KR20190081595A - 조직 투명도 분석 방법 - Google Patents
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Abstract
본 명세서에서는 투명화 기법으로 조직을 투명화하기 위한 처리를 수행하고, 투명화된 조직의 일부를 포함하고, 미리 결정된 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록 조직을 절단하고, 광학 리더기를 이용하여 획득된 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도를 측정하도록 구성된, 조직의 투명도 측정 방법이 제공된다.
Description
본 발명은 조직의 투명도 분석 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 다양한 투명화 기법에 따라 투명화된 목적 조직에 대하여 표준화된 분석 결과를 제공할 수 있는, 투명도 분석 방법에 관한 것이다
CLARITY (clear lipid-exchanged acrylamide-hybridized rigid imaging-compatible tissue hydrogel) 와 같은 조직 투명화 기술은 생체 조직 내 특정 물질을 외부물질 (exogenous element) 인 하이드로겔 (hydrogel) 로 대체하여 조직의 내부를 광학적으로 관찰할 수 있도록 투명하게 하는 기술이다.
예를 들어, 뇌 조직에 CLARITY 기법을 적용할 경우, 화학처리 과정을 거쳐 뇌의 지질 성분이 제거되고 최종적으로 투명한 뇌 조직이 획득된다. 이렇게 획득된 투명한 뇌 조직은, 뇌 조직의 구조가 보존됨에 따라 3 차원 이미지 분석, 신경돌기 추적, 추적된 뉴런의 위상 재건 등, 다양한 연구에 이용될 수 있다.
나아가, PARS (perfusion-assisted agent release in situ) 는 뇌를 포함한 다른 척수, 심장, 근육, 간, 폐, 신장, 대장 및 소장을 포함하는 몸 전체를 고분자 투과성 및 광학적 투명성을 제공할 수 있는 투명화 기술이다.
이러한, 투명화 기법들은 다양한 기관의 조직을 손상시키지 않고도 깊은 영역까지 기관을 관찰할 수 있도록 하여, 기관 구조의 분석 연구에 기여할 수 있고, 손상되지 않은 기관계로부터 통합적인 구조 분석과 분자적 정보의 획득을 가능하게 할 수 있다.
한편, 다양한 투명화 기법에 의해 투명화된 조직은, R.I (Reflex index) 측정 현미경을 이용하여 굴절도를 측정함으로써 이의 투명도가 분석될 수 있다. 그러나, R.I 측정 기반의 투명도 분석 방법은 분석의 정확도가 떨어질 수 있어, 분석 결과의 신뢰도 또한 낮을 수 있다. 이를 해결하고자 하는 방안으로 포토샵과 같은 프로그램을 통한 투명도 분석 방법이 제안되었으나, 적용한 투명화 기법의 종류에 따라 투명도 분석 결과가 상이할 수 있다. 이에 조직의 투명도 분석에 있어서 포토샵 기반의 투명도 분석 방법은, 실질적으로 이용하기 어려울 수 있다.
이에 따라, 이상의 한계를 극복하고 효과적으로 투명화된 조직을 분석하고 다양한 방식에 대해 공통적으로 실시할 수 있는 투명도 측정 방법에 대한 대한 개발이 지속적으로 요구되고 있는 실정이다. 즉, 다양한 투명화 기법에 따라 획득한 투명화된 조직에 대하여 표준화된 분석을 수행할 수 있는 새로운 분석 시스템의 개발이 요구되고 있다.
발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
투명화 기법은, 하이드로겔 기반의 투명화 기법, 수용성 제제 (soluble detergents) 기반의 투명화 기법, 유기 용매 기반의 투명화 기법이 있을 수 있다.
본 발명의 발명자들은 이러한 투명화 기법의 종류에 따라, 투명화된 조직의 크기가 원래의 조직과 상이한 크기로 변하는 것을 발견하였다.
보다 구체적으로, 본 발명의 발명자들은 하이드로겔 기반의 투명화 기법과 수용성 제제 (soluble detergents) 기반의 투명화 기법을 이용했을 때, 투명화된 조직이 원래의 조직과 유사하거나 미세하게 커지는 것을 발견할 수 있었다. 나아가, 본 발명의 발명자들은 유기 용매 기반의 투명화 기법을 이용했을 때, 투명화된 조직이 원래의 조직보다 작아지는 것을 발견할 수 있었다.
본 발명의 발명자들은 이상의 투명화 기법에 따른 투명화된 조직의 크기의 변화가 조직의 투명도에 대한 불명확한 분석의 요인이 될 수 있음을 인지할 수 있었다.
특히, 본 발명의 발명자들은 투명화된 기법에 따른 조직 크기의 변화에 따라, 동일한 샘플에 대하여 반복 실험을 진행 할 경우, 일정하지 않은 부위에 대한 투명도 분석이 수행될 수 있고, 그 결과 낮은 신뢰도를 갖는 분석 결과가 제공될 수 있다는 것에 주목하였다.
이에, 본 발명의 발명자들은 분석의 높은 신뢰도를 위해 투명화 기법에 따른 조직의 크기의 변화에 따른 새로운 투명도 분석 방법에 대하여 연구하였다. 연구를 통해, 본 발명의 발명자들은 투명화 기법에 의해 겔화 (gelation) 된 조직에 대하여 흡광도, 투명도 또는 투과되는 야광 빛의 세기 등을 측정함으로써 조직의 투명도를 효과적으로 분석할 수 있음을 발견하였다.
그 결과, 본 발명의 발명자들은 투명화 기법에 따른 조직의 크기의 변화에 따른, 다양한 투명화 기법에 대하여 표준화된 분석을 수행할 수 있는 새로운 조직의 투명도 분석 방법을 개발하기에 이르렀다.
또한, 본 발명의 발명자들은 투명화된 조직의 투명도를 다양하게 설정된 조건에서 분석할 수 있고, 연구실 수준에서도 조직의 투명도를 효과적으로 측정할 수 있는 조직의 투명도 분석 방법을 개발할 수 있었다.
이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 투명화 기법에 의해 투명화된 조직을 절단하여 표적 조직을 획득하고, 광학 리더기를 이용하여 획득된 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도를 측정하도록 구성된, 조직의 투명도 분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는, 투명화된 조직을 절단하여 표적 조직 및 표적 조직과 동일한 야광 디스크를 획득하고, 빛을 투과시킨 야광 디스크에 표적 조직을 배치하여, 야광 디스크로부터 표적 조직을 투과하여 발하는 야광 빛의 세기를 측정하도록 구성된, 조직의 투명도 분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는, 하이드로겔 기반의 투명화 기법, 수용성 제제 기반의 투명화 기법 또는, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 따라, 조직 크기의 변화를 최소화할 수 있도록 구성된, 조직의 투명도 분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 투명화 기법으로 조직을 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계, 투명화된 조직의 일부를 포함하고, 미리 결정된 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록, 조직을 절단하는 단계, 및 광학 리더기를 이용하여, 획득된 상기 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도를 측정하는 단계를 포함하는, 조직의 투명도 측정 방법이 제공된다.
본 명세서에서 이용되는 용어 “투명화 기법”은 관찰하고자 하는 기관 또는 이의 조직에 대하여 절개 또는 구조적 손상을 최소화하여 광학적으로 조직의 내부를 관찰할 수 있도록 투명하게 하는 기술을 의미할 수 있다.
이때, 조직은 화학적 처리를 통해 세포막 지질층을 하이드로겔과 같은 외부 물질로 대체되거나 Azobis 계열의 물질에 의해 하이드로겔화됨으로써 투명화될 수 있다. 이와 같은 하이드로겔 기반의 투명화 기법은, 예를 들어, CLARITY (clear lipid-exchanged acrylamide-hybridized rigid imaging-compatible tissue hydrogel), PACT (passive clarity technique), ACT (active clarity technique) 또는, SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals) 일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않고 보다 다양한 하이드로겔 기반의 투명화 기법이 조직을 투명화 하기 위해 이용될 수 있다.
나아가, 본 발명의 투명화 기법은, 수용성 제제를 이용하여 조직을 투명화할 수 있는, 수용성 제제 기반의 투명화 기법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 수용성 제제 기반의 투명화 기법은 seeDB (see deep brain), ClearT, ClearT2, ScaleA2, 또는 ScaleS일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않고 보다 다양한 수용성 제제 기반의 투명화 기법이 조직을 투명화 하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 투명화 기법은, 유기 용매를 이용하여 조직을 투명화할 수 있는, 유기 용매 기반의 투명화 기법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유기 용매 기반의 투명화 기법은 3DISCO (3D imaging of solvent-cleared organs), iDISCO (immunolabeling-enabled 3D imaging of solvent-cleared organs), 또는 BABB (benzyl alcohol-benzyl benzoate) 일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않고 보다 다양한 유기 용매 기반의 투명화 기법이 조직을 투명화 하기 위해 이용될 수 있다.
한편, 이상의 투명화 기법의 종류에 따라, 투명화된 조직의 크기가 원래의 조직과 상이한 크기를 가질 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔 기반의 투명화 기법과 수용성 제제 기반의 투명화 기법을 이용할 경우, 투명화된 조직은 하이드로겔화되거나 수용성 제제를 흡수함에 따라, 원래의 조직보다 미세하게 커질 수 있다. 또한, 유기 용매 기반의 투명화 기법을 이용할 경우, 투명화된 조직은 원래의 조직보다 작아질 수 있다.
이러한, 이상의 투명화 기법에 따른 투명화된 조직의 크기의 변화가 조직의 투명도에 대한 불명확한 분석의 요인이 될 수 있다.
한편, 본 명세서에서 이용되는 용어 “조직”은 뇌, 척수, 심장, 근육, 간, 폐, 신장, 대장, 또는 소장일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않고 투명화 기법이 적용될 수 있는 한, 다양한 조직이 본 발명의 투명화 분석 대상 조직이 될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 용어 “표적 조직”은 다양한 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여, 표적이 되는 부위를 포함하는 일정한 크기를 갖도록 절단된 조직을 의미할 수 있다. 예를 들어, 투명화된 조직이 뇌일 경우, 표적 조직은 전뇌, 중뇌 또는, 후뇌를 포함하도록 펀칭된 조직을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 용어 “광학 리더기”는 표적 조직에 대하여 특정한 파장에서의 흡광도 또는 투명도를 측정하도록 구성된 광학 분석 장치일 수 있다. 예를 들어, 광학 리더기는 ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 마이크로플레이트 리더 (Microplate Reader) 일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않고 조직에 대하여 빛을 투과하고 이에 대하여 발생되는 변화를 측정할 수 있는 한, 다양한 장비가 광학 리더기로 이용될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 용어 “흡광도”는 특정 파장에 따른 빛의 투과율을 의미할 수 있다. 이때, 흡광도는, 대상 물질에 대하여 측정된 OD (optical density) 값으로 정의될 수 있다. 한편, 흡광도는 조직의 투명한 정도와 연관될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 용어 “투명도”는 투명한 정도를 의미하며, 흡광도에 대한 백분율 값, 즉 OD 값의 백분율로 산출될 수 있다. 이때, 흡광도는 조직의 투명도와 반비례할 수 있다. 예를 들어, 흡광도가 다른 조직에 비하여 상대적으로 높은 조직은, 흡광도가 상대적으로 낮은 다른 조직보다 투명도가 낮을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 광학 리더기는 웰 플레이트 내의 각각의 웰에 빛을 조사하여 각 웰에 대한 흡광도 또는 투명도를 측정하도록 구성될 수 있다. 이때, 웰 플레이트는 각각의 웰의 직경이 6.0 mm 내지 7.0 mm로 설정된, 96 웰 플레이트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법으로 투명화된 조직은, 웰 플레이트 내의 웰의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록 펀칭될 수 있다. 웰에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 직경을 갖는 표적 조직은, 웰 플레이트 내부에 배치되어 효과적으로 고정될 수 있다. 이에 투명도가 분석되는 동안의 투명화에 따른 조직의 크기 변화, 예를 들어 표적 조직의 확대는 최소화될 수 있다. 나아가, 표적 부위를 포함하며 웰 사이즈에 맞도록 펀칭된 표적 조직에 대한 흡광도 및 투명도의 측정은, 절단하지 않은 전체 조직에 대하여 표적 부위에 해당하는 조직을 선택하여 분석을 수행하는 것보다, 그 결과가 정확할 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법으로 투명화된 뇌 조직에 대하여, 전뇌, 중뇌 및 후뇌를 각각 포함하도록 펀칭된 표적 조직을 웰 내에 배치하고, 각각의 웰에 대하여 투명도 분석을 수행할 경우, 전체 뇌 조직에 대하여 전뇌, 중뇌 및 후뇌 부위 각각에 대한 분석을 수행하는 것 보다 크기의 변동이 적어 그 결과가 정확할 수 있다. 나아가, 전뇌 중뇌 및 후뇌 부위와 같은 표적 조직에 대한 정확한 투명도 분석이 가능할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 유기 용매 기반의 투명화 기법으로 투명화된 조직은, 웰의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 제1 직경을 갖고 웰에 고정되도록 구성된 고정부 및 고정부의 내부에 위치하고 제1 직경보다 작은 제2 직경의 홀을 갖고 상기 제2 직경을 갖는 표적 조직을 획득하도록 구성된 절단 필러 (pillar) 를 포함하는 펀치를 이용하여, 펀칭될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 용어 “펀치”는 조직에 대하여 일정한 크기를 갖도록 구멍을 뚫는 기구를 의미할 수 있다. 예를 들어, 펀치는, 주변 조직의 붕괴 없이 표적 조직을 일정한 모양으로 펀칭할 수 있도록 날카롭고 얇은 날을 갖고, 직경의 선택이 용이한 아일렛 (eyelet) 심일 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않고, 펀치는 조직에 대하여 일정한 크기, 예를 들어 웰 플레이트와 유사한 직경을 갖고, 일정한 모양을 유지하도록 절단할 수 있는 한, 다양한 기구일 수 있다.
한편, 펀치는 웰 내부에 배치되어 조직을 안정적으로 고정할 수 있도록 구성된 고정부와, 전체 조직의 일부를 포함하는 표적 조직을 획득하도록 구성된 절단 필러로 구성될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 용어 “제1 직경“은 고정부의 직경을 의미하며, 웰의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 가질 수 있어 웰에 안정적으로 고정될 수 있다. 예를 들어 웰 플레이트가 96 웰 플레이트일 경우, 제1 직경은 6.0 mm 내지 7.0 mm로 설정될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 용어 “제2 직경“은 절단 필러의 직경을 의미하며, 전술한 제1 직경보다 작을 수 있다. 예를 들어, 제2 직경은 웰의 직경에 대하여 0.3 배 내지 0.6 배의 크기를 가질 수 있다. 그러나, 제2 직경의 범위는 이에 제한되지 않고, 광학 리더기에 의해 웰에 대하여 빛이 조사되는 영역 내에서 보다 다양한 범위로 설정될 수 있다. 예를 들어 웰 플레이트가 96 웰 플레이트일 경우, 빛이 투과되는 영역은 웰을 중심으로 직경 2.0 mm 내지 4.0 mm의 내부 영역일 수 있고, 이에 제2 직경은 2.0 mm 내지 4.0 mm로 설정될 수 있다. 한편, 표적 조직의 직경은, 절단 필러에 의해 펀칭됨에 따라 제2 직경과 유사할 수 있다.
펀치를 이용하여 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직으로부터 표적 조직을 획득하고, 절단 필러 내에 표적 조직을 포함하는 펀치를 웰 내에 배치하여 투명도를 분석하는 경우, 분석되는 동안의 투명화에 따른 조직의 크기 축소는 최소화될 수 있다. 이에, 펀치에 의해 고정된 표적 조직에 대한 흡광도 및 투명도의 측정은, 절단하지 않은 전체 조직에 대하여 표적 부위에 해당하는 조직을 선택하여 분석을 수행하는 것보다, 그 결과가 정확할 수 있다. 예를 들어, 유기 용매 기반의 투명화 기법으로 투명화된 뇌 조직에 대하여, 전뇌, 중뇌 및 후뇌를 각각 포함하도록 펀칭된 표적 조직을 포함하는 펀치를 웰 내에 배치하고, 각각의 웰에 대하여 투명도 분석을 수행할 경우, 전체 뇌 조직에 대하여 전뇌, 중뇌 및 후뇌 부위 각각에 대한 분석을 수행하는 것 보다 크기의 변동, 보다 구체적으로 크기가 축소되는 변화가 적을 수 있다. 나아가, 전뇌 중뇌 및 후뇌 부위와 같은 표적 조직에 대한 정확한 투명도 분석이 가능할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 투명화 기법으로 조직을 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계, 투명화된 상기 조직의 일부를 포함하고 미리 결정된 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록 조직을 절단하는 단계, 미리 결정된 크기를 갖는 야광 디스크를 획득하는 단계, 야광 디스크에 빛을 투과하는 단계, 빛이 투과된 상기 야광 디스크에, 획득된 상기 표적 조직을 배치하는 단계, 및 젤 이미징 (gel imaging) 분석 장비를 이용하여, 상기 야광 디스크로부터 상기 표적 조직을 투과하여 발하는 야광 빛의 세기를 측정하는 단계를 포함하는, 조직의 투명도 분석 방법이 제공된다.
본 명세서에서 이용되는 용어 “야광 디스크”는 일정한 세기의 빛에 노출된 후 암막 상태에서 야광 빛을 발하는 디스크를 의미할 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 빛이 투과된 야광 디스크 위에 놓여진 표적 조직에 대하여, 암막 상태에서의 투과되는 야광 빛의 세기를 측정함으로써 이의 투명도가 분석될 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않고 표적 조직에 대한 투명도 분석을 위해, 특정한 파장에서 빛을 발하는 형광 디스크가 더 이용될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 용어 “젤 이미징 분석 장비”는 표적 조직에 대하여 야광 또는 형광 빛의 세기를 측정하도록 구성된 광학 분석 장치일 수 있다. 특히, 젤 이미징 분석 장비는 투명화 기법에 의해 겔화된 조직으로부터 투과되는 야광 또는 형광 빛의 세기를 측정하기에 바람직할 수 있다. 예를 들어, 젤 이미징 분석 장비는 UV를 조사하여 겔화된 표적 조직과 같은 대상에 대한 빛의 세기를 측정하고, 이에 대한 이미지를 제공할 수 있는 Gel Doc (gel documentation system) 기반의 장비 일수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않고 투명화된 조직에 대하여 발하는 야광 또는 형광 빛의 세기를 측정할 수 있는 한, 다양한 장비가 젤 이미징 분석 장비로서 이용될 수 있다.
한편, 젤 이미징 분석 장비에 이용되는 웰 플레이트는 암막 조건을 제공할 수 있도록 검정색으로 코팅된 웰 블랙 플레이트 (well black plate) 일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법으로 투명화된 조직은, 웰 플레이트 내의 웰의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록 펀칭될 수 있다. 나아가, 야광 디스크 또한 플레이트의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 가질 수 있다. 웰에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 직경을 갖는 야광 디스크 및 표적 조직은, 웰 플레이트 내부에 순차적으로 배치되어 고정될 수 있다. 이에, 젤 이미징 분석 장비에 의해 야광 디스크로부터 표적 조직을 투과하여 발하는 야광 빛의 세기가 측정되는 동안, 표적 조직의 확대와 같은 투명화에 따른 조직의 크기 변화는 최소화될 수 있다. 나아가, 표적 부위를 포함하며 웰 사이즈에 맞도록 펀칭된 표적 조직으로 투과되는 야광 빛의 세기를 측정하는 것은, 절단하지 않은 전체 조직에 대하여 투과되는 야광 빛의 세기를 표적 부위 선택적으로 측정하는 것보다, 그 결과가 정확할 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법으로 투명화된 뇌 조직에 대하여, 전뇌, 중뇌 및 후뇌를 각각 포함하도록 펀칭된 표적 조직과 빛이 투과된 야광 디스크를 웰 내에 배치하고, 웰 각각에 대하여 분석을 수행할 경우, 전체 뇌 조직에 대하여 전뇌, 중뇌 및 후뇌 부위 각각에 대한 분석을 수행하는 것 보다 크기의 변동이 적어 그 결과가 정확할 수 있다. 나아가, 전뇌 중뇌 및 후뇌 부위와 같은 표적 조직에 대한 정확한 투명도 분석이 가능할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 펀치를 이용하여 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직으로부터 표적 조직을 획득하고, 빛이 투과된 야광 디스크와 절단 필러 내에 표적 조직을 포함하는 펀치를 웰의 내부에 순차적으로 배치할 수 있다. 그 다음, 젤 이미징 분석 장비를 이용하여 야광 디스크로부터 펀치 내의 표적 조직을 투과하여 발하는 야광 빛의 세기를 측정함으로써 조직의 투명도 분석이 수행될 수 있다. 이에, 펀치 내에 고정된 표적 조직은 분석이 수행되는 동안, 투명화에 따른 조직의 크기 축소가 최소화될 수 있다. 이에, 펀치에 의해 고정된 표적 조직에 대한 야광 빛의 세기의 측정은, 절단하지 않은 전체 조직에 대하여 표적 부위에 해당하는 조직 선택적으로 야광 빛의 세기를 측정하는 것 보다, 그 결과가 정확할 수 있다. 예를 들어, 웰의 직경에 대하여 0.8 내지 1.0 배의 직경을 갖는 야광 디스크와, 유기 용매 기반의 투명화 기법으로 투명화된 뇌 조직에 대하여, 전뇌, 중뇌 및 후뇌를 각각 포함하도록 펀칭된 표적 조직을 포함하는 펀치를 각각 웰 내부에 순차적으로 배치한다. 그 다음, 각각의 웰에 대하여 야광 빛의 세기를 측정함으로써 투명도 분석을 수행할 경우, 전체 뇌 조직에 대하여 전뇌, 중뇌 및 후뇌 부위 각각에 대한 분석을 수행하는 것 보다 크기의 변동, 보다 구체적으로 크기가 축소되는 변화가 적을 수 있다. 그 결과, 전뇌 중뇌 및 후뇌 부위와 같은 표적 조직에 대한 정확한 투명도 분석이 가능할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 발명은, 투명화 기법에 따른 조직의 크기의 변화를 최소화 할 수 있는 조직의 투명도 분석 방법을 제공함으로써, 다양한 투명화 기법에 대하여 표준화된 분석을 수행할 수 있는 효과가 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 하이드로겔 기반의 투명화 기법, 수용성 제제 기반의 투명화 기법 또는, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 따라, 조직 크기의 변화를 최소화할 수 있도록 구성된 조직의 투명도 분석 방법을 제공할 수 있는 효과가 있다.
본 발명은, 투명화된 조직에 대하여 흡광도, 투명도 또는 투과되는 야광 빛의 세기를 측정하도록 구성된 새로운 조직의 투명도 분석 방법을 제공함으로써, 투명화 기법에 의해 겔화된 조직에 대한 투명도 분석을 효과적으로 수행할 수 있다.
나아가, 본 발명은 투명화된 조직의 투명도를 다양하게 설정된 조건에서 분석할 수 있고, 연구실 수준에서도 최소한의 분석 장비만을 이용하여 조직의 투명도를 효과적으로 측정할 수 있는 효과가 있다.
이에, 본 발명은 투명화된 다양한 조직에 대한 해부학적 연구에 기여할 수 있는 효과가 있다.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법에 대한 순서도를 도시한 것이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법의 절차를 예시적으로 도시한 것이다.
도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법의 절차에 따라 웰 플레이트에 배치된 표적 조직을 예시적으로 도시한 것이다.
도 2a는 본 발명의 다른 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법에 대한 순서도를 도시한 것이다.
도 2b는 본 발명의 다른 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법의 절차를 예시적으로 도시한 것이다.
도 2c는 본 발명의 다른 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법의 절차에 따라 웰 플레이트에 배치된 표적 조직을 예시적으로 도시한 것이다.
도 3a는 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 따른 조직의 투명화 절차를 도시한 것이다.
도 3b는 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 따른 조직의 투명화 절차를 도시한 것이다.
도 4a는 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 따라 투명화된 조직의 표적 조직을 도시한 것이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 흡광도의 결과를 도시한 것이다.
도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 투명도의 결과를 도시한 것이다.
도 4d는 본 발명의 다른 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 형광 빛의 세기를 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 5a는 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 따라 투명화된 조직의 표적 조직을 도시한 것이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 흡광도의 결과를 도시한 것이다.
도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 투명도의 결과를 도시한 것이다.
도 5d는 본 발명의 다른 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 형광 빛의 세기를 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법의 절차를 예시적으로 도시한 것이다.
도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법의 절차에 따라 웰 플레이트에 배치된 표적 조직을 예시적으로 도시한 것이다.
도 2a는 본 발명의 다른 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법에 대한 순서도를 도시한 것이다.
도 2b는 본 발명의 다른 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법의 절차를 예시적으로 도시한 것이다.
도 2c는 본 발명의 다른 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법의 절차에 따라 웰 플레이트에 배치된 표적 조직을 예시적으로 도시한 것이다.
도 3a는 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 따른 조직의 투명화 절차를 도시한 것이다.
도 3b는 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 따른 조직의 투명화 절차를 도시한 것이다.
도 4a는 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 따라 투명화된 조직의 표적 조직을 도시한 것이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 흡광도의 결과를 도시한 것이다.
도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 투명도의 결과를 도시한 것이다.
도 4d는 본 발명의 다른 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 형광 빛의 세기를 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 5a는 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 따라 투명화된 조직의 표적 조직을 도시한 것이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 흡광도의 결과를 도시한 것이다.
도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 투명도의 결과를 도시한 것이다.
도 5d는 본 발명의 다른 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 형광 빛의 세기를 측정한 결과를 도시한 것이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
이하에서는, 도 1a 내지 1c를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법을 구체적으로 설명한다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법에 대한 순서도를 도시한 것이다. 도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법의 절차를 예시적으로 도시한 것이다. 도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법의 절차에 따라 웰 플레이트에 배치된 표적 조직을 예시적으로 도시한 것이다.
도 1a를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법은, 투명화 기법으로 조직을 투명화하기 위한 처리를 수행하고 (S110), 투명화된 조직의 일부를 포함하고 미리 결정된 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록, 조직을 절단하고 (S120), 광학 리더기를 이용하여, 획득된 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도의 측정 (S130) 이 수행된다.
보다 구체적으로, 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계 (S110) 에서는, 다양한 투명화 기법에 의해 투명화된 조직을 획득할 수 있다. 예를 들어, 도 1b를 참조하면 투명화 대상 조직 (112) 에 대한 투명화 처리가 수행될 수 있다. 이때, 투명화 대상 조직 (112) 은 마우스의 뇌 등의 특정 기관에 대하여 4 %의 PFA (paraformaldehyde) 로 고정시키고, 사상 단면을 갖도록 일정한 두께로 절단된 조직일 수 있다. 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계 (S110) 에서는 이러한 투명화 대상 조직 (112) 에 대하여 다양한 방법으로 투명화가 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, CLARITY, PACT, ACT, 또는 SWITCH와 같은 하이드로겔 기반의 투명화 기법, seeDB, ClearT, ClearT2, ScaleA2, 또는 ScaleS와 같은 수용성 제제 기반의 투명화 기법, 나아가 3DISCO, iDISCO, 또는 BABB와 같은 유기 용매 기반의 투명화 기법을 이용해 투명화 대상 조직 (112) 에 대한 투명화를 수행할 수 있다. 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계 (S110) 의 결과로, 투명화된 조직 (114) 를 획득할 수 있다.
투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계 (S110) 에서는 복수의 투명화 기법으로, 투명도를 분석하고자 하는 복수개의 조직 각각에 대한 투명화가 수행될 수 있다.
한편, 획득된 투명화된 조직 (114) 은 적용된 투명화 기법의 종류에 따라, 크기의 변화가 나타날 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔 기반의 투명화 기법과 수용성 제제 기반의 투명화 기법을 이용할 경우, 투명화된 조직 (114 (a)) 은 하이드로겔화 되거나 수용성 제제를 흡수함에 따라, 원래의 투명화 대상 조직 (112) 보다 미세하게 커질 수 있다. 또한, 유기 용매 기반의 투명화 기법을 이용할 경우, 투명화된 조직 (114 (b)) 은 원래의 투명화 대상 조직 (112) 보다 작아질 수 있다.
이에, 조직을 절단하는 단계 (S120) 에서는 투명화 기법의 종류에 따라 다양한 방법으로 조직을 절단할 수 있다. 예를 들어, 도 1b를 참조하면, 조직을 절단하는 단계 (S120) 에서는 하이드로겔 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직 (114 (a)) 이, 웰 플레이트 (122) 의 각각의 웰 (124) 의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 표적 조직 (126 (a)) 을 획득하도록 펀칭될 수 있다. 이때, 펀칭은 주변 조직의 붕괴 없이 표적 조직 (126 (a)) 을 일정한 모양, 웰 (124) 의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖도록 펀칭할 수 있는, 펀치 (128) 를 이용하여 수행할 수 있다. 보다 구체적인 예를 들어, 웰 플레이트 (122) 가 96 웰 플레이트일 경우, 펀치 (128) 는 내부 직경이 6mm 내지 7mm를 갖는 아일렛 심일 수 있다.
도 1b를 참조하면, 조직을 절단하는 단계 (S120) 에서는 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직 (114 (b)) 이, 웰 (124) 의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 제1 직경을 갖고 웰에 고정되도록 구성된 고정부 (129 (a)) 및 고정부 (129 (a)) 의 내부에 위치하고 제1 직경보다 작은 제2 직경의 홀을 갖고 상기 제2 직경을 갖는 표적 조직 (126 (b)) 을 획득하도록 구성된 절단 필러 (129 (b)) 를 포함하는 펀치 (129) 를 이용하여 펀칭될 수 있다. 이때, 펀칭된 표적 조직 (126 (b)) 은 절단 필러 (129 (b)) 내에 고정될 수 있고, 표적 조직 (126 (b)) 의 직경은 제2 직경과 유사할 수 있다. 보다 구체적인 예를 들어, 웰 플레이트 (122) 가 96 웰 플레이트일 경우, 펀치 (129) 는 고정부 (129 (a)) 에 대한 제1 직경이 6mm 내지 7mm이고, 절단 필러 (129 (b)) 제2 직경이 3mm 내지 4mm인 아일렛 심일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조직의 투명도 분석 방법은, 조직을 절단하는 단계 (S120) 하는 단계 이후에 표적 조직을 웰 플레이트 내부에 배치하는 단계가 더 수행될 수 있다. 예를 들어, 도 1b를 참조하면, 배치하는 단계에서는, 펀치 (128) 에 의해 획득된, 웰 (124) 의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 표적 조직 (126 (a)) 을 각각의 웰 (124) 내부에 배치할 수 있다. 이에 따라, 웰에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 직경을 갖는, 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 기법에 의해 투명화된 표적 조직 (126 (a)) 은, 웰 플레이트 (122) 내부에 배치되어 효과적으로 고정될 수 있다. 이에 투명도가 분석되는 동안, 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 투명화에 따른 표적 조직 (126 (a)) 의 확대와 같은 크기의 변화가 최소화될 수 있다.
나아가, 도 1b를 참조하면, 배치하는 단계에서는 절단 필러 (129 (b)) 내에 고정된, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 표적 조직 (126 (b)) 을 포함하는 펀치 (129) 를 웰 (124) 내에 배치할 수 있다. 이때, 펀치 (129) 는 고정부 (129 (a)) 에 의해 웰 (124) 내에 효과적으로 고정될 수 있다. 이에, 절단 필러 (129 (b)) 내에 표적 조직 (126 (b)) 을 포함하는 펀치 (129) 를 웰 (124) 내에 배치하여 투명도를 분석하는 경우, 분석되는 동안 유기 용매의 이용에 따른 표적 조직 (126 (b)) 의 크기 축소는 최소화될 수 있다.
도 1c를 참조하면, 배치되는 단계에 따라 웰 (124) 내부에 배치된 표적 조직 (126 (a) 또는 126 (b)) 이 도시된다. 보다 구체적으로, 표적 조직 (114 (a) 또는 114 (b)) 이 배치되지 않은 웰 (124) (도 1c의 (a) 참조), 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법으로 투명화된 표적 조직 (126 (a)) 이 배치된 웰 (124) (도 1c의 (b) 참조), 그리고 유기 용매 기반의 투명화 기법으로 투명화된 표적 조직 (126 (b)) 을 포함하는 펀치 (129) 가 배치된 웰 (124) (도 1c의 (c) 참조) 이 예시적으로 도시된다.
마지막으로, 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도의 측정하는 단계 (S130) 에서는 웰 (124) 내에 배치된 표적 조직 (126 (a) 또는 126 (b)) 에 대하여 특정한 파장의 광을 조사하고 OD값을 측정함으로써 이에 대한 투명도 분석이 수행될 수 있다. 예를 들어, 도 1b를 참조하면, 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도의 측정하는 단계 (S130) 에서는, 광학 리더기를 이용하여 표적 조직 (126 (a)) 을 포함하는 웰 플레이트 (122) 에 대하여 빛을 투과하고 각각의 웰 (124) 내의 표적 조직 (126 (a)) 에 대한 흡광도가 측정된다. 나아가, 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도의 측정하는 단계 (S130) 에서는, 측정된 흡광도에 대한 백분율을 취해 각각의 웰 (124) 내의 표적 조직 (126 (a)) 에 대한 투명도가 산출될 수 있다. 그 결과, 표적 부위를 포함하며 웰 (124) 사이즈에 맞도록 펀칭된 표적 조직 (126 (a)) 에 대한 흡광도 및 투명도의 측정은, 절단하지 않은 투명화된 조직 (114 (a)) 에 대하여 표적 부위에 해당하는 조직을 선택하여 분석을 수행하는 것보다, 그 결과가 정확할 수 있다.
도 1b를 참조하면, 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도의 측정하는 단계 (S130) 에서는 웰 (124) 내에 배치된 절단 필러 (129 (b)) 내에 표적 조직 (126 (b)) 에 대한 흡광도 또는 투명도 분석이 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도의 측정하는 단계 (S130) 에서는 광학 리더기를 이용하여 표적 조직 (126 (b)) 과 펀치 (129) 를 포함하는 웰 플레이트 (122) 에 대하여 빛을 투과하고 각각의 웰 (124) 내의 표적 조직 (126 (b)) 에 대한 흡광도가 측정된다. 나아가, 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도의 측정하는 단계 (S130) 에서는, 측정된 흡광도에 대한 백분율을 취해 각각의 웰 (124) 내의 표적 조직 (126 (b)) 에 대한 투명도가 산출될 수 있다. 이때, 펀치 (129) 에 의해 고정된 표적 조직 (126 (b)) 은 광학 리더기에 의해 광이 효과적으로 조사될 수 있다. 그 결과, 펀치 (129) 에 의해 고정된 표적 조직 (126 (b)) 에 대한 흡광도 및 투명도의 측정은, 절단하지 않은 투명화된 조직 (114 (b)) 에 대하여 표적 부위에 해당하는 조직을 선택하여 분석을 수행하는 것보다, 그 결과가 정확할 수 있다.
이하에서는, 도 2a 및 2c를 참조하여, 본 발명의 다른 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법을 구체적으로 설명한다. 이때, 설명의 편의를 위해 도 1a 내지 도 1c에서 사용된 도면 부호를 함께 이용한다.
도 2a는 본 발명의 다른 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법에 대한 순서도를 도시한 것이다. 도 2b는 본 발명의 다른 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법의 절차를 예시적으로 도시한 것이다. 도 2c는 본 발명의 다른 실시예에 따른, 조직 투명도 분석 방법의 절차에 따라 웰 플레이트에 배치된 표적 조직을 예시적으로 도시한 것이다.
도 2a를 참조하면, 본 발명의 다른 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법은, 투명화 기법으로 조직을 투명화하기 위한 처리를 수행하고 (S210), 투명화된 조직의 일부를 포함하고 미리 결정된 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록, 조직을 절단하고 (S220), 미리 결정된 크기를 갖는 야광 디스크를 획득 (S230) 하도록 구성된다. 그 다음, 야광 디스크에 빛을 투과하고 (S240), 빛이 투과된 야광 디스크에 표적 조직을 배치하며 (S250), 마지막으로 젤 이미징 분석 장비를 이용하여 야광 디스크로부터 표적 조직을 투과하여 발하는 야광 빛의 세기를 측정 (S260) 이 수행된다. 본 발명의 다른 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에서 이용되는 웰 플레이트 (122) 는 야광 빛의 세기를 측정하기 위한 암막 조건을 형성하기 위해 검은색 코팅된 플레이트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계 (S210) 에서는, 다양한 투명화 기법에 의해 투명화된 조직을 획득할 수 있다. 예를 들어, 도 2b를 참조하면 투명화 대상 조직 (112) 에 대한 투명화 처리가 수행될 수 있다. 이때, 투명화 대상 조직 (112) 은 마우스의 뇌 등의 특정 기관에 대하여 4 %의 PFA (paraformaldehyde) 로 고정시키고, 사상 단면을 갖도록 일정한 두께로 절단된 조직일 수 있다. 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계 (S210) 에서는 이러한 투명화 대상 조직 (112) 에 대하여 다양한 방법으로 투명화가 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, CLARITY, PACT, ACT, 또는 SWITCH와 같은 하이드로겔 기반의 투명화 기법, seeDB, ClearT, ClearT2, ScaleA2, 또는 ScaleS와 같은 수용성 제제 기반의 투명화 기법, 나아가 3DISCO, iDISCO, 또는 BABB와 같은 유기 용매 기반의 투명화 기법을 이용해 투명화 대상 조직 (112) 에 대한 투명화를 수행할 수 있다. 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계 (S210) 의 결과로, 투명화된 조직 (114) 를 획득할 수 있다.
투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계 (S210) 에서는 복수의 투명화 기법으로, 투명도를 분석하고자 하는 복수개의 조직 각각에 대한 투명화가 수행될 수 있다.
한편, 획득된 투명화된 조직 (114) 은 적용된 투명화 기법의 종류에 따라, 크기의 변화가 나타날 수 있다. 예를 들어, 하이드로겔 기반의 투명화 기법과 수용성 제제 기반의 투명화 기법을 이용할 경우, 투명화된 조직 (114 (a)) 은 하이드로겔화 되거나 수용성 제제를 흡수함에 따라, 원래의 투명화 대상 조직 (112) 보다 미세하게 커질 수 있다. 또한, 유기 용매 기반의 투명화 기법을 이용할 경우, 투명화된 조직 (114 (b)) 은 원래의 투명화 대상 조직 (112) 보다 작아질 수 있다.
이에, 조직을 절단하는 단계 (S220) 에서는 투명화 기법의 종류에 따라 다양한 방법으로 조직을 전단할 수 있다. 예를 들어, 도 2b를 참조하면, 조직을 절단하는 단계 (S220) 에서는 하이드로겔 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직 (114 (a)) 이, 젤 이미징 분석에 적합한 웰 플레이트 (122) 의 각각의 웰 (124) 의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 표적 조직 (126 (a)) 을 획득하도록 펀칭될 수 있다. 이때, 펀칭은 주변 조직의 붕괴 없이 표적 조직 (126 (a)) 을 일정한 모양, 웰 (124) 의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖도록 펀칭할 수 있는, 펀치 (128) 를 이용하여 수행될 수 있다. 보다 구체적인 예를 들어, 웰 플레이트 (122) 가 96 웰 플레이트일 경우, 펀치 (128) 는 내부 직경이 6mm 내지 7mm를 갖는 아일렛 심일 수 있다.
도 2b를 참조하면, 조직을 절단하는 단계 (S220) 에서는 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직 (114 (b)) 이, 웰 (124) 의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 제1 직경을 갖고 웰에 고정되도록 구성된 고정부 (129 (a)) 및 고정부 (129 (a)) 의 내부에 위치하고 제1 직경보다 작은 제2 직경의 홀을 갖고 상기 제2 직경을 갖는 표적 조직 (126 (b)) 을 획득하도록 구성된 절단 필러 (129 (b)) 를 포함하는 펀치 (129) 를 이용하여 펀칭될 수 있다. 이때, 표적 조직 (126 (b)) 은 절단 필러 (129 (b)) 내에 고정될 수 있고, 표적 조직 (126 (b)) 의 직경은 제2 직경과 유사할 수 있다. 보다 구체적인 예를 들어, 웰 플레이트 (122) 가 96 웰 플레이트일 경우, 펀치 (129) 는 고정부 (129 (a)) 에 대한 제1 직경이 6mm 내지 7mm이고, 절단 필러 (129 (b)) 제2 직경이 3mm 내지 4mm인 아일렛 심일 수 있다.
그 다음, 야광 디스크를 획득하는 단계 (S230) 에서는 미리 결정된 크기를 갖는 야광 디스크가 획득될 수 있다. 예를 들어, 도 2b를 참조하면, 야광 디스크를 획득하는 단계 (S230) 에서는 일정 시간 동안 빛이 투과되어 야광을 발할 수 있는 야광 디스크 (232) 가 획득될 수 있다. 이때, 야광 디스크 (232) 의 직경은 웰 (124) 의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 가질 수 있다. 구체적인 예를 들어, 웰 플레이트 (122) 가 96 웰 플레이트일 경우, 야광 디스크 (232) 는 직경이 6mm 내지 7mm를 가질 수 있다.
한편, 야광 디스크에 빛을 투과하는 단계 (S240) 에서는, 야광 빛을 발광할 수 없는 상태의 야광 디스크 (232) 에 대하여 빛이 투과될 수 있다.
다음으로, 빛이 투과된 야광 디스크에, 획득된 표적 조직을 배치하는 단계 (S250) 에서는 야광 디스크 (232) 및 표적 조직 (126 (a) 또는 126 (b)) 이 웰 (124) 내부에 순차적으로 배치될 수 있다. 예를 들어, 도 2b를 참조하면, 배치하는 단계 (S250) 에서는, 야광 디스크 (232) 및 웰 (124) 의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 표적 조직 (126 (a)) 을 웰 (124) 내부에 순차적으로 배치할 수 있다. 이에 따라, 웰에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 직경을 갖는, 야광 디스크 (232) 및 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 기법에 의해 투명화된 표적 조직 (126 (a)) 은, 웰 플레이트 (122) 내부에 배치되어 효과적으로 고정될 수 있다. 이에 투명도가 분석되는 동안, 야광 디스크로부터 표적 조직 (126 (a)) 을 투과하여 발하는 야광 빛의 세기가 측정되는 동안, 표적 조직의 확대와 같은 투명화에 따른 조직의 크기 변화는 최소화될 수 있다.
도 2b를 참조하면, 빛이 투과된 야광 디스크에, 획득된 표적 조직을 배치하는 단계 (S250) 에서는, 야광 디스크 (232) 및 절단 필러 (129 (b)) 내에 고정된 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 표적 조직 (126 (b)) 를 포함하는 펀치 (129) 가 웰 (124) 내에 순차적으로 배치할 수 있다. 이때, 웰 (124) 의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 야광 디스크 (232) 및 펀치 (129) 의 고정부 (129 (a)) 는 웰 (124) 내에 효과적으로 고정될 수 있다. 이에, 절단 필러 (129 (b)) 내에 표적 조직 (126 (b)) 을 포함하는 펀치 (129) 를 웰 (124) 내에 배치하여 투명도를 분석하는 경우, 분석되는 동안 유기 용매의 이용에 따른 표적 조직 (126 (b)) 의 크기 축소는 최소화될 수 있다.
도 2c를 참조하면, 빛이 투과된 야광 디스크에, 획득된 표적 조직을 배치하는 단계 (S250) 에 따라 웰 (124) 내부에 배치된 야광 디스크 (232) 와 표적 조직 (126 (a) 또는 126 (b)) 이 도시된다. 보다 구체적으로, 야광 디스크 (232) 만 배치된 웰 (124) (도 2c의 (a) 참조), 야광 디스크 (232) 및 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법으로 투명화된 표적 조직 (126 (a)) 이 배치된 웰 (124) (도 2c의 (b) 참조), 그리고 야광 디스크 (232) 및 유기 용매 기반의 투명화 기법으로 투명화된 표적 조직 (126 (b)) 을 포함하는 펀치 (129) 가 배치된 웰 (124) (도 2c의 (c) 참조) 이 예시적으로 도시된다.
한편, 본 발명의 다른 실시예에 따른 조직의 투명도 분석 방법에서, 조직을 절단하는 단계 (S220), 야광 디스크를 획득하는 단계 (S230), 야광 디스크에 빛을 투과하는 단계 (S240) 및 빛이 투과된 야광 디스크에, 획득된 표적 조직을 배치하는 단계 (S250) 는 순차적으로 수행되는 것은 아니다. 나아가, 이상의 단계 (S220, S230, S240 및 S250) 각각은 다른 단계가 수행되는 동안 동시에 수행될 수 있다. 예를 들어, 야광 디스크 (232) 는 조직을 절단하는 단계 (S220) 전에 획득될 수 있다. 나아가, 야광 디스크 (232) 는 웰 플레이트 (122) 의 각각의 웰 (124) 에 미리 배치될 수 있고, 배치된 야광 디스크 (232) 에 일정한 시간 동안 빛을 조사한 후 표적 조직 (126 (a) 또는 126 (b)) 가 그 위에 배치될 수 있다.
마지막으로, 마지막으로 야광 빛의 세기를 측정 하는 단계 (S260) 에서는 웰 (124) 내의 야광 디스크 (232) 에 놓여진 표적 조직 (126 (a) 또는 126 (b)) 에 대하여 암막 상태에서의 투과되는 야광 빛의 세기를 측정함으로써 이의 투명도가 분석될 수 있다. 예를 들어, 도 2b를 참조하면, 야광 빛의 세기를 측정 하는 단계 (S260) 에서는, 젤 이미징 분석 장비를 이용하여 표적 조직 (126 (a)) 을 포함하는 웰 플레이트 (122) 에 대하여 야광 디스크 (232) 로부터 표적 조직 (126 (a)) 을 통해 투과되는 야광 빛의 세기를 측정한다. 그 결과, 표적 부위를 포함하며 웰 (124) 사이즈에 맞도록 펀칭된 표적 조직 (126 (a)) 에 대한 야광 빛의 세기의 측정은, 절단하지 않은 투명화된 조직 (114 (a)) 에 대하여 표적 부위에 해당하는 조직을 선택하여 분석을 수행하는 것보다, 그 결과가 정확할 수 있다.
도 2b를 참조하면, 야광 빛의 세기를 측정 하는 단계 (S260) 에서는 웰 (124) 내의 야광 디스크 (232) 에 놓여진 절단 필러 (129 (b)) 내에 표적 조직 (126 (b)) 에 대하여 암막 상태에서의 투과되는 야광 빛의 세기를 측정함으로써 이의 투명도가 분석될 수 있다. 이에, 야광 디스크 (232) 로부터 투과된 펀치 (129) 에 의해 고정된 표적 조직 (126 (b)) 에 대한 야광 빛의 세기를 측정하는 것은, 절단하지 않은 투명화된 조직 (114 (b)) 에 대하여 표적 부위에 해당하는 조직을 선택하여 야광 빛의 세기를 측정하는 것보다, 그 결과가 정확할 수 있다.
이하에서는, 도 3a 및 도 3b를 참조하여, 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는 투명화 기법에 대하여 구체적으로 설명한다. 이때, 하이드로겔 기반의 투명화 기법으로 mPACT 기법을, 유기용매 기반의 1P BABB를 예로 들어 설명하나 본 발명의 다양한 실시예에서 이용될 수 있는 투명화 기법은 이에 제한되는 것은 아니다.
도 3a는 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 따른 조직의 투명화 절차를 도시한 것이다.
도 3a의 (a)를 참조하면, mPACT 기법에 따른 투명화 대상 기관으로 설정된 마우스의 뇌가 도시된다. 이때, 투명화를 위해 마우스의 뇌는 4 %의 PFA로 고정되고, 사상 단면을 갖도록 4mm의 일정한 두께로 절단될 수 있다.
도 3a의 (b)를 참조하면, 사상 단면을 갖는 마우스의 뇌조직에 대하여 mPACT 기법에 의한 투명화 과정이 된다. 보다 구체적으로, mPACT 기법에 따르면 PFA로 고정된 투명화 대상 조직은, 혼합된 A.A (acrylamide) 및 Azobis 계열의 VA-044가 처리된다. 그 다음, 8 %의 SDS (sodium dodecylsulfate) 의 세척 용액 및 0.5 % T.G (1-Thioglycerol) 의 비-갈색화 제제가 처리된다. 그 결과 불투명했던 대상 조직은 투명화 8일 후 하이드로겔화 되어, 투명한 상태가 된다.
도 3a의 (c)를 참조하면, 투명화가 수행되기 전의 조직 및 mPACT 기법에 따라 투명화된 조직이 함께 도시된다. 보다 구체적으로, mPACT 기법에 따라 투명화된 조직은 투명화 전의 조직의 크기보다 커진 것을 알 수 있다. 이러한 현상은, 대상 조직이 하이드로겔화를 위해 처리된 제제를 흡수함에 따라 나타날 수 있다. 이러한, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 따른 투명화된 조직의 크기의 변화는, 조직의 투명도에 대하여 불명확한 분석의 요인이 될 수 있다.
도 3b는 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 따른 조직의 투명화 절차를 도시한 것이다.
도 3b의 (a)를 참조하면, 1P-BABB 기법에 따른 투명화 대상 기관으로 설정된 마우스의 뇌가 도시된다. 이때, 투명화를 위해 마우스의 뇌는 4 %의 PFA로 고정되고, 사상 단면을 갖도록 4mm의 일정한 두께로 절단될 수 있다.
도 3b의 (b)를 참조하면, 사상 단면을 갖는 마우스의 뇌조직에 대하여 1P-BABB 기법에 의한 투명화 과정이 된다. 보다 구체적으로, 1P-BABB 기법에 따르면 PFA로 고정된 투명화 대상 조직은, 25 %, 50 %, 70 % 및 100 %의 1-P (1-propanol) 에 점진적으로 담겨 배양된다. 그 결과 1-P에 의해 대상 조직은 고정화되고, 약간의 pH조절제와, 1-P (1-propanol) 를 이용하여 다시 한번 대상 조직이 고정되고, BA (benzyl alcohol) 와 BB (benzyl benzoate) 의 혼합액 (BABB) 에 담겨 배양되며 시간이 경과된 후 투명화된 조직을 획득할 수 있다. 한편, 투명화가 진행될수록, 조직의 크기는 투명화 전의 크기보다 작아지는 것으로 나타난다.
도 3b의 (c)를 참조하면, 투명화가 수행되기 전의 조직 및 1P-BABB 기법 에 따라 투명화된 조직이 함께 도시된다. 보다 구체적으로, 1P-BABB 기법에 따라 투명화된 조직은 투명화 전의 조직의 크기보다 작아진 것을 알 수 있다. 이러한 현상은, 대상 조직이 휘발성 알코올에 의해 고정화 됨에 따라 나타날 수 있다. 이러한, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 따른 투명화된 조직의 크기의 변화는, 조직의 투명도에 대하여 불명확한 분석의 요인이 될 수 있다.
실시예 1: 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조직의 투명도 분석 방법을 이용한, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직의 투명도 분석
이하의 실시예 1에서는 도 4a 내지 4d를 참조하여 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직의 투명도 분석결과에 대하여 설명한다. 이때 투명도 분석을 위해, mPACT 기법에 따라 투명화된 쥐의 뇌 조직을 예로 들어 설명하나, 투명도 분석 대상 조직 및 투명화 기법은 이에 제한되는 것이 아니다.
도 4a는 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 따라 투명화된 조직의 표적 조직을 도시한 것이다. 도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 흡광도의 결과를 도시한 것이다. 도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 투명도의 결과를 도시한 것이다. 도 4d는 본 발명의 다른 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 형광 빛의 세기를 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 4a를 참조하면, 전술한 mPACT 기법에 따라 투명화된 뇌 조직으로부터, 대뇌 피질을 포함하는 전뇌 부위, 중뇌 부위 및 소뇌를 포함하는 후뇌 부위를 포함하는 표적 조직을 획득한다. 보다 구체적으로, 직경 6mm의 아일렛을 이용하여 전뇌, 중뇌 및 후뇌 부위를 펀칭하고, 펀칭된 세 개의 표적 조직에 대하여 다양한 투명도 분석이 수행된다.
도 4b의 및 4c를 참조하면, 펀칭된 전뇌, 중뇌 및 후뇌에 대하여 측정한, 조사된 파장에 따른 흡광도 및 투명도가 도시된다.
보다 구체적으로, 본 분석은 직경 6mm의 아일렛을 이용하여 투명화 되기 전의 사상단면을 갖는 쥐의 뇌 조직에 대하여 전뇌, 중뇌, 후뇌 부위를 펀칭하여 획득하고, mPACT 기법에 따라 투명화된 뇌 조직에 대하여 전술한 부위와 동일한 전뇌, 중뇌 및 후뇌 부위를 펀칭하여 획득한다.
이상의 펀칭된 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 는 흡광도 및 투명도 분석에 있어서 실험군으로 설정되었다. 나아가, 부위 전뇌 (투명화 전), 중뇌 (투명화 전), 후뇌 (투명화 전) 및, 조직이 들어가있지 않은 빈 웰, nRIMS 고정액 및 1 % 아가 (agar) 는 흡광도 및 투명도 분석에 있어서 대조군으로 설정되었다.
흡광도 분석은 각각의 실험군 및 대조군에 해당하는 표적 조직 또는 대조 물질을 96 웰 플레이트의 웰에 넣고, ELISA 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 각각의 웰에 다양한 영역의 파장을 조사한 후 OD값을 측정함으로써 수행되었다.
도 4b를 참조하면, 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 의 실험군에 대한 흡광도는 빈 웰, nRIMS 및 1 % 아가의 대조군과 비슷한 수준으로 나타난다. 이와 대조적으로 전뇌 (투명화 전), 중뇌 (투명화 전), 후뇌 (투명화 전) 의 대조군은 상대적으로 높은 흡광도를 나타낸다. 한편, 전뇌, 중뇌 및 후뇌의 각각의 표적 조직에 대한 유의한 흡광도 차이는 없는 것으로 나타난다.
도 4c를 참조하면, 측정된 OD값에 대하여 백분율을 취하여 산출된 투명도가 도시된다. 보다 구체적으로, 빈 웰, nRIMS의 대조군에 대한 투명도가 가장 높은 것으로 나타났다. 이때, 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 의 실험군에 대한 투명도는 1 % 아가의 대조군과 비슷한 수준으로 나타난다. 한편 이상의 결과와 대조적으로, 전뇌 (투명화 전), 중뇌 (투명화 전), 후뇌 (투명화 전) 의 대조군의 투명도는 0에 가까운 수준으로 나타난다.
이때, 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 의 각각의 실험군에 대한 투명도는 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 순서로 투명도가 높은 것으로 나타난다.
한편, 표적 조직에 대하여 측정된 흡광도는 투명도와 반비례할 수 있다. 예를 들어, 흡광도가 상대적으로 높은 조직은, 흡광도가 상대적으로 낮은 조직보다 투명도가 낮을 수 있다.
이와 같이, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 복수개의 표적 조직은, 본 발명의 일 실시예에 따른 투명도 분석 방법에 따라, 표적 조직 각각에 대한 흡광도 및 이에 따른 투명도를 측정함으로써, 각각의 표적 조직에 대한 투명화된 정도 및 투명도의 차이가 분석될 수 있다.
도 4d의 (a) 및 (b)를 참조하면, 펀칭된 전뇌, 중뇌 및 후뇌에 대하여 측정한, 조사된 파장에 따른 야광 빛의 세기를 측정한 값이 도시된다.
보다 구체적으로, 본 분석은 도 4b 및 4c에서 전술한 방법과 동일한, mPACT 기법에 따라 투명화된 실험군, 및 대조군이 준비되었다. 보다 구체적으로, mPACT 기법에 따라 투명화된 뇌 조직으로부터 펀칭된 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 의 표적 조직은 야광 빛의 세기 측정에 있어서 실험군으로 설정되었다. 나아가, 야광 디스크 및 표적 조직이 들어가 있지 않은 웰, 야광 디스크만 들어가 있는 웰은, 야광 빛의 세기 측정에 있어서 대조군으로 설정되었다.
야광 빛의 세기 측정은 96 웰 블랙 플레이트에서 수행되었으며, 실험군의 표적 조직이 들어갈 각각의 웰과 대조군의 야광 디스크만 들어갈 웰에는, 웰 사이즈에 알맞게 컷팅된 직경 6mm의 야광 디스크를 먼저 배치하였다. 그 다음, 일정한 시간 동안 웰 플레이트를 태양광 또는 형광등의 빛에 노출하였다. 다음으로, 야광 디스크가 배치된 웰 각각에 펀칭된 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 의 표적 조직을 배치한 후, Gel Doc+를 이용하여 30초 동안 암 조건에서 표적 조직을 투과하여 나타나는 야광 빛의 세기를 측정하였다.
도 4d의 (a)를 참조하면, 야광 디스크 및 표적 조직이 배치되어 있지 않은 웰 (표적 조직 (-), 야광 디스크 (-)) 과 대조적으로, 야광 디스크와 펀칭된 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 의 표적 조직을 배치한 실험군의 웰에서는 암조건에서 야광 빛이 각각의 표적 조직을 통해 발하는 것으로 나타난다. 한편, 야광 디스크와 펀칭된 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 의 표적 조직을 배치한 실험군의 웰에서는, 야광 디스크만 배치된 웰 (표적 조직 (-), 야광 디스크 (+)) 과는 유사한 수준으로 야광 빛이 표적 조직을 통해 발하는 것으로 나타난다. 실험군 각각을 살펴보면, 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 순서로 야광 빛의 세기가 큰 것으로 나타난다.
도 4d의 (b)를 참조하면, Gel Doc+의 소프트웨어에 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 의 실험군 각각의 웰에서 투과되는 빛의 세기와 동일한 측정 범위를 설정하고, 야광 빛의 세기를 비교하여 그래프화한 결과가 도시된다. 도 4d의 (a)의 결과와 동일하게, 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 순서로 야광 빛의 세기가 큰 것으로 나타난다. 이때, 측정된 야광 빛의 세기가 큰 표적 조직은, 투명도가 높은 표적 조직이라는 것을 의미할 수 있다.
이와 같이, 하이드로겔 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 복수개의 표적 조직은, 본 발명의 다른 실시예에 따른 투명도 분석 방법에 따라, 야광 디스크로부터 표적 조직 각각에 대하여 발하는 야광 빛의 세기를 측정함으로써, 각각의 표적 조직에 대한 투명화된 정도 및 투명도의 차이가 분석될 수 있다.
이상의 실시예 1의 결과로, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법은, 하이드로겔 기반의 투명화 기법으로 투명화된 조직에 대하여 크기의 변화를 최소화 하여 투명도를 분석할 수 있는 다양한 방법을 제공할 수 있다.
실시예 2: 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조직의 투명도 분석 방법을 이용한, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직의 투명도 분석
이하의 실시예 2에서는 도 5a 내지 5d를 참조하여 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직의 투명도 분석결과에 대하여 설명한다. 이때 투명도 분석을 위해, 1P-BABB 기법에 따라 투명화된 쥐의 뇌 조직을 예로 들어 설명하나, 투명도 분석 대상 조직 및 투명화 기법은 이에 제한되는 것이 아니다.
도 5a는 본 발명의 다양한 실시예에서 이용되는, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 따라 투명화된 조직의 표적 조직을 도시한 것이다. 도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 흡광도의 결과를 도시한 것이다. 도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 투명도의 결과를 도시한 것이다. 도 5d는 본 발명의 다른 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법에 따라, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직에 대하여 측정된 형광 빛의 세기를 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 5a를 참조하면, 전술한 1P-BABB 기법에 따라 투명화된 뇌 조직으로부터, 대뇌 피질을 포함하는 전뇌 부위, 중뇌 부위 및 소뇌를 포함하는 후뇌, 시상하부 및 뇌교 부위를 포함하는 표적 조직을 획득한다. 보다 구체적으로, 직경 6mm의 아일렛을 이용하여 전뇌, 중뇌, 후뇌, 시상하부 및 뇌교 부위를 펀칭하고, 펀칭된 다섯 개의 표적 조직에 대하여 다양한 투명도 분석이 수행된다.
도 5b 및 5c를 참조하면, 펀칭된 전뇌, 중뇌, 후뇌, 시상하부 및 뇌교의 표적 조직에 대하여 측정한, 조사된 파장에 따른 흡광도 및 투명도가 도시된다.
보다 구체적으로, 본 분석은 외부 직경이 6mm, 내부 직경이 3.5mm인 아일렛을 이용하여, 1P-BABB 기법에 따라 투명화된 뇌 조직에 대하여 전뇌, 중뇌, 후뇌, 시상하부 및 뇌교의 부위를 펀칭하여 획득한다. 이때, 펀칭된 각각의 표적 조직의 직경은 아일렛의 내부직경인 3.5mm와 유사할 수 있다. 나아가, 아일렛의 외부 직경은 본 분석에서 이용되는 96 웰 플레이트의 웰의 직경의 범위에 있어, 표적 조직을 포함하는 아일렛은 웰 내에서 안정적으로 고정될 수 있다.
아일렛에 고정된 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후), 후뇌 (투명화 후), 시상하부 (투명화 후) 및 뇌교 (투명화 후) 의 표적 조직은 흡광도 및 투명도 분석에 있어서 실험군으로 설정되었다. 나아가, 조직이 들어가있지 않은 빈 웰 및 표적 조직을 포함하지 않은 아일렛은 흡광도 및 투명도 분석에 있어서 대조군으로 설정되었다.
흡광도 분석은 각각의 실험군에 대하여 해당하는 표적 조직이 고정된 아일렛을 96 웰 플레이트의 웰 내에 배치하고, ELISA 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 각각의 웰에 다양한 영역의 파장을 조사한 후 OD값을 측정함으로써 수행되었다.
도 5b를 참조하면, 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후), 후뇌 (투명화 후), 시상하부 (투명화 후) 및 뇌교 (투명화 후) 의 실험군에 대한 흡광도는, 350 nm 내지 450 nm에서 0에 가까운 수준을 나타내는 빈 웰 및 아일렛의 대조군과 상이하게, 0.5 내지 3.5의 높은 수준으로 나타난다. 한편, 각각의 실험군에 대한 흡광도는 뇌교 (투명화 후), 시상하부 (투명화 후), 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 순서로 낮은 순서로 높은 것으로 나타난다. 특히, 동일한 파장에서의 뇌교 (투명화 후) 와 후뇌 (투명화 후) 의 흡광도는 약 1.5배의 차이를 보인다.
도 5c를 참조하면, 측정된 OD값에 대하여 백분율을 취하여 산출된 투명도가 도시된다. 보다 구체적으로, 빈 웰, 아일렛의 대조군에 대한 투명도가 가장 높은 것으로 나타났다. 이때, 도 5b의 결과와 유사하게, 각각의 실험군에 대한 투명도는 뇌교 (투명화 후), 시상하부 (투명화 후), 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 후뇌 (투명화 후) 순서로 높은 것으로 나타난다.
한편, 표적 조직에 대하여 측정된 흡광도는 투명도와 반비례할 수 있다. 예를 들어, 흡광도가 상대적으로 높은 조직은, 흡광도가 상대적으로 낮은 조직보다 투명도가 낮을 수 있다.
이와 같이, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 복수개의 표적 조직은, 본 발명의 일 실시예에 따른 투명도 분석 방법에 따라, 표적 조직 각각에 대한 흡광도 및 이에 따른 투명도를 측정함으로써, 각각의 표적 조직에 대한 투명화된 정도 및 투명도의 차이가 분석될 수 있다.
도 5d의 (a) 및 (b)를 참조하면, 펀칭된 전뇌, 중뇌, 후뇌, 시항하부 및 뇌교에 대하여 측정한, 조사된 파장에 따른 야광 빛의 세기를 측정한 값이 도시된다.
보다 구체적으로, 본 분석은 도 5b 및 5c에서 전술한 방법과 동일한, 1P-BABB 기법에 따라 투명화된 실험군, 및 대조군이 준비되었다. 보다 구체적으로, 1P-BABB 기법에 따라 투명화된 뇌 조직으로부터 펀칭된 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후), 후뇌 (투명화 후), 시상하부 (투명화 후) 및 뇌교 (투명화 후) 의 표적 조직은 야광 빛의 세기 측정에 있어서 실험군으로 설정되었다. 나아가, 야광 디스크만 들어가 있는 웰은, 야광 빛의 세기 측정에 있어서 대조군으로 설정되었다.
야광 빛의 세기 측정은 96 웰 블랙 플레이트에서 수행되었으며, 실험군의 아일렛에 고정된 표적 조직이 들어갈 각각의 웰과 대조군의 야광 디스크만 들어갈 웰에는, 웰 사이즈에 알맞게 컷팅된 직경 6mm의 야광 디스크를 먼저 배치하였다. 그 다음, 일정한 시간 동안 웰 플레이트를 태양광 또는 형광등의 빛에 노출하였다. 다음으로, 야광 디스크가 배치된 웰 각각에 펀칭된 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 후뇌 (투명화 후), 시상하부 (투명화 후) 및 뇌교 (투명화 후) 의 표적 조직을 포함하는 아일렛을 배치한 후, Gel Doc+를 이용하여 30초 동안 암 조건에서 표적 조직을 투과하여 나타나는 야광 빛의 세기를 측정하였다.
도 5d의 (a)를 참조하면, 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 후뇌 (투명화 후), 시상하부 (투명화 후) 및 뇌교 (투명화 후) 의 표적 조직을 배치한 실험군의 웰에서는 암조건에서 야광 빛이 각각의 표적 조직을 통해 발하는 것으로 나타난다. 이때, 실험군의 웰은 조직이 들어있지 않은 야광 디스크만 배치한 대조군 (표적 조직 (-)) 에 비하여 발하는 야광 빛의 세기는 약한 것으로 나타난다.
한편, 각각의 실험군에서 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 및 시상하부 (투명화 후) 의 야광 빛은 후뇌 (투명화 후) 및 뇌교 (투명화 후) 의 야광 빛보다 강하게 나타난다.
도 5d의 (b)를 참조하면, Gel Doc+의 소프트웨어에 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후) 후뇌 (투명화 후), 시상하부 (투명화 후) 및 뇌교 (투명화 후) 의 실험군 각각의 웰에서 투과되는 빛의 세기와 동일한 측정 범위를 설정하고, 야광 빛의 세기를 비교하여 그래프화한 결과가 도시된다. 보다 구체적으로, 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후), 시상하부 (투명화 후) 의 야광 빛의 세기는 유사한 것으로 나타난다. 이와 대조적으로, 뇌교 (투명화 후), 후뇌 (투명화 후) 는 전뇌 (투명화 후), 중뇌 (투명화 후), 시상하부 (투명화 후) 보다 야광 빛의 세가 낮은 것으로 나타난다. 이때, 측정된 야광 빛의 세기가 큰 표적 조직은, 투명도가 높은 표적 조직이라는 것을 의미할 수 있다.
이와 같이, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 복수개의 표적 조직은, 본 발명의 다른 실시예에 따른 투명도 분석 방법에 따라, 야광 디스크로부터 표적 조직을 포함하는 아일렛 각각에 대하여 발하는 야광 빛의 세기를 측정함으로써, 각각의 표적 조직에 대한 투명화된 정도 및 투명도의 차이가 분석될 수 있다.
이상의 실시예 2의 결과로, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 조직 투명도 분석 방법은, 유기 용매 기반의 투명화 기법으로 투명화된 조직에 대하여 크기의 축소를 최소화 하여 투명도를 분석할 수 있는 다양한 방법을 제공할 수 있다.
한편, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 투명도 분석 방법은, 투명화 기법에 따라 조직의 크기의 변화를 최소화 할 수 있는 새로운 투명도 분석 방법을 제공함으로써, 다양한 투명화 기법에 따라 투명화된 조직에 대하여 표준화된 분석을 수행할 수 있는 효과가 있다.
특히, 본 발명은 하이드로겔 기반의 투명화 기법, 수용성 제제 기반의 투명화 기법 또는, 유기 용매 기반의 투명화 기법에 따라, 조직 크기의 변화를 최소화할 수 있도록 구성된 조직의 투명도 분석 방법을 제공하여, 동일한 조직에 대하여 상이한 투명화 기법에 적용되더라도, 표준화된 투명도 분석이 가능할 수 있다.
이에, 본 발명은 투명화된 조직에 대한 다양한 투명도 분석 방법 및 이에 대한 해석 방법을 제공함으로써, 해부학적 연구 등 다양한 구조적 연구에 기여할 수 있다.
본 발명의 여러 실시예들의 각각 특징들이 부분적으로 또는 전체적으로 서로 결합 또는 조합 가능하며, 당업자가 충분히 이해할 수 있듯이 기술적으로 다양한 연동 및 구동이 가능하며, 각 실시예들이 서로에 대하여 독립적으로 실시 가능할 수도 있고 연관 관계로 함께 실시 가능할 수도 있다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
S110: 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계
S120: 조직을 절단하는 단계
S130: 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도의 측정하는 단계
112: 투명화 대상 조직
114: 투명화된 조직
114 (a): 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직
114 (b): 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직
122: 웰 플레이트
124: 웰
126 (a): 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 표적 조직
126 (b): 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 표적 조직
128, 129: 펀치
129 (a): 펀치의 고정부
129 (b): 펀치의 절단 필러
S210: 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계
S220: 조직을 절단하는 단계
S230: 야광 디스크를 획득하는 단계
S240: 야광 디스크에 빛을 투과하는 단계
S250: 획득된 표적 조직을 배치하는 단계
S260: 야광 빛의 세기를 측정 하는 단계
232: 야광 디스크
S120: 조직을 절단하는 단계
S130: 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도의 측정하는 단계
112: 투명화 대상 조직
114: 투명화된 조직
114 (a): 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직
114 (b): 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 조직
122: 웰 플레이트
124: 웰
126 (a): 하이드로겔 기반 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 표적 조직
126 (b): 유기 용매 기반의 투명화 기법에 의해 투명화된 표적 조직
128, 129: 펀치
129 (a): 펀치의 고정부
129 (b): 펀치의 절단 필러
S210: 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계
S220: 조직을 절단하는 단계
S230: 야광 디스크를 획득하는 단계
S240: 야광 디스크에 빛을 투과하는 단계
S250: 획득된 표적 조직을 배치하는 단계
S260: 야광 빛의 세기를 측정 하는 단계
232: 야광 디스크
Claims (15)
- 투명화 기법으로 조직을 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계;
투명화된 상기 조직의 일부를 포함하고, 미리 결정된 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록, 상기 조직을 절단하는 단계, 및
광학 리더기를 이용하여, 획득된 상기 표적 조직에 대한 흡광도 또는 투명도를 측정하는 단계를 포함하는, 조직의 투명도 측정 방법. - 제1항에 있어서,
상기 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계는,
서로 상이한 복수의 투명화 기법으로 복수개의 조직 각각에 대한 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계를 포함하고,
상기 조직을 절단하는 단계는,
상기 복수의 투명화 기법에 의해 획득한 투명화된 상기 조직 각각에 대한 표적 조직을 획득하도록, 상기 조직 각각을 절단하는 단계를 포함하고,
상기 흡광도 또는 투명도를 측정하는 단계는,
상기 복수의 투명화 기법에 따른 표적 조직 각각에 대한 흡광도 또는 투명도를 측정하는 단계를 포함하는, 조직의 투명도 측정 방법. - 제1항에 있어서,
상기 투명화 기법은 하이드로겔 (hydrogel) 기반의 투명화 기법 또는 수용성 제제 (souluble detergents) 기반의 투명화 기법이고,
상기 광학 리더기는 웰 플레이트 (well plate) 내의 각각의 웰에 빛을 조사하여 각 웰에 대한 흡광도 또는 투명도를 측정하도록 구성되고,
상기 절단하는 단계는,
상기 웰의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록, 상기 조직을 펀칭하는 단계를 포함하고,
상기 펀칭하는 단계 이후에 수행되는, 상기 웰의 내부에 상기 표적 조직을 배치하는 단계를 더 포함하는, 조직의 투명도 측정 방법. - 제3항에 있어서,
상기 하이드로겔 기반의 투명화 기법은,
CLARITY (clear lipid-exchanged acrylamide-hybridized rigid imaging-compatible tissue hydrogel), PACT (passive clarity technique), ACT (active clarity technique) 및 SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals) 중 적어도 하나이고,
상기 세정제 기반의 투명화 기법은,
seeDB (see deep brain), ClearT, ClearT2, ScaleA2 및 ScaleS 중 적어도 하나인, 조직의 투명도 측정 방법. - 제1항에 있어서,
상기 투명화 기법은 유기 용매 기반의 투명화 기법이고,
상기 광학 리더기는 웰 플레이트 내의 각각의 웰에 빛을 조사하여 각 웰에 대한 흡광도 또는 투명도를 측정하도록 구성되고,
상기 절단하는 단계는,
상기 웰의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 제1 직경을 갖고 상기 웰에 고정되도록 구성된 고정부, 및 상기 고정부의 내부에 위치하고 상기 제1 직경보다 작은 제2 직경의 홀을 갖고 상기 제2 직경을 갖는 표적 조직을 획득하도록 구성된 절단 필러 (pillar) 를 포함하는 펀치를 이용하여, 상기 조직을 펀칭하는 단계를 포함하고,
상기 펀칭하는 단계 이후에 수행되는, 상기 절단 필러 내부에 상기 표적 조직이 고정된 상기 펀치를, 상기 웰의 내부에 배치하는 단계를 더 포함하는, 조직의 투명도 측정 방법. - 제5항에 있어서,
상기 용매 기반의 투명화 기법은,
3DISCO (3D imaging of solvent-cleared organs), iDISCO (immunolabeling-enabled 3D imaging of solvent-cleared organs) 및 BABB (benzyl alcohol-benzyl benzoate) 중 적어도 하나인, 조직의 투명도 분석 방법. - 제1항에 있어서,
상기 흡광도 또는 투명도를 측정하는 단계는,
상기 광학 리더기를 이용하여 550 nm 내지 650 nm의 파장에서 상기 표적 조직에 대하여 흡광도 또는 투명도를 측정하는 단계를 포함하는, 조직의 투명도 분석 방법. - 제1항에 있어서,
상기 표적 조직의 직경은 3.0mm 내지 6.0mm인, 조직의 투명도 분석 방법. - 제1항에 있어서,
상기 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계는,
사상 단면 (sagittal section) 을 갖도록, 상기 대상 조직을 절단하는 단계, 및
사상 단면을 갖는 상기 대상 조직을 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계를 포함하는, 조직의 투명도 분석 방법. - 투명화 기법으로 조직을 투명화하기 위한 처리를 수행하는 단계;
투명화된 상기 조직의 일부를 포함하고, 미리 결정된 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록, 상기 조직을 절단하는 단계;
미리 결정된 크기를 갖는 야광 디스크를 획득하는 단계;
상기 야광 디스크에 빛을 투과하는 단계;
빛이 투과된 상기 야광 디스크에, 획득된 상기 표적 조직을 배치하는 단계, 및
젤 이미징 (gel imaging) 분석 장비를 이용하여, 상기 야광 디스크로부터 상기 표적 조직을 투과하여 발하는 야광 빛의 세기를 측정하는 단계를 포함하는, 조직의 투명도 분석 방법. - 제10항에 있어서,
상기 야광 빛의 세기를 측정하는 단계는,
암막 상태에서 발현하는 야광 디스크의 노출 시간에 따른, 상기 표적 조직을 투과하는 야광 빛의 세기를 측정하는 단계를 포함하는, 조직의 투명도 분석 방법. - 제10항에 있어서,
상기 투명화 기법은 하이드로겔 기반의 투명화 기법 또는 수용성 제제 기반의 투명화 기법이고,
상기 젤 이미징 분석 장비는 웰 플레이트 내의 각각의 웰로부터 발하는 야광 빛의 세기를 측정하도록 구성되고,
상기 조직을 절단하는 단계는,
상기 웰의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 표적 조직을 획득하도록, 상기 조직을 펀치하는 단계를 포함하고,
상기 야광 디스크는, 상기 웰의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖고,
상기 배치하는 단계는,
상기 웰의 내부에 상기 야광 디스크 및 상기 표적 조직을 순차적으로 배치하는 단계를 더 포함하는, 조직의 투명도 분석 방법. - 12항에 있어서,
상기 하이드로겔 기반의 투명화 기법은,
CLARITY, PACT, ACT 및 SWITCH 중 적어도 하나이고,
상기 세정제 기반의 투명화 기법은,
seeDB , ClearT, ClearT2, ScaleA2 및 ScaleS 중 적어도 하나인, 조직의 투명도 분석 방법. - 제10항에 있어서,
상기 투명화 기법은 유기 용매 기반의 투명화 기법이고,
상기 젤 이미징 분석 장비는 웰 플레이트 내의 각각의 웰로부터 발하는 야광 빛의 세기를 측정하도록 구성되고,
상기 조직을 절단하는 단계는,
상기 웰의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖는 제1 직경을 갖고 상기 웰에 고정되도록 구성된 고정부, 및 상기 고정부의 내부에 위치하고 상기 제1 직경보다 작은 제2 직경의 홀을 갖고 상기 제2 직경을 갖는 표적 조직을 획득하도록 구성된 절단 필러를 포함하는 펀치를 이용하여, 상기 조직을 펀칭하는 단계를 포함하고,
상기 야광 디스크는, 상기 웰의 직경에 대하여 0.8 배 내지 1 배의 크기를 갖고,
상기 배치하는 단계는,
상기 웰의 내부에 상기 야광 디스크 및, 상기 절단 필러 내부에 상기 표적 조직이 고정된 상기 펀치를 상기 웰의 내부에 순차적으로 배치하는 단계를 포함하는, 조직의 투명도 분석 방법. - 제14항에 있어서,
상기 용매 기반의 투명화 기법은,
3DISCO, iDISCO 및 BABB 중 적어도 하나인, 조직의 투명도 분석 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170184244A KR102050248B1 (ko) | 2017-12-29 | 2017-12-29 | 조직 투명도 분석 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020170184244A KR102050248B1 (ko) | 2017-12-29 | 2017-12-29 | 조직 투명도 분석 방법 |
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| KR20150043241A (ko) * | 2012-08-09 | 2015-04-22 | 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버시티 | 현미경적 분석을 위한 생물학적 표본을 준비하기 위한 방법과 조성물 |
| KR20160058900A (ko) * | 2013-09-20 | 2016-05-25 | 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지 | 온전한 전체 조직의 표현형분석을 위한 방법 |
| JP2017524913A (ja) * | 2014-07-03 | 2017-08-31 | トーレス、リチャード | 組織処理及び撮像の新規な方法 |
| KR101777515B1 (ko) * | 2016-05-16 | 2017-09-11 | 고려대학교 산학협력단 | 조직 필름화 장치 및 조직 필름화 방법 |
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- 2017-12-29 KR KR1020170184244A patent/KR102050248B1/ko active IP Right Grant
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| KR20160058900A (ko) * | 2013-09-20 | 2016-05-25 | 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지 | 온전한 전체 조직의 표현형분석을 위한 방법 |
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| KR102050248B1 (ko) | 2019-11-29 |
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