CN103314926B - 建立阿尔茨海默病动物模型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种建立阿尔茨海默病动物模型的方法。所述方法包括：将大鼠在暴露于工频磁场的条件下饲养至少60日，其中，在所述饲养过程中，为所述大鼠给药D-半乳糖和β-淀粉样蛋白液，以便获得所述阿尔茨海默病动物模型。由此，可以成为单因素诱导阿尔茨海默病动物模型的有益补充，根据本发明实施例的方法建立的阿尔茨海默病动物模型能够表达阿尔茨海默病动物特征性病理改变，且具备学习记忆障碍的特点，同时符合工频磁场长期持续暴露的环境要求，具有性质稳定，重现性好，且成本较低的优点。

Description

建立阿尔茨海默病动物模型的方法

技术领域

本发明涉及生物学领域，具体地，本发明涉及一种建立阿尔茨海默病动物模型的方法。

背景技术

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种以进行性认知障碍和记忆能力下降为主的退行性神经病变。其特征性病理学改变为：脑内β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）聚集形成的老年斑，神经元内tau蛋白异常聚集形成的神经原纤维缠结，神经元不同程度凋亡或丢失以及星形胶质细胞增生和肥大。AD不仅对患者本人及其家庭造成破坏性的影响，且随各国老龄化人口激增，有可能成为危害公众健康和社会卫生系统的全球性危机。

工频磁场（Power Frequency Magnetic Field,PF-MF）指由高压输电线、变压器、大功率电机及家用电器等电力设施产生的电磁场，其频率为50Hz（我国及欧洲等大部分地区）或60Hz（美国等），属极低频电磁场（Extremly LowFrequency Magnetic Field,ELF-MF）范畴。大量实验研究证实，PF-MF暴露可改变动物脑内神经递质及金属元素的含量，还会对神经元离子通道、膜受体及信号通路产生影响，从而影响神经行为与认知功能。目前，国内外研究者已从钙振荡、DNA损伤、机体内感应电流、氧化应激以及基于内源性的磁颗粒的存在等多方面探讨了PF-MF生物学效应的可能机制。然而，由于磁场暴露参数、研究对象等实验条件各异，有关PF-MF生物学效应的研究结果缺乏可比性，甚至产生了一定争议，从而导致至今仍旧无法明确PF-MF与生物体相互作用的量效关系，也无法完全阐明其作用机制。

因此，对于工频磁场与阿尔茨海默病动物模型有待进一步改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出建立一种多因素复合诱导的阿尔茨海默病动物模型的方法。

本发明是基于发明人以下的发现完成的：

AD发病的可能机制包括：铝中毒学说、胆碱能学说、炎症免疫学说、基因突变学说、Aβ学说等。以上述各学说为依据，现已建立多种AD动物模型。但研究发现，单因素诱导建立的AD动物模型仅能从病理、生化或行为等其中某一方面模拟AD特征性变化，全面性不足。由于AD发病机制复杂且病变持续时间长，至今尚无能够完全贴近AD复杂病因及病理变化过程或真实反映其发生各阶段特征的广泛普及的AD动物模型。多项流行病学调查显示，AD发生与工频磁场暴露密切相关，但有关揭示二者之间关系的动物实验研究报道尚属空白。因而，迄今仍缺乏适用于研究AD发生与工频磁场暴露之间关系及其作用机理的实验动物模型。目前已有的动物工频磁场暴露装置，多为单螺线管设计，磁场作用空间在线圈内部，体积有限，一次无法同时处理大批动物；且开机后螺线管温度升高明显，动物置于螺线管内经磁场暴露数小时后必须取出，否则将影响动物正常的生活状态，因而不能完全模拟工频磁场长期持续暴露的情况。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种建立阿尔茨海默病动物模型的方法。所述方法包括：将大鼠在暴露于工频磁场的条件下饲养至少60日，其中，在所述饲养过程中，为所述大鼠给药D-半乳糖和β-淀粉样蛋白液，以便获得所述阿尔茨海默病动物模型。由此，可以成为单因素诱导阿尔茨海默病动物模型的有益补充，根据本发明实施例的方法建立的阿尔茨海默病动物模型能够表达阿尔茨海默病动物特征性病理改变，且具备学习记忆障碍的特点，同时符合工频磁场长期持续暴露的环境要求，具有性质稳定，重现性好，且成本较低的优点。同时根据本发明实施例所提供的阿尔茨海默病联合工频磁场暴露动物模型，可用于PF-MF暴露对AD发生影响的动物实验研究，还可进一步用于PF-MF暴露生物学作用机制的研究，同时，可望为AD的临床治疗提供一种新的磁疗方法。

另外，根据本发明上述实施例的建立阿尔茨海默病动物模型的方法，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，在第1～42日，每日为所述大鼠给药D-半乳糖，在第43日对大鼠进行双侧海马立体定位注射β-淀粉样蛋白液。由此，可以造成大鼠各器官受损及系统功能衰退，并且导致类似AD老年斑的病理学特征的发生，并引起胶质细胞炎性反应，从而产生早衰、脑老化并学习记忆力下降的临床表现。

根据本发明的实施例，将所述D-半乳糖溶解于无菌生理盐水中，以50mg/kg/d的剂量对大鼠进行腹腔注射，将所述β-淀粉样蛋白液以1微克/微升溶解于无菌生理盐水，在37摄氏度孵育7天后以5微升的剂量对大鼠进行双侧海马立体定位注射。由此，D-半乳糖可以以等于大鼠机体等渗的溶解状态通过腹腔注射进入大鼠体内，从而造成大鼠的早老；并且经过孵育的β-淀粉样蛋白通过对大鼠进行双侧海马立体定位注射可以有效地引起大鼠脑内胶质细胞炎性反应，从而产生早衰、脑老化并学习记忆力下降的临床表现。

根据本发明的实施例，所述工频磁场的频率为50赫兹，磁场强度为400微特斯拉。由此，可以有效地模拟工频磁场的辐射暴露环境，对饲养于其中的大鼠产生影响，从而利用根据本发明实施例的方法建立的动物模型揭示阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）与工频磁场二者之间关系。

根据本发明的实施例，将大鼠在暴露于所述工频磁场的条件下是通过将所述大鼠培养于工频磁场暴露装置中而进行的，其中，所述工频磁场暴露装置包括：工频磁场发生组件，所述工频磁场发生组件用于产生工频磁场；以及饲养组件，所述饲养组件设置在所述工频磁场中。由此，工频磁场发生组件可以产生均匀的工频磁场，使得所有动物暴露于磁场强度均匀的模拟工频磁场中，对饲养于其中的动物产生均匀的磁场影响，从而建立能够表达阿尔茨海默病动物特征性病理及行为学改变，性质稳定，重现性好，且成本较低的理想动物模型。

根据本发明的实施例，所述工频磁场暴露装置进一步包括调压器，所述调压器与所述工频磁场发生组件连接，用于控制所述工频磁场的强度。由此，可以适当调节工频磁场的磁场频率和强度，从而有效地模拟工频磁场的辐射暴露环境。

根据本发明的实施例，所述动物饲养组件包括：本体，所述本体内限定出饲养空间；以及挡板，所述挡板将所述饲养空间分割为至少两个饲养室，其中，所述饲养空间的高度为20厘米。由此，可以同时处理大批动物，使所有动物长期持续暴露于特定参数的工频磁场中，从而建立能够表达阿尔茨海默病动物特征性病理及行为学改变，性质稳定，重现性好，且成本较低的理想动物模型。

根据本发明实施例的动物工频磁场暴露装置可具有如下优点：

1.磁场作用空间大，可一次同时饲养40只大鼠；

2.磁场强度均匀，中心点至周边衰减<10%；

3.开机后动物饲养环境温度恒定，且与室温差<±0.2℃，动物在装置中可长期正常生活，完全模拟了工频磁场长期持续暴露的环境。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例的工频磁场暴露装置示意图；

图2是根据本发明实施例的脑立体定位注射装置示意图；

图3是根据本发明实施例的四种不同处理对大鼠体重的影响；

图4是根据本发明实施例的ELF暴露对四种不同处理组的平均逃避潜伏期的影响；

图5是根据本发明实施例的ELF暴露对四种不同处理组大鼠的海马形态结构的影响；

图6是根据本发明实施例的ELF暴露对四种不同处理组大鼠的海马神经元尼氏体形态的影响；

图7是根据本发明实施例的ELF暴露对四种不同处理组大鼠的海马神经元尼氏体含量的影响；

图8是根据本发明实施例的ELF暴露对四种不同处理组大鼠的海马神经纤维含量的影响；和

图9是根据本发明实施例的ELF暴露对四种不同处理组大鼠的海马神经元超微结构的影响。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1Morris水迷宫学习

对80只8周龄二级雄性，体重212.6±13.6克的Wistar大鼠（由军事医学科学院实验动物中心提供）进行Morris水迷宫学习，Morris水迷宫检测及分析系统（SLY-WMS）由北京硕林苑科技公司研制。检测期间室温控制为25摄氏度，并保持安静及低光照；在水池中加入清水，调节水温至25摄氏度，使水面没过平台1厘米；水面顺时针等分为I、II、III、IV，4个象限，平台置于I象限中央；大鼠依次由I至IV象限池壁中点处贴壁入水；记录60秒内大鼠找到并停留于平台的时间，超过60秒未找到平台则记为60秒。每次更换象限前，先使大鼠在平台上停留20秒再投放入水。连续训练学习3天。计算4个象限找到平台时间的均值即为平均逃避潜伏期（Average Escape Latency,AEL），淘汰AEL过快、过慢及不稳定的16只，剩余64只随机分为工频磁场暴露联合阿尔茨海默病组（AD+ELF）、工频磁场暴露组（ELF）、阿尔茨海默病组（AD）和对照组（Con），每组各16只。

实施例2工频磁场暴露

通过调整工频磁场暴露装置调压器，使得工频磁场暴露装置的电压为172.5伏、输入电流为1.65安培。经高斯计（EFA300，Narda Safety Test Solutions）检测，此时两个子线圈间产生均匀的工频磁场，中心点磁场场强为400μT，频率为50Hz。将ELF组及AD+ELF组大鼠置于动物工频磁场暴露装置的动物饲养箱中饲养，持续暴露60天。Con组及AD组置于同样规格的动物饲养箱中，在磁场强度低于400nT的环境中饲养60天。实验期间，保持室温22摄氏度恒定，各组动物饲养箱内部温度与室温差<±0.2摄氏度，动物均自由进食水并进行12小时/12小时昼夜节律控制（见图1）。同时每周记录一次动物体重。

由图3结果可知，大鼠处于动物工频磁场暴露期间至暴露后4w，大鼠体重增长均呈延缓趋势，尤以暴露第2周至暴露后1周最为显著，ELF组及AD+ELF组体重均显著低于对照组和AD组（P<0.01）；暴露第1周，仅见ELF组显著低于对照组（P<0.05）；暴露后1周～2周，AD+ELF组显著低于AD组或对照组（P<0.05或P<0.01）；其余未见明显差异。以上表明，ELF暴露可导致正常大鼠及AD大鼠体重增长均明显延缓，而AD大鼠体重增长变化不明显。

实施例3D-半乳糖腹腔注射

在大鼠饲养于上述动物工频磁场暴露装置的第1～42天，每日为AD+ELF组及AD组大鼠腹腔注射以无菌生理盐水稀释的D-半乳糖液（Sigma,USA），剂量为50mg/kg/d；同时每日为ELF组及Con组大鼠腹腔注射等体积无菌生理盐水。

实施例4Aβ_25-35海马立体定位注射

Aβ_25-35（Sigma,USA）以无菌生理盐水稀释为1微克/微升，在37摄氏度温箱孵育7天，使其变为凝聚态后4摄氏度保存，1周内使用。在大鼠饲养于上述动物工频磁场暴露装置中的第43天，以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，剔去头颈部被毛并固定于大鼠脑立体定位仪；两耳正中皮肤75%酒精消毒，纵向剪开1.5厘米；无菌棉球蘸H₂O₂擦拭颅骨，充分暴露前囟；以前囟为基点，向后3.5毫米、双侧旁开3毫米处定位标志点；以牙科钻在标志点处小心钻通颅骨；调整微量注射器进针至硬脑膜表面下3.8毫米，到达海马CA3区；启动微量注射泵，以1微升/分钟的速度注射孵育好的Aβ溶液5微升；将微量注射器保持5分钟后缓慢撤针；棉签蘸75%酒精擦拭钻孔周围消毒；常规被皮缝合并以棉签蘸取碘伏擦拭缝合处消毒；肌肉注射生理盐水-青霉素钠抗感染，剂量5万U/只，连续3天。在大鼠饲养于上述动物工频磁场暴露装置中的第43天，以上述同样操作对ELF组及Con组大鼠立体定位注射等量无菌生理盐水。

实施例5认知功能检测

在大鼠饲养于上述动物工频磁场暴露装置中的61天，将大鼠从动物工频磁场暴露装置取出，进行常规恢复喂养，并在终止暴露的即刻、7天、15天和30天，分别检测四组不同处理大鼠的AEL。其中，检测大鼠AEL的操作与实施例1中Morris水迷宫学习操作步骤相同，不同的是更换象限时，无需使大鼠在平台上停留20秒，可直接投放入水。

由图4的结果可知，ELF组大鼠于磁场暴露60天后即刻，平均逃避潜伏期显著延长（P<0.01），暴露后恢复性喂养7～30天后与对照组比均差别不显著；AD组大鼠于磁场暴露后恢复喂养即刻～30d，平均逃避潜伏期均呈延长趋势，其中以暴露后即刻和15天较为显著（P<0.05或P<0.01），暴露后7天和30天均较ELF组显著延长（P<0.01）；AD+ELF组大鼠于磁场暴露后7天和30天，平均逃避潜伏期均较对照组和AD组显著缩短（P<0.05或P<0.01），暴露后15天较AD组和ELF组均明显缩短（P<0.05）；其余未见明显差异。由此可知，ELF暴露可导致大鼠学习记忆能力一过性下降，AD大鼠学习记忆能力持续下降，ELF联合暴露可显著改善AD大鼠的认知功能障碍。

实施例6大鼠海马组织检测

在大鼠饲养于上述动物工频磁场暴露装置中的61天，将大鼠从动物工频磁场暴露装置取出，进行常规恢复喂养，并在终止暴露的即刻、15天和30天，以1%戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠后进行断头取脑，左侧脑组织先后经4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋-5μm厚制片，切片经HE染色及Bielschowsky银染色分别观察四组大鼠海马形态结构及神经原纤维含量变化，并进行光镜观察和显微摄像。

图5中HE染色显示，ELF组于磁场暴露后即刻，海马齿状回和CA3区部分神经元变性，主要表现为核固缩深染、核周隙增宽，细胞水肿，血管周隙略增宽；暴露后恢复喂养15天，上述病变减轻，并可见胶质细胞增生；暴露后恢复喂养30天基本恢复。AD组于磁场暴露后恢复喂养即刻～30d，大鼠海马齿状回和CA3区神经元变性均较ELF组明显加重，且未见减轻或改善。AD+ELF组于磁场暴露后恢复喂养即刻～30天，海马神经元变性程度介于ELF组与AD组之间，并呈逐渐减轻趋势，但至暴露后30天仍未恢复。

实施例7大鼠神经元尼氏体含量分析

将实施例6中获得的四组大鼠脑组织石蜡切片经甲苯胺蓝染色后镜下观察。每组随机选取20个视野照相，并采用北航CMIAS病理图像分析系统进行图像分析，计算其平均光密度值（Mean optical density,MOD）。

图6中甲苯胺蓝染色和定量分析结果表明，ELF组于磁场暴露后恢复常规喂养即刻，海马神经元尼氏体含量明显减少（P<0.05），而暴露后恢复常规喂养15天和30天，尼氏体含量与对照组比均差别不显著；AD组于磁场暴露后恢复常规喂养即刻～30d，海马神经元尼氏体含量均较ELF组呈进一步减少趋势，且均显著少于对照组（P<0.05或P<0.01），未见恢复；AD+ELF组神经元尼氏体含量介于ELF组与AD组之间，并于暴露后恢复常规喂养15天显著少于对照组（P<0.05），暴露后30d与ELF组和AD组比均差别显著（P<0.05）。

实施例8大鼠海马组织神经纤维含量观察

将实施例6中获得的四组大鼠脑组织石蜡切片经银染（Bielschowsky染色）后镜下观察。图8的银染结果显示，ELF组于磁场暴露后恢复常规喂养即刻～30天，海马神经纤维含量均未见明显改变；而AD组神经纤维含量均显著增多，未见恢复；AD+ELF组则介于ELF组与AD组之间，呈逐渐减少趋势，但至暴露后30天仍未恢复。

实施例9大鼠海马超微结构观察

在大鼠饲养于上述动物工频磁场暴露装置中的61天，将大鼠从动物工频磁场暴露装置取出，进行常规恢复常规喂养，并在终止暴露的即刻、15天和30天，取大鼠海马CA3区1mm³组织经2.5%戊二醛固定2小时，1%锇酸固定2小时，乙醇和丙酮脱水，Epon812树脂（SPI,USA）包埋，半薄切片定位，超薄切片厚70纳米，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，采用透射电镜（HITACHIH7650,Japan）观察并照相。

从图9为利用AMT摄像系统在80.0kV电压下，以标尺为500nm的放大倍数下进行观察的结果，从结果中可知，磁场暴露后恢复常规喂养的即刻，ELF组可见部分海马神经元核型不整，核膜边界不清，核染色质凝聚、沿核膜边集，凋亡发生；线粒体肿胀、空化、嵴消失，粗面内质网扩张、脱颗粒，突触间隙模糊，突触内囊泡减少；胶质细胞肿胀；血管周间隙增宽。于暴露后恢复常规喂养的15天和30天，上述病变逐渐减轻。AD组神经元病变明显加重，并可见胞内神经原纤维缠结形成、胞外神经纤维增生、脂褐素沉积等AD特征性改变，暴露后恢复常规喂养的即刻～30天未见明显减轻；AD+ELF组神经元病变与AD组相似，但较之略轻，至暴露后恢复常规喂养的30天仍未恢复。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (1)

1.一种建立阿尔茨海默病动物模型的方法，其特征在于，包括：

将大鼠在暴露于工频磁场的条件下饲养至少60日，

其中，

在所述饲养过程中，为所述大鼠给药D-半乳糖和β-淀粉样蛋白液，以便获得所述阿尔茨海默病动物模型，

其中，所述工频磁场的频率为50赫兹，磁场强度为400微特斯拉，

其中，在第1～42日，每日为所述大鼠给药D-半乳糖，在第43日对大鼠进行双侧海马立体定位注射β-淀粉样蛋白液，

其中，

将所述D-半乳糖溶解于无菌生理盐水中，以50mg/kg/d的剂量对大鼠进行腹腔注射，

将所述β-淀粉样蛋白液以1微克/微升溶解于无菌生理盐水，在37摄氏度孵育7天后以5微升的剂量对大鼠进行双侧海马立体定位注射，

其中，将大鼠在暴露于所述工频磁场的条件下是通过将所述大鼠培养于工频磁场暴露装置中而进行的，其中，所述工频磁场暴露装置包括：

工频磁场发生组件，所述工频磁场发生组件用于产生工频磁场；以及

饲养组件，所述饲养组件设置在所述工频磁场中，

其中，所述工频磁场暴露装置进一步包括调压器，所述调压器与所述工频磁场发生组件连接，用于控制所述工频磁场的强度，

其中，所述动物饲养组件包括：

本体，所述本体内限定出饲养空间；以及

挡板，所述挡板将所述饲养空间分割为至少两个饲养室，

其中，所述饲养空间的高度为20厘米。