JP2007171194A - 比較対照型二次元および三次元ゲル電気泳動システム - Google Patents
比較対照型二次元および三次元ゲル電気泳動システム Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007171194A JP2007171194A JP2006343421A JP2006343421A JP2007171194A JP 2007171194 A JP2007171194 A JP 2007171194A JP 2006343421 A JP2006343421 A JP 2006343421A JP 2006343421 A JP2006343421 A JP 2006343421A JP 2007171194 A JP2007171194 A JP 2007171194A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gel
- carrier
- strip
- separation
- dimension
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 title description 13
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 title description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 172
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 19
- 239000011888 foil Substances 0.000 claims description 18
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 16
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 claims description 15
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 9
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 4
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 claims description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 claims 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 claims 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 38
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 10
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 10
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 10
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 10
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 6
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000004141 dimensional analysis Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 5
- TUQOTMZNTHZOKS-UHFFFAOYSA-N tributylphosphine Chemical compound CCCCP(CCCC)CCCC TUQOTMZNTHZOKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KGIGUEBEKRSTEW-UHFFFAOYSA-N 2-vinylpyridine Chemical compound C=CC1=CC=CC=N1 KGIGUEBEKRSTEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000002349 difference gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 2
- 238000005370 electroosmosis Methods 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 2
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- QKTWWGYCVXCKOJ-UHFFFAOYSA-N 2-methoxy-1-(2-methoxyphenyl)-2-phenylethanone Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(OC)C(=O)C1=CC=CC=C1OC QKTWWGYCVXCKOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101000955144 Drosophila melanogaster WASH complex subunit 1 Proteins 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical group C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical group CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Chemical group 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000001746 injection moulding Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- PSGAAPLEWMOORI-PEINSRQWSA-N medroxyprogesterone acetate Chemical compound C([C@@]12C)CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@](OC(C)=O)(C(C)=O)CC[C@H]21 PSGAAPLEWMOORI-PEINSRQWSA-N 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N monopropylene glycol Natural products CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000002685 polymerization catalyst Substances 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000007870 radical polymerization initiator Substances 0.000 description 1
- 238000010526 radical polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036632 reaction speed Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 239000010979 ruby Substances 0.000 description 1
- 229910001750 ruby Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010972 statistical evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
- G01N27/44795—Isoelectric focusing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
- G01N27/44773—Multi-stage electrophoresis, e.g. two-dimensional electrophoresis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
- G01N27/44782—Apparatus specially adapted therefor of a plurality of samples
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
【課題】二次元ゲル電気泳動に基づいて複合タンパク質サンプルを分離するためのデバイスが提供される。並行して処理されるより多くのゲルに対してより均質な条件を確立する、つまりより再現性のある比較対照試験のためにより堅牢かつ簡便な方法を提供する。
【解決手段】このデバイスにおける分離では、一次元目ストリップ中での等電点に基づいた第1の分離、および二次元目ゲル中での分子サイズに基づいた第2の分離が行われる。該デバイスは、第1の分離のステップのための少なくとも2本のゲルストリップおよび二次元目の分離のための対応するゲルを含む。該2本のゲルストリップは単一の担体上でその片面または両面に配置されている。
【効果】少なくとも2本の第1ゲルストリップを有していることによって少なくとも2つの分析プロセスを並行して行うことができる。
【選択図】図8
【解決手段】このデバイスにおける分離では、一次元目ストリップ中での等電点に基づいた第1の分離、および二次元目ゲル中での分子サイズに基づいた第2の分離が行われる。該デバイスは、第1の分離のステップのための少なくとも2本のゲルストリップおよび二次元目の分離のための対応するゲルを含む。該2本のゲルストリップは単一の担体上でその片面または両面に配置されている。
【効果】少なくとも2本の第1ゲルストリップを有していることによって少なくとも2つの分析プロセスを並行して行うことができる。
【選択図】図8
Description
本発明は、二次元ゲル電気泳動に基づいて分析目的でサンプル混合物を分離するための請求項1により導かれるデバイス、およびゲル電気泳動分析の方法に関し、一体化と自動化の方法を示唆するものである。
詳細には、本発明は、その根底では、既にEP1712903A1に開示されている、バルブの使用を伴わない高速UVゲル重合、およびSDS動電的平衡化に基づく方法の範囲を広げることで、並行分析と比較対照試験を行うための簡便で効果的な方法を提供するゲル電気泳動の有利な実施形態に関するものである。
二次元スラブゲル電気泳動は、現在、最も用いられているプロテオミクス分析法であり、今もなお存在するいろいろな限界の問題が指摘されているとしても、なお数年は用いられるであろう。実際、二次元スラブゲル電気泳動は、依然として時間がかかり煩雑な方法であって、熟練者を必要とし、結果の品質は主にこの熟練者の腕によって決まるものである。電気泳動の後のステップは高度にロボット化されているが、分離のステップはそれからは程遠く、その結果、制御下に置かれるべき多数のパラメーターにおける変動から、精度と再現性に関する問題が生じうる。そのような問題のいくつかは、例えば、サンプル量、サンプルロス、およびストリップの均質性という点でのサンプルのロードと再水和;損傷と汚染のリスクのあるストリップの取り扱い;不正確でゆっくりとしたストリップのゲルへのカップリング;特に勾配についての均質性、注入スピード、および反応スピードという点でのゲル注入および重合;空気感受性;操作が開始されるまでに要する時間;結果として電場の断絶をも引き起こす気泡トラップのリスク;操作中の温度の上昇;pHの変化と粘度の変化;バッファー能力のロス;である。したがって、許容しうる再現性の欠如(2つのゲル像でちょうど重ね合わせることができるものはないことを意味する)は、ゲルが、多くの場合、例えば実験サンプルペア間におけるタンパク質発現の差異を検出・定量するために作製され比較されるということを考慮した場合、依然として大きな問題である。実際的な言い方をすると、これは、各条件に対してリファレンスマップを構築して一定の確実性に至るためにさらに多くのゲルをつくる必要性があり、このことは、言い換えると、さらに多くの手作業を意味する。
見かけ上、この問題を乗り越えるひとつの方法が、1997年に紹介された。すなわち蛍光2Dディファレンシャルゲル電気泳動(DIGE)である(Unlu M, Morgan ME, Minden JS. 1997. Difference gel electrophoresis: A single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis 18:2071-2077)。これは、別個の励起・発光スペクトルを有する、質量と電荷がマッチされた蛍光シアニン色素の2種類のN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルの誘導体であるCy3とCy5を用いて、2つのタンパク質サンプルのリシン残基を示差的にラベルし、そのサンプルを次に混合して同一のゲル上で泳動することに基づくものである。つまり、マッチングは自動的にまた間違いなく行われ、原理的には単一のゲルだけで十分である。しかしながら、適切な統計的評価を行うためには、少なくとも3〜5枚のゲルがなお必要である。物事を前よりもさらに複雑にするのは、非常に厳密なラベル化条件を守らなければならないという事実である。実際、プレ・ラベル化により、多数の位置異性体と同時に部分的に反応した分子種も生成されて、非常に不均質な結果が生じうることはよく知られている。したがって、可能であればタンパク質分子全体の中の単一のリシン残基への付加を行おうとするので、ラベル化は最小限でなければならない。加えて、過剰反応した分子種は増大した疎水性を獲得した結果として沈殿することも考えられるが、最大の問題は、DIGEゲルとその示差的に発現したタンパク質のスポットを次のMS分析のために切り出すことが簡単にできないという事実である。実際、どのリシンに、つまり消化スポットのどのペプチドにその二価の蛍光ラベルが結合するかを予測するすべはなく、その結果ペプチドの同定は問題をはらんでいると思われる。さらに、ゲルが蛍光スキャナーから取り外された後は、スポットはもはや見えなくなり、その結果、電気泳動後の可視化には結果的にSypro Rubyや他の視覚染色法を用いなければならない。最後に、最大の限界は、ことによるとその装置、ソフトウエア、試薬のコストが非常に高いことに代表されるかもしれない。
機器クロマトグラフィ分析の主な強みは、よりよい再現性に結び付いている自動化である。というのは、サンプルがロードされた後は、それ以上の手作業による介入が必要とされないからである。けれども、これは、同じカラムを使用して、同じ方法でサンプルを次から次へと連続した順序で分析する場合にのみ当てはまる。同一の物質が充填された同一のサイズのカラムでも、カラムの充填状態それ自体が完全には再現性がないので、実際はいろいろな溶出時間を与える可能性がある。例えばモノリスのような新しい材料はそれと一緒に新しい利点をもたらすが、カラムは現在も1個ずつ作成されており、これは、ゲルと同様、並行して分析を行った2つのクロマトグラムを重ね合わせることができる場合はないことを意味する。このほかにも、オンライン検出のような他の固有の利点やMSへのダイレクトカップリングの可能性があるにも拘わらず、計測のコストと複雑さからくる限界により、結局はこの方法は、より速いもの、また本当により便利なものとはなっていない。それにひきかえゲルは、容易に並行して分析を行うことができ、最適条件下では優れた分解能を与えることができ、そして像を見ることで直接比較することができる。したがって、もし一体化および自動化、つまりより高い再現性およびスループットがゲルに対しても達成されると、その可能性はさらに非常に大きなものとなり、より多くの比較可能なゲルを、より短い時間で、より少ない作業および削減されたコストで分析することが可能になる。
EP1712903A1では、バルブなしの一次元目と、SDS動電的平衡化と、高速UV重合とを組み合せることに基づく一般的な方法の改変が紹介され、これは最終的に、非常にシンプルな一体化・自動化されたシステムおよび先行技術に勝る他の重要な利点をもたらした。その重要な部分を以下に記す。
簡潔化のために、またEP1712903A1の中で提案されている発明のよりよい理解のために、二次元ゲル電気泳動分析のための種々の方法または処理ステップを、操作の順に説明する。以下はその開発された方法を実施する際に含まれるステップの簡単なリストであり、それぞれに対する考察は後に述べる。
1. IEF(等電点電気泳動)に先立って還元/アルキル化を行う。
2. サンプルをロードする。
3. 後に提案する方法のいずれかによりIEFを実施する。
4. ストリップとゲル型の向かい合う表面との間の間隔を広げる。
5. 二次元目の分離のためにゲル溶液を加え、同時にカップリングさせて重合を行う。
6. フォーカスしたタンパク質に対してSDSを動電的に加える。
7. ランニング・バッファーを交換し、二次元目を実施する。
8. ゲル型を開け、ゲルを取り出す。
9. 固定および染色を行う。
2. サンプルをロードする。
3. 後に提案する方法のいずれかによりIEFを実施する。
4. ストリップとゲル型の向かい合う表面との間の間隔を広げる。
5. 二次元目の分離のためにゲル溶液を加え、同時にカップリングさせて重合を行う。
6. フォーカスしたタンパク質に対してSDSを動電的に加える。
7. ランニング・バッファーを交換し、二次元目を実施する。
8. ゲル型を開け、ゲルを取り出す。
9. 固定および染色を行う。
上記ステップのいくつかについての以下の説明の中では、添付の図1〜7も参照される。それらの図には、EP1712903A1による、考えられる実施形態の例および開発されたシステムまたはデバイスの一部が示されている。
ステップ1
還元/アルキル化は、サンプルのロードの直前に、文献(Sebastiano et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003, 17, 2380-2386)に従って行われるサンプル調製の最終ステップとして行う。該方法の若干の改変を伴うが、同じ還元剤およびアルキル化剤、すなわちトリブチルホスフィン(TBP)およびビニルピリジン(VP)を用いるのが好ましい。これまでに、アルキル化反応を起こすのにはサンプル溶液の緩衝は必要でないことが見出されている。つまり、脱塩を行わない限り高電流および長いIEF時間をもたらす、塩濃度の意味のない増大が回避される。さらに、TBPとVPは互いに反応しうるので、この2つの試薬を、同時ではなく2つの連続するステップで加えることがより効率的であると考えられる。この場合はまた、より短い反応時間(例えば全体で30分)が必要とされる。タンパク質サンプルを可溶化するのに用いられる典型的な溶液は、一例として以下の構成成分からなる(当然、変形は許される)。
還元/アルキル化は、サンプルのロードの直前に、文献(Sebastiano et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003, 17, 2380-2386)に従って行われるサンプル調製の最終ステップとして行う。該方法の若干の改変を伴うが、同じ還元剤およびアルキル化剤、すなわちトリブチルホスフィン(TBP)およびビニルピリジン(VP)を用いるのが好ましい。これまでに、アルキル化反応を起こすのにはサンプル溶液の緩衝は必要でないことが見出されている。つまり、脱塩を行わない限り高電流および長いIEF時間をもたらす、塩濃度の意味のない増大が回避される。さらに、TBPとVPは互いに反応しうるので、この2つの試薬を、同時ではなく2つの連続するステップで加えることがより効率的であると考えられる。この場合はまた、より短い反応時間(例えば全体で30分)が必要とされる。タンパク質サンプルを可溶化するのに用いられる典型的な溶液は、一例として以下の構成成分からなる(当然、変形は許される)。
これに、TBPを、例えば、初めに5mMの濃度で約10分間加え、次にVPを最終濃度20mMで約20分間加え、そして再び、ジチオエリトリトール(DTE)のような異なる還元剤ではなくTBPを、前の試薬の過剰分を打ち消すのに十分なモル量で加える。
1,2−プロパンジオール(これは、例えばグリセロール、PEG、ジエチレングリコールのような他の考えられる添加剤よりも好ましい添加剤である)の機能は、サンプル溶液の粘度を低く保つことと並んでIEF間のEOF(電気浸透流)を最小限にすることで
あり、これは、以下にあるとおり、サンプルのロードのステップにとって重要である。
あり、これは、以下にあるとおり、サンプルのロードのステップにとって重要である。
ステップ2
サンプル(例えば上記した溶液中の)を、小さなサンプルウェルに、例えばピペットによりロードする。該サンプルウェルから、サンプルは、ストリップと該ストリップに直接向かい合っている使い捨て本体部内側面とに接触するに至ることができ、そして本発明で提案されているように該内側面と半乾燥ストリップとの間の毛管親水力によって誘導されて、所定の、図1にも示されている空間部を完全に満たすことができる。図1は、長さ方向の断面図で、EP1712903A1で提案されている2Dゲル電気泳動デバイスまたは使い捨て2Dゲル電気泳動デバイス内に配置されている第1ゲルストリップの一部を示すものである。上述したサンプル1はサンプルウェル3にロードされ、そして親水性ゲルストリップ7に沿った毛管空間部5に沿って、矢印で示した方向に誘導される。必ずしも必要ではないが、好ましくは、使い捨て本体部11の表面9の、ストリップに向かい合っている表面は親水性とし、それ以外の面の少なくとも一部は疎水性か、あるいはゲル非粘着性とする。サンプルの誘導は、単に使い捨て本体部に、その下側に置かれるストリップのサイズに等しい2本の平行な線を引くことによっても促進される可能性がある。この同じカバー平面の、ストリップが取り付けられる部分は、ゲル粘着性となっているのが望ましい。カバー平面は、全て親水性であってもよいし、あるいはゲル接着特性を有していてもよい。カバー平面が例えば、フォイルである場合、その利点は、分析の完了時に、フォイルをゲルと一緒に剥がすことができて、取り扱いがより容易になり、また破損のリスクを最小限にすることができることである。上記ロードを支援するために加圧または真空を用いることもできるが、一般には避けることができる。このように制御された方式により、ストリップを再水和するのに必要とされる量に正確に対応するサンプル容量を導入することができて、無駄を最小限にすることができる。
サンプル(例えば上記した溶液中の)を、小さなサンプルウェルに、例えばピペットによりロードする。該サンプルウェルから、サンプルは、ストリップと該ストリップに直接向かい合っている使い捨て本体部内側面とに接触するに至ることができ、そして本発明で提案されているように該内側面と半乾燥ストリップとの間の毛管親水力によって誘導されて、所定の、図1にも示されている空間部を完全に満たすことができる。図1は、長さ方向の断面図で、EP1712903A1で提案されている2Dゲル電気泳動デバイスまたは使い捨て2Dゲル電気泳動デバイス内に配置されている第1ゲルストリップの一部を示すものである。上述したサンプル1はサンプルウェル3にロードされ、そして親水性ゲルストリップ7に沿った毛管空間部5に沿って、矢印で示した方向に誘導される。必ずしも必要ではないが、好ましくは、使い捨て本体部11の表面9の、ストリップに向かい合っている表面は親水性とし、それ以外の面の少なくとも一部は疎水性か、あるいはゲル非粘着性とする。サンプルの誘導は、単に使い捨て本体部に、その下側に置かれるストリップのサイズに等しい2本の平行な線を引くことによっても促進される可能性がある。この同じカバー平面の、ストリップが取り付けられる部分は、ゲル粘着性となっているのが望ましい。カバー平面は、全て親水性であってもよいし、あるいはゲル接着特性を有していてもよい。カバー平面が例えば、フォイルである場合、その利点は、分析の完了時に、フォイルをゲルと一緒に剥がすことができて、取り扱いがより容易になり、また破損のリスクを最小限にすることができることである。上記ロードを支援するために加圧または真空を用いることもできるが、一般には避けることができる。このように制御された方式により、ストリップを再水和するのに必要とされる量に正確に対応するサンプル容量を導入することができて、無駄を最小限にすることができる。
ステップ3
留意すべきことは、ストリップ7はその側面でバルブで密閉しなくてもよいという事実である。ゲル型は全ての辺において密閉されているので、またIEFの間、使い捨てゲル型は例えば、冷却プレート上に置かれて温度は好ましくは低温に保たれるので、蒸発は最小限に抑えられる。市販のストリップを用いることもでき、それらは、密閉されたコンパクトな使い捨て本体部中に既に一体化されているか、またはそうでなければ、カバー部(これは、使い捨て主本体部を密閉する)に取り付けられて別個に販売されるものと思われる。ストリップはまた、上記同じ親水性誘導システム(この場合は、両方の面が)を用いてin situで重合してもよく、あるいはそうでなければ、親水性の中性多孔質材料(例えばストリップ形状をしたメンブレン)であってもよい。後者の場合はしかしながら、受動的な再水和の代わりに、能動的なサンプルロードを行うことになるだろう。新規なIEF媒体も本願明細書中に開示されており、これは、サンプル溶液とプレミックスされ、上記したように誘導されてストリップ形状となり、そして温度を室温よりも少しだけ高く上げるとゲル化することができるものである。このような特性を持っている媒体は、エチレンオキシドとプロピレンオキシドのブロックコポリマーであり、プルロニック(Pluronics[登録商標])と呼ばれるBASF社の市販製品群がそれである。好適と考えられるものは、例えばプルロニック(Pluronic)F127であり、上記で説明したサンプル溶液と同じようなサンプル溶液と混合する場合、約20%またはそれ以上の濃度で使用される。この製品は、他の販売用途のほかに、既に、オリゴヌクレオチドおよび一部のケースではペプチドのキャピラリー電気泳動において有効な篩媒体として使用されてきたが、タンパク質のIEFには使用されたことはない。このコポリマーを水溶液で臨界濃度に溶解させた場合の標準的な特性は、低温(典型的には<5℃)では液体であり、室温では一種の液晶質ゲルとなることである。サンプル溶液中に尿素、チオ尿素、両性電解質、および界面活性剤が存在すると、ゲル化点が30〜35℃より高くシフトする。つまり、室温では取り扱いおよび誘導が容易な液体(粘稠ではあるが)となる。キャピラリー電気泳動およびストリップ形状での電気泳動のいずれにおいても、図2および3に示されているように、うまくフォーカスされたタンパク質を得ることが可能であった。図2は、等電点フォーカス化を行うステップが終わった後の、離れて位置しているタンパク質成分17を含んでいるプルロニックストリップ15を示すものである。図3は、線図の形態で、プルロニックが充填されたキャピラリーでのキャピラリーIEFによる、同じサンプルの分離を示すものである。この場合、線CはIEF中の電流低下を表しており、線Pは移動の後のIEFピークを示している。キャピラリー電気泳動における利点は、ポリマー自体の動的コーティング特性により、未コートのキャピラリーを用いることができることである。
留意すべきことは、ストリップ7はその側面でバルブで密閉しなくてもよいという事実である。ゲル型は全ての辺において密閉されているので、またIEFの間、使い捨てゲル型は例えば、冷却プレート上に置かれて温度は好ましくは低温に保たれるので、蒸発は最小限に抑えられる。市販のストリップを用いることもでき、それらは、密閉されたコンパクトな使い捨て本体部中に既に一体化されているか、またはそうでなければ、カバー部(これは、使い捨て主本体部を密閉する)に取り付けられて別個に販売されるものと思われる。ストリップはまた、上記同じ親水性誘導システム(この場合は、両方の面が)を用いてin situで重合してもよく、あるいはそうでなければ、親水性の中性多孔質材料(例えばストリップ形状をしたメンブレン)であってもよい。後者の場合はしかしながら、受動的な再水和の代わりに、能動的なサンプルロードを行うことになるだろう。新規なIEF媒体も本願明細書中に開示されており、これは、サンプル溶液とプレミックスされ、上記したように誘導されてストリップ形状となり、そして温度を室温よりも少しだけ高く上げるとゲル化することができるものである。このような特性を持っている媒体は、エチレンオキシドとプロピレンオキシドのブロックコポリマーであり、プルロニック(Pluronics[登録商標])と呼ばれるBASF社の市販製品群がそれである。好適と考えられるものは、例えばプルロニック(Pluronic)F127であり、上記で説明したサンプル溶液と同じようなサンプル溶液と混合する場合、約20%またはそれ以上の濃度で使用される。この製品は、他の販売用途のほかに、既に、オリゴヌクレオチドおよび一部のケースではペプチドのキャピラリー電気泳動において有効な篩媒体として使用されてきたが、タンパク質のIEFには使用されたことはない。このコポリマーを水溶液で臨界濃度に溶解させた場合の標準的な特性は、低温(典型的には<5℃)では液体であり、室温では一種の液晶質ゲルとなることである。サンプル溶液中に尿素、チオ尿素、両性電解質、および界面活性剤が存在すると、ゲル化点が30〜35℃より高くシフトする。つまり、室温では取り扱いおよび誘導が容易な液体(粘稠ではあるが)となる。キャピラリー電気泳動およびストリップ形状での電気泳動のいずれにおいても、図2および3に示されているように、うまくフォーカスされたタンパク質を得ることが可能であった。図2は、等電点フォーカス化を行うステップが終わった後の、離れて位置しているタンパク質成分17を含んでいるプルロニックストリップ15を示すものである。図3は、線図の形態で、プルロニックが充填されたキャピラリーでのキャピラリーIEFによる、同じサンプルの分離を示すものである。この場合、線CはIEF中の電流低下を表しており、線Pは移動の後のIEFピークを示している。キャピラリー電気泳動における利点は、ポリマー自体の動的コーティング特性により、未コートのキャピラリーを用いることができることである。
ステップ4
少なくとも市販のストリップにおいても経験されるひとつの問題は、ストリップおよび該ストリップと直接接触して重合される二次元目のゲルが同じ厚みを有する場合、二次元目に再現性がないことに代表される。正しい量のサンプルを導入するため、良好な毛管力を期待するため、また良好な一次元目の分析を行うためには、一方では、再水和したストリップの厚みに対応した型のスペーシングが必要である。他方では、ゲルとの適当なカップリングを実現するため、また良好な二次元目の分析を行うためには、ストリップ上には小さな空間が必要である。この問題を解決する、3つの考えられる解決策を図4〜6に模式図で示す。図には、断面図で、分析用使い捨て本体部の第1ゲルストリップ7部分の一部が示されている。1つの方法は、ゲル型については厚みを一定にし、ストリップに対応してのみ厚みを変えることである。例えば、使い捨て本体部11にスリット21を設けることができ、この場合、親水性底部24を有する調整バー23が、図4aおよびbに示されている2つの許される位置で自動的に上げ下げされる。図4bは、上げられてストリップ7上に間隙25を形成している調整バー23を示すものである。当然他の変形も考えられ、例えば、ストリップが、硬質もしくは弾性の調整バーに取り付けられて移動する。もう1つの方法は、ゲル型全体のスペーシングを2つの許される位置間で変えることである。この目的のためには、図5aおよび5bに示されているように、またこの異なる幾何的配置に対して描きうるように、弾性圧縮可能フレーム27(「O」リング様)を、2つの型平面12および14間に挿入することができる。図5aに示すように該フレームを押圧すると、最後には2つの平面12および14が互いに接するまでもってくることができ、圧縮可能フレームを膨張させると、図5bに示すように、上部モールド平面12とゲルストリップ7との間に空隙部または間隙25が形成される。図6に模式図で描かれているように、ストリップ7に対応してストリップと同じ高さをもつ好適な空隙部25を残すこともできる。図6aは押圧された圧縮可能フレームを示すものであり、図6bは膨張された状態にある圧縮可能フレームを示すものである。サンプルロードのメカニズムは好ましくはなお同じであるが、ストリップの周りの空気体積は少なくなると思われる。
少なくとも市販のストリップにおいても経験されるひとつの問題は、ストリップおよび該ストリップと直接接触して重合される二次元目のゲルが同じ厚みを有する場合、二次元目に再現性がないことに代表される。正しい量のサンプルを導入するため、良好な毛管力を期待するため、また良好な一次元目の分析を行うためには、一方では、再水和したストリップの厚みに対応した型のスペーシングが必要である。他方では、ゲルとの適当なカップリングを実現するため、また良好な二次元目の分析を行うためには、ストリップ上には小さな空間が必要である。この問題を解決する、3つの考えられる解決策を図4〜6に模式図で示す。図には、断面図で、分析用使い捨て本体部の第1ゲルストリップ7部分の一部が示されている。1つの方法は、ゲル型については厚みを一定にし、ストリップに対応してのみ厚みを変えることである。例えば、使い捨て本体部11にスリット21を設けることができ、この場合、親水性底部24を有する調整バー23が、図4aおよびbに示されている2つの許される位置で自動的に上げ下げされる。図4bは、上げられてストリップ7上に間隙25を形成している調整バー23を示すものである。当然他の変形も考えられ、例えば、ストリップが、硬質もしくは弾性の調整バーに取り付けられて移動する。もう1つの方法は、ゲル型全体のスペーシングを2つの許される位置間で変えることである。この目的のためには、図5aおよび5bに示されているように、またこの異なる幾何的配置に対して描きうるように、弾性圧縮可能フレーム27(「O」リング様)を、2つの型平面12および14間に挿入することができる。図5aに示すように該フレームを押圧すると、最後には2つの平面12および14が互いに接するまでもってくることができ、圧縮可能フレームを膨張させると、図5bに示すように、上部モールド平面12とゲルストリップ7との間に空隙部または間隙25が形成される。図6に模式図で描かれているように、ストリップ7に対応してストリップと同じ高さをもつ好適な空隙部25を残すこともできる。図6aは押圧された圧縮可能フレームを示すものであり、図6bは膨張された状態にある圧縮可能フレームを示すものである。サンプルロードのメカニズムは好ましくはなお同じであるが、ストリップの周りの空気体積は少なくなると思われる。
ステップ5
ゲル注入をより制御性よく行うためには、このステップは好ましくは垂直で行う。すなわち該機器は、使い捨て本体部を90°回転させて操作されることになる。ゲル溶液の導入は適当な接続管または針を介して、底部から頂部に向かって、または頂部から底部に向かってのいずれかで行うことができ、ストリップは、垂直な型に対して4つの辺のいずれに位置していてもよい。このようにして、ゲル溶液は型を完全に満たすことになり、少なくとも部分的にストリップに接触しているか、それを覆っているか、および/またはそれを囲んでおり、そして一次元目の分解能およびストリップ内部でのアクリルアミドの拡散を維持するためには、可能ならばサンプルと架橋させて、重合が迅速に行われるのが好ましい。この理由から、ラジカル重合の開始剤および触媒として過硫酸アンモニウム(APS)およびN,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)をそれぞれ用いる従来の方法は好ましくない。なぜならこれらの試薬は、ゲル注入の時点で直ちに重合を開始するので、これらの試薬は、最後の瞬間に添加、混合しなければならないからであり、またその反応が、完結までに通常1時間より長くかかってゆっくりと進むからである。理想的には、ゲル溶液は、重合用の試薬を既に含んでいて、また貯蔵条件下では安定であることである。同時に重要なのは、一旦反応が開始されると(例えば外部エネルギー源によって)、その従来の篩ゲルの特性を維持しながら反応が迅速に進むことである。これは、例えばUV開始重合により、アクリルアミドゲル溶液中で、波長範囲に開始剤の吸収スペクトルが含まれる光源に曝露されるまで安定である開始剤を選ぶことで達成することができる。したがって、使い捨て本体部には、UV透過性材料を使用すべきである。これらの化合物は一般的には極性でないので、水溶液にはほとんど溶けないことから、ゲル溶液の改変が必要である。例えば、ジエチレングリコール最大10%までを、ゲルの性能を損なうことなく用いることができる。好適な開始剤は、例えば、0.05%またはそれ以下の濃度の2,2’−ジメトキシ−2−フェニルアセトフェノン(DMPA)である。これを用いることにより、ゲル型を十分な出力のUVA光に曝露することで、完全な重合を5分以内に実現することができる。
ゲル注入をより制御性よく行うためには、このステップは好ましくは垂直で行う。すなわち該機器は、使い捨て本体部を90°回転させて操作されることになる。ゲル溶液の導入は適当な接続管または針を介して、底部から頂部に向かって、または頂部から底部に向かってのいずれかで行うことができ、ストリップは、垂直な型に対して4つの辺のいずれに位置していてもよい。このようにして、ゲル溶液は型を完全に満たすことになり、少なくとも部分的にストリップに接触しているか、それを覆っているか、および/またはそれを囲んでおり、そして一次元目の分解能およびストリップ内部でのアクリルアミドの拡散を維持するためには、可能ならばサンプルと架橋させて、重合が迅速に行われるのが好ましい。この理由から、ラジカル重合の開始剤および触媒として過硫酸アンモニウム(APS)およびN,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)をそれぞれ用いる従来の方法は好ましくない。なぜならこれらの試薬は、ゲル注入の時点で直ちに重合を開始するので、これらの試薬は、最後の瞬間に添加、混合しなければならないからであり、またその反応が、完結までに通常1時間より長くかかってゆっくりと進むからである。理想的には、ゲル溶液は、重合用の試薬を既に含んでいて、また貯蔵条件下では安定であることである。同時に重要なのは、一旦反応が開始されると(例えば外部エネルギー源によって)、その従来の篩ゲルの特性を維持しながら反応が迅速に進むことである。これは、例えばUV開始重合により、アクリルアミドゲル溶液中で、波長範囲に開始剤の吸収スペクトルが含まれる光源に曝露されるまで安定である開始剤を選ぶことで達成することができる。したがって、使い捨て本体部には、UV透過性材料を使用すべきである。これらの化合物は一般的には極性でないので、水溶液にはほとんど溶けないことから、ゲル溶液の改変が必要である。例えば、ジエチレングリコール最大10%までを、ゲルの性能を損なうことなく用いることができる。好適な開始剤は、例えば、0.05%またはそれ以下の濃度の2,2’−ジメトキシ−2−フェニルアセトフェノン(DMPA)である。これを用いることにより、ゲル型を十分な出力のUVA光に曝露することで、完全な重合を5分以内に実現することができる。
光重合それ自体は新規なものではないが、本発明者の知る限りにおいては、これが二次元ゲルに基づいたプロテオミクスに適用されたことはない。
ステップ6および7
この時点で、ストリップはゲルにカップリングされており、タンパク質がストリップ内でその等電点においてバンド状にフォーカスされている。しかしながら、これは、タンパク質の正味の電荷がゼロであるので、二次元目の分析のためにそれらをゲルにトランスファーできないことを意味する。実際、タンパク質はそれまでにアルキル化されているが、まだ、タンパク質に正味の負の電荷を与え、またドデシル硫酸ナトリウム(SDS)とは複合体化していない。SDSは、タンパク質に一定比率で結合して次にタンパク質をゲル篩マトリックスの中でサイズによって分離させることを可能にするものである。SDSをタンパク質まで運ぶ1つの方法は、陰極用バッファー槽から動電的に運ぶことである。しかしながら、ランニングバッファー中に存在するSDSの濃度よりも高いSDS濃度が必要である(例えば2%に対して0.1または0%)。このことは2つの意味を有する。第一には、陰極におけるバッファーは、動電的平衡に達した後は取り替えるかまたは希釈する必要があり、第二には、バッファーからのストリップの距離は、ゲルに入って行く高SDS濃度の領域を最小限にするために、好ましくは小さくあるべきだということである(例えば<5mm)。結果として得られる効果はしかしながら、標準的な方法よりも優れている。SDSがゲルの中に移行してタンパク質バンドと出会うと、タンパク質バンドは尾部から移動し始め、頭部ではそのまま残る。バンドがゲル内部を移行して分離を始める前に、バンドがストリップの反対側のところで徐々に圧縮されるスタッキング効果が得られる。これは言い換えると、分解能の向上を意味する。この点で、図7は、大腸菌溶解産物の2D分離(この場合、総サンプル量150μgを、7cm、pH範囲4〜7のIEFストリップにロードし、二次元目の分離は、本発明の方法に従ったSDS動電的平衡化に基づいて実施した)の結果を示すものである。図7に示されている達成分解能は、当業者に明らかなものであり、質量分光分析によっても確かめられた(これにより、人工産物がないことも分かった)。タンパク質が一旦SDSと複合体化すると、その相互作用は十分強く、その結果SDSは、実際、もはやゲル溶液中に存在している必要がない。このようにして、SDSが、ゲル溶液からストリップの中に拡散してタンパク質の部分的複合体化を引き起こし、上述したスタッキング効果を潜在的に乱すことがないことも確認する。第一のバッファーによるSDSの動電的平衡化は、好ましくは分離条件よりも弱い電場で行う。例えば約5〜6v/cmまたはそれ以下の電場を用いる。このステップは概ね5〜10分を要し、これは、SDSがストリップを通過するのに必要な時間であり、この後、操作を、例えばバッファーを取り替えるのに必要な時間中断し(少なめの容量から出発した場合は陰極のバッファーを取り替えるかまたは希釈する)、そして熱を効率的な冷却によって発散させながら、迅速分離のためのより強い電場で操作を再開する。このより強い電場の強度はそのシステムによって決まるもので、好ましくは、例えば約20ボルト/センチメーターより強いものとする。より強い電場が用いられる場合は、システムの冷却能力はより高いものを用いなければならない。好ましくは、ゲル型は、例えば、上記図5および6で説明した押圧可能フレームによって、2枚の平面の間において全ての辺で密閉されている。バッファーは、型の2つの向かい合う端部で、かつ同じ平面上で、2つの平行スリット(ひとつは、ストリップとひとつの端部との間に配置されている)を介して、そして上記理由からストリップにできるだけ近く、ゲルに接触している。スリットはまた、ストリップからの蒸発と乾燥をより効率よく防ぐために、またゲル溶液の漏出を防ぐためにも、垂直位置での注入中は閉じておくのが好ましい。スリットは、例えば必要な時点で必要な場所にのみ、使い捨て本体部の物理的一体部分である、例えば射出成形によって作られた薄いライニングに、(機器部に一体化されているブレード機能を用いて)切り込みを入れることによって設けてもよい。そうでなければスリットは、正しい厚みと多孔率を備え、かつ注入の際のゲルの押出し圧力には耐えるが、その後SDS含有バッファーで湿らされてゲルと電気的接触を確立する多孔性メンブレン(例えばポリエチレン、PES(ポリエーテルスルホン)、ポリプロピレン、またはPET)で密封されていてもよい。テープや接着性つまみの使用は、自動化の観点から、避けるのが好ましい。
この時点で、ストリップはゲルにカップリングされており、タンパク質がストリップ内でその等電点においてバンド状にフォーカスされている。しかしながら、これは、タンパク質の正味の電荷がゼロであるので、二次元目の分析のためにそれらをゲルにトランスファーできないことを意味する。実際、タンパク質はそれまでにアルキル化されているが、まだ、タンパク質に正味の負の電荷を与え、またドデシル硫酸ナトリウム(SDS)とは複合体化していない。SDSは、タンパク質に一定比率で結合して次にタンパク質をゲル篩マトリックスの中でサイズによって分離させることを可能にするものである。SDSをタンパク質まで運ぶ1つの方法は、陰極用バッファー槽から動電的に運ぶことである。しかしながら、ランニングバッファー中に存在するSDSの濃度よりも高いSDS濃度が必要である(例えば2%に対して0.1または0%)。このことは2つの意味を有する。第一には、陰極におけるバッファーは、動電的平衡に達した後は取り替えるかまたは希釈する必要があり、第二には、バッファーからのストリップの距離は、ゲルに入って行く高SDS濃度の領域を最小限にするために、好ましくは小さくあるべきだということである(例えば<5mm)。結果として得られる効果はしかしながら、標準的な方法よりも優れている。SDSがゲルの中に移行してタンパク質バンドと出会うと、タンパク質バンドは尾部から移動し始め、頭部ではそのまま残る。バンドがゲル内部を移行して分離を始める前に、バンドがストリップの反対側のところで徐々に圧縮されるスタッキング効果が得られる。これは言い換えると、分解能の向上を意味する。この点で、図7は、大腸菌溶解産物の2D分離(この場合、総サンプル量150μgを、7cm、pH範囲4〜7のIEFストリップにロードし、二次元目の分離は、本発明の方法に従ったSDS動電的平衡化に基づいて実施した)の結果を示すものである。図7に示されている達成分解能は、当業者に明らかなものであり、質量分光分析によっても確かめられた(これにより、人工産物がないことも分かった)。タンパク質が一旦SDSと複合体化すると、その相互作用は十分強く、その結果SDSは、実際、もはやゲル溶液中に存在している必要がない。このようにして、SDSが、ゲル溶液からストリップの中に拡散してタンパク質の部分的複合体化を引き起こし、上述したスタッキング効果を潜在的に乱すことがないことも確認する。第一のバッファーによるSDSの動電的平衡化は、好ましくは分離条件よりも弱い電場で行う。例えば約5〜6v/cmまたはそれ以下の電場を用いる。このステップは概ね5〜10分を要し、これは、SDSがストリップを通過するのに必要な時間であり、この後、操作を、例えばバッファーを取り替えるのに必要な時間中断し(少なめの容量から出発した場合は陰極のバッファーを取り替えるかまたは希釈する)、そして熱を効率的な冷却によって発散させながら、迅速分離のためのより強い電場で操作を再開する。このより強い電場の強度はそのシステムによって決まるもので、好ましくは、例えば約20ボルト/センチメーターより強いものとする。より強い電場が用いられる場合は、システムの冷却能力はより高いものを用いなければならない。好ましくは、ゲル型は、例えば、上記図5および6で説明した押圧可能フレームによって、2枚の平面の間において全ての辺で密閉されている。バッファーは、型の2つの向かい合う端部で、かつ同じ平面上で、2つの平行スリット(ひとつは、ストリップとひとつの端部との間に配置されている)を介して、そして上記理由からストリップにできるだけ近く、ゲルに接触している。スリットはまた、ストリップからの蒸発と乾燥をより効率よく防ぐために、またゲル溶液の漏出を防ぐためにも、垂直位置での注入中は閉じておくのが好ましい。スリットは、例えば必要な時点で必要な場所にのみ、使い捨て本体部の物理的一体部分である、例えば射出成形によって作られた薄いライニングに、(機器部に一体化されているブレード機能を用いて)切り込みを入れることによって設けてもよい。そうでなければスリットは、正しい厚みと多孔率を備え、かつ注入の際のゲルの押出し圧力には耐えるが、その後SDS含有バッファーで湿らされてゲルと電気的接触を確立する多孔性メンブレン(例えばポリエチレン、PES(ポリエーテルスルホン)、ポリプロピレン、またはPET)で密封されていてもよい。テープや接着性つまみの使用は、自動化の観点から、避けるのが好ましい。
SDSを、フォーカスしたタンパク質まで動電的に移動させるという方法は新規でない。これまでに公表された研究が1つあり、そこではタンパク質が先ず微小流動チャネル中でフォーカスされ、この場合、動電的に導入されるSDSは、サイドのチャネルへと別個の領域に注入することが必要であるという違うシステムが記載されている。本明細書では、そうではなく、二次元ゲル電気泳動への最初の適用が開示され、また、このストリップとゲル間のスタッキング効果が初めて記載される。
ステップ8および9
サンプルのロードからここまで、全てのステップが自動化可能である。二次元目の操作が終わったら、ユーザーは、使い捨て本体部を機器部から手作業で取り出すことができ、そしてゲルを外すことができる。好ましくは、より容易な取り扱いのためには、ゲルは、型の表面の一方(使い捨て本体部かカバー表面のどちらか[カバー表面は、硬い板状部材(例えばガラスやポリマー)またはより柔軟性のある重合体フォイルのいずれからなっていてもよい])に付いたままにしておく。ゲルが接着している表面は、当然、重合プロセスが化学的にアクセス可能となっていなければならず、他の表面は、ラジカル重合に関して化学的に不活性となっていなければならない。担持されたゲルは、この後、固定および染色についての従来からの手順に従って処理することができる。
サンプルのロードからここまで、全てのステップが自動化可能である。二次元目の操作が終わったら、ユーザーは、使い捨て本体部を機器部から手作業で取り出すことができ、そしてゲルを外すことができる。好ましくは、より容易な取り扱いのためには、ゲルは、型の表面の一方(使い捨て本体部かカバー表面のどちらか[カバー表面は、硬い板状部材(例えばガラスやポリマー)またはより柔軟性のある重合体フォイルのいずれからなっていてもよい])に付いたままにしておく。ゲルが接着している表面は、当然、重合プロセスが化学的にアクセス可能となっていなければならず、他の表面は、ラジカル重合に関して化学的に不活性となっていなければならない。担持されたゲルは、この後、固定および染色についての従来からの手順に従って処理することができる。
平衡化のステップ6および7の際のスタッキング効果の結果として、二次元目の分解能が増大する。前以って行われるアルキル化とSDS動電的平衡化は、同時に、一次元目と二次元目の合間にストリップを平衡化溶液で処理する必要性をなくす。これは、ストリップを取り扱いまたは移動あるいはストリップをバルブで密閉することが回避されるということ、余分なバッファーが必要でないということ、カップリング用アガロースまたは他のスタッキングゲルの使用が回避されるということ、手作業であれ自動であれ、操作の複雑さが低減されるということ、時間が節約されるということを意味し、これはまた拡散によってバンドが広がることが最小限になることを意味し、したがって第1の分離に対しても分解能が増大することを意味する。最後に、平衡化溶液を用いる場合に起こりうるタンパク質のウォッシュアウトはもはや問題とならない。素早く重合することができかつ外的な光源が照射されない限り安定であるゲル形成液を使用することによって、ゲル調製に伴う問題が回避され、IEFの前にゲルを予め重合させてそれをストリップから隔壁を用いて分離することの必要性も回避され、そして待ち時間が長くなって、結果としてストリップ内での分解能が失われることも回避される。
EP 1 712 903 A1
Unlu M, Morgan ME, Minden JS. 1997. Difference gel electrophoresis: A single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis 18:2071-2077.
Sebastiano et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003, 17, 2380-2386.
本発明の課題は、上述したEP1712903A1の特許出願にある方法のなかの、ステップの範囲を広げ、それに価値を加えることにある。
既に開示されているこの方法は、実際、一連の新規な実施形態に非常に適したものであり、並行して処理されるより多くのゲルに対してより均質な条件を確立する、つまりより再現性のある比較対照試験のためにより堅牢かつ簡便な方法を提供するものであり、これら全てを、その上、削減されたコストと最小限の手作業時間で、使い捨て方式において行う。
本発明により、分析目的でサンプル混合物を二次元ゲル電気泳動に基づいて分離するためのデバイスが提案される。該デバイスは、第1の分離のステップのための少なくとも2本のゲルストリップと二次元目のための対応するゲルが配置されていて、それぞれに少なくとも2つの分析プロセスを並行して行うことができるようになっていることを特徴としている。1つの考えられる実施形態によれば、少なくとも2本の平行な第1ゲルストリップが、好ましくは単一の担体上で同じ面かまたは両面に対称に配置されている。
本発明のデバイスのさらなる考えられる実施形態は、特許請求の範囲にある従属クレーム中に記載されているかまたは添付の図面を参照にした以下の実施例中に詳細に記載されている。
以下に、模式図によって図示されている、また簡潔に「ミラーゲル」、「対称ゲル」、および「平行ゲル」(これは、三次元分析に拡大可能である)と称される新規な発明のコンセプトを開示し、その相対的利点の要点を述べる。本発明の説明はしたがって主に新規な実施形態の説明であって、根底にあるその方法は、EP1712903A1の特許出願から派生し、これに開示されたのと同じであるという事実を強調しておく。つまり、この後、例えばサンプルのロード、再水和、IEF、平衡化、および二次元目ゲル電気泳動を行うやり方については、既に他のどこかかまたは上記で説明されているので、説明は省略する。本発明の一部は、しかしながら、最初のものから派生した別の新規な方法でもあり、そこではバルブを使用することなく、三次元目ゲル電気泳動へのカップリングに先立つ前分画ステップとして、二次元IEFを行うことができる。
図8は、本発明の一例として、いわゆる「ミラーゲル」の形態にある一つの考えられる実施形態を示すものである。
図8に示されているこの実施形態は、2枚の外側カバー表面35および37間でサンドイッチ配置33にある中心または中間フォイル31を有し、この2枚のカバー表面間の距離は変えられるようになっており、その結果、これらの表面のそれぞれと、中間にあるフォイルとの間の距離が、該表面に外部圧力が加えられているかまたは該表面にクランプシステム39および41が用いられているために、例えば、(EP1712903A1中に既に開示されているように)フォイル31のそれぞれの面に配置されている圧縮可能ガスケットシステム43および45によって、約0.7mmか約1mmのいずれかの値をとることができるようになっている。このように形成された電気泳動カセット様配置33は、図8の図に図示されているバッファー槽47および49も含めて、光および/またはUV透過性材料を用いて射出成型することができ、またその全てもしくは一部を使い捨てとすることができる。この光またはUV透過性は、二次元目の分離のためのゲルの形成にUVまたは光開始重合が用いられ、該重合は中心部フォイル31と2枚のカバー表面35および37との間に形成される2つのチャンバー32および34内で行われるという理由から、重要である。
2本の同じ第1ゲルストリップまたはIPGストリップ51は、好ましくは中央部フォイル31の両面に、互いに対応する正確な位置に取り付けられて整列されている。該中央部フォイルの一つの特徴は、両面がゲル接着特性を有していることである。この第1ゲルストリップは、好ましくは、EP1712903A1に沿って上記に開示されているステップ2のステップ2内に記載・提案されているように、親水性ゲル材料から作成する。ミラー配置では、さらに、外側プレート35および37上にはゲル/バッファー境界面にスリット53がある。該境界面に対しては、前に開示されているのと同じ理由で、例えばメンブレンを用いることができる。フォイルのもう一つの特徴は、フォイルのそれぞれの面にある2つのチャンバー32および34の間の液体連通を可能にする機能を有する、2つのストリップに平行な線に沿ったゲル型の2つの端部にある一連の穴55および57である。このように、2つのチャンバー32および34は、ゲル溶液を注入する際に同時かつ均質に満たすことができ、また上記したステップ5中に提案されているように、適切な波長と出力の、例えば、UV光を両面から短時間照射することで重合もまた同時に行わせることができる。これは、勾配ゲルを注入する場合の利点と同じでもある。
図8に示されている実施形態は、その一般法がもっている全ての利点以外にも、比較対象の2つのタンパク質サンプルについての二次元電気泳動のその2つの分離ステップを、DIGE法におけるのと同じように、しかしプレ・ラベル化を必要とすることなしに、あたかもその2つのステップが単一のゲルにおいて泳動されているかのように、ほぼ同一の条件下で分析を行うことを可能にするものである。タンパク質スポットは、理論的には、透明フォイル31の両面で2Dミラーパターンを形成することになり、可視化染色の後、続いてこの透明フォイルを通して該2つのパターンを直接的に比較することができる。2つのサンプルの異なる組み合せ、例えばサンプル1とサンプル2との組み合せ以外に、サンプル1とサンプル1との組み合せ、サンプル2とサンプル2との組み合せで、より多くの実験を対照として行うことも考えられる。
本発明のさらなる考えられる例としての別の実施形態が、いわゆる「対称ゲル」の形態で、図9aおよび9bに示されている。
図9aは、一次元目および二次元目のサンプル分離の最中にある本発明によるデバイスを縦断面図で示すものであり、図9bは、分離が終わった後の、分析目的でその2つのサンプルの分離を同時に比較するという可能性を有するゲルストリップを示すものである。
図9aに図示されているデバイス61は、2倍の領域をもち、かつ片面だけがゲル接着特性を有するフォイル63を備える。2本の第1ゲルストリップ65が、その2本の間の距離が所定距離となり、かつゲルデバイス61の中心軸Aからは等しい距離となるところに平行に取り付けられて整列されており、それにより該デバイスは完全に対称的な形状をとっている。そして、射出成型された好ましくはUV透過性の使い捨て本体部64に一体化された、2つのゲル、2つの陽極、および1つの共通の陰極のための3つの異なるバッファー槽67、69、および71がある。別の形態として、該バッファー槽を外部に存在させて、代わりに機器部に一体化させ、そしてバッファーを再循環させることも考えられる。フォイル63と、使い捨て本体部64の内側面62との間の距離は、このケースでも、圧縮可能ガスケット68が配置されていることによって、異なるステップの間で変えられるようになっている。図9a中の矢印73は、上記に開示したステップ6で提案されている中央部スリットを通しての動電的平衡化の間のSDSの移動の方向を示すものであり、また二次元目の2つのゲルのための2つのチャンバー66内での二次元目泳動の反対方向を示すものでもある。二次元目泳動の後、フォイル63を剥がし、染色し、そして2本のゲルストリップから等しい距離のところにある中間線で曲げて、図9bに示されているように、透かして簡単に直接的な比較を行うことができる。これは、例えば、フォイル63の中央に凹部または溝72を設けることで達成することができる。
このケースでも均質な条件は保証されるので、その利点は実質的に上記したのと同じである。一つの好ましくない差異点は、この実施形態は、勾配ゲルを注入するのには適していないという点である。一つの好ましい差異点は、おそらく、デザインがより単純であることであり、従って製造コストがさらに低くなり、確かに2つの別個の単一のゲル使い捨て品に対するよりも低くなる。
再び、本発明のさらなる例としての別の実施形態を、図10に、いわゆる「平行ゲル」の形態で示す。
この実施形態に関しては、多数の第1のゲルストリップ81(>2)が、平坦で薄い担体83上で、等しい距離で平行にかつ互いには完全に整列されて配置されており、該担体を貫通して、外部バッファー(図示されていない)との境界面に、ストリップに平行でありかつ各ストリップから等しい距離にある一連のスリット85も配置されている。ストリップは、異なるサンプルまたは同じサンプルの複製を並行して分析を行うために同じものであってもよいし、または例えば、前分画のステップの後のより限定された範囲の分離のために異なるpH範囲を有するものであってもよい。ストリップ担体の縁部には、圧縮可能ガスケット88が用いられており、このガスケット上には、例えば、二次元目の分離のための第2のゲルを配置するための、下側の第1ゲルストリップ81に対応して等しく間隔を置いて立っている平行で垂直なゲル型89(例えば1mmの間隔で)を構成している立体ブロック87が固定される。ゲル型間の空間は空洞部となり、ゲル型が覆われるまで陽極ランニングバッファーで満たされることになる。このブロックは、光またはUV透過性材料から射出成型された単品ブロックであるが、バッファー空洞部の端部に沿って挿し込まれた構造物であって、その結果、分析が終わった時点において手で軽くねじることでブロックを容易に分解することができるようになっていて、個々のゲル型89を開いてゲルを取り出せるようになっている。図にある矢印91は、電場の形、動電的平衡化の間のSDSの移動の方向を示しており、スタッキングは各ストリップの中央部の方へ、またその後のタンパク質のトランスファーおよび移動は垂直ゲルの中へと進む。これについても、EP1712903A1に既に開示されているステップを参照されたい。
個々に行う単一のゲルの分析に対する主な利点は、ここでも、より均質な条件をいくつものゲルに対して同時に有するということであり、その結果、ゲル間により高い再現性を期待することができる。また、単一のストリップと単一のゲルをハンドリングするのと比べて、システムおよび操作の複雑さの著しい低減が図られ、ストリップをトレイ中で二次元目の分離にカップリングさせるための非常に簡便で単純な方法を提供するものである。また、注目に値するのは、この図10の実施形態は、例えばミネラルオイル中で一次元目と二次元目との間でストリップを標準平衡化溶液と平衡化させるという古典的なIEFの実行方法にも修正可能であるという点である。
最後に、図11aおよび11bに示すように、さらなる実施形態により、二次元分析から三次元分析への拡大が可能になる。これまでの実施形態とは対照的に、図11aおよび11bに示されているデバイスでは、複数のサンプル分画が可能となるか、または提案されているということはなく、分画が改善されて、例えば、タンパク質サンプルのようなサンプルの分離でのよりよい分解能が得られるものである。図11aは、一次元目の分離についての実施形態を断面図で示すものであり、図11bは、第1の分離についての実施形態を上から見た図で示すものである。
ストリップの再水和およびフォーカス化をバルブまたは隔壁手段なしでも行うことができるという事実は、異なるストリップとストリップとをカップリングして、例えば、図11にあるように広いpH範囲のIPGストリップから狭いpH範囲のIPGストリップにまたぐようにすることを可能にするものである。実際、第1ストリップ103に対してはIEFを十分長い時間行って、そのpH範囲にわたって前フォーカス化およびタンパク質分布を行わせることも可能であるし、またIEFを十分短い時間行ってその等電点に到達するまではなお荷電させておくということが可能である。このように、pH範囲ハシゴ段の順番に従って並べられた平行ストリップ、例えば、104〜111にカップリングさせた後は、タンパク質は直角に移動させて分離することができる。つまり、一次元目での分画および二次元目の分解能の向上が得られる。
従って、高速重合および好ましくはSDS動電的平衡化により、図11aおよび11bに示されている実施形態は、ここで、図10の実施形態と組み合せることができる。この実施形態では、符号89で示されているいくつかのゲル型の各々は、平行ストリップ104〜111のうちの1つの上に配置され、三次元目(これまでは二次元目であった)の分離を行うことができるようになる。
図8〜11に示されている実施形態は、単に、本発明を説明するための、また本発明をよりよく理解するための例にすぎない。EP1712903A1中に提案されているゲル電気泳動使い捨て品と比較すると、該特許出願において、バルブの配置を必要としない使い捨ての本体部を用いた、自動化の対象となるより単純でより良い電気泳動分離法が提案されていることから、本発明によって、分析混合物の同時の2つまたはそれ以上の分離が可能である。
本発明は、当然、図8〜11に示されている実施形態に全く限定されるものではなく、少なくとも2本の第1のゲルストリップを使用することを提案しかつそれぞれ電気泳動を用いて少なくとも2つのサンプルに対して少なくとも2つの分離プロセスを並行して行うという可能性を有する、EP1712903A1に基づいたいかなる展開も、本発明の範囲内に包含される。
参照文献
[1]Unlu M, Morgan ME, Minden JS. 1997. Difference gel electrophoresis: A single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis 18:2071-2077.
[2]Sebastiano et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003, 17, 2380-2386.
[1]Unlu M, Morgan ME, Minden JS. 1997. Difference gel electrophoresis: A single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis 18:2071-2077.
[2]Sebastiano et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003, 17, 2380-2386.
Claims (26)
- 二次元ゲル電気泳動に基づいて複合タンパク質サンプルを分離するためのデバイスであって、該分離では一次元目ストリップ中での等電点に基づいた第1の分離および二次元目ゲル中での分子サイズに基づいた第2の分離が行われる上記デバイスにおいて、第1の分離ステップのための少なくとも2本のゲルストリップおよび二次元目のための対応するゲルが単一の担体上で同じ面かまたは両面に配置されており、少なくとも2つの分析プロセスを並行して行うことができることを特徴とする、上記デバイス。
- 前記第1の分離ステップのための少なくとも2本のゲルストリップが、該担体上で平行かつ/または対称に配置されていることを特徴とする、請求項1に記載のデバイス。
- 前記少なくとも2本の第1ゲルストリップの上側に少なくとも1枚の向かい合う使い捨ての表面が配置され、かつ分離対象のサンプル混合物の導入の前に、前記少なくとも2本の第1ゲルストリップのそれぞれの上側に、該ストリップと、該向かい合う表面との間の間隙が設けられていることを特徴とする請求項1または2に記載のデバイスにおいて、かかる向かい合う表面が少なくとも該間隙の面において疎水性材料もしくはゲル非付着性材料からできているかまたはそれでコートされており、かつサンプル導入が親水性の誘導によって起こるものである、上記デバイス。
- 前記デバイスの使い捨て本体部が、1枚の担体または底部プレートと、少なくとも1枚のカバープレートとから構成され、該カバープレートが移動可能であることにより、該担体または底部プレートと該カバープレートとの間の距離が可変となっていることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記担体または底部プレートと前記少なくとも1枚のカバープレートとの間に、弾性で圧縮可能なフレームが、例えばOリング様シーリングの形態で配置され、それにより該担体または底部プレートを該少なくとも1枚のカバープレートに対して移動して、該担体または底部プレートと該カバープレートとの間の距離、および/あるいは該担体または底部プレート上にある第1ゲルストリップとそれぞれの向かい合う表面(1つまたは複数)との間の距離が変わることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記第1ゲルストリップに向かい合って配置されているいずれかのカバープレートおよび好ましくは同時に前記担体がUVおよび可視光透過性であり、それにより二次元目の分離のためのゲルのUVゲル重合と分離されたタンパク質サンプルの像比較ができるようになっており、前記第1ゲルストリップと前記二次元目ゲルがそれぞれ互いに接触して配置されていることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記ゲルストリップの周囲にはバルブが配置されていないことを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記デバイスが、少なくとも1本ずつの第1ゲルストリップが両面に配置されている中心担体または中心プレートを含むサンドイッチ様もしくはミラー様となっており、かつそれぞれの面が、該中心担体の面に平行なカバー表面によって可変距離で密閉されていることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記中心担体が、両面がゲル接着特性を有するフォイルであることを特徴とする、請求項8に記載のデバイス。
- 前記中心担体と前記2枚の向かい合うカバー表面との間の空間が、二次元目の分離のために用意される第2ゲルの形成のための空隙様チャンバーを少なくとも部分的に形成していることを特徴とする、請求項8に記載のデバイス。
- 前記中心担体と前記2枚のカバー表面との間に、弾性で圧縮可能なフレームが、例えば圧縮可能Oリング様シーリングの形態で配置されていて、それにより該2枚のカバー表面の中心担体に対する距離および/または第1ゲルストリップとそれぞれの向かい合うカバー表面との間の距離を変えることができることを特徴とする、請求項8〜10のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記サンドイッチ様またはミラー様デバイスが、2枚の向かい合うカバープレートを中心担体に対して所定位置および所望距離に保持するクランプ様手段を含むカセット様となっており、該カバープレートが同時に、例えば第2のゲルの配合溶液などを導入するための穴、ゲル/バッファー境界面におけるスリット、および好ましくはバッファー槽を含むことを特徴とする、請求項8〜11のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記中心担体に沿った適切な位置に一連の穴または開口部が配置され、それにより前記2つの空隙様チャンバー間で液体連通が可能となっていることを特徴とする、請求項8〜12のいずれか1項に記載のデバイス。
- 1枚のフォイル様またはフィルム様担体が2倍の領域を持ち、片面がゲル接着特性を有し、かつ2本の第1ゲルストリップがそれらの間の距離が所定距離で、好ましくは該フィルム様またはフォイル様担体の中心軸から等しい距離で取付および整列されており、該2本の第1ゲルストリップを有する担体が使い捨て本体部のカバー表面によって密閉されており、該担体と該カバー表面との間の距離が、例えば担体とカバー表面との間にOリング様シーリングのような圧縮可能ガスケットが配置されていることによって電気泳動プロセスの異なるステップとステップの間において可変となっている、請求項1〜7のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記フィルム様またはフォイル様担体が透過性であり、かつその中央部分に凹部または溝様手段を含み、それにより、二次元目の分離の後、使い捨て本体部から剥がされた該フィルム様またはフォイル様担体を前記2本の第1ゲルストリップから等しい距離にある中心線で折り曲げて重ね合わせることで、透かすことにより分離されたサンプルの容易かつ直接的な比較を行うことができることを特徴とする、請求項14に記載のデバイス。
- 前記使い捨て本体部のカバー表面が、例えば第2のゲルの配合溶液などを導入するための穴、ゲル/バッファー境界面におけるスリット、および好ましくは3つのバッファー槽を含み、該3つのバッファー槽のうち、1つは中央部陽極槽、2つは相向かい合う陰極槽であり、前記2本のストリップのSDS動電的平衡化と前記2つの二次元目の分離が反対方向に進むことを特徴とする、請求項14または15に記載のデバイス。
- プレート様またはフォイル様の平坦で薄い担体の片面上で、好ましくは等しい距離で、また好ましくは互いに完全に整列されて平行に配置された複数の第1ゲルストリップを含み、該第1ゲルストリップに平行でまた好ましくはそれぞれのストリップからは等しい距離にある一連のスリットが該担体を貫通して配置されている、請求項1〜7のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記第1ゲルストリップのプレート様またはフォイル様担体の周囲部分に圧縮可能ガスケットが用いられており、該ガスケットの頂部には、下側にある第1ゲルストリップに対応して等しい間隔で配置されて立つ、二次元目でのゲル分離のために用意された平行に並んだ垂直なゲル型を含む使い捨て本体部の立体ブロックが取り付けられており、該ゲル型は透過性材料から作られ、かつ前記プレート様またはフォイル様担体に対する該立体ブロックの距離は可変であることを特徴とする、請求項17に記載のデバイス。
- 前記ゲル型とゲル型との間に溝などの形態の手段が配置され、それにより二次元目の分離ステップの完了時に該ゲル型をそれぞれ個々に使い捨て本体部から容易に分解することができることを特徴とする、請求項18に記載のデバイス。
- 一次元目の分離が完了するまで、前記プレート様またはフォイル様担体に対して適切な距離にある平坦な密封用カバーをさらに含み、次いでそれが請求項18に記載の立体ブロックで置き換えられてその後ゲル注入、重合、および二次元目の分離に進められる、請求項17に記載のデバイス。
- 複合タンパク質サンプルを前分画するための請求項1〜7のいずれか1項に記載のデバイスであって、プレート様またはフォイル様担体上に、広いpH範囲でのサンプルの第1の迅速分離のために用意された1本の一次第1ゲルストリップが取り付けられ、該迅速分離においてはサンプルのタンパク質がその等電点に達する前でいまだ荷電しており、該担体がさらに複数の二次第1ゲルストリップを含み、該二次ゲルストリップは、一次ゲルストリップと1つの辺で接触し、かつそれに対してほぼ直角に、またそれら同士の間がほぼ平行に、すなわち互いの間が等しい距離に配置されており、またそれぞれが、一次ストリップの広いpH範囲内に含まれる狭いpH範囲に対応するpHハシゴ段となっており、その結果一次ストリップに由来する区画のそれぞれの二次ストリップへのトランスファーを行うことができ、分解能の向上を実現しうることを特徴とする、上記デバイス。
- 請求項21に記載のデバイスと、請求項18〜20のいずれか1項に記載のゲル型立体ブロックを組み合せることで得られるデバイス。
- 二次元ゲル電気泳動に基づいて複合タンパク質サンプルを分離するための方法であって、該分離では、等電点に基づいた一次元目ストリップ中での第1の分離および分子サイズに基づいた二次元目ゲル中での第2の分離が行われる上記方法において、単一の担体の同じ面かまたは両面に配置されている少なくとも2本のゲルストリップおよび対応する二次元目ゲル内で少なくとも2つの分析プロセスがそれぞれ並行して行われ、該一次元目ストリップと該二次元目ゲルは接触していることを特徴とする、上記方法。
- 前記一次元目の分離の後、担体と、少なくとも1枚の向かい合う使い捨ての表面との間の距離を増大させることにより、ゲル注入、重合、SDS平衡化、二次元目ゲル中へのトランスファーと分離のための最適な条件をもたらすことを特徴とする、請求項23に記載の方法。
- 前記分析プロセスが、サンプル導入の前のアルキル化とストリップの再水和、親水性サンプル誘導、二次元目ゲルの作製のための高速UVゲル重合、および一次元目で分画されて二次元目ゲルの中に進入する前のサンプルのSDS動電的平衡化に基づくことを特徴とする、請求項23または24に記載の方法。
- 特に複合タンパク質サンプルのようなサンプル混合物を分離するための、請求項1〜22のいずれか1項に記載のデバイスの使用。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP05028033A EP1801573A1 (en) | 2005-12-21 | 2005-12-21 | Method and apparatus for parallel two-dimensional electrophoresis |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007171194A true JP2007171194A (ja) | 2007-07-05 |
Family
ID=36599661
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006343421A Withdrawn JP2007171194A (ja) | 2005-12-21 | 2006-12-20 | 比較対照型二次元および三次元ゲル電気泳動システム |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7854827B2 (ja) |
EP (1) | EP1801573A1 (ja) |
JP (1) | JP2007171194A (ja) |
CN (1) | CN1987446A (ja) |
CA (1) | CA2571097A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4957917B2 (ja) * | 2008-07-15 | 2012-06-20 | 凸版印刷株式会社 | 電気泳動器具および電気泳動方法 |
CN101768207A (zh) * | 2009-01-05 | 2010-07-07 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 一种蛋白质复合物或复合体的三维凝胶电泳分离方法 |
EP4163617A1 (en) * | 2012-08-09 | 2023-04-12 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for preparing biological specimens for microscopic analysis |
US20150346145A1 (en) * | 2013-01-02 | 2015-12-03 | Abraham Shtevi | Device for performing electrophoresis producing mirror copies of separated proteins by using the same gel and the same samples |
US20140264468A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. | Biofet with increased sensing area |
WO2015096063A1 (en) | 2013-12-25 | 2015-07-02 | Coyote Bioscience Co., Ltd. | Methods and systems for nucleic acid amplification |
CN106471363A (zh) * | 2014-08-06 | 2017-03-01 | 卡尤迪生物科技(北京)有限公司 | 电泳装置 |
Family Cites Families (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4874490A (en) | 1988-11-04 | 1989-10-17 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Pre-cast gel systems for two-dimensional electrophoresis |
KR100266912B1 (ko) | 1992-02-28 | 2000-12-01 | 파라비 레이 | 조직접촉물질이며 방출조절운반체인 광중합성 생분해성 하이드로겔 |
US7569748B2 (en) | 1993-05-18 | 2009-08-04 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Nucleic acid encoding an insecticidal protein toxin from photorhabdus |
US20050043490A1 (en) | 1993-05-26 | 2005-02-24 | Klee Joachim E. | Polymerizable compounds and compositions |
US5795749A (en) | 1995-04-05 | 1998-08-18 | The Scripps Research Institution | Use of 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase to prepare 2-deoxyfucose, analogues and derivatives |
WO1998057161A1 (en) * | 1997-06-09 | 1998-12-17 | Hoefer Pharmacia Biotech, Inc. | Device for rehydration and electrophoresis of gel strips and method of using the same |
US6554991B1 (en) | 1997-06-24 | 2003-04-29 | Large Scale Proteomics Corporation | Automated system for two-dimensional electrophoresis |
US6277259B1 (en) | 1998-04-24 | 2001-08-21 | Enterprise Partners Ii | High performance multidimensional proteome analyzer |
US20020096431A1 (en) | 1999-09-01 | 2002-07-25 | Pierre Sevigny | Apparatus for the manufacture of a disposable electrophoresis cassette and method thereof |
US6676819B1 (en) * | 1999-09-14 | 2004-01-13 | Yaoqing Diana Liu | Methods and apparatus for automatic on-line multi-dimensional electrophoresis |
US6358387B1 (en) * | 2000-03-27 | 2002-03-19 | Caliper Technologies Corporation | Ultra high throughput microfluidic analytical systems and methods |
DE10113257C1 (de) | 2001-03-19 | 2002-11-14 | Inst Mikrotechnik Mainz Gmbh | Elektrophoresevorrichtung und ihre Verwendung |
WO2002084273A1 (en) | 2001-04-17 | 2002-10-24 | Nextgen Sciences Ltd | Electrophoretic separation system |
US6974526B2 (en) | 2001-05-01 | 2005-12-13 | Calibrant Biosystems, Inc. | Plastic microfluidics enabling two-dimensional protein separations in proteome analysis |
US20030127331A1 (en) | 2002-01-10 | 2003-07-10 | Leka George T. | Two-dimensional electrophoresis method and cassette |
US7153405B2 (en) * | 2002-04-12 | 2006-12-26 | Tecan Trading Ag | Cassette, system, and 2-D gel electrophoresis method for separating molecules |
WO2003092846A2 (en) | 2002-05-01 | 2003-11-13 | Cheng Sheng Lee | Plastic microfluidics enabling two-dimensional separations of biological molecules |
GB0212853D0 (en) * | 2002-06-01 | 2002-07-17 | Novartis Pharma Ag | Separation of molecules |
US20040112751A1 (en) | 2002-08-26 | 2004-06-17 | Jongyoon Han | Multidimensional electrophoresis and methods of making and using thereof |
JP2007524069A (ja) * | 2003-09-24 | 2007-08-23 | アジレント・テクノロジーズ・インク | フレームを使用した分子の抽出 |
EP1668350B1 (en) * | 2003-09-24 | 2012-06-13 | Agilent Technologies, Inc. | Electrophoretic separation of amphoteric molecules |
EP1712903B1 (en) | 2005-04-11 | 2015-07-15 | Roche Diagnostics GmbH | Method for Integrated 2D gel electrophoresis |
-
2005
- 2005-12-21 EP EP05028033A patent/EP1801573A1/en not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-12-13 CA CA002571097A patent/CA2571097A1/en not_active Abandoned
- 2006-12-20 US US11/642,242 patent/US7854827B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-12-20 CN CNA2006101720185A patent/CN1987446A/zh active Pending
- 2006-12-20 JP JP2006343421A patent/JP2007171194A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US7854827B2 (en) | 2010-12-21 |
CA2571097A1 (en) | 2007-06-21 |
CN1987446A (zh) | 2007-06-27 |
US20070151854A1 (en) | 2007-07-05 |
EP1801573A1 (en) | 2007-06-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Dawod et al. | Recent advances in protein analysis by capillary and microchip electrophoresis | |
JP2007171194A (ja) | 比較対照型二次元および三次元ゲル電気泳動システム | |
Silvertand et al. | Recent developments in capillary isoelectric focusing | |
AU2002322513B2 (en) | Arrays of buffers for analysing biomolecules by their isoelectric point | |
Huang et al. | On‐line isotachophoretic preconcentration and gel electrophoretic separation of sodium dodecyl sulfate‐proteins on a microchip | |
US8329016B1 (en) | Microfluidic device having an immobilized pH gradient and PAGE gels for protein separation and analysis | |
KR20200115619A (ko) | 샘플 특성화를 위한 장치, 방법 및 키트 | |
Drabik et al. | Gel electrophoresis | |
Yang et al. | Microfluidic 2-D PAGE using multifunctional in situ polyacrylamide gels and discontinuous buffers | |
Nordman et al. | Interfacing microchip isoelectric focusing with on-chip electrospray ionization mass spectrometry | |
US7901558B2 (en) | Integrated 2D gel electrophoresis method and system | |
AU2008247532A1 (en) | System and method for proteomics | |
Shimura | Capillary isoelectric focusing | |
Görg et al. | Two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients | |
JP2005528197A (ja) | 分子の分離 | |
Westermeier | 5 Slab gel IEF | |
Dwyer | Electrophoretic techniques of analysis and isolation | |
Jin | Development of Microfluidic Based Western Blot Technology for Fast and High-Content Analyses. | |
US20170052146A1 (en) | Methods and apparatus for introducing a sample into a separation channel for electrophoresis | |
WO2015064736A1 (ja) | 二次元電気泳動の一次元目電気泳動媒体、当該媒体を保持した媒体付き保持体、当該媒体を用いた二次元電気泳動装置、当該媒体を用いた二次元電気泳動方法、治具 | |
Drabik et al. | FUNDAMENTALS OF GEL ELECTROPHORESIS | |
Ranica | Apllication of capillary electrophoresis to analyze human transferrin focusing on the detection and quantification of the asialo-Tf isoform | |
GELFI | PIER GIORGIO RIGHETTI, ALESSANDRA BOSSI, and | |
Kaster et al. | Essential guides to method development in capillary electrophoresis | |
Fujii et al. | A Simple and Easy-to-Use Capillary Isoelectric Focusing Technique Using Reagent-Release Hydrogels |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20090119 |