se toma la muestra, habiéndose preparado dicha muestra y puesto en contacto con la composición según la invención.

Claims (6)

1. Procedimiento para el procesamiento de una muestra histológica, citológica o de autopsia, caracterizado por tratar dicha muestra, a temperatura ambiente y presión ambiente, con una composición que comprende el 60% en volumen de octano, el 10% en volumen de alcohol isopropílico y el 30% en volumen de alcohol etílico.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se lleva a cabo un lavado de la muestra con un reactivo intermedio antes del procesamiento de dicha muestra con dicha composición.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho reactivo intermedio es alcohol etílico al 95%.
4. Composición que comprende el 60% en volumen de octano, el 10% en volumen de alcohol isopropílico y el 30% en volumen de alcohol etílico.
5. Composición según la reivindicación 4, para su uso en el procesamiento de una muestra histológica, citológica o de autopsia.
6. Uso de una composición según la reivindicación 4 para el procesamiento de una muestra histológica, citológica o de autopsia.
ES03730390T 2002-05-28 2003-05-27 Composicion para la preparacion de muestras histologicas, citologicas y de autopsia. Expired - Lifetime ES2329355T3 (es)

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