CN108588214A - 联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱及其测定方法和应用 - Google Patents

联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱及其测定方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种联合Aβ和D‑gal构建的AD模型鼠海马区差异基因表达图谱的构建方法，包括：1)用Aβ和D‑gal处理大鼠，以建立AD模型鼠；2)用Morris水迷宫测量AD模型鼠的记忆损伤，以确定AD模型鼠的成功构建；3)获取AD模型组与正常对照组的海马区样本，对各所述测试海马区基因表达分别获取基因芯片数据；4)各基因芯片数据上传到基因芯片数据分析软件，获取差异表达基因，筛选AD模型鼠差异表达的基因谱；5)对差异表达的基因进行功能注释分类和生物通路分析，以揭示与AD发生的相关分子基础。本发明将Aβ和D‑gal作为整体AD模型来研究其基因表达谱，有效避免了由外源基因诱导的其他改变表达的错误。

Description

联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱及其测 定方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种AD模型鼠海马区基因表达差异谱的测定方法，具体涉及联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱及其测定方法和应用。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是以认知能力下降和记忆力缺陷为特征的最为普遍的与年龄相关进行性神经退行性疾病，约占所有老年认知功能障碍患者的2/3。虽然AD对患者的行为造成破坏性影响并最终对其生命构成严重威胁，但基于大脑皮质中存在细胞内神经原纤维缠结(NFT)以及在海马区细胞外淀粉样斑块(APs)的临床病理学诊断仅适用于AD中度和终末阶段。目前，AD病例在初期很少被诊断出来。最近，利用代谢组学、蛋白质组学和基因组学技术监测整个AD发展过程中的分子扰动，以筛选诊断治疗靶标的生物标志物。
据报道，长期给予D-半乳糖(D-gal)可以诱发行为和神经化学变化，这些变化被应用于模拟脑老化自然过程。同时，β淀粉样蛋白(Aβ)是阿尔茨海默病(AD)的关键病理标志，并且在该疾病的进展过程中起关键作用。因此，D-gal和Aβ被广泛用于诱导AD、AD样模型研究、AD的作用机制和筛选抗AD药物。先前的研究表明，D-gal和Aβ联合诱导大鼠可更接近AD患者的行为与神经化学变化。
基因芯片是同时测量数千个mRNA表达的方便且强大的工具。已有研究报道利用基因芯片分析的方法，探索和识别与疾病或异常疾病相关的新型分子靶点。
“逍遥散对阿尔茨海默病模型大鼠海马mRNA表达的影响，李高申等，中国老年学杂志2015年8月第35卷，4199-4201”公开了一种用AD模型鼠探讨逍遥散对阿尔茨海默病的海马mRNA表达的影响，涉及D-gal腹腔注射和Aβ1-42双侧海马注射联合造模，实验鼠经给药处理后剥离其海马，提取RNA并进行反转录，运用实时定量PCR的方法检测mRNA表达变化，该方法构建的大鼠模型与阿尔茨海默病的行为变化相似，但实时定量PCR在检测mRNA表达差异时费时费力，样本量小，不利于挖掘基因差异表达谱。
“应用基因芯片筛选β淀粉样蛋白诱导的阿尔茨海默病细胞模型差异表达基因，郭秋野，第一军医大学，2006”公开了一种利用基因芯片研究阿尔茨海默病相关基因表达差异的方法，涉及用Aβ25-35诱导构建AD细胞模型，运用基因芯片筛选该模型与未经诱导的对照细胞间的差异表达基因，分析差异基因的功能，实现高通量检测。但所用模型为细胞模型，体外实验不能精准代表体内变化，且单一使用Aβ25-35诱导效果不稳定。
因此，建立一种高度模拟阿尔茨海默病行为变化的实验模型，并对尽可能多的基因进行差异表达分析，得到差异表达分析谱，在生物技术领域具有重要意义和广阔运用前景。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱及其测定方法和应用，将Aβ和D-gal作为整体AD模型来研究其基因表达谱，有效避免了由外源基因诱导的其他改变表达的错误。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱的测定方法，所述方法包括以下步骤：
依次用Aβ和D-gal处理大鼠，以建立AD模型鼠；用Morris水迷宫测量AD模型鼠的记忆相关行为，以确定模型鼠的成功建立；用基因芯片获取基因表达数据，并与正常组对照，筛选AD模型鼠差异表达的基因，构建AD模型鼠海马区基因表达差异谱；最后，对差异表达的基因进行功能注释分类和生物通路分析，构建AD模型鼠海马区基因表达差异谱。
根据现有技术，长期给予D-半乳糖(D-gal)可以诱发行为和神经化学变化，这些变化被应用于模拟脑老化自然过程的许多特征。同时，β淀粉样蛋白(Aβ)是阿尔茨海默病(AD)的关键病理标志，并且在该疾病的进展过程中起关键作用。因此，D-gal和Aβ被广泛用于诱导AD或AD样模型研究AD的作用机制和筛选抗AD药物。先前的研究表明，D-gal和Aβ能联合诱导大鼠更为深刻的类AD行为缺陷。本发明提供的测定方法仅建立在化学物质(Aβ和D-gal)的处理，而非引入外源基因(如APP和APP/PS-1)，而建立起来的AD模型鼠，从而有效避免了由外源基因诱导的其他改变表达的错误。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)建立AD模型鼠：在大鼠脑室内(i.c.v.)注射老化的淀粉状蛋白肽Aβ25-35(优选为Sigma，USA)，根据Stereotaxic Atlas确定注射部位(AP-3.0mm，ML2.0mm，DV2.9mm)；两周后，每天在大鼠皮下注射D-半乳糖，持续50天，以加速AD模型鼠的脑部老化程度；建立AD模型鼠；
(2)行为学表征分析：在建立AD模型鼠14天后，在Morris水迷宫中测量AD模型鼠的记忆相关行为，验证AD模型鼠的学习记忆损伤；
(3)基因芯片分析：提取AD模型鼠双侧海马组织的总RNA，然后利用基因芯片获取AD模型鼠及正常组双侧海马组织的基因表达数据，两组数据对照，筛选出差异表达的基因，构建AD模型鼠海马区基因表达差异谱；
(4)功能注释分类和生物通路分析：利用PANTHER分类系统和DAVID生物信息资源的注释功能将差异表达的基因进行分类和功能注释；
(5)综合步骤(2)和步骤(4)的结果，研究AD的分子基础以及AD病理机制。
优选地，步骤(1)中，老化的淀粉状蛋白肽Aβ25-35的浓度为1-10μg/μl，例如可以是1μg/μl、1.5μg/μl、2μg/μl、2.5μg/μl、3μg/μl、3.5μg/μl、4μg/μl、4.5μg/μl、5μg/μl、5.5μg/μl、6μg/μl、6.5μg/μl、7μg/μl、7.5μg/μl、8μg/μl、8.5μg/μl、9μg/μl、9.5μg/μl或10μg/μl以及所述范围之内所有的点值，由于篇幅的限制，在此不再一一赘述，优选为2-8μg/μl；
优选地，老化的淀粉状蛋白肽Aβ25-35的用量为2-10μl，例如可以是2μl、2.5μl、3μl、3.5μl、4μl、4.5μl、5μl、5.5μl、6μl、6.5μl、7μl、7.5μl、8μl、8.5μl、9μl、9.5μl或10μl以及所述范围之内所有的点值，由于篇幅的限制，在此不再一一赘述，优选为4-6μl；
优选地，在大鼠脑室内注射老化的淀粉状蛋白肽Aβ25-35后，用青霉素处理3-5天，以预防感染，例如可以是3天、3.2天、3.4天、3.6天、3.8天、4天、4.2天、4.4天、4.6天、4.8天或5天，以及所述范围之内所有的点值，由于篇幅的限制，在此不再一一赘述；
优选地，青霉素的用量为1-8×104U/天，例如可以是1×104U/天、1.5×104U/天、2×104U/天、2.5×104U/天、3×104U/天、3.5×104U/天、4×104U/天、4.5×104U/天、5×104U/天、5.5×104U/天、6×104U/天、6.5×104U/天、7×104U/天、7.5×104U/天或8×104U/天以及所述范围之内所有的点值，由于篇幅的限制，在此不再一一赘述，优选为2-6×104U/天；
优选地，D-半乳糖的浓度为100-200mg/kg，例如可以是100mg/kg、105mg/kg、110mg/kg、115mg/kg、120mg/kg、125mg/kg、130mg/kg、135mg/kg、140mg/kg、145mg/kg、150mg/kg、155mg/kg、160mg/kg、165mg/kg、170mg/kg、175mg/kg、180mg/kg、185mg/kg、190mg/kg、195mg/kg或200mg/kg，以及所述范围之内所有的点值，由于篇幅的限制，在此不再一一赘述，优选为130-180mg/kg；
优选地，D-半乳糖的用量为100-200mg，例如可以是100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg或200mg，以及所述范围之内所有的点值，由于篇幅的限制，在此不再一一赘述，优选为130-180mg。
优选地，步骤(2)中，随机将若干AD模型鼠放入Morris水迷宫中，让AD模型鼠寻找安全逃离的平台，如果AD模型鼠在60s内没有找到所述平台，就将其引导到所述平台上并停留10-20s(例如可以是10s、11s、12s、13s、14s、15s、16s、17s、18s、19s或20s)；间隔8-15min(例如可以是8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min或15min)后，将AD模型鼠放回Morris水迷宫中(此步骤完成后，将AD模型鼠干燥并放回笼中，待重复试验)；连续训练3-7天(例如可以是3天、3.5天、4天、4.5天、5天、5.5天、6天、6.5天或7天)，每天3-5次(例如可以是3次、4次或5次)，在视频追踪系统(HVS Imaging，Hampton，England)的帮助下，记录AD模型鼠从水中逃逸到安全平台的时间(即逃避潜伏期)，以评估AD模型鼠的空间任务学习能力。寻找定位平台的所需时间被认为是空间任务学习的一个指标。完成空间任务学习试验后，进行探索性测试，以评估空间记忆的检索。
步骤(2)的详细步骤见“宗园媛等，APP PS双转基因阿尔茨海默病小鼠模型的老年斑及行为学动态分析，中国比较医学杂志，2008，18(9),8-12”以及“Masoud SoheiliKashani1et al，Aqueous extract of lavender(Lavandula angustifolia)improves thespatialperformance of a rat model of Alzheimer’s disease,Neurosci Bull,April1,2011,27(2):99-106”。
在探头测试中，随后，将平台从Morris水迷宫中移出，将AD模型鼠从平台位置对面的象限中释放，并自由游泳50-80s，例如可以是50s、51s、52s、53s、54s、55s、56s、57s、58s、59s、60s、61s、62s、63s、64s、65s、66s、67s、68s、69s、70s、71s、72s、73s、74s、75s、76s、77s、78s、79s或80s，测量AD模型鼠在平台位置所在的目标象限中花费的时间和游泳距离。在任务学习和探针测试中的延迟表示为平均值±SEM，应用双向重复测量方差分析(Two-wayANOVA)。
步骤(3)中，所有大鼠(包括所有实验组、对照组和正常组的大鼠)通过断颈杀死，迅速将大鼠脑组织在冰平台上取出并用无菌PBS洗涤以除去表面上的血液和筋膜；分离的双侧海马被转移到冷冻管中并储存在液氮中。根据RNAeX试剂操作指南，使用Trizol提取双侧海马组织总RNA。使用RNA纯化和检测试剂盒测定RNA含量和纯度。按照制造商的说明书，测量260和280nm处的吸光度并用于计算A260/A280的比率，通过变性甲醛凝胶电泳评估18S和28S RNA条带的完整性。
优选地，步骤(3)中，所述基因芯片为Rat Genome Array 230 2.0；
优选地，步骤(3)的具体步骤为：分别通过Affymetrix Hybridization Oven 640，Fluidics Station 450和GeneChip Scanner 3000对AD模型鼠双侧海马组织的总RNA进行杂交、洗涤和扫描；通过Affymetrix Microarray Suite软件(Affymetrix GeneChip操作软件版本1.4，GCOS1.4)进行芯片图像生成和归一化分析，得到原始数据；由于数千个基因同时扫描，微阵列数据的量化和统计分析与标准统计方法不同，根据文献“Lockhart,D.J.,etal.,Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotidearrays.Nat Biotechnol,1996.14(13):p.1675-80.”和“Wutzler,A.,et al.,Variationsin the human soluble epoxide hydrolase gene and recurrence of atrialfibrillation after catheter ablation.Int J Cardiol,2013.168(4):p.3647-51.”所述的微阵列数据分析方案，从原始数据中得到荧光的平均信号强度。
根据以下公式计算倍数变化：
如果SIa≥SIb，
或者如果SIa≤SIb；
其中，FC为倍数变化值；SIa和SIb是来自使用相同基因探针的成对比较的特定基因的平均信号强度，在比较中符合FC≥1.5或FC≤-1.5标准的基因被认为是差异基因。
优选地，步骤(4)中，利用PANTHER分类系统(http://www.pantherdb.org/)的基因标识符用本体术语，根据差异基因的生物学途径、分子功能和蛋白质类别在饼图中分类。
优选地，通过Fisher精确检验二项式概率和超几何分布测量基因本体富集度。错误发现率(FDR)被用来纠正P值：P值<0.05，FDR<0.1作为阈值来选择显著差异的基因。
优选地，利用DAVID生物信息资源(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)的注释功能，并分别通过功能注释图和功能注释进行聚类。作为优选技术方案，所述方法包括以下步骤：
(1)建立AD模型鼠：在大鼠脑室内注射2-10μl浓度为1-10μg/μl的老化的淀粉状蛋白肽Aβ25-35；随后用1-8×104U/天的青霉素用量处理3-5天；两周后，每天在大鼠皮下注射用量为100-200mg、浓度为100-200mg/kg的D-半乳糖，持续50天；建立AD模型鼠；
(2)行为学表征分析：在建立AD模型鼠14天后，随机将若干AD模型鼠放入Morris水迷宫中，让AD模型鼠寻找安全逃离的平台；如果AD模型鼠在60s内没有找到所述平台，就将其引导到所述平台上并停留10-20s；间隔8-15min后，将AD模型鼠放回Morris水迷宫中；连续训练3-7天，每天3-5次，同时记录AD模型鼠从Morris水迷宫中逃逸到平台的时间；
随后，将平台从Morris水迷宫中移出，将AD模型鼠从平台位置对面的象限中释放，并自由游泳50-80s，测量AD模型鼠在平台位置所在的目标象限中花费的时间和游泳距离；
(3)RNA抽提与质量检测:分别从模型和和对照组大鼠双侧海马在液氮中研碎后，提取RNA。
具体的实施例中，步骤如下：每50～100mg组织加入1mL Unizol，用匀浆机彻底匀浆；匀浆后，转移匀浆液至离心管中，12,000g，2-8℃离心10min，以去除不溶性物质；转移上清至另一离心管中，15-30℃放置5min以充分裂解核蛋白复合体；按每1mL Unizol加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒，15-30℃放置2-3min。12,000g，2-8℃离心15min；小心转移上层水相至另一离心管中，每1mL Unizol加入0.5mL异丙醇，充分缓慢混匀溶液后，15-30℃放置10min沉淀RNA，12,000g，2-8℃离心10min；弃尽上清，每1mL Unizol加入1mL 75％乙醇，洗涤RNA沉淀；用涡旋振荡器短暂涡旋数秒后，7,500g，2-8℃离心5min；干燥RNA沉淀(注意不要完全干燥)，加入适量DEPC水溶解，于55-60℃水浴中孵育10min，-70℃保存备用。将抽提的RNA常规电泳，结果正确；用酶标仪测定RNA的OD260、OD280值，OD260/OD280值均大于等于1.86，满足实验要求；
(4)基因芯片扫描及分析：提取的AD模型鼠双侧海马组织的总RNA，分别通过Affymetrix Hybridization Oven 640和Fluidics Station 450对AD模型鼠双侧海马组织的总RNA进行扩增和杂交及洗涤和干燥；所用的基因芯片Rat Genome Array 230 2.0；最后通过Affymetrix Microarray Suite软件进行芯片图像生成和归一化分析，得到原始数据；根据微阵列数据分析方案，从原始数据中得到荧光的平均信号强度；
根据以下公式计算倍数变化：
如果SIa≥SIb，
或者如果SIa≤SIb；
其中，FC为倍数变化值；SIa和SIb是来自使用相同基因探针的成对比较的特定基因的平均信号强度，在比较中符合FC≥1.5或FC≤-1.5标准的基因被认为是差异基因；另外，FC可以进行优选，FC≥1.2或FC≤-1.2,FC≥2或FC≤-2；
(5)功能注释分类和生物通路分析：利用PANTHER分类系统和DAVID生物信息资源的注释功能将差异表达的基因进行分类和功能注释；
(6)综合步骤(2)-(4)的结果，构建AD模型鼠海马区基因表达差异谱。
第二方面，本发明提供如第一方面所述的测定方法构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱。
优选地，所述基因表达差异谱包括表达上调的基因和表达下降的基因。
优选地，所述表达上调的基因的主要功能组有催化活性组、金属动态平衡组的基因。
优选地，所述表达下降的基因是主要功能组有神经肽/激素组、核糖核蛋白的基因；
优选地，所述表达上调的基因为包括Nrip3，Man1a，Man1a 1，Rnf113a2，Cdh22和Ephx2。
优选地，所述表达下降的基因包括Oxt，Avp，Sgk1，Pmch，Rps9和RP6。
第三方面，本发明提供如第一方面所述的测定方法构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱在AD病理研究方面的应用。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
本发明公开了一种联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱及其测定方法和应用，将Aβ25-35注射到大鼠双侧海马内，同时将D-gal长期皮下注射到大鼠体内，用于构建AD模型鼠，诱导痴呆和AD，创造性地将Aβ和D-gal作为整体AD模型来研究其基因表达谱。Morris水迷宫实验表明，AD模型鼠表现出空间记忆损伤的特征，表明D-gal和Aβ的脑老化和神经变性效应。在AD发育初期，大鼠海马内D-gal和Aβ的外源积累可能促进大鼠空间记忆和学习能力的下降。Aβ或D-半乳糖(D-gal)诱导脑内Aβ过量产生，记忆障碍已被用于产生老化和AD模型，本发明的测定方法表明Aβ+D-gal的模型代表了一个很好的记忆缺陷模型。Aβ的脑超负荷是阿尔茨海默病(AD)的关键特征。值得注意的是，在这项工作中，我们使用Aβ注射替代APP或APP/PS-1敲入或3xTg转基因AD大鼠来增加Aβ)的脑负荷；衰老加速老鼠倾向8(SAMP8)，通过表型选择衰老加速小鼠的亚系也是一个Aβ相关AD模型，显示Aβ在脑和年龄依赖性学习和记忆缺陷积累，避免了转基因大鼠中由外源基因诱导的其他改变的转录水平。
附图说明
图1中，图1-A为本发明中建立AD模型鼠的流程图；图1-B为行为学表征分析中，在五天的Morris水迷宫训练试验中(每天四次)定位隐藏的空间学习平台结果图；图1-C为行为学表征分析中，在目标象限中游动的距离和时间的百分比结果图；
图2中，图2-A为从AD模型组和对照组大鼠海马提取总RNA作为对照，1％甲醛变性凝胶显色图；图2-B为Aβ和D-半乳糖诱导的AD模型组与对照组的散点图显示它们之间的差异基因表达图；
图3中，图3为Aβ和D-半乳糖诱导的AD模型组中差异表达的基因的功能分类，根据它们与PANTHER蛋白质类别(3-A)和分子功能(3-B)的注释。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
从广东省实验动物中心购买30只雄性SpragueDawley大鼠，12周龄，体重(255±15)g，大鼠单独饲养在25℃，保持12小时的光照/黑暗循环，可自由获得食物和水。适应性喂养2周后，将所有大鼠平均分为AD模型组(实施例1)、对照组(对比例1)和正常组(对比例2)。
实施例1
(1)建立AD模型鼠：建立的流程图如图1-A所示，在大鼠脑室内注射2μl浓度为1μg/μl的老化的淀粉状蛋白肽Aβ25-35；随后用1×104U/天的青霉素用量处理3天；两周后，每天在大鼠皮下注射用量为100mg、浓度为100mg/kg的D-半乳糖，持续50天；
(2)行为学表征分析：在建立AD模型鼠14天后，随机将若干AD模型鼠放入Morris水迷宫中，并在60s内将AD模型鼠放置在隐藏的平台上，如果AD模型鼠在60s内没有找到所述平台，就将其引导到所述平台上并停留10s；间隔8min后，将AD模型鼠放回Morris水迷宫中；连续训练3天，每天3次，同时记录AD模型鼠从Morris水迷宫中逃逸到平台的时间；
随后，将平台从Morris水迷宫中移出，将AD模型鼠从平台位置对面的象限中释放，并自由游泳50s，测量AD模型鼠在平台位置所在的目标象限中花费的时间和游泳距离；
(3)基因芯片分析：提取AD模型鼠双侧海马组织的总RNA，然后利用基因芯片RatGenome Array 230 2.0从AD模型鼠双侧海马组织的总RNA筛选出差异表达的基因，使用甲醛变性琼脂糖电泳检测RNA纯度和完整性；
具体步骤如下：每50～100mg组织加入1mL Unizol，用匀浆机彻底匀浆；匀浆后，转移匀浆液至离心管中，12,000g，2-8℃离心10min，以去除不溶性物质；转移上清至另一离心管中，15-30℃放置5min以充分裂解核蛋白复合体；按每1mL Unizol加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒，15-30℃放置2-3min。12,000g，2-8℃离心15min；小心转移上层水相至另一离心管中，每1mL Unizol加入0.5mL异丙醇，充分缓慢混匀溶液后，15-30℃放置10min沉淀RNA，12,000g，2-8℃离心10min；弃尽上清，每1mL Unizol加入1mL 75％乙醇，洗涤RNA沉淀；用涡旋振荡器短暂涡旋数秒后，7,500g，2-8℃离心5min；干燥RNA沉淀(注意不要完全干燥)，加入适量DEPC水溶解，于55-60℃水浴中孵育10min，-70℃保存备用。将抽提的RNA常规电泳，结果正确；用酶标仪测定RNA的OD260、OD280值，OD260/OD280值均大于等于1.86，满足实验要求；
分别通过Affymetrix Hybridization Oven 640，Fluidics Station 450和GeneChip Scanner 3000对AD模型鼠双侧海马组织的总RNA进行杂交、洗涤和扫描；通过Affymetrix Microarray Suite软件进行芯片图像生成和归一化分析，得到原始数据；根据微阵列数据分析方案，从原始数据中得到荧光的平均信号强度；
根据以下公式计算倍数变化：
如果SIa≥SIb，
或者如果SIa≤SIb；
其中，FC为倍数变化值；SIa和SIb是来自使用相同基因探针的成对比较的特定基因的平均信号强度，在比较中符合FC≥1.5或FC≤-1.5标准的基因被认为是差异基因；
(4)功能注释分类和生物通路分析：利用PANTHER分类系统和DAVID生物信息资源的注释功能将差异表达的基因进行分类和功能注释；
(5)综合步骤(2)和步骤(4)的结果，构建AD模型鼠海马区基因表达差异谱。
实施例2
(1)建立AD模型鼠：在大鼠脑室内注射10μl浓度为10μg/μl的老化的淀粉状蛋白肽Aβ25-35；随后用8×104U/天的青霉素用量处理5天；两周后，每天在大鼠皮下注射用量为200mg、浓度为200mg/kg的D-半乳糖，持续50天；
(2)行为学表征分析：在建立AD模型鼠14天后，随机将若干AD模型鼠放入Morris水迷宫中，并在60s内将AD模型鼠放置在隐藏的平台上，如果AD模型鼠在60s内没有找到所述平台，就将其引导到所述平台上并停留20s；间隔15min后，将AD模型鼠放回Morris水迷宫中；连续训练7天，每天5次，同时记录AD模型鼠从Morris水迷宫中逃逸到平台的时间；
随后，将平台从Morris水迷宫中移出，将AD模型鼠从平台位置对面的象限中释放，并自由游泳80s，测量AD模型鼠在平台位置所在的目标象限中花费的时间和游泳距离；
(3)基因芯片分析：提取AD模型鼠双侧海马组织的总RNA，然后利用基因芯片RatGenome Array 230 2.0从AD模型鼠双侧海马组织的总RNA筛选出差异表达的基因；分别通过Affymetrix Hybridization Oven 640，Fluidics Station 450和GeneChip Scanner3000对AD模型鼠双侧海马组织的总RNA进行杂交、洗涤和扫描；通过AffymetrixMicroarray Suite软件进行芯片图像生成和归一化分析，得到原始数据；根据微阵列数据分析方案，从原始数据中得到荧光的平均信号强度；
根据以下公式计算倍数变化：
如果SIa≥SIb，
或者如果SIa≤SIb；
(4)功能注释分类和生物通路分析：利用PANTHER分类系统和DAVID生物信息资源的注释功能将差异表达的基因进行分类和功能注释；
(5)综合步骤(2)和步骤(4)的结果，构建AD模型鼠海马区基因表达差异谱。
实施例3
(1)建立AD模型鼠：在大鼠脑室内注射6μl浓度为5μg/μl的老化的淀粉状蛋白肽Aβ25-35；随后用4.5×104U/天的青霉素用量处理4天；两周后，每天在大鼠皮下注射用量为150mg、浓度为150mg/kg的D-半乳糖，持续50天；
(2)行为学表征分析：在建立AD模型鼠14天后，随机将若干AD模型鼠放入Morris水迷宫中，并在60s内将AD模型鼠放置在隐藏的平台上，如果AD模型鼠在60s内没有找到所述平台，就将其引导到所述平台上并停留15s；间隔12min后，将AD模型鼠放回Morris水迷宫中；连续训练5天，每天4次，同时记录AD模型鼠从Morris水迷宫中逃逸到平台的时间；
随后，将平台从Morris水迷宫中移出，将AD模型鼠从平台位置对面的象限中释放，并自由游泳65s，测量AD模型鼠在平台位置所在的目标象限中花费的时间和游泳距离；
(3)基因芯片分析：提取AD模型鼠双侧海马组织的总RNA，然后利用基因芯片RatGenome Array 230 2.0从AD模型鼠双侧海马组织的总RNA筛选出差异表达的基因；分别通过Affymetrix Hybridization Oven 640，Fluidics Station 450和GeneChip Scanner3000对AD模型鼠双侧海马组织的总RNA进行杂交、洗涤和扫描；通过AffymetrixMicroarray Suite软件进行芯片图像生成和归一化分析，得到原始数据；根据微阵列数据分析方案，从原始数据中得到荧光的平均信号强度；
根据以下公式计算倍数变化：
如果SIa≥SIb，
或者如果SIa≤SIb；
(4)功能注释分类和生物通路分析：利用PANTHER分类系统和DAVID生物信息资源的注释功能将差异表达的基因进行分类和功能注释；
(5)综合步骤(2)和步骤(4)的结果，构建AD模型鼠海马区基因表达差异谱。
对比例1
与实施例1相比，对比例1的区别仅在于把老化的淀粉状蛋白肽Aβ25-35和D-半乳糖替换为同等体积的生理盐水，其余的处理均与实施例1相同。
对比例2
对比例2不做任何处理，正常饲养，作为正常组。
记忆障碍测试结果
将对比例1和对比例2的大鼠在水迷宫中找到隐藏平台的时间进行对比，发现其并没有区别：p＝0.19；5天训练的平均潜伏期，对比例1为31.34±5.76s，对比例2为25.21±3.73s。因此，可以排除手术对于AD模型鼠的干扰。
如图1-B所示，AD模型组的大鼠比正常大鼠和对照组大鼠需要更多的时间(近2倍)来定位隐藏的安全平台(P<0.05)，表明AD模型组与对照组之间的表现明显不同，即AD模型组的学习能力受到显著损害。
在任务学习之后，对不同三组的老鼠进行探测线索以评估任务学习的检索。在探测线路中，平台被移除。记录在训练试验期间平台被隐藏的迷宫的目标象限中所花费的时间和游动距离。如图1-C所示，AD模型组的空间学习能力差异显着(P<0.05)，正常组和对照组大鼠在目标象限中花费相似的时间(P＝0.077)，正常组和对照组空间学习能力显着相关(P<0.05)。图1-C还显示正常组和对照组优先在目标象限中搜索，而AD模型组对该象限没有偏好。这些结果提示Aβ25-35联合D-半乳糖诱导的AD模型组大鼠的记忆功能受损，表明外源性Aβ在大鼠海马积累；在AD的初期阶段，长期给予D-gal可促进空间记忆和学习的衰退。
基因表达谱结果
从实施例1和对比例1的大鼠海马组织中提取总RNA并通过紫外透射仪显现在变性凝胶上，可以看到具有尖锐的28S和18S rRNA条带和不大清晰的5srRNA条带，如图2-A所示。28S rRNA条带具有大约两倍的18S rRNA带的强度，表明RNA的完整性并且表明提取的RNA退出符合基因微阵列的要求。如图2-B所示，通过Affymetrix软件计算后显示，杂交信号强度散点图中的大多数数据点在X-Y比率为0.67-1.5的对角线附近，表明大多数基因具有非差异表达。然而，少量的数据点远离对角线，这代表了差异表达的基因。
AD模型组和对照组的基因表达水平的比较显示，35个基因的表达水平改变超过了1.5倍，其中12个上调，23个下调。AD模型组的大鼠海马中18个基因表达水平显著变化(至少2倍以上，如表1所示)，其中8个上调，13个下调。这些基因的功能分析根据它们在基因本体术语中的注释表明，涉及催化活性(Man1a，Nrip3和Ephx2)，金属动态平衡(Manla，Rnf113a2，Cdh22和Ephx2)，神经肽/激素组(Oxt，Avp和Pmch)，DNA复制(Fam111a)，转移蛋白(Slc1a3和Uqcrc2)以及核糖核蛋白(Rps9和RP6)等基因的表达上调，细胞黏附分子Cdh22和受体Cckbr，激酶(Sgk和Prkcd)和发育蛋白(Arc)下调。如表1所示，上调基因的主要功能组是催化活性，其中Nrip3(核受体相互作用蛋白3)，Man1a(甘露糖苷酶1α)，1和Ephx2，(环氧化物水解酶2)，此三种酶转录物中观察到上调的倍数变化。而下降基因是神经肽/激素组(如Oxt，Avp，Sgk1和Pmch等)在AD组有较显著的下调。
表1
功能注释分类
功能注释分类结果如图3-A和图3-B所示，图3-A描绘了各个差异表达基因的PANTHER蛋白质类别分类结果，从图中可以看出，信号分子(PC00207)，核酸结合(PC00171)，水解酶(PC00121)和受体(PC00197)占总蛋白质类别的一半(51％)；另一半为转运蛋白(PC00227)，伴侣蛋白(PC00072)，钙结合蛋白(PC00060)，转移酶(PC00220)和转移载体蛋白(PC00219)。在信号分子中，除了Cort(皮质抑制素，抑制生长激素分泌)，Ppp1r1b，Oxt和Avp下调显著，尤其是Oxt和Avp，分别为下调了4倍和5倍。考虑其原因可能是神经肽Oxt在抗焦虑和抗抑郁作用中起重要作用，Oxt可能通过改变海马突触的可塑性来影响海马依赖的学习和记忆。考虑到Oxt的增加改善了小鼠的长期空间学习能力，期望在下降的学习记忆大鼠中Oxt下调是合理的，这与目前发表的研究结果一致。Oxt(催产素)和Avp(精氨酸加压素)都是神经性垂体激素，被认为是调节复杂多样的社会行为的重要神经调节因子，二者牵涉到与社会赤字相关的精神障碍。结果暗示了信号分子在消息传递兴奋性信号中的重要性。Aβ和D-gal在AD模型大鼠中的沉积可能通过调节这些信号分子的转录表达来影响神经信号转导。
如图3-B所示，将上述显著差异表达的基因分类到催化活性(catalytic activityGO：0003824)，结合活性(binding GO：0005488)，转运蛋白活性(transporter activityGO：0005215)，信号转导活性(singal transducer activity GO：0004871)，受体活性(receptor activity GO：0004872)和结构分子活性(structure molecular activity GO：0005198)几个大类中。对于催化活性，上调的甘露糖苷酶1α(Manla1)和环氧化物水解酶2(Ephx2)分别涉及甘露糖和环氧化物代谢。以前的证据支持胰岛素降解酶(IDE)和中性溶酶(NEP)是参与Aβ降解的主要内肽酶。在本发明中，天冬氨酸型内肽酶Nrip3基因的转录表达显着上调，表明潜在的新内肽酶可能参与Aβ的降解或指示它们之间的潜在联系。结果提示注射Aβ和D-gal影响这一组酶下调，这可能与Aβ和D-gal诱导的神经毒性有关。
生物通路分析
为了鉴定所涉及的生物学过程，将差异表达的基因(DEGs)提交给DAVID途径挖掘工具以共同探索和观察功能相关的基因。GO富集分析显示AD模型大鼠有4种分子功能(MF)分类。MF类别包括神经肽激素活性(GO：0005184)，神经垂体激素活性(GO：0005185)，蛋白激酶活性(GO：0004672)，蛋白质结合(GO：0005515)，这些小组很好地对应于其他人发现的功能小组。例如，蛋白激酶活性的MF类别在衰老和神经退行性疾病中发生改变。在本发明中，鉴定了来自这一类的几个新基因，包括PrKcd和Sgk1。在此微阵列扫描中观察到Prkcd(蛋白激酶C，δ)的转录表达减少，与先前报道的在SAMP8AD模型大鼠中与年龄相关的蛋白激酶Cγ降低的表达线性一致。血清/糖皮质激素调节激酶1(Sgk1)的转录表达也下调了。虽然以前的研究表明Sgk表达水平与小鼠年龄高度相关，但调控方式却相反：随着年龄的增长，调控方式上调。
如表2-4所示，与神经系统有关的显着富集的生物学过程GO术语包括细胞内信号转导(GO：0035556)，突触传递的正调节(GO：0050806)，胞质钙离子浓度的正调节(GO：0007204)，凋亡过程(GO：0006915)。AD模型组与富含细胞成分的对照组之间的DEG与神经系统相关的GO术语包括神经元投影(GO.0043005)和不对称突触(GO.0032279)。使用不同表达的AD基因，确定了显着的KEGG途径。如表4所示，cAMP信号通路(rno04024)丰富了这一工作，可能与代谢和钙稳态有关。在此，比较来自大鼠海马的AD-对照表达数据集的转录表达，并进行了对所述去基因表达的基因的途径分析。如此表所示，AD模型中的基因表达改变是复杂的，反映了涉及多种分子类别的信号转导，激素，激酶和受体调节神经系统过程和调节突触传递，金属稳态和行为。AD模型大鼠基因表达谱的检测将为阐明AD进展中的病因和相关分子事件提供线索。
表2基因本体分析与神经系统相关的分子功能项，调整后的P值<0.01
表3基因本体分析与神经系统相关的生物过程项，调整后的P值<0.001
表4基因本体KEGG通路分析，调整的P值<0.001
术语 生物学过程 数目 基因
rno04024 cAMP信号转导通路 4 Nfkbia,Adora2a,Ppp1r1b,Gria3
综上所述，本发明公开了一种联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱及其测定方法和应用，将Aβ25-35注射到大鼠双侧海马内，同时将D-gal长期皮下注射到大鼠体内，用于构建AD模型鼠，诱导痴呆和AD，创造性地将Aβ和D-gal作为整体AD模型来研究其基因表达谱。Morris水迷宫实验表明，AD模型鼠表现出空间记忆损伤的特征，表明D-gal和Aβ的脑老化和神经变性效应。在AD发育初期，大鼠海马内D-gal和Aβ的外源积累可能促进大鼠空间记忆和学习能力的下降。Aβ或D-半乳糖(D-gal)诱导脑内Aβ过量产生，记忆障碍已被用于产生老化和AD模型，本发明的测定方法表明Aβ+D-gal的模型代表了一个很好的记忆缺陷模型。Aβ的脑超负荷是阿尔茨海默病(AD)的关键特征。值得注意的是，在这项工作中，我们使用Aβ注射替代APP或APP/PS-1敲入或3xTg转基因AD大鼠来增加Aβ)的脑负荷；衰老加速老鼠倾向8(SAMP8)，通过表型选择衰老加速小鼠的亚系也是一个Aβ相关AD模型，显示Aβ在脑和年龄依赖性学习和记忆缺陷积累，避免了转基因大鼠中由外源基因诱导的其他改变的转录水平。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱的测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
依次用Aβ和D-gal处理大鼠，以建立AD模型鼠；用Morris水迷宫测量AD模型鼠的记忆相关行为，以确定AD模型鼠的成功建立；用基因芯片获取基因表达数据，并与正常组对照，筛选AD模型鼠差异表达的基因，构建AD模型鼠海马区基因表达差异谱；最后，对差异表达的基因进行功能注释分类和生物通路分析。
2.根据权利要求1所述的联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱的测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)建立AD模型鼠：在大鼠脑室内注射老化的淀粉状蛋白肽Aβ25-35；两周后，每天在大鼠皮下注射D-半乳糖，持续50天；建立AD模型鼠；
(2)行为学表征分析：在建立AD模型鼠14天后，在Morris水迷宫中测量AD模型鼠的记忆相关行为，验证AD模型鼠的学习记忆损伤；
(3)基因芯片分析：提取AD模型鼠双侧海马组织的总RNA，利用基因芯片获取AD模型鼠及正常组双侧海马组织的基因表达数据，两组数据对照，筛选出差异表达的基因，构建AD模型鼠海马区基因表达差异谱；
(4)功能注释分类和生物通路分析：利用PANTHER分类系统和DAVID生物信息资源的注释功能将差异表达的基因进行分类和功能注释；
(5)综合步骤(2)和步骤(4)的结果，研究AD的分子基础以及AD病理机制。
3.根据权利要求2所述的联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱的测定方法，其特征在于，步骤(1)中，老化的淀粉状蛋白肽Aβ25-35的浓度为1-10μg/μl，优选为2-8μg/μl；
优选地，老化的淀粉状蛋白肽Aβ25-35的用量为2-10μl，优选为4-6μl；
优选地，在大鼠脑室内注射老化的淀粉状蛋白肽Aβ25-35后，用青霉素处理3-5天；
优选地，青霉素的用量为1-8×104U/天，优选为2-6×104U/天；
优选地，D-半乳糖的浓度为100-200mg/kg，优选为130-180mg/kg；
优选地，D-半乳糖的用量为100-200mg，优选为130-180mg。
4.根据权利要求2或3所述的联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱的测定方法，其特征在于，步骤(2)中，随机将若干AD模型鼠放入Morris水迷宫中，让AD模型鼠寻找安全逃离的平台；如果AD模型鼠在60s内没有找到所述平台，就将其引导到所述平台上并停留10-20s；间隔8-15min后，将AD模型鼠放回Morris水迷宫中；连续训练3-7天，每天3-5次，同时记录AD模型鼠从Morris水迷宫中逃逸到平台的时间；
将平台从Morris水迷宫中移出，将AD模型鼠从平台位置对面的象限中释放，并自由游泳50-80s，测量AD模型鼠在平台位置所在的目标象限中花费的时间和游泳距离。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱的测定方法，其特征在于，步骤(3)中，所述基因芯片为Rat Genome Array 230 2.0；
优选地，步骤(3)的具体步骤为：分别通过Affymetrix Hybridization Oven 640，Fluidics Station 450和GeneChip Scanner 3000对AD模型鼠双侧海马组织的总RNA进行杂交、洗涤和扫描；通过Affymetrix Microarray Suite软件进行芯片图像生成和归一化分析，得到原始数据；根据微阵列数据分析方案，从原始数据中得到荧光的平均信号强度；
根据以下公式计算倍数变化：
如果SIa≥SIb，
或者如果SIa≤SIb；
其中，FC为倍数变化值；SIa和SIb是来自使用相同基因探针的成对比较的特定基因的平均信号强度，在比较中符合FC≥1.5或FC≤-1.5标准的基因被认为是差异基因。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱的测定方法，其特征在于，步骤(4)中，利用PANTHER分类系统的基因标识符用本体术语，根据差异基因的生物学途径、分子功能和蛋白质类别在饼图中分类；
优选地，通过Fisher精确检验二项式概率和超几何分布测量富集度；
优选地，利用DAVID生物信息资源的注释功能，并分别通过功能注释图和功能注释进行聚类。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的联合Aβ和D-gal构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱的测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)建立AD模型鼠：在大鼠脑室内注射2-10μl浓度为1-10μg/μl的老化的淀粉状蛋白肽Aβ25-35；随后用1-8×104U/天的青霉素用量处理3-5天；两周后，每天在大鼠皮下注射用量为100-200mg、浓度为100-200mg/kg的D-半乳糖，持续50天；建立AD模型鼠；
(2)行为学表征分析：在建立AD模型鼠14天后，随机将若干AD模型鼠放入Morris水迷宫中，让AD模型鼠寻找安全逃离的平台；如果AD模型鼠在60s内没有找到所述平台，就将其引导到所述平台上并停留10-20s；间隔8-15min后，将AD模型鼠放回Morris水迷宫中；连续训练3-7天，每天3-5次，同时记录AD模型鼠从Morris水迷宫中逃逸到平台的时间；
随后，将平台从Morris水迷宫中移出，将AD模型鼠从平台位置对面的象限中释放，并自由游泳50-80s，测量AD模型鼠在平台位置所在的目标象限中花费的时间和游泳距离；
(3)RNA抽提与质量检测：分别从模型和和对照组大鼠双侧海马提取RNA；使用NanodropND-1000测定RNA在230、260、280nm波长下的吸收值，以计算浓度评估RNA纯度；使用甲醛变性琼脂糖电泳检测RNA纯度和完整性；
(4)基因芯片扫描及分析：提取的AD模型鼠双侧海马组织的总RNA，分别通过Affymetrix Hybridization Oven 640和Fluidics Station 450对AD模型鼠双侧海马组织的总RNA进行扩增和杂交及洗涤和干燥；所用的基因芯片为Rat Genome Array 230 2.0；最后通过Affymetrix Microarray Suite软件进行芯片图像生成和归一化分析，得到原始数据；根据微阵列数据分析方案，从原始数据中得到荧光的平均信号强度；
在比较中符合倍数变化值FC≥1.5或FC≤-1.5标准的基因被认为是差异基因；
(5)功能注释分类和生物通路分析：利用PANTHER分类系统和DAVID生物信息资源的注释功能将差异表达的基因进行分类和功能注释；
(6)综合步骤(2)-(4)的结果，构建AD模型鼠海马区基因表达差异谱。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的测定方法构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱。
9.根据权利要求8所述的基因差异谱，其特征在于，所述基因表达差异谱包括表达上调的基因和表达下降的基因；
优选地，所述表达上调的基因的主要功能组有催化活性组、金属动态平衡组的基因；
优选地，所述表达下降的基因是主要功能组有神经肽/激素组、核糖核蛋白的基因；
优选地，所述表达上调的基因为包括Nrip3，Man1a，Man1a 1，Rnf113a2，Cdh22和Ephx2；
优选地，所述表达下降的基因包括Oxt，Avp，Sgk1，Pmch，Rps9和RP6。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的测定方法构建的AD模型鼠海马区基因表达差异谱在AD病理研究方面的应用。
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