CN113801848B - 电刺激诱导小鼠海马神经元细胞系氧化应激模型的建立方法 - Google Patents

电刺激诱导小鼠海马神经元细胞系氧化应激模型的建立方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113801848B
CN113801848B CN202110878824.9A CN202110878824A CN113801848B CN 113801848 B CN113801848 B CN 113801848B CN 202110878824 A CN202110878824 A CN 202110878824A CN 113801848 B CN113801848 B CN 113801848B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mouse hippocampal
oxidative stress
hippocampal neuron
electrical stimulation
establishing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110878824.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113801848A (zh
Inventor
张庆富
赵学刚
许顺江
曾辉
屠丽红
徐彦粉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
FIRST HOSPITAL OF HEBEI MEDICAL UNIVERSITY
Original Assignee
FIRST HOSPITAL OF HEBEI MEDICAL UNIVERSITY
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by FIRST HOSPITAL OF HEBEI MEDICAL UNIVERSITY filed Critical FIRST HOSPITAL OF HEBEI MEDICAL UNIVERSITY
Priority to CN202110878824.9A priority Critical patent/CN113801848B/zh
Publication of CN113801848A publication Critical patent/CN113801848A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113801848B publication Critical patent/CN113801848B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种电刺激诱导小鼠海马神经元细胞系氧化应激模型的建立方法，其通过电刺激装置对小鼠海马神经元细胞进行不同电压和通电时长的刺激后再培养，获得小鼠海马神经元细胞系氧化应激模型。本发明操作简单，成本低，通过本发明获得的氧化应激模型可进一步用于氧化应激介导的高压电烧伤引起神经精神疾病的发病机制和抗氧化机制的研究。

Description

电刺激诱导小鼠海马神经元细胞系氧化应激模型的建立方法
技术领域
本发明涉及一种电刺激诱导小鼠海马神经元细胞系氧化应激模型的建立方法。
背景技术
随着社会发展与进步，电能的应用越来越广泛，电烧伤发生率逐年增加， 且有较高致残率和致死率，成为危害人身安全的重要因素之一。高压电烧伤是由高压交流电流经机体所引起的机体组织和器官损伤，与一般热力烧伤不同，它通过电物理效应、化学效应等多种效应引起机体复合损伤，其渐进性损伤严重。
研究发现，高压电烧伤与氧化应激的关系密切。高压电烧伤可通过热效应引起细胞直接损伤，也可通过激活白细胞等方式引发全身组织的氧化应激，而当机体产生了持续而高水平的氧化应激反应，进入抵抗期和耗竭期时，则可能发展为PTSD。影像学研究显示，PTSD患者海马体积持续性缩小，可能与高水平氧化应激触发神经元凋亡有关。目前关于高压电烧伤与氧化应激在动物水平上的研究相对有限，而在细胞水平的研究几乎没有，本课题组之前通常选用其他化学药物（如H2O2）替代电流刺激细胞，以研究高压电烧伤在细胞水平发生氧化应激后的变化，而化学药物刺激无法模拟电流刺激的瞬时性及电压电势的趋向性等特点。
因此，为了阐明电能对海马神经元细胞氧化应激损伤的作用机制，宜选择合适的装置和方法刺激细胞，建立可靠的细胞模型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种电刺激诱导海马神经元细胞（HT-22）氧化应激细胞模型的建立方法和装置，以能够操作简单，成本低的方法建立电刺激诱导的小鼠海马神经元细胞氧化应激模型，从而可进一步用于氧化应激介导的高压电烧伤引起神经精神疾病的发病机制和抗氧化机制的研究。
本发明采用以下技术方案：
一种电刺激诱导小鼠海马神经元细胞系氧化应激模型的建立方法，其通过电刺激装置对小鼠海马神经元细胞进行不同电压和通电时长的刺激后再培养，获得小鼠海马神经元细胞系氧化应激模型。
进一步的，其具体包括如下步骤：
（a）小鼠海马神经元细胞在培养基中进行体外培养；
（b）经步骤（a）扩大培养后的小鼠海马神经元细胞在电刺激装置中，于25V~100V的电压下进行通电1~10s；
（c）经步骤（b）处理后的小鼠海马神经元细胞继续培养24h，获得小鼠海马神经元细胞系氧化应激模型。
进一步的，所述步骤（a）和步骤（c）的培养基为：质量体积比浓度10％的胎牛血清的DMEM培养基。
进一步的，所述步骤（a）和步骤（c）的培养条件为：小鼠海马神经元细胞在孔板中，于37℃在5％CO2 培养箱中进行培养。
进一步的，所述步骤（a）进行扩大培养结束时，小鼠海马神经元细胞的浓度为5~10×104 个/mL。
进一步的，所述电刺激装置包括变压器和孔板；所述变压器的输出端通过导线连接石墨电极，所述石墨电极深入孔板的孔内对培养基及培养的细胞进行通电。
进一步的，所述变压器的变压范围为0-100V。
进一步的，所述步骤（b）中，通电电压为25V、50V、75V或100V；通电时间为1s、3s、5s或10s。
作为优选的，所述步骤（b）中，通电电压为50V或75V；通电时间为5s。
本发明的有益效果在于，利用本发明的电刺激诱导的海马神经元细胞氧化应激细胞模型的建立方法，能够操作简单、成本低的建立电刺激诱导的HT-22细胞氧化应激模型，从而可进一步用于氧化应激介导的高压电引起神经精神疾病脑区损伤作用机制和抗氧化机制的研究。
附图说明
图1为电刺激装置的结构示意图。
其中，1、变压器；2、孔板；3、导线；4、石墨电极。
图2为实施例1中不同电刺激强度对小鼠海马神经元细胞存活率的影响图。
图3为实施例2中不同电压强度电击5s后小鼠海马神经元细胞凋亡图。
图4为实施例3中不同电刺激强度对小鼠海马神经元细胞SOD活性的影响图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。
实施例1：不同电刺激电压和电刺激时间对小鼠海马神经元细胞存活率的影响试验
1、细胞培养与电刺激实验
电刺激装置包括变压器1和24孔板2；所述变压器1的输出端通过导线3连接石墨电极4，所述石墨电极4深入24孔板2的孔内对培养基及培养的细胞进行通电。所述变压器的变压范围为0-100V。
根据研究目的要求，本实验分别设置假电组（0V）和不同电刺激（电压强度分别为25V、50V、75V、100V，电击时长分别为1s、3s、5s、10s）组。小鼠海马神经元细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基，细胞浓度5-10×10 4 个/mL，接种于24孔板，每孔1ml，置于37℃、5％CO2 培养箱中培养。24h后即每孔细胞生长到80%左右，电击组分别按照25V（1 s、3 s、5s、10s），50V（1、3、5、10s），75V（1、3、5、10s），100V（1、3、5、10s）的电刺激强度组合施加电刺激，对照组施加0V的假电刺激，待施加完电刺激后更换新的培养液（每孔1ml），在37℃、5％CO2 培养箱中继续培养。
2、CCK-8法检测细胞存活率
继续培养24h后，弃去培养基，每孔加入1000μl空白培养基和100μl CCK-8溶液，37℃、5％CO2 培养箱中孵育2.5h，用酶标仪测定450nm波长处的吸光度值，计算细胞存活率。
Figure 505062DEST_PATH_IMAGE002
。
由此得到不同电刺激强度对小鼠海马神经元细胞存活率的影响，结果如图2所示。图2表明，随着电压的升高，细胞存活率逐渐降低；且随着电刺激时间的增加，细胞存活率也呈下降趋势。与对照组（0V）相比，其他组小鼠海马神经元细胞存活率均显著降低（P<0.05）。同时，刺激时长为5s时，不同电压刺激小鼠海马神经元细胞存活率下降梯度较为合适。
实施例2：用流式细胞仪检测不同电刺激强度下小鼠海马神经元细胞凋亡情况
1、细胞培养与电刺激：细胞培养方法同实施例1，电刺激组分别按25V&5s、50V&5s、75V&5s和100V&5s施加电刺激。
2、流式细胞仪检测细胞凋亡情况
收集 HT-22 细胞，用预冷 PBS 离心洗涤。用双蒸水稀释 5×Binding Buffer为1×工作液，取500μl 1×Binding Buffer 重悬细胞，再加入 5μL Annexin V- FITC 和 10μl PI，轻轻混匀。避光，室温反应 10 min，样品在1 h 内用流式细胞仪检测。
由此得到不同电刺激强度刺激后小鼠海马神经元细胞的凋亡情况，结果如图3所示。图3表明，随着电压强度的增加，细胞凋亡率逐渐上升；其中50V&5s、75V&5s和100V&5s刺激细胞后，与对照组（0V）相比，凋亡率均显著升高（P<0.05）。
实施例3：不同电刺激强度对小鼠海马神经元细胞SOD活性的影响实验
1、细胞培养与电刺激：细胞培养方法同实施例1，电刺激组分别按25V&5s、50V&5s和75V&5s施加电刺激。
2、WST-1法检测细胞SOD活性
继续培养24h后，弃去培养基，设置对照孔、对照空白孔、测定孔和测定空白孔，用酶标仪测定450nm波长处的吸光度值，计算细胞SOD抑制率。
Figure 953361DEST_PATH_IMAGE004
。
用BCA法测定待测组细胞上清液蛋白浓度，计算细胞SOD力（细胞SOD活力（U/mgprot） =细胞SOD抑制率÷50%×反应体系（0.24ml）/稀释倍数（0.02ml）÷待测样本蛋白浓度（mgprot/ml））。
由此得到不同电刺激强度对小鼠海马神经元细胞SOD活性的影响，结果如图4所示。图4表明，随着刺激电压的增加，SOD活性先升高再下降；50V&5s和75V&5s刺激细胞后，与对照组（0V）相比，SOD活性显著降低（P<0.05）。
上述实施例中，实验数据采用SPSS 26.0统计分析软件进行单因素ANOVA方差分析，全部数据均以均数±标准差（means±SD）表示。当P<0.05认为有统计学差异。
综上，细胞发生凋亡（细胞凋亡流式图），并且与对照组比较有差异；氧化应激的指标（SOD）也发生变化，与对照组比较有差异，说明神经元细胞发生了氧化应激，即其氧化应激细胞模型建立成功。

Claims (6)

1.一种电刺激诱导小鼠海马神经元细胞系氧化应激模型的建立方法，其特征在于，
（a）小鼠海马神经元细胞在培养基中进行体外培养；
（b）经步骤（a）扩大培养后的小鼠海马神经元细胞在电刺激装置中，于50V或75V的电压下进行通电5s；
（c）经步骤（b）处理后的小鼠海马神经元细胞继续培养24h，获得小鼠海马神经元细胞系氧化应激模型。
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤（a）和步骤（c）的培养基为10％的胎牛血清的DMEM培养基。
3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤（a）和步骤（c）的培养条件为：小鼠海马神经元细胞在孔板中，于37℃在5％CO2 培养箱中进行培养。
4.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤（a）进行扩大培养结束时，小鼠海马神经元细胞的浓度为5~10×104 个/mL。
5.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述电刺激装置包括变压器（1）和孔板（2）；所述变压器（1）的输出端通过导线（3）连接石墨电极（4），所述石墨电极（4）深入孔板（2）的孔内对培养基及培养的细胞进行通电。
6.根据权利要求5所述的建立方法，其特征在于，所述变压器（1）的变压范围为0-100V。
CN202110878824.9A 2021-08-02 2021-08-02 电刺激诱导小鼠海马神经元细胞系氧化应激模型的建立方法 Active CN113801848B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110878824.9A CN113801848B (zh) 2021-08-02 2021-08-02 电刺激诱导小鼠海马神经元细胞系氧化应激模型的建立方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110878824.9A CN113801848B (zh) 2021-08-02 2021-08-02 电刺激诱导小鼠海马神经元细胞系氧化应激模型的建立方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113801848A CN113801848A (zh) 2021-12-17
CN113801848B true CN113801848B (zh) 2023-03-31

Family

ID=78893229

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110878824.9A Active CN113801848B (zh) 2021-08-02 2021-08-02 电刺激诱导小鼠海马神经元细胞系氧化应激模型的建立方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113801848B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114849060B (zh) * 2022-05-07 2023-08-25 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） 电刺激在调控生物体内mdk中的应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106282112A (zh) * 2016-10-17 2017-01-04 广西大学 过氧化氢诱导的小鼠单核巨噬细胞系氧化应激模型的建立方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113801848A (zh) 2021-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20030170898A1 (en) Method for intracellular modifications within living cells using pulsed electric fields
US10301587B2 (en) Compact subnanosecond high voltage pulse generation system for cell electro-manipulation
Yin et al. Low-level laser effect on proliferation, migration, and antiapoptosis of mesenchymal stem cells
Levin Large-scale biophysics: ion flows and regeneration
Brill et al. Adult generation of glutamatergic olfactory bulb interneurons
Tai et al. Impaired excitability of somatostatin-and parvalbumin-expressing cortical interneurons in a mouse model of Dravet syndrome
Li et al. Autophagy attenuates the oxidative stress-induced apoptosis of Mc3T3-E1 osteoblasts.
Villeda et al. The circulatory systemic environment as a modulator of neurogenesis and brain aging
Gonzalez-Burgos et al. Functional maturation of GABA synapses during postnatal development of the monkey dorsolateral prefrontal cortex
Xiong et al. Selective labeling of individual neurons in dense cultured networks with nanoparticle-enhanced photoporation
CN113801848B (zh) 电刺激诱导小鼠海马神经元细胞系氧化应激模型的建立方法
Balaban et al. Homolog of protein kinase Mζ maintains context aversive memory and underlying long-term facilitation in terrestrial snail Helix
Ma et al. Photobiomodulation attenuates neurotoxic polarization of macrophages by inhibiting the notch1-HIF-1α/NF-κB signalling pathway in mice with spinal cord injury
Harmon et al. Integration of swimming-related synaptic excitation and inhibition by olig2+ eurydendroid neurons in larval zebrafish cerebellum
Awasthi et al. Effects of nanosecond pulsed electric fields on the intracellular function of HeLa cells as revealed by NADH autofluorescence microscopy
Jaatinen et al. The combination of electric current and copper promotes neuronal differentiation of adipose-derived stem cells
Maxwell et al. Axoaxonic synapses on terminals of group II muscle spindle afferent axons in the spinal cord of the cat
Xu et al. Rotating magnetic field delays human umbilical vein endothelial cell aging and prolongs the lifespan of Caenorhabditis elegans
Jaffe Extracellular current measurements with a vibrating probe
Jun et al. Electrical stimulation-induced cell clustering in cultured neural networks
Bosch et al. A polyclonal antibody against mammalian FOS can be used as a cytoplasmic neuronal activity marker in a teleost fish
Morgun et al. Neurogenic potential of implanted neurospheres is regulated by optogenetic stimulation of hippocampal astrocytes ex vivo
US9797862B2 (en) Dielectrophoresis-based cell destruction to eliminate unwanted subpopulations of cells
US20070155011A1 (en) Method of producing stable collagen producing mesenchymal cells from adult adipose stem cells via transfection
Tay Acute and chronic neural stimulation via mechano-sensitive ion channels

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant