CN1987446A - 可比较的二维和三维凝胶电泳系统 - Google Patents

Abstract

一种基于二维凝胶电泳用于复杂蛋白质样品分离的装置，该分离包括基于等电点的第一维胶条中的第一分离和基于分子大小的第二维凝胶中的第二分离，该装置包括用于第一分离步骤的至少两个凝胶条和用于第二维分离的对应凝胶。将两个凝胶条排列在单个载体上的相同侧或相对侧。因具有至少两个第一凝胶条，可以平行执行至少两个分析过程。

Description

可比较的二维和三维凝胶电泳系统

技术领域

本发明涉及根据权利要求1介绍的基于二维凝胶电泳的用于分离原因分析用样品混合物的装置(arrangement)，以及建议用于集成和自动化方式的凝胶电泳分析方法。

具体来说，本发明涉及凝胶电泳的有利实施方案，通过基于快速UV凝胶聚合作用和SDS电动平衡而无需使用阀门，扩大基于专利申请EP 1712903 A1中公开的方法的范围，以提供方便和有效的方式来实现平行分析和比较研究。

背景技术

二维平板凝胶电泳仍是蛋白质组学的最常用方法，并且如果解决了现在存在的其它限制，这种情况可能仍会持续多年。实际上，它仍然是耗时且工作繁重的过程，需要训练有素的人员，结果质量主要取决于这些人员之手。虽然电泳后步骤高度自动化，但是分离步骤距此目标尚远，因此由保持在控制下的各种参数的变化产生精确性和一致性的问题。某些问题是例如，就样品量而言的样品加载和再水化，就匀质性、灌制和反应速度、尤其是粒度而言的胶条损失和匀质性、具有损坏和污染风险的胶条处理、胶条与凝胶的不精确或缓慢偶联、凝胶灌制和聚合，空气敏感度，运行开始前完成的时间，由此还导致场不连续的胶条气泡风险、运行期间温度升高、pH和粘度变化、缓冲容量的损失。缺乏可接受再现性，这意味着没有两个凝胶图像可直接重叠，由此在考虑主要将凝胶进行比较，例如检测和定量试验样品对之间的蛋白质表达差异的情况下，其仍是主要问题。就实际的情况而言，这解释为需要运行更多凝胶以构建每种条件的参考图像并达到某种程度的确定性，这又意味着甚至更多的手工工作。

在1997年，引入了明显克服此问题的技术，即荧光2-D差示凝胶电泳(DIGE)[1]。这基于使用荧光花青染料Cy3和Cy5的两种质量和电荷匹配的N-羟基琥珀酰亚胺酯衍生物(它们具有不同的激发和发射光谱)，以差异性地标记两个蛋白质样品的赖氨酸残基，然后将它们混合并在相同的凝胶上运行。

因此，匹配是自动且直接的，理论上仅单个凝胶即可足够。但是，为了适合的统计评估，还至少需要三至五个凝胶。使事情比之前甚至更复杂的是，要遵循非常苛刻的标记条件。实际众所周知的是，预先标记可以生成大量位置异构物以及部分反应的类型，从而得到非常不均一的结果。因此，标记必须最小化，以尝试实现添加到整个蛋白质分子上的单个赖氨酸残基上。此外，过度反应的种类还可能由于获得增加的疏水性而沉淀，但是最大的问题是无法仅运行一个DIGE凝胶就切出差异化表达的蛋白质斑点用于后续MS分析。实际上，没有办法预测共价荧光标记将附着于哪个赖氨酸，和由此附着于哪个消化斑点的肽，由此肽的鉴定可成为问题所在。而且，从荧光扫描仪移出凝胶之后，斑点不再可见，由此需要以任何方式使用Sypro Ruby或其它可视染色技术以实现电泳后可视化。最终，或许最大的限制表现为非常高成本的设备、软件和试剂。

与更好再现性相关的自动化是对仪器色谱分析方法的主要优势，因为加载样品之后不再需要手动干预。尽管如此，这仅在以先后顺序逐个样品使用相同色谱柱和运行相同方法时才成立。使用相同材料填充的相同尺寸的色谱柱实际可以产生不同的洗脱时间，因为色谱柱填充本身不是良好可再现的。例如monoliths的新材料具有新的优点，但是仍要逐个生产色谱柱，这意味着与凝胶类似，没有平行运行的两个色谱分析可以重叠。除此之外，因成本和仪器复杂性导致的限制使得该方法毕竟不是更快速且实际更方便，尽管具有其它固有优点例如在线检测和直接与MS偶联的可能性。另一方面，凝胶可以容易地以平行方式运行，可以在最优条件下提供更好的分辨率，并可以通过成像直接比较。因此如果对凝胶也实现集成和自动化，由此实现更高的可再现性和通量，允许以更少的工作量和降低的成本在更少时间内运行更多且可比较的凝胶，则其潜力仍是非常大的。

在前一申请EP 1712903 A1中，引入了对一般方法的修改，基于无阀第一维SDS电动平衡与快速UV聚合之间的组合，最终得到真正简单的集成且自动化的系统以及优于现有技术的其它重要优点，稍后将再次回顾和描述其中最重要的部分。

出于简化和更好地理解EP 1712903 A1内提出的发明的原因，二维凝胶电泳分析的各种方法或过程步骤是按操作顺序描述的。如下是执行开发的方法时所涉及步骤的简要列表，之后是对它们的论述：

1.在IEF(等电聚焦)之前执行还原/烷基化。

2.加载样品。

3.以任何如下提出的方式运行IEF。

4.增加胶条与凝胶模背面的间距。

5.在实现同时偶联和聚合的同时引入用于第二维分离的凝胶溶液。

6.以电动学方式将SDS引入聚焦的蛋白质。

7.置换运行缓冲器并运行第二维。

8.打开凝胶模以移出凝胶。

9.进行固定和染色。

在各个步骤的下文描述中，还参考附图1-7，其中显示出分别根据EP 1712903 A1开发的系统或设备的可能实施方案和部分。

步骤1

还原/烷基化作为根据[2]的样品制备的最后一步在加载样品之前进行。优选使用相同的还原剂和烷基化剂，即三丁基膦(TBP)和乙烯基吡啶(vinyl pirydine，VP)，虽然对该方法稍作修改。已经发现并无必要缓冲发生烷基化反应的样品溶液，因此避免了盐浓度的无意义增加，而高盐浓度会导致高电流和较长的IEF时间(除非实施了脱盐)。而且，认为在两个连续步骤中而非同时添加TPB和VP更有效率，因为这两种试剂可相互反应。以此方式，所需要的反应时间也更短，例如总共30分钟。例如，用于溶解蛋白质样品的典型溶液由如下组成(当然允许有所变化)：

硫脲	2M
		尿素	7M
CHAPS	2％(w/v)
		Bio-Lyte3/10两性电解质	0.5％(v/v)
溴酚蓝	0.002％(w/v)
		1，2-丙二醇	20％

为此，添加TBP，例如首先在浓度5mM下持续约10分钟，然后添加VP 20mM最终浓度持续约20分钟，再添加足够摩尔量的TBP以猝灭过量的前一种试剂，而非添加另一种还原试剂如二硫赤藓糖醇(DTE)。

1，2-丙二醇是例如甘油、PEG、二甘醇的其它可能添加剂中较常用的添加剂，其作用是将IEF期间的EOF最小化，同时维持样品溶液的低粘度，正如下文所见到的，这对于样品加载步骤是重要的。

步骤2

如图1定义和图示的，将例如在上文溶液中的样品置入，例如用吸移管移入小样品孔中，其中该样品接触胶条和直接面对胶条的一次性容器的内表面，并根据本发明的计划由此表面与整个充满色谱柱的半干胶条之间的毛细管亲水力导向。图1分别显示出2D凝胶电泳分析设备或一次性容器内的EP 1712903 A1提出的第一胶条纵截面部分。上述样品1被插入到样品槽3中，并沿着箭头所示方向导向毛细管开口5、亲水性凝胶条7。优选但非必需的，与胶条对应的区域是亲水性的，而一次性容器11的表面9的至少其余部分是疏水性的或无凝胶附着的。也可仅通过在下方复制胶条尺寸的一次性容器上的两条平行划线来增强样品导向。在粘附胶条的相同覆盖面上可能需要凝胶粘附，这里可完全是亲水性的或具有凝胶结合特性。如果这是例如箔，则优点在于最后可以将它与胶条一起剥离，使得处理更容易且使损坏的风险最小化。可以采用压力或真空来协助加样，但是一般避免使用。在此受控的方式中，可以引入刚好对应于再水合胶条所需的量的样品体积，从而使浪费最小。

步骤3

要注意的是，胶条7没有在两端通过任何阀门封闭。因为凝胶模几乎在所有的面封闭，并且在IEF一次性放置在例如冷却板上的期间优选将温度保持凉爽，蒸发被最小化。可以使用可商业获得的胶条，其中该胶条已经被集成在封闭的压缩一次性容器中，或附着于封盖来单独提供，该封盖封闭主一次性容器。还可以使用亲水性导向的相同系统原位聚合胶条，此次是在两面，或使用亲水性中性多孔材料(例如胶条形状的膜)。但是在本例中，我们不采用被动再水化，而是采用主动样品加载。所公开的也是新的IEF介质，该介质可与样品溶液预混合，按上文导向以呈现胶条形状，并能在温度升到稍微高于室温时形成凝胶。具有此特征的介质是环氧乙烯和环氧丙烷的嵌段共聚物，它属于一类可由BASF公司商业获得的称为Pluronics^*的产品。可能适合的一种是例如Pluronic F127，当与上文描述的样品溶液混合时浓度为约20％或以上。除了其它商业应用外，该产品已经在核苷酸、有时是肽的毛细管电泳分析中用作有效筛分介质，但是从未用于蛋白质的IEF。当以临界浓度溶解在水溶液中时，该共聚物的常见特征是在低温下(通常＜5℃)处于液态，而在室温下变成一种液晶凝胶。样品溶液中尿素、硫脲、两性电解质和洗涤剂的存在将胶凝点提高30-35℃，因此在室温下使其成为液态，虽然黏稠，但是易于处理和导向。在毛细管电泳和胶条形状的情况下，可以获得良好聚焦的蛋白质，如图2和3所示。图2显示等电聚焦步骤之后具有单独位置的蛋白质成分17的pluronic胶条15。图3以示意图形式显示pluronic填充的毛细管中通过毛细管IEF进行的相同样品的分离。这里，线C表示IEF期间电流下降，而线P显示活动化之后的IEF峰值。毛细管电泳中的优点在于，由于聚合物本身的动态涂层特性，可以使用无涂层的毛细管。

步骤4

至少商业胶条遇到的一个问题是，当胶条和与该胶条直接接触的聚合第二维凝胶具有相同的厚度时，其表现为不可再现的第二维。一方面，对应于再水化胶条厚度的模间距是必要的，以便引入正确量的样品，依赖良好的毛细管力并执行良好的第一维分析。另一方面，要求胶条上的小空间，以便实现与凝胶的适合偶联，并执行良好的第二维分析。为了解决此问题，图4-6以示意图方式显示三种可能的解决方案，其中通过截面图的方式，在第一凝胶条7的区域中显示一次性分析容器的部分。一种方法是凝胶模具有不变厚度，而只相应改变胶条厚度。例如，一次性容器11中可具有窄缝21，其中对应于图4a和4b所示的两个允许位置，具有亲水性底部24的啮合条23自动放下和升起。图4b显示升起的啮合条23以在胶条7上方形成缝隙25。但是其它变化也是可能的，其中例如待移动的胶条附着于刚性或弹性部件上。另一种方法是改变整个凝胶模在两个允许位置之间的间距。对于此目的，可以在两个模平面12和14之间插入“O”环形弹性可压缩框27，如图5a和5b所示，可以为它们划出不同几何形状。最后如图5a所示，可以在框被挤压时使两个平面12和14彼此接触，而在可压缩框如图5b所示伸展开时在上层模平面12与凝胶条7之间形成腔或缝隙7。可以留下高度与胶条7相同的适合腔25，对应于如图6中图示划出的胶条。同样地，图6a显示挤压的可压缩框，而图6b显示伸展状况下的可压缩框。优选样品加载的机制仍是相同的，但是减少了胶条周围的空气体积。

步骤5

为了实现更具可控性的凝胶灌制，该步骤优选在垂直方向上执行，这意味着设备将使该一次性装置旋转90°。凝胶溶液的引入可以通过适合的管形装置或针从下至上或从上至下进行，并且该胶条可在相对于垂直模的四面的任何面定位。以此方式，凝胶溶液将填满模，至少部分接触、覆盖和/或包裹该胶条，这是优选方式以保持第一维的分辨率和丙烯酰胺在胶条内的扩散，其可能与样品交联，使得聚合快速发生。因此，不优选分别使用过硫酸铵(APS)和N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)作为自由基聚合的引发剂和催化剂，因为这些试剂需要在灌制期间的最后时间加入和混合，因为它们已经立即开始聚合，而且反应进行得慢，通常耗费超过一个小时才完成。理想情况下，凝胶溶液已经包含用于聚合的试剂，并储藏条件下是稳定的；重要的还有一旦例如通过外部能源触发反应，此反应快速进行，同时保持传统筛分凝胶的特征。这可以通过UV-引发的聚合来实现，其中选择暴露在光源(波长范围包括它的吸收光谱)下之前在丙烯酰胺凝胶溶液中稳定的引发剂。因此一次性容器应该使用UV透明材料。因为这些化合物一般是非极性的，因此在含水溶液中溶解性不好，所以更改凝胶溶液是必要的。例如，可使用最多10％的二甘醇而不降低凝胶的性能。合适的引发剂例如为0.05％或以下浓度的2，2′-二甲氧基-2-苯基-苯乙酮(DMPA)。如此，凝胶模暴露于足够能量的UVA光导致在少于5分钟内完全聚合。

虽然光聚合本身不是新技术，但是据我们所知它从未应用于基于二维凝胶的蛋白质组学。

步骤6和步骤7

在此点上，将胶条与凝胶偶联，胶条内聚焦在条带中的蛋白质在等电位点处。但是这意味着它们携带零净电荷，无法转移到用于第二维分析的凝胶。实际先前已经将它们烷基化，但是尚未与十二烷基硫酸钠(SDS)复合，SDS为它们提供净负电荷，并按恒定的比例与它们结合，允许现在通过凝胶筛分基质根据尺寸分离它们。将SDS引入蛋白质的一种方法是以电动学方式从阴极缓冲液容器引入。但是需要SDS的浓度高于运行缓冲液中存在的浓度，例如2％比0.1或0％。这具有两个含义：首先在电动平衡之后需要更换或稀释阴极处的缓冲液，其次胶条与缓冲液的距离优选地应该小(例如＜5mm)，以便使进入凝胶的高SDS浓度区域最小。但是所得到的效果优于标准方法。因为SDS迁移到凝胶内并且遇到蛋白质条带，这些条带从尾部开始移动而头部仍是稳定的。结果是条带开始在凝胶内迁移和分离之前逐渐压缩在胶条背面的堆积效应，这又意味着分辨率的增益。就此而言，图7显示E.Coli溶菌产物的二维分离的结果，其中150μg的样品总量加载在7cm、pH范围4-7的IEF胶条上，并根据基于SDS电动平衡的本发明方法来进行二维分离。图7所示达到的分辨率对于本领域技术人员来说是显见的，并通过质谱分析确认，其也证明不存在人为结果。一旦将蛋白质与SDS复合，则相互作用足够强，从而使得SDS确实无需开始就存在于凝胶溶液中。通过这种方式，我们还确定没有SDS从凝胶溶液扩散进胶条，导致蛋白质部分复合，并潜在地干扰所描述的堆积效应。使用第一缓冲液的SDS电动平衡优选在比分离条件低的电场下执行。所施加的是例如约5-6v/cm或更低的范围内的电场。该步骤耗时约5-10分钟，该时间对于SDS穿过胶条是必需的，之后暂停运行，例如用于更换缓冲液所必需的时间，更换或稀释阴极处的缓冲液的时间(如果从较小体积开始)，然后在高得多的电场下重新开始运行以快速分离，同时通过高效冷却散发热量。更高电场的强度取决于系统，优选高于例如约20瓦特/厘米。如果施加更高的电场，需要施加更高的系统冷却能力。优选地，从两个平面之间的所有面封闭凝胶模，例如通过参考图5和图6提及的可挤压框。缓冲液在模的两个对边和相同平面上通过两个平行窄缝接触凝胶，其中一个窄缝位于胶条与一个边之间，并由于以上原因尽可能地靠近胶条。还优选封闭窄缝以更有效率地防止蒸发和胶条干燥，并避免垂直灌制期间凝胶溶液泄漏。可例如仅在需要时或需要的位置利用集成在设备中的刀片功能、薄(thinner)衬片通过切割产生窄缝，该衬片表示例如通过注塑制成的一次性容器的物理整体部分。窄缝可以通过多孔膜，例如聚乙烯、PES(聚醚砜)、聚丙烯或PET以合适的厚度和孔隙度密封，而且其在灌制期间要承受凝胶的冲击力，然后被含SDS的缓冲液润湿，由此产生与凝胶的电接触。从自动化的角度来看，优选避免使用带或粘贴片。

以电动学方式引入SDS以移动聚焦蛋白质的方法不是新的。有一个先前发布的著作，但是其中描述了不同系统，其中蛋白质首先在微观流体通道中聚焦，以电动学方式引入的SDS必须注入侧通道中单独的区域。而这里报告首先应用二维凝胶电泳，首次描述胶条与凝胶之间的该堆积效应。

步骤8和步骤9

从样品加载至此，所有步骤都可以自动化。一旦完成二维运行，则用户可以手动从设备中移出一次性容器，并取出凝胶。优选地，为了易于处理，凝胶保持与模表面的一面接触，即与一次性容器或封闭面接触，它们可由刚性板(例如玻璃或聚合物)构成，或由更柔软的聚合物箔构成。因此凝胶附着的表面需要为聚合过程化学可影响的，而另一表面需要对自由基聚合呈化学惰性。然后可根据传统固定和染色过程来处理支撑凝胶。

由于平衡步骤6和7期间的堆积效应，第二维中的分辨率增加。现有技术的烷基化和SDS电动平衡一起免去了用第一与第二维之间的平衡溶液处理胶条的需要。这意味着避免处理或移动胶条或用阀门封闭胶条，免去额外的缓冲液，避免使用偶联琼脂糖或其它堆积凝胶，降低操作的复杂性(无论是手动还是自动方式)，节省了时间，这也意味着使由扩散导致的带加宽减至最小，因此增加了第一分离的分辨率。最后，当使用平衡溶液时可发生的最终蛋白质洗出不再是问题。凝胶形成可以快速聚合，且只要未施加外部光源就是稳定的，其使用避免了与凝胶制备相关的问题，免去了IEF之前预先聚合凝胶并通过屏障将其与胶条分开的必要，避免了长时间等待以及随后的胶条内分辨率损失。

本发明的目的在于拓宽根据EP 1712903 A1申请描述的方法步骤的范围并使之增值。

先前公开的方法实际特别适于一系列新的实施方案，实现更多平行凝胶的更均一条件，由此为可再现性比较研究提供更牢固且便利的方法；并且这全部仍采用一次性方式，降低了成本，使操作时间最少。

根据本发明，提出一种基于二维凝胶电泳的用于分离原因分析用样品混合物的装置，其特征在于，排列第一分离步骤的至少两个凝胶条和第二维的对应凝胶，并以平行方式可分别执行至少两种分析方法。根据一个可能的实施方案，至少两个平行第一凝胶条优选对称地排列在单个载体上的相同侧或相对侧。

在独立权利要求中描述或在以下实施例中参考附图更详细描述了本发明装置的其它可能实施方案。

附图说明

图1显示2D凝胶电泳分析设备或一次性容器内的第一胶条纵截面部分。

图2显示等电聚焦步骤之后具有单独位置的蛋白质成分17的pluronic胶条15。

图3显示pluronic填充的毛细管中通过毛细管IEF进行的相同样品的分离。

图4显示凝胶模具有不变厚度的实施方案。

图5显示改变整个凝胶模在两个允许位置之间的间距的实施方案。

图6显示具有高度与胶条相同的适合腔的实施方案。

图7显示E.Coli溶菌产物的二维分离的结果。

图8显示“镜像凝胶”形式的实施方案。

图9显示“对称凝胶”形式的实施方案。

图10显示“平行凝胶”形式的实施方案。

图11显示三维分析的实施方案。

发明内容

下文公开了流程图所示且简称为“镜像凝胶”、“对称凝胶”和“平行凝胶”的新发明概念，后者可以延伸到三维分析，并且突出了其相对优势。因此本发明的描述主要是新实施方案的描述，强调事实是该方法的基础与先前EP 1712903 A1申请中公开和衍生的相同。因此，将不再提及例如进行样品加载、再水化、IEF、平衡和第二维凝胶电泳的方式，因为在它处或上文已有描述。但是本发明部分也是从前者衍生的另一种新方法，通过该新方法可执行二维IEF，而无需在偶联到第三维凝胶电泳之前使用阀门作为预分级步骤。

图8显示所谓“镜像凝胶”形式的本发明实例的以一个可能实施方案。

图8所示的该实施方案在两个外封盖表面35和37之间具有夹层装置33中的中央或中间箔31，两个外封盖表面35和37之间的距离可以改变，使这两个表面各自与中间箔之间的距离可采用例如约0.7mm或约1mm的值，具体取决于所施加的外部压力或夹紧装置39和41的系统，该夹紧装置系统由例如先前欧洲申请EP 1712903 A1中公开的可压缩衬片43和45的系统形成，现在位于箔31的各侧。由此形成的电泳盒状装置33还包括如图8所示的缓冲液容器47和49，装置33可以利用光和/或UV透明材料注塑成型，并且可以是全部或部分一次性的。光或UV透明性是重要的，原因是为形成凝胶用于第二维分离，使用UV或光激活的聚合，该聚合发生于中央箔31与两个封盖表面35和37之间形成的两个室32和34内。

两个完全相同的第一凝胶条或IPG胶条51附着于中央箔31的任一侧，并优选在彼此对应的精确位置处对齐，中央箔31的特征是在两侧都具有凝胶结合特性。这些第一凝胶条优选由亲水性凝胶材料制成，符合以上EP 1712903 A1公开的步骤2内的描述和提议。在镜像装置中还在外部板35和37上凝胶/缓冲液介面处具有窄缝53，对其可应用相同原因，也如先前公开的例如有关膜的使用。箔的另一个特征是沿着与胶条平行的两条线并在凝胶模两个极末端处的一系列孔55和57，其功能是允许箔各侧的两个室32和34之间的液体连通。以此方式，在灌制凝胶溶液时，可以同时且均匀地填充两个室32和34，并且如上述步骤5内提出的，聚合可通过来自两侧的短暂光照(例如适合波长和能量的UV光)来同时完成，当灌制梯度凝胶时这同样是相同的优点。

除了一般性方法的所有优点外，图8所示的实施方案还允许在几乎完全相同条件下对两种待比较蛋白质样品运行二维电泳的两个分离步骤，如同DIGE方法中它们在一个凝胶中运行一样，而无需预先标记。理论上蛋白质点在透明箔31的两侧形成2D镜像模式，据此它们可在可视染色之后直接比较。可利用两种样品的不同组合进行更多试验用于对照，例如样品1对样品1、样品2对样品2、此外当然还有样品1对样品2。

图9a和图9b中显示所谓“对称凝胶”形式的作为本发明再一个可能实施例的再一个实施方案。

图9a显示第一维和第二维的样品分离期间，沿纵切面的本发明装置，图9b显示完成分离后用于原因分析的凝胶条，其具有同时比较两个样品的分离的可能性。

图9a所示的实施方案61有具有双倍面积且仅在一侧具有凝胶结合特性的箔63。两个第一凝胶条65现在平行附着并排列在它们之间的某个距离处，与凝胶装置61的中心轴A等距离，该装置现在采取完全对称的形状。现在有三个不同的缓冲液容器67、69和71用于两块凝胶、两个阳极和一个共同的阴极，它们也集成在注塑成型的优选为UV透明的一次性容器64中。在备选方式中，所述容器可以是外部集成的，而不在设备中，可以使缓冲液再循环。由于可压缩衬片68的放置，箔63和一次性容器68的内表面62之间的距离在不同步骤期间可变化。如上文公开的步骤6所提出的，图9a的箭头73指示电动平衡期间SDS移动通过中央窄缝的方向，对第二维的两块凝胶两个室66内的第二维运行的反方向，此后撕掉箔63，染色并在与两个胶条等距的中线上弯曲，以便同样以透明方式实现容易且直接的比较，如图9b所示。这可以通过例如在箔63中设置槽或沟72来实现。

因为在此情况中也可以确保均一条件，所以实质上优点与上文相同。一个不利的不同处是，该实施方案不适于灌制梯度凝胶。一个有利的不同处是或许设计更简单，且制造成本甚至更低，肯定低于两个单独的单一凝胶一次性容器。

同样，图10中显示所谓“平行凝胶”形式的作为本发明再一个实施例的再一个实施方案。

根据此实施方案，等距平行地排列许多第一凝胶条81(≥2)，并优选在平且薄的载体83上彼此对齐，通过载体83可在与外部缓冲液(未显示)的介面处排列一系列也与胶条平行并与各胶条等距的窄缝85。这些胶条可以完全相同以运行不同的样品，或平行地运行相同样品的副本，或可在例如预分级步骤之后携带不同pH范围用于放大的分离。在胶条载体周围同样使用可压缩衬片88，在其上方夹持例如固体块87，固体块87由平行垂直凝胶模89(例如1mm的间距)构成，用于安排第二维分离的第二凝胶，等间距地与下方的第一凝胶条81对应。中间的空间为要由阳极运行缓冲液填充直至覆盖凝胶模的腔。虽然这是同样用光或UV透明的材料注塑成型的单片块，但是沿着缓冲液腔的边缘插入零件，以便在分析结束时通过轻微的手动扭力可容易地拆除该块，从而能够打开各个凝胶模89以移出凝胶。附图中的箭头91也指示电场形状，电动平衡期间SDS的移动方向，其中朝各胶条的中心堆积，然后蛋白质转移和迁移到垂直凝胶中。同样参考先前欧洲申请EP 1712903 A1的先前所述步骤。

优于个别单个凝胶分析的主要优点是，对于多个凝胶同时具有更均一的条件，从而在它们之间可预期更高的可再现性。同样与处理单个胶条和单个凝胶相比，系统和操作的复杂性显著降低，获得真正方便直接的方法以在盘中将胶条偶联到第二维分离。还应该注意的是根据图10，还可修改该实施方案以运行IEF的常规方法(例如在矿物油下)，并利用一维和二维之间的标准平衡溶液平衡胶条。

最后，再一个实施方案允许从二维分析延伸到三维分析，如图11a和11b所示。与先前的实施方案比较，在图11a和图11b所示的装置中，可能或提议不进行多次样品分级而是任何改进的分级，以在样品(例如蛋白质样品)的分离中达到远远更好的分辨率。图11a以截面图形式显示第一维分离的实施方案，而图11b以俯视图形式显示第一分离的实施方案。

可实现胶条再水化和聚焦而无需任何阀门或屏障装置，该事实使得有可能偶联不同胶条，例如图11所示从宽pH范围IPG胶条到窄pH范围IPG胶条。实际上可对第一胶条103运行IEF足够长时间，以允许沿pH范围的预聚焦和蛋白质分布，但是对于在达到等电点之前仍带电的蛋白质时间足够短。以此方式，在偶联到平行胶条(例如根据pH范围梯度排序的104-111)之后，可转移并垂直分离蛋白质，由此实现第一维分级并增加了第二维的分辨率。

由于更快速的聚合和优选的SDS电动平衡，所以图11a和图11b所示的实施方案现在可以与图10的实施方案组合，其中编号89所指的各个个体凝胶模安排为各自位于平行胶条104至111的其中一个之上，并可执行第三维(在第二维之前)的分离。

图8至图11所示的实施方案仅仅是为了描述和更好地理解本发明的示例。与现有技术的欧洲专利申请EP 1712903 A1中提出的凝胶电泳一次性容器相比，有可能根据本发明同时进行两个或两个以上的分析混合物的分离，因为在EP 1712903 A1内，提出了更简单且更好的使用一次性容器的自动化电泳分离方法，而无需阀门装置。

本发明当然不完全限于图8至图11所示的实施方案，任何基于EP 1712903 A1、提出使用至少两个凝胶条并有可能分别使用电泳平行执行至少两个样品的至少两个分离过程的发展，都落在本发明的范围内。

参考文献

[1]Unlu M，Morgan ME，Minden JS.1997.Difference gelelectrophoresis：A single gel method for detecting changes in proteinextracts(差示凝胶电泳：检测蛋白质提取物中变化的单一凝胶方法).Electrophoresis 18：2071-2077.

[2]Sebastiano et al.Rapid Commun.Mass Spectrom.2003，17，2380-2386.

Claims (26)

1.基于二维凝胶电泳用于分离复杂蛋白质样品的装置，所述分离包括基于等电点的第一维胶条中的第一分离和基于分子大小的第二维凝胶中的第二分离，其特征在于，将所述第一分离步骤的至少两个凝胶条和所述第二维的对应凝胶排列在单个载体上的相同侧或相对侧，并可平行执行至少两个分析过程。

2.如权利要求1所述的装置，其特征在于，将所述第一分离步骤的至少两个凝胶条平行和/或对称地排列在所述载体上。

3.如权利要求1或2之一所述的装置，其特征在于，在所述至少两个第一凝胶条上方，安排至少一个相对的一次性表面，以及在引入要分离的所述样品混合物之前，在各所述至少两个第一凝胶条的上方，提供所述胶条与所述相对表面之间的缝隙，其中至少在所述缝隙侧的这种相对表面由具有疏水性或非凝胶粘附材料构成或用其包被，并且样品引入通过亲水性导向发生。

4.如权利要求1-3任一项所述的装置，其特征在于，所述装置的所述一次性容器由一个载体或底板和至少一个盖板构成，至少一个所述盖板可以移动，使得所述载体或所述底板与所述盖板之间的距离是可变的。

5.如权利要求1-4任一项所述的装置，其特征在于，在所述载体或底板与至少一个盖板之间安排例如O形密封圈形式的弹性可压缩框，用于相对于所述至少一个盖板移动所述载体或底板，以改变所述载体或底板与所述盖板之间的距离和/或所述载体或底板上的所述第一凝胶条与相对表面之间的距离。

6.如权利要求1-5任一项所述的装置，其特征在于，任何安排为与所述第一凝胶条相对的所述盖板、优选还有所述载体是UV和可见光透明的，使得有可能进行所述第二维分离的凝胶的UV凝胶聚合以及分离蛋白质样品的图像比较，所述第一凝胶条与所述第二维凝胶排列为分别彼此接触。

7.如权利要求1-6任一项所述的装置，其特征在于，在所述凝胶条的周围不安排阀门。

8.如权利要求1-7任一项所述的装置，其特征在于，所述装置是夹层或镜像状的，包括中央载体或板，其上两侧安排至少一个第一凝胶条，并且在可变距离由与所述中央载体平面平行的封盖表面将每一侧封闭。

9.如权利要求8所述的装置，其特征在于，所述中央载体是两侧具有凝胶结合特性的箔。

10.如权利要求8所述的装置，其特征在于，所述中央载体与所述两个相对封盖表面之间的空间构成至少部分中空状的室，用于形成为所述第二维分离提供的所述第二凝胶。

11.如权利要求8-10任一项所述的装置，其特征在于，在所述中央载体与两个覆盖面之间安排例如O形密封圈形式的弹性可压缩框，以允许所述两个覆盖面相对于所述中央载体的距离可变和/或所述第一凝胶条与相对覆盖面之间的距离可变。

12.如权利要求8-11任一项所述的装置，其特征在于，所述夹层或镜像状的装置是盒状的，包括将所述两个相对盖板保持到位且在相对于所述中央载体的期望距离上的夹具状装置，所述盖板还包括例如用于引入所述第二凝胶形成溶液等的孔、在凝胶/缓冲液介面处的窄缝和优选的缓冲液容器。

13.如权利要求8-12任一项所述的装置，其特征在于，一系列的孔或开口位于沿着所述中央载体的适合位置处，以允许所述两个中空状室之间的液体连通。

14.如权利要求1-7任一项所述的装置，所述装置包括一个箔或膜状载体，所述箔或膜状载体具有双倍面积，在一侧具有凝胶结合特性并附着有两个第一凝胶条，所述两个第一凝胶条之间按某个距离对齐，并优选与所述箔或膜状载体的中心轴等距，具有所述两个第一凝胶条的所述载体由所述一次性容器的覆盖面封闭，由于例如安排在载体与覆盖面之间的可压缩衬片如O环形密封圈，在电泳过程的不同步骤期间所述载体和所述覆盖面之间的距离是可变的。

15.如权利要求14所述的装置，其特征在于，所述膜或箔状载体是透明的，并在中央区域包括沟或槽状装置，使得在所述第二维分离之后，剥离出所述一次性容器的所述膜或箔状载体可以沿与所述两个第一凝胶条等距的中线弯曲和折叠，以便在透明的情况中实现所分离样品的容易且直接的比较。

16.如权利要求14或15所述的装置，其特征在于，所述一次性容器的所述覆盖面包括例如用于引入第二凝胶形成溶液等的孔、在凝胶/缓冲液介面处的窄缝和优选的三个缓冲液容器，一个中央阳极容器和两个相对的阴极容器，其中所述两个胶条和所述两个第二维分离的SDS电动平衡在相反方向上进行。

17.如权利要求1-7任一项所述的装置，所述装置包括多个平行排列、优选等距的第一凝胶条，并优选在板或箔状的平且薄载体的一侧上彼此精确对齐，通过所述载体排列一系列也与所述第一凝胶条平行且优选与每个胶条等距的窄缝。

18.如权利要求17所述的装置，其特征在于，在所述第一凝胶条板或箔状载体的周围区域使用可压缩衬片，在所述衬片上方附着所述一次性容器的固体块，所述固体块包括等间距地与下方所述第一凝胶条对应的用于所述第二维凝胶分离的平行垂直凝胶模，所述凝胶模由透明材料制成，并且所述固体块相对于所述板或箔状载体的距离是可变的。

19.如权利要求18所述的装置，其特征在于，在所述凝胶模之间安排槽等形式的装置，使得可在所述第二维分离步骤结束时将各个所述凝胶模容易地从所述一次性容器中单独拆除。

20.如权利要求17所述的装置，所述装置还包括平密封盖，所述平密封盖在所述第一维分离完成之前相对于所述板或箔状载体处于适合的距离，然后在继续凝胶铸型、聚合和第二维分离之前由如权利要求18所述的固体块替代。

21.如权利要求1至7的其中一项所述的用于预分级复杂蛋白质样品的装置，其特征在于，在板或箔状载体上，附着一个主第一凝胶条，所述主第一凝胶条用于宽pH范围中的样品第一快速分离，使得所述样品的蛋白质在达到它们的等电点之前仍带电，所述载体还包括多个辅助第一凝胶条，所述辅助第一凝胶条排列为在一侧与所述主凝胶条接触且与其几乎垂直，而且它们之间几乎平行，彼此之间处于等距，所述第二凝胶条表示pH梯度，所述pH梯度各自对应于包含在所述主胶条的宽pH范围内的窄pH范围，使得可发生所述主胶条至相应辅助胶条的区域转移，并可以获得提高的分辨率。

22.如权利要求18至20任一项所述的凝胶模的固体块与如权利要求21所述的装置组合得到的装置。

23.基于二维凝胶电泳用于分离复杂蛋白质样品的方法，所述分离包括基于等电点的所述第一维胶条中的第一分离和基于分子大小的第二维凝胶中的第二分离，其特征在于，在排列在单个载体上相同侧或相对侧的所述至少两个凝胶条和对应第二维凝胶内，分别平行执行至少两个分析过程，所述第二维凝胶与所述第一维胶条接触。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，在所述第一维分离之后，增加所述载体与所述至少一个相对一次性表面之间的距离，以提供用于凝胶铸型、聚合、SDS平衡、转移和分离到所述二维凝胶中的最优条件。

25.如权利要求23或24之一所述的方法，其特征在于，所述分析方法基于样品引入和胶条再水化、亲水性样品导向、用于产生第二维凝胶的快速UV聚合之前的烷基化，以及基于进入所述第二维凝胶之前在第一维中分级的样品的SDS电动平衡。

26.如权利要求1-22任一项所述的装置用于分离样品混合物的用途，所述混合物尤其例如是复杂蛋白质样品。

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