CN112569475B - 一种电磁波改善阿尔茨海默病空间认知障碍和Aβ沉积的方法 - Google Patents
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Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
- A61N5/00—Radiation therapy
- A61N5/02—Radiation therapy using microwaves
- A61N5/022—Apparatus adapted for a specific treatment
Abstract
本发明提出了一种电磁波改善阿尔茨海默病空间认知障碍和Aβ沉积的方法。该方法包括：使待提高个体处于微波辐射下，所述微波辐射的频率为900MHz，所述微波辐射的平均场强为25‑31V/m。该方法可显著改善阿尔茨海默病个体的空间认知障碍，降低脑内Aβ沉积或tau蛋白磷酸化，而不引起个体焦虑。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及电磁波改善阿尔茨海默病空间认知障碍和Aβ沉积的方法。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是困扰全球医疗最严重的问题之一，是老年痴呆性疾病中一种常见类型。AD主要以进行性记忆力减退和获得性知识丧失，直至日常生活能力完全丧失为特征，给社会和家庭造成严重的负担，成为威胁老年健康的重要疾病之一。现今AD的发病机制尚未清楚，AD的主要病理特征是脑内老年斑(Senile plaques,SP)与神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFT)的形成。SP是位于细胞外的一种球形结构，核心是β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)，周围则由胶质细胞以及变性神经元的轴突和树突等组成。Aβ是由正常的脑中淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)酶解产生，由细胞分泌至胞外，主要包括Aβ42与Aβ40两种。NFT的分布在病程进展中比SP更具特征性，其主要是由过度磷酸化的tau蛋白形成的不可溶、具有高度自我聚集活性的双股螺旋神经丝(paired helical filament silk,PHFs)聚集形成的结构。在AD早期，tau蛋白的异常磷酸化就已发生，且Aβ毒性的发挥需要tau蛋白来介导；AD患者神经细胞变性、记忆力降低等也可由tau蛋白的异常磷酸化导致；过度磷酸化的tau蛋白会损伤细胞的结构与功能，导致神经元进行性变性。
目前临床上对于AD的防治措施主要包括药物干预(如使用胆碱酯酶抑制剂、N-甲基-D-天门冬氨酸受体拮抗剂等)与综合护理(如针灸、音乐疗法、怀旧疗法等)等措施。微波是指频率范围在300～300000MHz的高频电磁波，被应用于多种疾病的辅助治疗中，但关于微波对AD的防治方法仍在探索中。
发明内容
本研究选用APP/PS1小鼠作为模型动物，通过长期微波辐射APP/PS1小鼠，探讨微波辐射对阿尔茨海默病模型小鼠行为学的影响，采用免疫组化、刚果红染色、透射电镜和酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)等方法，对大脑皮层和海马结构以及Aβ沉积等的改变开展研究，为筛选一种非侵入性的、非药物性的治疗阿尔茨海默病的方法提供依据，也为寻找一种有效的记忆增强方法提供线索。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种提高空间学习记忆能力的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使待提高个体处于微波辐射下，所述微波辐射的频率为900MHz,所述微波辐射的平均场强为25-31V/m。根据本发明实施例的方法，可显著改善个体的空间学习记忆能力，而不引起个体焦虑。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述微波辐射的时间为2.5月～6.5月，优选地，为3月。
根据本发明的实施例，所述待提高个体具有空间学习记忆功能障碍。发明人发现，在上述微波辐射下，不会对正常个体的行为产生影响。
根据本发明的实施例，所述待提高个体为阿尔茨海默病患者或APP/PS1小鼠。发明人发现，900MHz，平均场强25-31V/m微波辐射2月龄或5月龄APP/PS1小鼠3月，可改善其空间学习记忆能力障碍。而APP/PS1小鼠是国际上公认的阿尔茨海默病模型小鼠之一，该小鼠是通过重组DNA技术将人/鼠淀粉样蛋白前体(APP)和人类早老素(PS1)两种突变基因转染到动物体内，可引起早发性老年痴呆，表现出人类阿尔茨海默病的病理过程，因此，900MHz,平均场强25-31V/m微波辐射可显著改善阿尔茨海默病患者的空间学习记忆能力障碍。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种降低Aβ沉积或tau蛋白磷酸化的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将待处理样品处于微波辐射下，所述微波辐射的频率为900MHz，所述微波辐射的平均场强为25-31V/m。根据本发明实施例方法，可显著降低待测样品中Aβ沉积或tau蛋白磷酸化。根据本发明实施例的方法可用于科学研究中，以科研为目的有效改变待测样品中的Aβ沉积或tau蛋白磷酸化，如可用于Aβ沉积或tau蛋白磷酸化的机制研究。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述待处理样品为大脑皮层或海马神经元或APP/PS1小鼠或阿尔茨海默病患者。
根据本发明的实施例，所述微波辐射的时间为2.5月～6.5月，优选地，为6月。
根据本发明的实施例，所述大脑皮层或海马神经元来自2月龄或5月龄APP/PS1小鼠。发明人发现，900MHz，平均场强25-31V/m微波辐射2月龄和5月龄APP/PS1小鼠6个月可显著降低其大脑皮层或海马区神经元Aβ蛋白的积聚或tau蛋白磷酸化。
附图说明
图1是根据本发明实施例的2m龄组小鼠行为学流程图；
图2是根据本发明实施例的5m龄组小鼠行为学流程图；
图3是根据本发明实施例的微波辐射后2m龄小鼠定位航行实验结果，
其中，C2m：2m龄C57小鼠空白对照组，R2m：2m龄C57小鼠辐射组，
CT2m：2m龄转基因小鼠对照组，RT2m：2m龄转基因小鼠辐射组，
与C组相比，*P<0.05，**P<0.01，与CT组相比，#P<0.05；
图4是根据本发明实施例的微波辐射后5m龄小鼠定位航行实验结果，
其中，C5m：5m龄C57小鼠空白对照组，R5m：5m龄C57小鼠辐射组，
CT5m：5m龄转基因小鼠对照组，RT5m：5m龄转基因小鼠辐射组，
与C组相比，*P<0.05，**P<0.01，与CT组相比，#P<0.05；
图5是根据本发明实施例的微波辐射后2m龄小鼠Y迷宫实验结果，
其中，(A)2月龄小鼠进入新异臂次数；(B)2月龄小鼠自发交替反应率
与C组相比，*P<0.05；
图6是根据本发明实施例的微波辐射后5m龄小鼠Y迷宫实验结果，
其中，(A)5月龄小鼠进入新异臂次数；(B)5月龄小鼠自发交替反应率
与C组相比，*P<0.05；
图7是根据本发明实施例的微波辐射后2m龄小鼠新物体识别实验结果，
与C组相比，*P<0.05；
图8是根据本发明实施例的微波辐射后5m龄小鼠新物体识别实验结果；
图9是根据本发明实施例的微波辐射后2m龄小鼠高架十字迷宫实验结果，
其中，(A)2月龄小鼠进入开臂时间百分比；(B)2月龄小鼠进入开臂次数百分比
与C组相比，*P<0.05；
图10是根据本发明实施例的微波辐射后5m龄小鼠高架十字迷宫实验结果，
其中，(A)5月龄小鼠进入开臂时间百分比；(B)5月龄小鼠进入开臂次数百分比；
图11是根据本发明实施例的β-actin基因PCR结果；
图12是根据本发明实施例的APP基因PCR结果；
图13是根据本发明实施例的PS1基因PCR结果；
图14是根据本发明实施例的微波照射后2m组小鼠脑内淀粉样蛋白沉积实验结果，
其中，A与B：示C2M组海马与大脑皮层，未见淀粉样蛋白沉积；C与D：CT2M组照射6m，海马与大脑皮层出现淀粉样蛋白沉积，斑块面积较小，凝集程度较高(▲)；E与F：CT2M组照射9m，海马与大脑皮层淀粉样蛋白沉积增多，斑块面积较大，凝集程度较高(▲)；G与H：RT2M组照射6m，海马与大脑皮层出现淀粉样蛋白沉积，斑块面积较小，凝集程度较高(▲)；I与J：RT2M组照射9m，海马与大脑皮层淀粉样蛋白沉积增多，斑块面积较大，部分斑块开始解聚(→)；
图15是根据本发明实施例的微波照射后2m组APP/PS1小鼠刚果红染色斑块数量统计结果，其中，*p<0.05,RT2M vs CT2M；
图16是根据本发明实施例的微波照射后5m组小鼠脑内淀粉样蛋白沉积刚果红染色结果，其中，
A与B：示C5M组海马与大脑皮层，未见淀粉样蛋白沉积；C与D：CT5M组照射6m，海马与大脑皮层出现淀粉样蛋白沉积，斑块面积较小，凝集程度较高(▲)；E与F：CT5M组照射9m后，海马与大脑皮层淀粉样蛋白沉积增多，斑块面积较大，部分斑块开始解聚(→)；G与H：RT5M组照射6m后，海马与大脑皮层出现淀粉样蛋白沉积，斑块面积较小，凝集程度较高(▲)；I与J：RT5M组照射9m后，海马与大脑皮层淀粉样蛋白沉积增多，斑块面积较大，部分斑块开始解聚(→)；
图17是根据本发明实施例的微波照射后5m组APP/PS1小鼠刚果红染色斑块数量统计结果；
图18是根据本发明实施例的微波照射9m小鼠β-淀粉样蛋白免疫组化染色结果，
其中，A与B：C5M组海马与大脑皮层；C与D：CT5M组海马与大脑皮层。
图中棕黄色斑块即为阳性结果(▲)；
图19是根据本发明实施例的微波照射2m组APP/PS1小鼠大脑皮层与海马β-淀粉样蛋白免疫组化斑块总面积的定量分析结果；
图20是根据本发明实施例的微波照射2m组APP/PS1小鼠大脑皮层β-淀粉样蛋白免疫组化斑块面积的定量分析结果；
图21是根据本发明实施例的微波照射2m组APP/PS1小鼠海马β-淀粉样蛋白免疫组化斑块面积的定量分析结果；
图22是根据本发明实施例的微波照射5m组APP/PS1小鼠大脑皮层与海马β-淀粉样蛋白免疫组化斑块总面积的定量分析结果，**p<0.01,RT5M vs CT5M；
图23是根据本发明实施例的微波照射5m组APP/PS1小鼠大脑皮层β-淀粉样蛋白免疫组化斑块面积的定量分析结果，**p<0.01,RT5M vs CT5M；
图24是根据本发明实施例的微波照射5m组APP/PS1小鼠海马β-淀粉样蛋白免疫组化斑块面积的定量分析结果，*p<0.05,RT5M vs CT5M；
图25是根据本发明实施例的微波照射2m组小鼠大脑皮层Aβ1-40含量测定结果，*p<0.05vs C2M组，**p<0.01vs C2M组，#p<0.05vs CT2M组，##p<0.01vs CT2M组；
图26是根据本发明实施例的微波照射2m组小鼠大脑皮层Aβ1-42含量测定结果，*p<0.05vs C2M组，**p<0.01vs C2M组，#p<0.05vs CT2M组；##p<0.01vs CT2M组；
图27是根据本发明实施例的微波照射5m组小鼠大脑皮层Aβ1-40含量测定结果，*p<0.05vs C5M组，**p<0.01vs C5M组，#p<0.05vs CT5M组，##p<0.01vs CT5M组；
图28是根据本发明实施例的5月组小鼠大脑皮层Aβ1-42含量测定结果，其中，*p<0.05vs C5M组，**p<0.01vs C5M组，#p<0.05vs CT5M组；##p<0.01vs CT5M组；
图29是根据本发明实施例的微波辐射后小鼠海马超微结构改变结果图，其中，
A：示正常神经元，B：R2m组照射6m，可见神经元核膜溶解，其它细胞器结构基本正常；C：RT2m组照射9m，可见神经元内质网扩张(▲)，溶酶体()，D：CT5m组6m，神经元内可见较多溶酶体和退变组织，E和F：RT5m照射9m，可见局部均质样结构(*)和大量髓样小体聚集(#)；以及
图30是根据本发明实施例的微波辐射后APP/PS1小鼠海马神经元突触和髓鞘超微结构改变结果图，其中，
A：示正常神经元突触结构，可见清晰的突触间隙(◇)，完整的突触前后膜结构；
B：R5m组照射9m，可见突触穿孔，突触间隙模糊(◆)；
C：示正常髓鞘结构，可见髓鞘致密，呈同心圆样排列(□)；
D：RT2m照射6m，局部可见髓鞘结构解离(■)。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1微波辐射对APP/PS1小鼠认知行为的影响研究
1材料与方法
1.1实验动物及分组
二级雄性APP/PS1小鼠(购自华阜康)与雄性C57小鼠(购自维通利华)各48只，其中2m龄和5m龄雄性APP/PS1转基因小鼠各24只；2m龄和5m龄雄性C57小鼠各24只。随机分为2m龄C57小鼠空白对照组(C2m)和辐射组(R2m)，2m龄转基因小鼠对照组(CT2m)和辐射组(RT2m)，5m龄C57小鼠空白对照组(C5m)和辐射对照组(R5m)，5m龄转基因小鼠对照组(CT5m)和辐射组(RT5m)，每组12只，每只小鼠进行独立编号。
1.2微波辐射条件
实验设备：军事医学研究院自建电磁混响室。
暴露参数：脉冲调制微波900MHz，平均场强25-31V/m，暴露时间为每天上午辐射1h(8:00)，下午辐射1h(17：00)；持续暴露6m或9m。
1.3行为学实验检测时间点
1.3.1行为学实验流程图如图1(2m龄组)和图2(5m龄组)所示
1.3.2行为学实验时间点
如行为学流程图1和图2所示，2m龄组于辐射第91d、92d、93d、94d、95d、180d和270d时，5m龄组于辐射前第1-5d、辐射90d、180d和270d通过Morris水迷宫(Morris Water Maze,MWM)评价小鼠空间学习记忆能力；2m龄组小鼠在辐射180d和270d，5m龄组在辐射97d和182d通过Y迷宫(Y-Maze)检测小鼠空间学习记忆能力；2m龄组和5m龄组于辐射184d进行高架十字迷宫(Elevated Plus Maze,EPM)检测小鼠焦虑情绪；2m龄组和5m龄组于辐射186d至188d通过新物体识别(New Object Recognition,NOR)检测非空间认知能力。每个行为学实验之间至少间隔一天，且行为学实验在微波辐射间隔进行。
1.4小鼠空间认知能力检测
1.4.1Morris水迷宫
1.4.1.1Morris水迷宫实验设备和试剂
不锈钢水池 北京顾林苑科技责任公司，中国
取景器 北京顾林苑科技责任公司，中国
水迷宫数据记录软件 北京阳光仪器责任有限公司，中国
二氧化钛 国药集团化学试剂有限公司，中国
1.4.1.2实验步骤
(1)在直径100cm的不锈钢水池中注入水，没过平台2cm，水温控制在21±2℃左右，倒入二氧化钛，使水颜色成为乳白色。将水池等划分为4个象限，并在第一象限中放置平台(平台到圆心与池壁的距离相等)，用遮光布将水池围起来，遮光布悬挂一个参照物，并保持不变，便于小鼠进行定位，取景器位于水池上方，可自动记录数据轨迹并分析。
(2)将小鼠面朝池壁依次放入四个象限中，记录小鼠在每一个象限60s内找到平台的时间，并让其在平台处待5s，使其记忆加深；若小鼠在60s内未能找到平台，则适当引导小鼠到平台上；实验结束后，用干毛巾将小鼠擦干，避免因垫料潮湿生病。通过软件记录每只小鼠的路程、各个象限的时间、平均逃避潜伏期、平均速度。
1.4.2Y迷宫
1.4.2.1Y迷宫实验设备
黑色不透明敞箱(长×宽×高35cm×5cm×10cm) stoelting公司，美国
ANY-maze软件 stoelting公司，美国
1.4.2.2实验步骤
(1)Y迷宫由三个完全相同的闭合臂以及一个中心区组成，在中央区内，各个臂都有一个挡板，三个臂之间的夹角为120°，并将三个臂分别名为起始臂(Start Arm)，其他臂(OtherArm)与新异臂(Novel Arm)。实验分为适应期和测试期两个阶段，在适应期，用挡板将新异臂遮挡，将小鼠从起始臂贴壁开始放入，让其自由活动10min。1h后进入测试期，将新异臂打开，并且将小鼠从起始臂开始放入，让小鼠自由探索，同时用ANY-maze软件记录小鼠在8min内进入各臂的次数和顺序，当小鼠四肢完全进入臂内，为进臂一次，以连续进入不同臂为一次正确交替反应，进而计算自发交替反应率。自发交替反应率＝(正确交替反应次数/总次数-2)×100％。
(2)每只动物实验结束后，用75％酒精喷洒敞箱底部，并用干毛巾擦拭干净，清理粪便，以免前一只小鼠遗留的气味对实验造成影响。
1.5小鼠非空间认知能力检测
1.5.1新物体识别实验设备
黑色不透光敞箱 北京智鼠多宝生物科技有限责任公司，中国
Xeye ABa动物行为视频分析系统 安徽正华生物仪器设备有限公司，中国
1.5.2新物体识别实验步骤
(1)新物体识别实验分为三个阶段，分别是适应期，学习期和识别期；第1、2天为适应期，第3天为学习期和识别期。在适应期，将小鼠放入无任何物体，50cm×50cm×40cm的黑色不透明敞箱后，让小鼠在敞箱中自由活动10min；在学习期，在黑色不透明敞箱的一侧壁边，间隔一定距离放置两个一模一样的绿色圆椎体(直径6cm，高10cm)。学习期，将小鼠在放置物体的相对壁贴壁放入，让小鼠在敞箱中自由探索10min；学习期后，每只小鼠间隔60min后进入识别期；在识别期，将一个绿色的椎体更换为红色的圆柱体(直径6cm，高10cm)。将小鼠从相同的位置放入敞箱中，软件记录小鼠分别探索两个物体的时间。通过计算辨别指数反应小鼠的学习记忆能力，辨别指数越高，表示小鼠学习记忆能力越好。辨别指数＝(探索新物体时间-探索旧物体时间)/(探索新物体时间+探索旧物体时间)。
(2)每只动物实验结束后，用75％酒精喷洒敞箱底部，并用干毛巾擦拭干净，清理粪便，以免前一只小鼠遗留的气味对本实验造成影响。
1.6小鼠焦虑情绪检测
1.6.1高架十字迷宫实验设备
SB015型高架十字迷宫 北京智鼠多宝生物科技有限责任公司，中国
Xeye ABa动物行为视频分析系统 安徽正华生物仪器设备有限公司，中国
1.6.2实验步骤
(1)高架十字迷宫有两个相对的开放臂(长×宽70cm×8cm)，两个相对的闭合臂(长×宽66.5cm×5.5cm)，中央平台(长×宽8cm×5.5cm)，平台距离地面高度为70cm。将小鼠面朝任一开放臂，放置于高架十字迷宫的中央平台，记录小鼠在5min内进入各臂的次数与时间，采用进入开放臂次数占总的进臂次数的百分比以及进入开放臂时间占总的进臂时间的百分比表示抗焦虑作用。
(2)每只动物实验结束后，用75％酒精喷洒高架平台，并用干毛巾擦拭干净，清理粪便，以免前一只小鼠遗留的气味对实验造成影响。
1.7动物基因型检测
1.7.1实验设备和试剂
1.7.2脑组织DNA提取
每只小鼠取20mg脑组织，按照DNA提取试剂盒说明书提取DNA，操作步骤如下：
(1)将组织放置2ml EP管中捣碎制成细胞悬液，10,000rmp离心1min；
(2)倾倒上清液，加入200μlGA，震荡充分混匀；
(3)加入Proteinase K混匀，在56℃金属浴放置，待组织完全溶解，短离去掉管壁水珠；
(4)加入200μl缓冲液GB，震荡充分混匀，在70℃金属浴放置10min，溶液变澄清，短离去掉管壁水珠；
(5)加入200μl无水乙醇，震荡充分混匀，短离去掉管壁水珠；
(6)将所得溶液转移置吸附柱内，离心30s，倾倒废液，再将吸附柱CB3放置收集管中；
(7)在吸附柱CB3内加500μl缓冲液GD，12,000rmp离心30s，倾倒废液，再将吸附柱CB3放置收集管中，再重复此步骤一次；
(8)将吸附柱CB3放置收集管中，空离，12,000rmp离心2min，倒掉废液；
(9)将吸附柱CB3在室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；
(10)将吸附柱CB3转移置新的EP管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12,000rmp离心2min，将溶液收集到新的EP管内；
(11)将收集到的DNA溶液进行分装，并放置-20℃冻存。
1.7.3 PCR扩增及凝胶电泳
(1)引物设计：根据APP/PS1小鼠的两个靶基因和内参β-actin，设计三对引物，引物序列如下。
引物一：APP(350bp)
GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG PAP-A-S
CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCCG PAP-A-A
引物二：PS1(608bp)
AATAGAGAACGGCAGGAGCA PAP-P-S
GCCATGAGGGCACTAATCAT PAP-P-A
引物三：β-actin(262bp)
GCTACAGCTTCACCACCACAG β-actin-u
GGTCTTTACGGATGTCAACGTC β-actin-d
(2)配制PCR反应体系：
(3)PCR反应条件：
(4)DNA电泳：
配置1.5％的琼脂凝胶，加入10μl核酸染料，倒入胶板中，冷却凝固。加5μl样品和1μl6×loading buffer进行充分混匀后上样。上样完毕后，将电压设置为130mV，电泳30min后显影，凝胶成像仪观察显影结果。
1.8统计学分析
行为学实验数据统计分析采用软件SPSS 21.0，Morris水迷宫采用2×2重复测量的方差分析，其余行为学实验采用2×2方差分析，采用GraphPad Prism 6.0软件作图。数据以均数±标准误(MEAN±S.E)表示，*P<0.05和#P<0.05表示具有显著意义，**P<0.01表示非常具有显著意义。
2实验结果
2.1 Morris水迷宫结果
Morris水迷宫实验用于评价小鼠空间学习记忆能力，2m龄组小鼠实验结果表明，C2m组小鼠找到平台的时间随着实验天数的增加，平均逃避潜伏期逐渐缩短，CT2m组小鼠随着实验天数的增加，逃避潜伏期有所缩短，但与C2m组相比，平均逃避潜伏期仍显著延长(P<0.05)，提示CT2m组小鼠的空间学习记忆能力受损；与CT2m组相比，RT2m组小鼠逃避潜伏期有所缩短(P<0.05)，提示RT2m组小鼠空间学习记忆能力有一定程度改善。结果如图3所示。
5m龄组实验结果可见，C5m组小鼠随着实验天数的增加，逃避潜伏期逐渐缩短，CT5m组小鼠随着实验天数的增加，平均逃避潜伏期几乎持续不变，提示CT5m组小鼠空间学习记忆能力严重受损(P<0.01)；与C5m组小鼠相比，R5m组小鼠在辐射前3d、4d，辐射后180d逃避潜伏期有所延长(P<0.05)；与CT5m组小鼠相比，在辐射90d后，RT5m组小鼠的空间学习记忆能力有所改善(P<0.05)；而辐射180d、270d后，RT2m组的逃避潜伏期有所延长，基本与CT2m持平。结果如图4所示。
2.2 Y迷宫结果
Y迷宫通过记录小鼠进入新异臂的次数以及自发交替反应率来反应小鼠工作记忆能力，2m龄组小鼠实验结果显示，与C2m组小鼠相比，R2m组小鼠进入新异臂的次数无显著差异，而辐射后182d自发交替反应率降低(P<0.05)；CT2m组进入新异臂的次数较高，且差异具有统计学意义(P<0.05)；RT2m组进入新异臂的次数较高，且差异具有统计学意义(P<0.01)。与CT2m组小鼠相比，RT2m组小鼠进入新异臂次数与自发交替反应率无明显差异。微波辐射272d，各组小鼠之间没有统计学差异。结果如图5所示。
5m龄组小鼠实验结果显示，与C5m组小鼠相比，R5m组小鼠进入新异臂次数和自发交替反应率无明显差异；辐射182d，与C5m组小鼠相比，CT5m组与RT5m组进入新异臂的次数较低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与CT5m组小鼠相比，RT5m组小鼠进入新异臂次数与自发交替反应率无明显差异。在辐射182d和辐射272d，各组小鼠的自发交替反应率均无统计学差异。结果如图6所示。
2.3新物体识别实验结果
新物体识别实验是通过辨别指数反应小鼠的学习记忆能力，辨别指数越高，表明小鼠学习记忆能力越好。辐射186d，2m龄组小鼠实验结果显示，与C2m组小鼠相比，R2m组无明显差异，CT2m组小鼠的辨别指数显著性降低(P<0.05)，提示APP/PS1小鼠学习记忆能力降低；与CT2m组小鼠相比，RT2m组小鼠辨别指数较高，虽无统计学意义，但有一定程度逆转。结果如图7所示。
辐射186d，5m龄组小鼠实验结果表明，C5m组小鼠探索旧物体的时间超过探索新物体的时间，提示此时C5m组小鼠非空间认知能力受损，与C5m组相比，R5m组小鼠和CT5m组小鼠均存在非空间认知障碍。与CT5m组相比，RT5m组小鼠虽没有统计学差异，但RT5m组小鼠的非空间认知能力有一定改善。结果如图8所示。
2.4高架十字迷宫实验结果
高架十字迷宫实验用来检测小鼠的焦虑情绪，小鼠进入开放臂的次数越多，所待的时间越长，表明小鼠的焦虑的程度较低。高架十字迷宫实验用来检测小鼠的焦虑情绪，小鼠进入开放臂的次数越多，所待的时间越长，表明小鼠的焦虑的程度较低。辐射184d，2m龄组小鼠实验结果表明，与C2m组相比，R2m组与C2m组之间没有统计学差异，CT2m组开臂次数百分比与开臂时间百分比较高(P<0.05)；与CT2m组相比，RT2m组无显著性差异。结果如图9所示。
辐射184d，5m龄组小鼠实验结果表明，与C5m组相比，R5m组无显著性差异，CT5m组进入开臂的次数与时间与C5m组相持平；与CT5m组相比，RT5m组未见显著差异，但RT5m组小鼠进入开放臂的时间和次数有增多的趋势。结果如图10所示。
2.5动物基因型检测结果
APP/PS1小鼠是阿尔茨海默病模型的双转基因小鼠，可以在多处弥补单转基因动物模型，表现出人类更多的阿尔茨海默病的病理过程。其中β-actin基因扩增产物大小为262bp，APP基因扩增产物片段是350bp，PS1基因扩增产物片段是608bp。本实验将每只小鼠进行基因型鉴定，以确定阿尔茨海默病小鼠模型转入APP与PS1两个基因。图11、12、13是部分小鼠PCR的结果，其中1至6号是空白对照组小鼠，7至12号是APP/PS1对照组小鼠，17至22号是辐射组小鼠，13、14、15、16、23、24号为APP/PS1辐射组小鼠。结果表明，C57小鼠不含有APP和PS1两个基因，APP/PS1小鼠已转入APP和PS1基因。
3讨论
阿尔茨海默病是影响老年人的生活与健康的严重疾病之一，而伴随着世界人口的增长，阿尔茨海默病患者也逐渐增多，临床上仍未出现可以有效治疗阿尔茨海默病的药物。APP/PS1小鼠是国际上公认的阿尔茨海默病模型小鼠之一，该小鼠是通过重组DNA技术将人/鼠淀粉样蛋白前体(APP)和人类早老素(PS1)两种突变基因转染到动物体内，可引起早发性老年痴呆，表现出人类阿尔茨海默病的病理过程。本研究通过基因鉴定已确认APP/PS1转基因实验动物模型建立完成。
3.1微波辐射对APP/PS1小鼠空间认知能力的影响
Morris水迷宫是20世纪80年代由Morris首次提出用于评价啮齿类动物空间学习记忆的经典实验，通过依靠远端的线索寻找隐藏平台，随着实验的不断改进，现已被广泛用于阿尔茨海默病、痴呆症、药物对实验动物学习记忆的影响等研究。Y迷宫是通过利用啮齿类动物对新异臂有探索的天性，可有效的反应动物对新异臂有识别记忆。Morris水迷宫、Y迷宫和T迷宫是有效测试啮齿类空间学习记忆能力的实验，与Morris水迷宫相比，Y迷宫训练时间较短，并减少实验过程应激条件对学习记忆的影响；但研究发现，与Y迷宫相比，Morris水迷宫实验可以提供更多实验参数，并且更有效的反应实验动物的空间认识能力。
随着电磁技术的发展和广泛应用，电磁辐射对人体健康的影响越来越受到关注。研究采用不同的行为学装置，发现不同剂量的微波辐射对小鼠的空间认知有不同程度的影响：采用手机辐射的标准(918MHz，SAR0.25W/kg)对正常小鼠进行辐射，通过放射状水迷宫发现辐射对小鼠认知能力可产生一定程度的有益影响。也有研究通过模拟数字无线电话信号的射频电磁波(900MHz，SAR为0.05W/kg)持续辐射成年雄性C57小鼠，在八臂迷宫实验发现该辐射剂量对小鼠的空间学习认知能力无影响。此外，有研究发现采用10GHz功率密度为0.25mW/cm2、SAR值为0.179W/kg辐射小鼠15d，与对照组相比，小鼠的空间学习记忆能力受损。在本研究中，通过Morris水迷宫实验发现，采用平均场强为25-31V/m的微波长期辐射2m龄小鼠，与C2m组小鼠相比，R2m组小鼠未表现出空间学习记忆能力损伤，平均逃避潜伏期有一定程度的缩短。长期辐射5m龄小鼠，与C5m组小鼠相比，发现辐射90d时，R5m组小鼠平均逃避潜伏期没有受到影响，辐射180d其平均逃避潜伏期延长，辐射270d却有所缩短，说明微波辐射对5m龄组小鼠的空间认知有一定的损害作用，但随着辐射时间的延长，小鼠的空间认知受损有一定改善。在Y迷宫实验中，本研究发现R2m组小鼠在辐射182d后自发交替反应率下降，说明长期辐射可能导致小鼠认知能力下降；但5m龄小鼠未见明显异常。
有研究通过Morris水迷宫和放射状水迷宫实验发现APP/PS1双转基因小鼠6～8月龄时在中可表现出认知功能障碍。本研究中，Morris水迷宫实验结果表明，APP/PS1小鼠成长至5月龄时已经表现出空间学习记忆功能障碍，Morris水迷宫实验中正常APP/PS1组与正常对照组相比，平均逃避潜伏期随着学习天数增加而显著降低，并且随着月龄的增大，小鼠的空间认知障碍更严重。以往研究发现，通过Y迷宫检测APP/PS1小鼠学习记忆能力，发现小鼠在3月龄时空间认知能力表现出下降趋势，但在9月龄时才出现明显的空间认知障碍。但在本研究中，与C2m组小鼠相比，CT2m组小鼠的行为学数据表现异常，并未表现出空间认知的损伤，反而对新异臂环境更感兴趣，进入新异臂的次数更多；而与C5m组小鼠相比，CT5m组小鼠成长6月后发现，小鼠进入新异臂的次数降低，此时才表现出空间认知障碍。提示Morris水迷宫比Y迷宫实验可以更为敏感地检测APP/PS1小鼠的空间认知障碍。
有研究采用918MHz，0.25W/kg持续辐射APP/PS1转基因小鼠8个月，通过放射状水迷宫实验发现，辐射对小鼠的学习记忆有明显改善作用。也有研究采用频率为1950MHz，SAR值为5W/kg持续辐射5×FAD小鼠8个月，通过Y迷宫实验测试，发现辐射后的5×FAD小鼠记忆损伤明显改善，提示辐射可以改善AD的认知功能。本研究发现，通过长期的微波辐射，2m龄组小鼠实验结果表明，Morris水迷宫实验中，与CT2m组小鼠相比，RT2m组小鼠在辐射90d后并未表现出空间认知障碍，RT2m组小鼠在辐射90d后并未表现出空间认知障碍，而在辐射第180d，RT2m组小鼠表现出认知功能障碍，提示微波辐射3m对2m龄组APP/PS1小鼠的发病存在一定程度的改善作用。在5m龄组小鼠实验中，微波辐射3m后，与C5m组小鼠相比，RT5m组小鼠出现空间认知障碍，而与CT5m组小鼠相比，RT5m组小鼠的逃避潜伏期有所下降，且差异具有统计学意义，说明微波辐射3m对5m龄APP/PS1组小鼠的发病有一定程度的改善作用；在微波辐射6m和9m，RT5m组小鼠的逃避潜伏期与CT5m组小鼠逃避潜伏期相持平，说明微波辐射6m不能改善APP/PS1小鼠的空间认知能力。以上结果提示，一定时间的微波辐射(3m)对APP/PS1小鼠的空间认知能力有显著改善作用，但过长时间的微波辐射这种改善作用会减弱。
3.2微波辐射对APP/PS1小鼠非空间认知能力的影响
新物体识别实验用于评价啮齿类动物的非空间认知能力，依靠小鼠喜新厌旧的天性探讨其学习记忆能力的影响，正常小鼠由于对旧物体存在记忆，会花更多的时间探索新物体。有研究采用频率为900MHz，SAR值为3.5W/kg辐射大鼠45min，通过新物体识别实验发现，该频率和剂量的微波并没有改变大鼠的非空间认知能力。在本实验中，发现采用平均场强为25-31V/m的微波辐射长期辐射正常小鼠，在辐射第186d开始进行实验，与C2m组小鼠相比，R2m组小鼠并未发生非空间认知能力障碍，说明该剂量的微波辐射不能改变正常小鼠的非空间认知能力。而在5m龄组小鼠实验中，发现该组小鼠的辨别指数异常，C5m组小鼠和R5m组小鼠均表现出非空间认知的障碍，与以往研究相比，小鼠行为表现异常，引起这种情况的原因可能是5m龄组小鼠的年龄过大和实验样本量少有关。
以往研究表明，APP/PS1小鼠在5月龄时就已经表现出非空间认知能力的障碍。在本研究中，与C2m组小鼠相比，CT2m组小鼠辨别指数显著较低，说明CT2m组小鼠在8月龄时也已经表现出非空间认知能力障碍，RT2m组小鼠经过6m的微波辐射后，虽然与CT2m组没有统计学差异，但辨别指数有所增高，表明微波辐射对2m龄组APP/PS1小鼠的非空间认知障碍有一定程度的改善。在5m龄组小鼠中，CT5m组小鼠的辨别指数也显著降低，说明CT5m小鼠也存在非空间认知能力的障碍，与CT5m组小鼠相比，RT5m组小鼠的辨别指数有所增高，提示微波辐射6m对5m龄组APP/PS1小鼠的非空间认知障碍有一定程度改善。
3.3微波辐射对APP/PS1小鼠焦虑情绪的影响
测试啮齿类动物焦虑情绪的行为学主要有旷场实验、高架O迷宫和高架十字迷宫等实验[27]，其中高架十字迷宫是评价抗焦虑药物的有效实验之一，主要是利用小鼠对新事物好奇的天性，以及对高悬的开臂存在恐惧形成的矛盾心理，造成焦虑，而焦虑情绪的小鼠进入开臂的次数和时间会缩短，更多倾向于较为安全的闭合臂。有研究采用低频率的(5-100Hz)微波持续辐射小鼠6周，在旷场试验中，小鼠并未表现出焦虑行为，Kumlin T等采用频率为900MHz、SAR值为9W/kg辐射大鼠，发现并未增加大鼠的焦虑水平，也有研究采用1.8GHz，SAR值分别为2.2W/kg和2.7W/kg辐射小鼠，旷场实验和高架十字迷宫实验表明小鼠的焦虑水平增多。在本实验中，微波辐射2m龄和5m龄小鼠6m均未出现焦虑情绪，提示采用SAR值为0.25-1.05W/Kg的微波长期辐射正常小鼠，不会导致小鼠焦虑。
有研究通过高架十字迷宫检测6月龄和9月龄的快速老化APP/PS1小鼠，与正常同月龄组小鼠相比，结果表明快速老化APP/PS1小鼠进入开放臂的时间和次数增多，小鼠表现出低焦虑水平，表明快速老化APP/PS1模型小鼠的焦虑水平较低[32]。也有研究表明，3月龄的APP/PS1小鼠与相同月龄的正常小鼠相比，APP/PS1小鼠表现出焦虑现象，但没有空间认知障碍。在本实验中，辐射6m，APP/PS1小鼠行为表现异常，CT2m组小鼠进入开放臂的时间和次数增多，CT2m组小鼠更喜欢开放臂，说明CT2m组小鼠未出现焦虑情绪；CT5m小鼠也未表现出焦虑状态。提示本实验的APP/PS1小鼠未出现焦虑情绪。RT2m组小鼠与RT5m组小鼠实验结果表明，采用平均场强为25-31V/m的微波辐射对APP/PS1小鼠焦虑水平无明显影响。
4结论
(1)APP/PS1小鼠5月龄表现出空间学习记忆功能障碍，8m龄表现出非空间学习记忆能力障碍，未出现焦虑状态。
(2)900MHz,平均场强25-31V/m微波辐射2m龄和5m龄APP/PS1小鼠3m，可改善其空间学习记忆能力障碍。
(3)900MHz,平均场强25-31V/m微波辐射3-9m对C57小鼠行为学未见明显影响。
实施例2微波辐射对APP/PS1小鼠脑结构的影响研究
1.材料与方法
1.1实验动物与分组
二级雄性APP/PS1小鼠(购自华阜康)48只与雄性C57小鼠(购自维通利华)48只。2m龄与5m龄雄性APP/PS1小鼠和2m龄与5m龄雄性C57小鼠各24只，其中对照组与微波暴露组各半。依次编号为2m龄C57小鼠空白对照组(C2M)与照射组(R2M)；2m龄转基因小鼠对照组(CT2M)与照射组(RT2M)；5m龄C57小鼠空白对照组(C5M)与照射组(R5M)；5m龄转基因小鼠对照组(CT5M)与照射组(RT5M)。
1.2实验动物的照射
照射装置为军事医学院军事医学研究所提供的电磁混响室；选用照射频率为900MHz的脉冲调制微波，平均场强25-31V/m；2m组在小鼠2月龄时开始给予照射，5m组在小鼠5月龄时开始给予照射，每天上午照射1h(8:00)；下午照射1h(17:00)，持续6m和9m。
1.3实验动物的取材
照射6m和9m时，各组分别取一半小鼠进行取材。麻醉小鼠，取全脑，沿大脑纵裂切开，一半放入多聚甲醛固定，进行石蜡包埋，制成石蜡切片；另一半分离海马与皮层，取1mm3大小的海马组织进行戊二醛固定，制备电镜样本，其余组织-80℃冻存。
1.4刚果红染色实验
1.4.1主要实验设备
名称 公司
CO2培养箱 Heraeus
1.4.2主要试剂及配制
1.4.2.1刚果红染液的配制
使用购置于SIGMA公司的刚果红固体，编号为C6767-25G，取0.5g刚果红固体溶于100mL 50％的乙醇溶液中，配制0.5％的刚果红染液，充分震荡混匀，过滤使用。
1.4.2.2碱性乙醇分化液的配制
取0.2g KOH晶体溶于100mL 80％的乙醇溶液中，配制0.2％的碱性乙醇分化液，充分震荡混匀使用。
1.4.3实验步骤
(1)将石蜡切片在60℃烘箱中孵育60min；
(2)脱蜡：二甲苯Ⅰ(10min)---二甲苯Ⅱ(10min)，室温；
(3)水化：无水乙醇(5min)---95％乙醇(5min)---90％乙醇(5min)---80％乙醇(5min)---70％乙醇(5min)---蒸馏水(5min)，室温；
(4)用刚果红染液在37℃的培养箱中孵育3h，蒸馏水洗；
(5)碱性乙醇分化液分化1-2s，蒸馏水洗；
(6)苏木精复染20s，蒸馏水洗；
(7)脱水：70％乙醇(3s)---80％乙醇(3s)---90％乙醇(3s)---95％乙醇(3s)---无水乙醇(3s)，室温；
(8)透明：二甲苯Ⅰ(10min)---二甲苯Ⅱ(15min)，室温；
(9)中性树脂封片。
1.5免疫组织化学染色实验
1.5.1主要实验设备
1.5.2主要试剂及配制
1.5.2.1 3％的双氧水甲醇溶液的配制
3％的双氧水甲醇溶液双氧水：甲醇：蒸馏水按1：7：2的比例配制3％的双氧水甲醇溶液100mL，密封待用。
1.5.2.2DAB显色液的配制
自中杉金桥公司购置的DAB显色液试剂盒，浓缩的DAB溶液(试剂1)1滴，约50uL，与DAB底物液(试剂2)1mL混匀，现配现用。
1.5.2.3返蓝液的配制
每100mL蒸馏水中加入1mL氨水，配制成1％的返蓝液使用。
1.5.3实验步骤
(1)脱蜡：二甲苯Ⅰ(10min)---二甲苯Ⅱ(10min)，室温；
(2)水化：无水乙醇(5min)---95％乙醇(5min)---90％乙醇(5min)---80％乙醇(5min)---70％乙醇(5min)---蒸馏水(5min)，室温；
(3)3％的双氧水甲醇溶液孵育15min，室温；
(4)蒸馏水冲洗，PBS洗5min；
(5)抗原修复：将浸入抗原修复液的切片放进微波炉，中火孵育5min，室温冷却20min；再次将浸入抗原修复液的切片放进微波炉，中火孵育5min，冰水冷却至室温；
(6)PBS洗涤3次，每次5min；
(7)封闭：用正常的山羊血清，室温孵育10min，倒掉，不洗；
(8)加一抗，4℃冰箱过夜；
(9)PBS洗涤3次，每次5min；
(10)滴加二抗，室温孵育60min；
(11)PBS洗涤3次，每次5min；
(12)显色：DAB显色液孵育8min左右，在光镜下控制显色程度，可适当延长或缩短，一般不超过15min，蒸馏水洗终止显色反应；
(13)苏木精复染：苏木精染液室温孵育1-2min，自来水冲洗；
(14)盐酸乙醇分化：盐酸乙醇分化液分化1-2s；
(15)返蓝：在返蓝液中返蓝1-2min；
(16)脱水：70％乙醇(3s)---80％乙醇(3s)---90％乙醇(3s)---95％乙醇(3s)---无水乙醇(3s)，室温；
(17)透明：二甲苯Ⅰ(10min)---二甲苯Ⅱ(15min)，室温；
(18)封片：中性树脂封片。
1.6ELISA实验
1.6.1主要仪器设备
名称 公司
酶标仪 PerkinElmer
旋涡震荡器 Kylin-bell
1.6.2主要试剂及配制
名称 公司
小鼠β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)酶联免疫吸附测定盒 Elabscience
小鼠β淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)酶联免疫吸附测定盒 Elabscience
1.6.2.1标准品工作液的配制
将两种标准品Aβ1-42和Aβ1-40分别于10000g离心1min，加入标准品&样品稀释液1mL至冻干标准品中，旋紧管盖，静置10min，上下颠倒数次，待其充分溶解后，轻轻混匀，配成1000pg/mL的标准品工作液。然后进行倍比稀释。配制成以下浓度:1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0pg/mL工作液。
1.6.2.2生物素化抗体工作液的配制
实验前计算当次实验所需用量(以100uL/孔计算)，实际配制时应多配制100-200uL。使用前15min，以生物素化抗体稀释液将100×浓缩生物素化抗体稀释成1×工作浓度，当日配制当日使用。
1.6.2.3酶结合物工作液的配制
实验前计算当次实验所需用量(以100uL/孔计算)，实际配制时应多配制100-200uL。使用前15min，以酶结合物稀释液将100×浓缩HRP酶结合物稀释成1×工作浓度，当日配制当日使用。
1.6.2.4洗涤液的配制
将浓缩洗涤液用双蒸水按1：25稀释，当日配制当日使用。
1.6.3实验步骤
(1)组织匀浆的制备：称取适量的大脑皮层组织，用预冷的PBS冲洗，去除残留血液，按1:34的重量体积比加入预冷的PBS，此溶液再按1:100的比例加入蛋白酶抑制剂，在冰上充分研磨；然后将匀浆进行反复震荡破碎，每隔5min在震荡机上震荡15s，震荡8次；
(2)将标准品工作液依次加入到前3列孔中，每个浓度的工作液并列加3孔，每孔100uL。待测样品加入到其他孔，每孔100uL。给酶标板覆膜,37℃孵育90min；
(3)弃去液体，甩干，不洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液100uL，混匀，酶标板加上覆膜，37℃孵育1h；
(4)甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350uL，浸泡1-2min，吸去或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次；
(5)每孔加酶结合物工作液100uL，加上覆膜，37℃温育30min；
(6)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3；
(7)每孔加底物溶液(TMB)90uL,酶标板覆膜37℃避光孵育15min左右，可根据实际显色情况酌情缩短或延长，但不可超过30min。当标准孔出现明显梯度时，即可终止；
(8)每孔加终止液50uL，终止反应；
(9)立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。
1.7电镜
1.7.1主要实验设备
名称 公司
透射电子显微镜 HITACHI
1.7.2实验步骤
取各组大鼠海马组织，于冰上取1mm3组织块，立即浸入2.5％戊二醛内固定2h，而后1％锇酸固定2h，梯度乙醇和丙酮脱水，Epon812树脂包埋，半薄切片定位后，制作超薄切片，再用醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察其超微结构并采集图片。
1.8统计学分析
本研究数据采用SPSS21.0软件进行分析，GraphPad Prism软件进行作图，数据以均数与标准误
表示，刚果红染色和免疫组化结果采用独立样本t检验(two-samplet-test)的统计方法，ELISA结果则采用单因素方差分析(One-way ANOVA)的统计方法。
2.实验结果
2.1刚果红染色实验结果
刚果红染色结果显示，转基因组小鼠的海马及大脑皮层等部位出现无结构的均一的橘红色淀粉样蛋白沉积(图14C、D、E等)，在非转基因组则未出现此类沉淀(图14A、B，图16A、B)。
微波照射6m，2m与5m的CT组与RT组小鼠的海马与大脑皮层均已出现淀粉样蛋白沉积(图14C、D、G、H；图16C、D、G、H)，但斑块面积较小，凝集程度较高，且2m的RT组较CT组斑块数量显著减少(p<0.05)；微波照射9m，2m与5m的CT组与RT组小鼠的海马和大脑皮层的淀粉样蛋白沉积较6m时显著增多，面积增大，RT组部分斑块出现解聚(图16I、J，箭头所示)，斑块数量的定量分析结果见图15与图17。
2.2免疫组织化学染色实验结果
免疫组化结果显示：2m组与5m组转基因小鼠在海马及大脑皮层均出现大量β-淀粉样蛋白阳性表达的棕黄色斑块，而非转基因小鼠脑内未出现(图18)。斑块面积的定量分析结果显示，RT2M组小鼠与CT2M组小鼠相比，组间差异没有统计学意义(图19-21)；如图22-24所示，与CT5M组相比，RT5M组小鼠照射6m，大脑皮层及海马区的斑块面积均显著减少(p<0.05或p<0.01)，照射9m两组之间无统计学差异。
2.3ELISA实验结果
采用ELISA检测大脑皮层Aβ40与Aβ42的含量，结果如下图25-28所示。
由图25可知，微波辐射6m，与C2M组相比，2m其余各组小鼠大脑皮层Aβ1-40的含量均下降(p<0.05)；微波辐射9m，与C2M组相比，CT2M组小鼠大脑皮层的Aβ1-40的含量增加(p<0.05)；与CT2M组相比，RT2M组小鼠大脑皮层Aβ1-40的含量降低(p<0.05)，且与C2M组无显著性差异。
由图26可知，微波辐射6m，2m各组小鼠大脑皮层Aβ1-42的含量无统计学差异；微波辐射9m，CT2M组小鼠与C2M组相比，大脑皮层的Aβ1-42含量增加(p<0.05)；RT2M组与C2M和CT2M组相比，小鼠大脑皮层的Aβ1-42含量均显著降低(p<0.05或p<0.01)。
由图27可知，微波辐射6m，5m各组小鼠大脑皮层Aβ1-40的含量无统计学差异；微波辐射9m，CT5M组小鼠与C5M组相比，大脑皮层的Aβ1-40的含量增加(p<0.05)；R5M组与C5M组小鼠相比，大脑皮层的Aβ1-40的含量显著增加(p<0.01)；RT5M组小鼠与C5M组和CT5M组相比，大脑皮层Aβ1-40的含量均增加(p<0.05或p<0.01)。
由图28可知，微波辐射6m，5m各组小鼠大脑皮层Aβ1-42的含量无统计学差异；微波辐射9m，与C5M组相比，R5M组和RT5M组小鼠大脑皮层的Aβ1-42含量均增加(p<0.05或p<0.01)。
2.4电镜观察结果
2m组和5m组中，C组海马示基本正常神经元(图29A)、胶质细胞、突触和髓鞘(图30A和30C)等结构；R组可见个别退变或水肿神经元(图29B)；CT和RT组可见神经元退变，神经元内可见较多溶酶体和退变结构(图29C和29D)，个别可见突触穿孔和髓鞘解聚现象(图30B和30D)。照射9m较照射6m更为显著，5m组较2m组退变结构更多，且5m组照射9m可见局部均质样结构和大量髓样小体聚集(图29E和29F)，胶质细胞和突触结构基本正常。CT和RT组间未观察到明显差异。
3.讨论
随着社会的发展，人们生活水平逐渐提高，人口老龄化已成为我国当今社会面临的一个重大难题。据2015年所公布的世界痴呆报告显示，在全世界约每3秒就会多一个痴呆患者，这对于人口基数庞大的中国来说，无疑是一个亟待解决的问题。但是，目前对于AD仍无法根治，且没有十分有效的疗法，只能通过药物治疗或物理干预，但效果都不太理想，既然目前无法治愈AD，那么预防或延缓AD的发生发展，改善AD患者的病症就显得尤为重要。
AD是一种起病隐匿，病情持续发展的神经系统退行性疾病。AD患者脑内病理变化包括Aβ积聚与炎症，NFT形成，神经元丢失等。SP的核心是由APP经过β-分泌酶和γ-分泌酶的蛋白水解作用产生的含有39-43个氨基酸的蛋白组成的，Aβ40和Aβ42是形成SP的两种主要蛋白，一般情况下，Aβ40的含量要高于Aβ42，但Aβ42的神经毒性更强，更易聚集形成SP，但是，APP也可以在α-分泌酶的作用下，水解形成对神经有营养保护作用的sAPPα，从而减少Aβ蛋白的生成。SP的形成会导致自由基生成增多，炎症反应加重，Tau蛋白异常磷酸化加剧形成NFT等一系列病理学改变，这些改变皆会导致神经元的丢失，功能障碍或死亡等。因此，可以通过降低脑内Aβ的水平来改善AD的病理变化和临床症状，目前研究中降低Aβ水平的方法主要分为两大类：减少Aβ的产生或加快Aβ的清除。减少其产生的方法主要有运用β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂以及α-分泌酶激动剂等。加快其清除的方法则主要有免疫治疗、加快酶解和促进其向脑外转运[30]等，但效果都不是十分显著。因此，本研究对微波辐射后APP/PS1小鼠大脑皮层和海马结构以及Aβ沉积等的改变进行研究，希望可以为AD的防治找出新方法。
本研究选用APP/PS1双转基因小鼠作为AD模型鼠，研究表明该模型小鼠在2-3月龄时，即出现Aβ蛋白的生成增多，6月龄时即可出现老年斑的沉积，到9月龄时，沉积数量大量增加，是研究AD的常用模型鼠之一。本研究在2m龄和5m龄APP/PS1小鼠照射6m和9m时，通过ELISA检测大脑皮层和海马Aβ蛋白含量，刚果红染色和Aβ蛋白免疫组化综合分析SP的数量并观察其形态，电镜观察其超微结构，结果可见APP/PS1小鼠8m龄时可见大脑皮层和海马区Aβ蛋白沉积的斑块数量和面积均增加，且11m龄时增加更为显著；而Aβ40和Aβ42的含量在8m龄时未见改变，11m龄时方检测到其显著增加；电镜观察到了8m龄时神经元内外大量退变的结构，11m龄时上述改变加重，并可见突触穿孔，髓鞘解离，退变组织周围还可见均质样结构。以上结果显示，APP/PS1小鼠在照射6m时已出现AD特征性的病理改变，到照射9m时，上述病变更加显著，提示AD模型鼠造模成功。但Aβ1-40和Aβ1-42含量检测的方法敏感性较低，仍需进一步改进。
微波是指频率范围在300～300000MHz的高频电磁波，随着科技的进步，它已充斥于我们的学习与生活当中。虽然电磁辐射会产生一些对人体有害的效应，如微波照射可以通过NMDA受体信号通路的过度活化损害大鼠海马和PC12细胞的突触可塑性[22,34]；长期低水平的微波暴露大鼠会导致海马结构和功能的显著改变，包括线粒体肿胀，嵴疾病[35]以及粗面内质网也表现出囊状扩张，突触囊泡数量减少等改变。但也有研究指出，不同频率的电磁辐射可以对认知产生有益的作用，研究表明：人短期暴露于手机辐射(918MHz，SAR0.25W/kg)后会对认知产生有益效应；Arendash等研究也表示，将成人长期暴露于高频电磁场(918MHz，0.25-1.05W/kg)6个月以上，每日暴露可预防认知障碍；另外，Schuz等研究发现，长期使用手机的人(10年或更长时间)因AD和血管性痴呆症住院的风险降低了30-40％；将AD小鼠长期暴露于高频电磁场可以产生一种Aβ抗聚集作用，进而减少脑内Aβ沉积；5×FAD转基因(Tg-5×FAD)小鼠在射频电磁场中暴露8个月后(1950MHz，SAR 5W/kg，2小时/天，5天/周)，脑内Aβ斑块的数量与大小都显著减少。与对照转基因小鼠相比，Tg-5×FAD组小鼠海马中的Aβ比例降低了30％；内嗅皮质区的Aβ比例下降了15％；全脑区的Aβ比例下降了10％。并且近年来，越来越多的研究表明，对于AD的病变所采取的相关干预治疗措施只有在AD发病早期，淀粉样斑块还没有大面积形成时实施才会有更好的疗效。因此，本研究中，在APP/PS1小鼠2m时，SP未形成之前就给予照射，旨在观察微波照射对AD发生的预防作用；APP/PS1小鼠5m时，在SP刚开始形成时给予照射，旨在观察微波辐射对AD的治疗作用。
本研究结果显示：微波辐射C57小鼠6m和9m后，电镜可见海马个别神经元出现退行性改变(核膜溶解，内质网扩张等)，辐射5m龄C57小鼠9m，大脑皮层和海马Aβ1-40和Aβ1-42的含量增加，但刚果红染色和免疫组化结果中未见Aβ蛋白斑块的沉积。表明微波长期辐射不会诱发C57小鼠出现老年斑。对于2m组APP/PS1小鼠，持续照射6m，与CT2M组相比，RT2M组脑内Aβ数量明显减少(p<0.05)，但斑块面积未见明显差异；照射9m后，斑块形成未见明显差异，但大脑皮层的Aβ1-40与Aβ1-42的含量较CT2M组均显著下降(p<0.05或p<0.001)；提示在SP形成之前进行微波照射，照射6m内对SP的形成有一定的减缓作用；随着微波照射时间的延长，微波照射抑制SP形成的作用会减弱，但Aβ蛋白的生成受抑制。对于5m组APP/PS1小鼠，照射6m时，与CT5M组相比，RT5M组小鼠海马及大脑皮层的斑块面积显著减少(p<0.05或p<0.001)，斑块数量未见明显差异；但当持续照射9m时，RT5M组的斑块面积和数量无统计学差异，但Aβ1-40与Aβ1-42的含量却显著增加(p<0.05)。这提示在SP形成之后再进行微波照射，在照射6m内，微波照射对于SP的形成有一定的减缓作用，但照射9m却促进大脑皮层Aβ1-40与Aβ1-42的生成。关于微波辐射抑制SP形成的机制，仍待进一步深入研究。
4.结论
(1)APP/PS1小鼠8m龄后大脑皮层和海马区Aβ蛋白斑块大量沉积。
(2)900MHz，平均场强25-31V/m微波辐射6-9m不会诱发C57小鼠出现老年斑。
(3)900MHz，平均场强25-31V/m微波辐射2m龄和5m龄APP/PS1小鼠6m可改善其大脑皮层和海马区Aβ蛋白的积聚
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (7)
1.一种提高空间学习记忆能力的方法，其特征在于，所述方法用于非治疗目的，包括：使待提高个体处于微波辐射下，所述微波辐射的频率为900MHz，所述微波辐射的平均场强为25-31V/m，所述个体不具有空间学习记忆功能障碍。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微波辐射的时间为2.5月～6.5月。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微波辐射的时间为3月。
4.一种降低Aβ沉积或tau蛋白磷酸化的方法，所述方法用于非治疗目的，其特征在于，将待处理样品处于微波辐射下，所述微波辐射的频率为900MHz，所述微波辐射的平均场强为25-31V/m，所述待处理样品为海马神经元。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述微波辐射的时间为2.5月～6.5月。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述微波辐射的时间为6月。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述海马神经元来自2月龄或5月龄APP/PS1小鼠。
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