IT202000025159A1 - Composizione per il trattamento di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici. - Google Patents
Composizione per il trattamento di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici. Download PDFInfo
- Publication number
- IT202000025159A1 IT202000025159A1 IT102020000025159A IT202000025159A IT202000025159A1 IT 202000025159 A1 IT202000025159 A1 IT 202000025159A1 IT 102020000025159 A IT102020000025159 A IT 102020000025159A IT 202000025159 A IT202000025159 A IT 202000025159A IT 202000025159 A1 IT202000025159 A1 IT 202000025159A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- composition
- paraffin
- samples
- treatment
- histological
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 85
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 42
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 title claims description 15
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 54
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 47
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 31
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 claims description 24
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 claims description 24
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 claims description 21
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims description 21
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 21
- 238000005352 clarification Methods 0.000 claims description 18
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 11
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 claims description 11
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 claims description 10
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- HEWZVZIVELJPQZ-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethoxypropane Chemical compound COC(C)(C)OC HEWZVZIVELJPQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 22
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 11
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 5
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-XJKSGUPXSA-N (+)-haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2C[C@]2(O)[C@H]1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-XJKSGUPXSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 235000013871 bee wax Nutrition 0.000 description 1
- 239000012166 beeswax Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012303 cytoplasmic staining Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
DESCRIZIONE dell?invenzione avente per titolo:
?Composizione per il trattamento di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici?
Riassunto dell?invenzione
La presente invenzione si riferisce ad una composizione per il trattamento di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici, in particolare ad una composizione in grado di accorpare i reagenti per i trattamenti di disidratazione, chiarificazione ed infiltrazione in paraffina del campione, ed al suo uso nella preparazione di campioni da analizzare.
Contesto tecnico
La diagnosi anatomo-patologica ? il risultato dell?interpretazione da parte dell?anatomopatologo delle caratteristiche morfologiche, macroscopiche e microscopiche, del campione biologico in esame.
Per fornire una diagnosi accurata e completa, il campione escisso dal paziente deve essere sottoposto ad una serie di trattamenti che hanno lo scopo di assicurare la sua conservazione nel tempo. Tali trattamenti prevedono sostanzialmente:
i. fissazione;
ii. disidratazione;
iii. chiarificazione; e
iv. infiltrazione in paraffina.
Il primo stadio di tali processi consiste nella fissazione del campione in una soluzione di
?
formalina neutra tamponata al 10%, che ? in grado di minimizzare i fenomeni di degradazione causati dalla rimozione del tessuto dal proprio ambiente vitale e dall?eventuale presenza di microrganismi.
Dopo la fissazione, il campione viene di norma disidratato mediante svariati passaggi successivi con soluzioni etanoliche a concentrazione crescente, fino ad etanolo al 99% e successivamente chiarificato con xilene. Questi passaggi hanno lo scopo di rimuovere l?acqua dal campione per permettere la sua successiva infiltrazione con paraffina, che ? una sostanza idrofoba.
L?infiltrazione in paraffina finale ? necessaria per rendere il campione sufficientemente solido da potere essere tagliato in sezioni micrometriche, per essere successivamente colorato e analizzato.
I vari passaggi del trattamento di disidratazione (con soluzioni etanoliche) hanno lo scopo di sostituire l?acqua all?interno del tessuto con soluzioni ad idrofobicit? crescente per rendere possibile la penetrazione della paraffina che ? una sostanza del tutto idrofoba. Generalmente, dopo la fissazione in formalina, un protocollo di trattamento di disidratazione e chiarificazione prevede di sottoporre il campione ai seguenti passaggi:
- trattamento con alcol 70%;
- trattamento con alcol 90%;
- trattamento con alcol 99% (tre volte); e
- trattamento chiarificante con xilene (tre volte).
Dopo il passaggio di chiarificazione con xilene, che ? in grado di rimuovere l?alcol e aumentare nettamente la compatibilit? con la paraffina, in termini di idrofobicit?, il tessuto viene infiltrato, generalmente mediante tre bagni consecutivi di paraffina fusa alla temperatura di circa 60?C. Il triplice passaggio consente di ottenere un tessuto infiltrato privo di xilene, che viene rilasciato dal campione soprattutto nel primo bagno di paraffina.
?
Dopo l?infiltrazione in paraffina, il campione pu? essere incluso in un blocchetto di paraffina e tagliato al microtomo.
Le paraffine presenti in commercio sono miscele di idrocarburi perlopi? lineari con un numero di atomi di carbonio C20-C55. Se ne distinguono due categorie in relazione alla finalit? d?uso: paraffina per infiltrazione e paraffina per inclusione.
La paraffina utilizzata per l?infiltrazione del tessuto, cio? nell?ultimo trattamento sopraindicato, pu? essere una paraffina con punto di fusione minore rispetto alla paraffina utilizzata per l?inclusione in blocchetto (52-54?C vs 56-58?C), poich? costituita da catene idrocarburiche con un numero minore di atomi di carbonio. Questa caratteristica conferisce minore viscosit? al prodotto e quindi una maggiore velocit? di penetrazione all?interno del tessuto. Attualmente esistono in commercio paraffine per infiltrazione che differiscono per la lunghezza delle catene idrocarburiche o per la presenza di piccole percentuali di cere aggiuntive (come la microcristallina o la cera d?api) che riducono le dimensioni dei cristalli che si formano durante il raffreddamento. Negli ultimi anni in alcune formulazioni ? stata aggiunta una percentuale intorno al 2% di dimetilsolfossido (DMSO) per incrementare maggiormente l?efficienza di penetrazione nel tessuto, il DMSO, infatti, viene ampiamente utilizzato come solvente in tossicologia e farmacologia, per aumentare la penetrazione di principi attivi all?interno delle membrane cellulari.
I trattamenti (ii), (iii) e (iv) sopra riportati richiedono notevole tempo ed energia, oltre all?impiego di grandi quantit? di solventi.
Un comune protocollo prevede infatti l?utilizzo di 4-5 litri di solvente per ogni singolo passaggio. Si noti che per le seguenti lavorazioni:
- trattamento con alcol 70%; (disidratazione)
- trattamento con alcol 90%; (disidratazione)
?
- trattamento con alcol 99% (tre volte); (disidratazione)
- trattamento chiarificante con xilene (tre volte); e
- trattamento di infiltrazione in paraffina (tre volte).
vengono impiegati complessivamente circa 40-45 litri di solventi (alcol e xilene) ogni circa 1000 campioni, oltre alla paraffina che viene utilizzata per l?infiltrazione, in un procedimento che dura circa 14 ore.
WO03/100384, EP822403 e WO2013/144986 descrivono delle composizioni che permettono la realizzazione delle fasi di disidratazione e chiarificazione simultaneamente. Tuttavia, la processazione dei campioni con dette composizioni richiede tempi lunghi e successivamente il campione deve essere sottoposto ad un passaggio di infiltrazione in paraffina. Inoltre EP822403 richiede l?impiego di microonde per effettuare il trattamento, oltre che temperature e pressioni elevate. Tali condizioni possono danneggiare i campioni da esaminare.
Esiste la necessit? di disporre di nuovi reagenti innovativi che permettano di risparmiare tempo e solventi, rendendo cos? pi? rapido, economico ed ecologico il trattamento dei campioni da analizzare.
Scopi dell?invenzione
? uno scopo dell?invenzione fornire una composizione per la preparazione di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici per la loro analisi, che riduce i tempi e i costi dei trattamenti dei detti campioni e richiede l?impiego di pochi passaggi e reagenti.
? un altro scopo dell?invenzione fornire l?uso della detta composizione per la preparazione di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici per la loro analisi, ed un metodo per la preparazione dei detti campioni.
? un ulteriore scopo fornire una composizione come reagente unico per la realizzazione della simultanea disidratazione, chiarificazione ed infiltrazione di campioni biologici, citologici,
?
istologici e autoptici.
? infine un ulteriore scopo dell?invenzione fornire metodi e procedimenti che impiegano la detta composizione.
Breve descrizione delle Figure
La Figura 1 mostra dei campioni trattati secondo l?Esempio 1 dell?invenzione.
La Figura 2 mostra un confronto tra la composizione dell?invenzione, a sinistra, e la composizione di EP802403, a destra (Esempio 7).
La Figura 3 mostra la processazione di campioni nelle due fasi (superiore ed inferiore) della composizione di EP802403 (Esempio 7).
La Figura 4 mostra a sinistra un campione processato nella fase inferiore della composizione di EP802403 e a destra il campione processato nella fase superiore (Esempio 7).
La Figura 5 mostra il campione della Figura 4, sulla sinistra, dopo 2 e 7 giorni dall'inclusione (Esempio 7). Il campione si presenta subito non omogeneamente infiltrato in paraffina, tanto che dopo una sola settimana dall?inclusione fuoriesce dalla sua sede nel blocchetto.
La Figura 6 mostra un campione di polmone processato secondo l?invenzione, sinistra, e secondo EP802403, destra, dopo la colorazione standard con ematossilina/eosina (Esempio 7). La Figura 7 mostra un campione di fegato processato secondo l?invenzione, sinistra, e secondo EP802403, destra, dopo la colorazione standard con ematossilina/eosina (Esempio 7).
Descrizione dell?invenzione
Secondo uno dei suoi aspetti, l?invenzione ha per oggetto l?uso di una composizione che comprende paraffina, almeno un alcol e almeno un idrocarburo scelto tra nafta e ottano, per la preparazione di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici per la loro analisi.
Pi? in particolare, l?invenzione ha per oggetto l?uso della detta composizione come reagente per la realizzazione simultanea dei trattamenti di disidratazione, di chiarificazione e di
?
infiltrazione in paraffina, in un solo passaggio.
Per ?paraffina? si intende qui indicare la paraffina per analisi, preferibilmente per analisi istologiche, preferibilmente avente un punto di fusione di 56-58?C.
Secondo l?invenzione, l?almeno un alcol ? scelto tra gli alcoli C1-C4, lineari o ramificati, preferibilmente scelti tra l?alcol etilico e l?alcol isopropilico. Secondo una forma di realizzazione preferita, la composizione comprende una miscela di alcol etilico e alcol isopropilico, pi? preferibilmente una miscela di alcol isopropilico/alcol etilico in un rapporto in volume rispettivamente che va da 2-4/1 a 1/2-4, vantaggiosamente di circa 3/1 o 1/3.
Per ?nafta? si intende qui indicare una miscela di idrocarburi derivanti da una frazione del petrolio priva di idrocarburi aromatici e prevalentemente composta da molecole aventi da 4 a 11, principalmente da 7 a 9 atomi di carbonio. Secondo una forma di realizzazione preferita, la nafta ? la ?Naphtha hydrotreated light?, avente il numero di Chemical Abstracts 64742-49-0.
Secondo una forma di realizzazione preferita, almeno un idrocarburo ? la nafta, come sopra definita.
Salvo diversamente specificato, tutte le percentuali ed i rapporti qui descritti sono espressi in volume.
Secondo una forma di realizzazione, la composizione pu? anche comprendere 2,2-dimetossipropano.
Secondo un altro dei suoi aspetti, la presente invenzione ha per oggetto una composizione che comprende, o in subordine consiste in, paraffina, almeno un alcol, almeno un idrocarburo, come sopra definiti, ed eventualmente 2,2-dimetossipropano.
Secondo una forma di realizzazione preferita, la composizione dell?invenzione comprende, o subordine consiste in:
- paraffina (come sopra definita): 40-60%, preferibilmente circa 50%;
?
- alcol etilico alcol isopropilico: 15-25%, preferibilmente circa 20%; e - almeno un idrocarburo (come sopra definito): 25-40%, preferibilmente circa 30%, detto idrocarburo essendo pi? preferibilmente nafta; e
- eventualmente uno o pi? componenti ulteriori, in ragione di 0-15%, preferibilmente 0-5%;
dette % essendo espresse in volume rispetto al volume totale della composizione.
Le forme di realizzazione preferite sopra menzionate si applicano anche alla composizione dell?invenzione.
Secondo una forma di realizzazione preferita, la composizione dell?invenzione comprende o in subordine consiste in il 50% di paraffina, il 5% di alcol etilico, il 15% di alcol isopropilico e il 30% di nafta o ottano, preferibilmente nafta.
Secondo una forma di realizzazione preferita, la composizione dell?invenzione comprende o in subordine consiste in il 43-50%, preferibilmente circa 45-50% di paraffina, il 15% di alcol etilico, il 5% di alcol isopropilico, il 30% di nafta o ottano, preferibilmente nafta e eventualmente uno o pi? componenti ulteriori, in ragione di 0-15%, preferibilmente 0-5%. Come detto, la composizione dell?invenzione ? sostanzialmente composta dai componenti sopra menzionati. Tuttavia, piccole quantit? di ulteriori componenti possono essere presenti. A titolo di esempio, quando presente, il 2,2-dimetossipropano ? aggiunto alla composizione in quantit? pari all?1-15% in volume, rispetto al volume totale della composizione. ? inoltre possibile, e preferito, aggiungere una quantit? catalitica di acido cloridrico concentrato (HCl 37%), in ragione di 1/1000 v/v rispetto al volume del dimetossipropano.
Tutti i componenti della composizione sono noti e commercialmente disponibili.
Per la preparazione della composizione, si opera come segue: la paraffina solida viene trasferita in una tanica di opportuno volume, a cui viene fornito calore mediante fascia riscaldante o altro
?
sistema di riscaldamento. La paraffina viene lasciata alla temperatura di 60-65?C fino ad ottenere una soluzione liquida omogenea. Vengono quindi aggiunti nella tanica i componenti liquidi, senza ordine particolare. La tanica impiegata ? un sistema chiuso, ? dotata di un foro principale a chiusura ermetica per l?introduzione della paraffina e un setto con valvola di non ritorno per l?introduzione degli ingredienti liquidi. La tanica ? equipaggiata, inoltre, con un refrigerante a ricadere, che ha il compito di condensare i vapori degli ingredienti bassobollenti facendoli ricadere sottoforma di gocce liquide all?interno della tanica stessa (il sistema a ricadere ? necessario per evitare sovrapressioni all?interno della tanica e la perdita di solvente sottoforma di vapore, inficiando la sua composizione). Dopo aver aggiunto i componenti liquidi, la miscela viene lasciata sotto agitazione alla temperatura di 60-65?C per il tempo sufficiente a rendere omogenea la soluzione (liquida); viene quindi inflaconata, ancora calda, in taniche di varia forma o volume, in cui raffredda.
La composizione dell?invenzione si presenta come un solido bianco alla temperatura e pressione ambiente. Questa sua caratteristica rende inoltre la composizione dell?invenzione maneggevole, trasportabile e stoccabile almeno al pari degli svariati reagenti necessari per la disidratazione e la chiarificazione, che sono tutti costituiti da solventi liquidi. Un ulteriore importante vantaggio ? il rispetto della salute dell?operatore, per il quale vengono drasticamente ridotti i rischi di sversamento e non sono necessari spostamenti dei reagenti dalle taniche contenenti i reagenti liquidi.
Per il suo utilizzo, la composizione viene portata allo stato liquido per semplice riscaldamento, ad esempio a circa 60?C. I campioni vengono quindi trattati secondo l?invenzione, dove per ?trattare? si intende immergere il campione nella composizione, preferibilmente per circa 1-3 ore.
Con la composizione dell?invenzione ? anche molto versatile e si presta alla processazione
?
secondo varie modalit?. Infatti la composizione dell?invenzione ? in grado di processare i campioni sia in modalit? statica sia dinamica (agitazione della soluzione, perfusione, ecc.). ? possibile ripetere il bagno, se necessario.
Come detto, la composizione qui descritta permette di realizzare simultaneamente i trattamenti di disidratazione, chiarificazione ed infiltrazione in paraffina, inglobando pertanto in un?unica lavorazione i trattamenti (ii), (iii) e (iv) che comportano convenzionalmente svariati passaggi in solventi ed in paraffina, come spiegato nel ?Contesto dell?invenzione?.
Infatti, in modo sorprendente, la formulazione dell?invenzione permette di processare i campioni eseguendo contemporaneamente tutti gli step ?tradizionali? di disidratazione, chiarificazione ed infiltrazione in paraffina, con un singolo passaggio. Pi? in particolare, a differenza delle formulazioni note sopra riportate, non ? necessario neppure effettuare in modo separato i passaggi di infiltrazione in paraffina. Secondo l?invenzione il campione pertanto effettua un solo passaggio nella formulazione dell?invenzione, per un tempo compreso tra 1 e 3 ore a seconda delle dimensioni del campione, a pressione ambiente ed alla temperatura di circa 60-65?C.
Nella pratica, dopo un eventuale primo lavaggio opzionale del campione, previamente fissato con formalina, con soluzione idroalcolica (al 50% o al 70%), la composizione dell?invenzione disidrata, chiarifica ed infiltra il campione in un unico passaggio seguito da un opzionale passaggio di asciugatura prima dell?inclusione in blocchetto di paraffina.
Alla fine del detto passaggio, il campione risulta ben disidratato ed infiltrato, pronto per proseguire la routine standard della diagnosi istologica (inclusione in blocchetto di paraffina, taglio di sezioni al microtomo, colorazione delle sezioni, montaggio, analisi al microscopio). La composizione dell?invenzione permette quindi di ottenere dei campioni correttamente processati in sole 3 ore, con un risparmio significativo di solventi e reagenti.
?
Secondo un altro dei suoi aspetti, l?invenzione ha per oggetto l?uso della composizione dell?invenzione come reagente per effettuare la disidratazione, la chiarificazione e l?infiltrazione in paraffina dei campioni come qui definiti, in un unico trattamento.
Secondo un altro dei suoi aspetti, l?invenzione ha per oggetto un metodo per il trattamento di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici, in particolare per i trattamenti di disidratazione, chiarificazione ed infiltrazione in paraffina, che comprende l?impiego di una composizione come qui descritta.
Secondo un altro dei suoi aspetti, l?invenzione ha per oggetto un metodo per il trattamento di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici, in particolare per i trattamenti di disidratazione, chiarificazione ed infiltrazione in paraffina, che comprende trattare detti campioni con una composizione come qui descritta.
Secondo un altro dei suoi aspetti, l?invenzione ha per oggetto un procedimento per il trattamento di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici previamente sottoposti a fissazione con formalina, in particolare per i trattamenti di disidratazione, chiarificazione ed infiltrazione in paraffina, che comprende:
1. scaldare a circa 60-65?C la composizione dell?invenzione;
2. trattare i detti campioni con una composizione secondo l?invenzione.
La Tabella che segue riporta il confronto tra il trattamento dei campioni secondo le metodologie e con le composizioni note ed il trattamento con il metodo e la composizione dell?invenzione:
? immediatamente evidente dalla Tabella sopra riportata che il trattamento che impiega la composizione dell?invenzione comporta numerosi vantaggi in termini di tempi, energia, solventi e permette di realizzare cos? un trattamento dei campioni pi? ecologico.
L?invenzione sar? ora descritta a mezzo dei seguenti esempi, qui riportati a titolo meramente illustrativo ed in alcun modo limitativo.
Sezione Sperimentale
Esempio 1
Composizione secondo l?invenzione
Si prepara una composizione che consiste in (% in volume):
50% di paraffina
?
5% di alcol etilico
15% di alcol isopropilico e
30% di nafta.
Esempio 2
Composizione secondo l?invenzione
Si prepara una composizione che consiste in (% in volume):
50% di paraffina
5% di alcol etilico
15% di alcol isopropilico e
30% di ottano.
Esempio 3
Composizione secondo l?invenzione
Si prepara una composizione che consiste in (% in volume):
40% di paraffina
5% di alcol etilico
15% di alcol isopropilico e
40% di ottano o nafta.
Esempio 4
Composizione secondo l?invenzione
Si prepara una composizione che consiste in (% in volume):
50% di paraffina
15% di alcol etilico
5% di alcol isopropilico e
30% di ottano.
?
Esempio 5
Composizione secondo l?invenzione
Si prepara una composizione che consiste in (% in volume):
44,995% di paraffina
15% di alcol etilico
5% di alcol isopropilico
30% di ottano o nafta
5% di 2,2-dimetossipropano e
0,005% di HCl concentrato (HCl 37%).
Esempio 6
Trattamento di campioni di rene e fegato
I campioni da testare di 1,5 x 1,5 cm (2 mm di spessore) sono posti in un bagno nella composizione dell?Esempio 1, per un tempo di 2 ore a pressione ambiente alla temperatura di 60-65?C. La Figura 1 mostra il risultato del trattamento dopo inclusione, taglio e colorazione standard con ematossilina/eosina.
Esempio 7 (Esempio comparativo)
Confronto tra il trattamento di campioni secondo l?invenzione e secondo EP822403
? stata riprodotta una composizione preferita di EP822403 avente la seguente composizione percentuale:
alcol etilico/alcol isopropilico/paraffina = 1/1/1 (vol)
(qui definita ?composizione comparativa?) e si ? provato a processare dei campioni secondo il metodo dell?invenzione con tale composizione. La composizione comparativa alla temperatura di processo (60?C) si ? presentata disomogenea, ovvero composta da 2 fasi distinte, come mostrato in Figura 2.
?
Si sono separate le due fasi, e si ? provato a processare dei campioni con le fasi separate della composizione comparativa e si ? osservato che, mentre i campioni processati nella fase superiore risultavano accettabili, i campioni processati nella fase inferiore non erano tagliabili durante la preparazione della sezione per la visione al microscopio (si vedano Figure 3 e 4).
Inoltre, la processazione effettuata nella parte superiore della formulazione suddetta ha portato ad una colorazione del vetrino (colorazione standard ematossilina/eosina) non omogenea e non idonea in quanto la colorazione citoplasmatica non ha mostrato un contrasto sufficiente per la corretta interpretazione del vetrino da parte del patologo (si vedano Figure 5 e 6).
L?Esempio comparativo dimostra che le composizioni disidratanti e chiarificanti della tecnica anteriore non sono adatte alla realizzazione del trattamento secondo l?invenzione, la quale rappresenta senza dubbio un significativo progresso tecnico, in termini di risparmio di tempo, energie e solventi.
?
Claims (10)
1. Uso di una composizione che comprende paraffina, almeno un alcol, preferibilmente scelto tra alcol etilico e alcol isopropilico, e almeno un idrocarburo scelto tra nafta e ottano, per la preparazione analitica di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici.
2. Uso secondo la rivendicazione 1, per la realizzazione simultanea dei trattamenti di disidratazione, di chiarificazione e di infiltrazione in paraffina, in un solo passaggio.
3. Uso secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che la detta composizione comprende anche 2,2-dimetossipropano.
4. Composizione che comprende, o in subordine consiste in, paraffina, almeno un alcol, preferibilmente scelto tra alcol etilico e alcol isopropilico, almeno un idrocarburo scelto tra nafta e ottano, ed eventualmente 2,2-dimetossipropano.
5. Composizione secondo la rivendicazione 4, caratterizzata dal fatto che comprende, o in subordine consiste in:
- paraffina (come sopra definita): 40-60%, preferibilmente circa 50%;
- alcol etilico alcol isopropilico: 15-25%, preferibilmente circa 20%; e
- almeno un idrocarburo (come sopra definito): 25-40%, preferibilmente circa 30%, detto idrocarburo essendo pi? preferibilmente nafta; e
- uno o pi? componenti ulteriori, in ragione di 0-15%, preferibilmente 0-5%.
6. Composizione secondo la rivendicazione 4 o 5, caratterizzata dal fatto che comprende il 43-50%, preferibilmente 45-50% di paraffina, il 5% di alcol etilico, il 15% di alcol isopropilico e il 30% di nafta o ottano, preferibilmente nafta, uno o pi? componenti ulteriori, in ragione di 0-15%, preferibilmente 0-5%.
7. Metodo per disidratare chiarificare ed infiltrare in paraffina campioni biologici, citologici, istologici e autoptici, che comprende trattare detti campioni con una composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 6.
8. Metodo per il trattamento di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici, che comprende effettuare su un campione previamente sottoposto a fissazione un unico trattamento di disidratazione, chiarificazione ed infiltrazione in paraffina con la composizione dell?invenzione.
9. Procedimento per il trattamento di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici previamente sottoposti a fissazione, in particolare per i trattamenti di disidratazione, di chiarificazione e di infiltrazione in paraffina, che comprende:
- scaldare a circa 60-65?C la composizione dell?invenzione;
- trattare i detti campioni con una composizione secondo l?invenzione.
10. Uso della composizione di una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 6, come reagente per effettuare la simultanea disidratazione, chiarificazione ed infiltrazione in paraffina di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici.
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IT102020000025159A IT202000025159A1 (it) | 2020-10-23 | 2020-10-23 | Composizione per il trattamento di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici. |
EP21806375.8A EP4232794A1 (en) | 2020-10-23 | 2021-10-21 | Composition for the treatment of biological, cytological, histological and autopsical samples |
US18/249,545 US20230393038A1 (en) | 2020-10-23 | 2021-10-21 | Composition for the treatment of biological, cytological, histological and autopsical samples |
PCT/IB2021/059713 WO2022084907A1 (en) | 2020-10-23 | 2021-10-21 | Composition for the treatment of biological, cytological, histological and autopsical samples |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IT102020000025159A IT202000025159A1 (it) | 2020-10-23 | 2020-10-23 | Composizione per il trattamento di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici. |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
IT202000025159A1 true IT202000025159A1 (it) | 2022-04-23 |
Family
ID=74184719
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
IT102020000025159A IT202000025159A1 (it) | 2020-10-23 | 2020-10-23 | Composizione per il trattamento di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici. |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
IT (1) | IT202000025159A1 (it) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0802403A1 (fr) | 1996-04-16 | 1997-10-22 | Borghi Saveri France | Dispositif pour la mesure d'un couple moteur |
EP0822403A1 (en) | 1996-08-02 | 1998-02-04 | Milestone S.r.l. | Process for processing organic specimens |
WO2003100384A1 (en) | 2002-05-28 | 2003-12-04 | Diapath S.R.L. | Composition for the preparation of histological, autopsical, cytological samples |
US20120202241A1 (en) * | 2008-05-28 | 2012-08-09 | Steven Paul Wheeler | Histological specimen treatment apparatus and method |
WO2013144986A2 (en) | 2012-03-30 | 2013-10-03 | Madau Giacomo | Composition for processing histological, postmortem, cytological samples |
-
2020
- 2020-10-23 IT IT102020000025159A patent/IT202000025159A1/it unknown
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0802403A1 (fr) | 1996-04-16 | 1997-10-22 | Borghi Saveri France | Dispositif pour la mesure d'un couple moteur |
EP0822403A1 (en) | 1996-08-02 | 1998-02-04 | Milestone S.r.l. | Process for processing organic specimens |
US6042874A (en) * | 1996-08-02 | 2000-03-28 | Milestone S.R.L. | Process for processing organic specimens |
WO2003100384A1 (en) | 2002-05-28 | 2003-12-04 | Diapath S.R.L. | Composition for the preparation of histological, autopsical, cytological samples |
US20120202241A1 (en) * | 2008-05-28 | 2012-08-09 | Steven Paul Wheeler | Histological specimen treatment apparatus and method |
WO2013144986A2 (en) | 2012-03-30 | 2013-10-03 | Madau Giacomo | Composition for processing histological, postmortem, cytological samples |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20100323395A1 (en) | Method For Automatically Processing Tissue Samples In A Tissue Processor | |
US7618828B2 (en) | Method for histoprocessing | |
US10139320B2 (en) | Composition for processing histological, postmortem, cytological samples | |
CN105973673A (zh) | 一种桉树组织的石蜡切片方法 | |
CN109470534B (zh) | 一种病理组织透明脱蜡液及其制备方法 | |
US20090203066A1 (en) | Method for preparing a sample | |
US20150050689A1 (en) | Formalin-Free Fixation Agent For Histological Stains of Tissue Samples | |
CN110779785A (zh) | 一种新型无甲醛组织固定液 | |
RU2536502C2 (ru) | Цитологическая и гистологическая фиксирующая композиция и способ окрашивания | |
IT202000025159A1 (it) | Composizione per il trattamento di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici. | |
CN110132690A (zh) | 一种大脑组织冰冻切片的甲苯胺蓝快速染色方法 | |
US20050142631A1 (en) | Composition for the preparation of histological, autopsical, cytological samples | |
RU2499242C2 (ru) | Способ подготовки образцов биологических тканей к гистологическим исследованиям | |
US20230393038A1 (en) | Composition for the treatment of biological, cytological, histological and autopsical samples | |
WO2024013605A1 (en) | Improved composition for the treatment of biological, cytological, histological and autopsical samples | |
CN104931327A (zh) | 微米级生物材料石蜡切片方法 | |
RU2593343C1 (ru) | Способ окраски гистологических срезов при диагностике трихинеллеза | |
CN111380735B (zh) | 一种高效环保生物组织处理液及其处理组织切片方法 | |
CN113008646B (zh) | 一种消除柑橘固定样品组织切片中沉淀物质的方法 | |
NL2033625B1 (en) | Tissue sample preparation | |
Chaudhuri | Basic Histological Techniques (MicroTechniques) for Staining of Animal Tissue | |
IT202100011903A1 (it) | Procedimento per il trattamento di campioni biologici, citologici, istologici e autoptici. | |
WO2024117901A1 (en) | Tissue sample preparation | |
SU909622A1 (ru) | Способ приготовлени гистологических препаратов | |
CN115808337A (zh) | 一种骨髓组织脱钙用组合试剂及脱钙方法和应用 |