CN105917225A - 确定治疗应答的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一般性地涉及确定针对美他多辛治疗的应答的方法，所述美他多辛治疗用于治疗脆性X综合征及其它认知障碍。本发明还涉及鉴定将对美他多辛治疗作出应答的个体。

Description

确定治疗应答的方法
相关申请
本申请要求于2013年9月9日提交的临时申请USSN 61/875,384、于2013年9月26日提交的USSN 14/038258和于2014年5月9日提交的临时申请USSN 61/991,351的优先权和权益，其内容均在此通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明一般性地涉及确定针对美他多辛治疗的应答的方法，所述美他多辛治疗用于治疗脆性X综合征及其它认知障碍。本发明还涉及鉴定将对美他多辛治疗作出应答的个体。
背景技术
如其名称所暗示的，脆性X综合征(Fragile X Syndrome，FXS)与中期染色体中在图谱位置Xq 27.3处表达为等色裂隙的脆性部位相关。脆性X综合征是一种遗传性疾病，其由位于X染色体上的脆性X智力低下1(fragile X mental retardation 1，FMR1)基因的5’-非翻译区中的突变引起。引起FXS的突变与脆性X智力低下基因FMR1中的CGG重复相关。在大多数的健康个体中，CGG重复的总数量为小于10至40，平均为约29。在脆性X综合征中，CGG序列重复200次至超过1,000次。当对象具有超过约200个CGG重复时，脆性X基因变得超甲基化，这使该基因沉默。结果，不产生或者以降低的水平产生脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein，FMRP)，并且该对象表现出FXS的表现。
FMR1基因的前突变扩增(55至200个CGG重复)在普通群体中较为频繁，其中估计流行率为女性1/259和男性1/812。前突变的携带者通常具有正常的IQ，但是情感问题例如焦虑较为常见。年长的男性前突变携带者(50岁及以上)发生进行性意向性震颤和共济失调。这些运动障碍频繁地伴随着进行性认知和行为困难，包括记忆丧失、焦虑以及执行功能缺陷、独处或应激性行为，和痴呆。这一疾病已认定为脆性X相关性震颤/共济失调综合征(fragile X-associated tremor/ataxia syndrome，FXTAS)。对患有FXTAS的对象的磁共振成像揭示小脑中脚和邻近小脑白质中的T2加权信号强度增强。
FXS作为外显率降低的X连锁显性疾病而分离。携带脆性X突变的任何性别均可表现出不同严重程度的智力障碍。患有FXS的儿童和成人具有不同程度的智力障碍或学习障碍以及行为和情绪问题，包括自闭样特征和倾向。患有FXS的幼儿通常具有发育重要事件(例如学习如何坐、行走和说话)的延迟。受侵袭的儿童可具有频繁发怒、注意力难以集中、频繁癫痫发作(例如，颞叶癫痫发作)，常常高度焦虑、易于不知所措，可具有感觉性觉醒过度紊乱、胃肠道紊乱，并且可具有说话问题和异常行为，例如挥舞手和咬手。
FXS可通过对来自对象的样品(例如，血样、口腔样品)进行建立的遗传测试来诊断。所述测试基于CGG重复的数量来确定该对象的FMR1基因中是否存在突变或前突变。
患有FXS的对象还可具有自闭症。经诊断患有自闭症的所有儿童中约5％具有FMR1基因的突变并且还具有脆性X综合征(FXS)。自闭症谱系障碍(autism spectrum disorder，ASD)见于约30％患有FXS的男性和20％患有FXS的女性中，并且另外的30％FXS个体表现出自闭症症状但不诊断具有ASD。虽然智力障碍是FXS的标志性特征，但是患有FXS的对象常常表现出自闭症特征，范围从轻度病例中的羞怯、缺乏眼神接触和社交焦虑到重度受侵袭者中的挥舞手、咬手和持续言语。患有FXS的对象表现出与自闭症相关的其它症状，例如注意力不足和多动、癫痫发作、对感觉刺激过敏、强迫性行为以及胃肠道功能改变。FMR1突变阻止或者极大地降低了单一蛋白质(FMRP)的表达。认为在不存在FMRP情况下的脑发育导致FXS的主要症状。
除核心症状之外，患有FXS的儿童还频繁地具有严重的行为紊乱，例如易怒、攻击和自伤行为等。在对患有FXS之男性(8至24岁)的最近研究中，报道在两个月的观察期内，79％的对象中有自伤行为且75％的对象中有攻击行为。
目前，针对患有FXS的人的可用治疗方案包括例如行为矫正和用多种药物(未经FDA批准用于治疗FXS)进行治疗，所述药物包括抗抑郁和抗精神病药物。已经使用认知行为治疗来在患有FXS和自闭症的个体中改善语言和社交。近年来，已在患有自闭症的个体的治疗中普遍利用使用非典型抗精神病药利培酮的药理学治疗来增强非药理学方法。在自闭症儿童中进行利培酮的随机化安慰剂对照试验证明临床总体印象改善(Clinical Global Impressions-Improvement)和异常行为量表(AberrantBehavior Checklist)的易怒分量表显著改善(McCracken，J.T.，等，N.Engl.J.Med.347：314-321(2002))。然而，不良事件包括体重增加、食欲增加、疲劳、嗜睡、眩晕和流涎。通过施用利培酮并未改善社交隔离和交流，并且不良副作用(例如锥体束外症状和运动障碍)已与自闭症儿童中的利培酮使用有关。
发明概述
本发明提供了在已接受美他多辛治疗之患有脆性X综合征或其它认知障碍的对象中评估美他多辛治疗方案的有效性的方法，其如下进行：测量来自所述对象的样品中磷酸化ERK和Akt蛋白的量；测量所述样品中ERK和Akt蛋白的总量；计算磷酸化ERK和Akt蛋白量与ERK和Akt蛋白总量的比率，并将该计算比率与由未患病对象测量的计算比率进行比较。当所述对象的计算比率与已知未患病对象的计算比率近似时，所述治疗是有效的。
本发明还提供了确定患有脆性X综合征或其它认知障碍的对象是否将从美他多辛治疗方案获益的方法，其如下进行：测量源自所述对象的样品中磷酸化ERK和Akt蛋白的量；测量所述样品中ERK和Akt蛋白的总量；计算磷酸化ERK和Akt蛋白量与ERK和Akt蛋白总量的比率，并将所述对象计算比率与由未患病对象测量的计算比率进行比较。当所述对象计算比率高于已知未患病对象的计算比率时，所述对象将从美他多辛治疗方案获益。
本发明还提供了在患有脆性X综合征或其它认知障碍的对象中监测美他多辛治疗方案的方法，其如下进行：在第一时期测量来自所述对象的第一样品中磷酸化ERK和Akt蛋白的量；在所述第一时期测量所述第一样品中ERK和Akt蛋白的总量；计算磷酸化ERK和Akt蛋白量与ERK和Akt蛋白总量的第一比率；在第二时期测量来自所述对象的第二样品中磷酸化ERK和Akt蛋白的量；在所述第二时期测量所述第二样品中ERK和Akt蛋白的总量；计算磷酸化ERK和Akt蛋白量与ERK和Akt蛋白总量的第二比率，并将第一比率与第二比率进行比较。当第二比率低于第一比率时，所述治疗是有效的。
在一些方面中，所述测量步骤包括免疫测定。在一些实施方案中，所述样品是全血或其级分。在一些实施方案中，所述样品是外周血单个核细胞(peripheral blood mononucleated cell，PBMC)。在一些实施方案中，所述PMBC是淋巴细胞或单核细胞。
除非另外限定，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管在本发明的实践中可使用与本文中所述那些类似或等同的方法和材料，下面仍对合适的方法和材料进行了描述。本文中提及的所有公开、专利申请、专利以及其它参照文献均明确地通过引用以其整体并入。如有冲突，将以本说明书(包括定义)为准。另外，本文中所述的材料、方法和实施例仅是示例性的并非旨在限制。
本发明的其它特征和优点将由以下详细描述和权利要求书而变得明显并且涵盖在其中。
附图简述
图1示出了在2月龄Fmr1敲除(knockout，KO)或野生型(Wild Type，WT)小鼠中进行7天载剂(vehicle，V)或美他多辛(metadoxine，M)(100、150或200mg/kg)的每天一次腹膜内(intraperitoneal，ip)施用对场景恐惧条件反射的影响。特别地，图A示出了载剂或150mg/kg美他多辛的影响。图B示出了载剂或100mg/kg美他多辛的影响。图C示出了载剂或200mg/kg美他多辛的影响。所示数据为平均值±平均值标准误差(standard error of the mean，sem)，N＝10只小鼠/组。＊p＜0.05、＊＊＊＊p＜0.0001并且NS＝不显著。
图2示出了在2月龄Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠中进行7天载剂(V)或150mg/kg美他多辛(M)的每天一次腹膜内施用对社交接近行为的影响。所示数据为平均值±sem，N＝10只小鼠/组。＊p＜0.05和＊＊＊＊p＜0.0001。
图3示出了在2月龄Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠中进行7天载剂(V)或150mg/kg美他多辛(M)的每天一次腹膜内施用对Y形迷宫自发交替(Y-maze spontaneous alternation)(图A)、Y形迷宫奖励性交替(Y-maze rewarded alternation)(图B)或Y形迷宫水迷宫空间辨别(Y-maze water maze spatial discrimination)(图C)的影响。所示数据为平均值±sem，N＝10只小鼠/组。＊＊＊p＜0.001、＊＊＊＊p＜0.0001并且NS＝不显著。
图4示出了在2月龄Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠中进行7天载剂(V)或150mg/kg美他多辛(M)的每天一次腹膜内施用对T形迷宫奖励性交替的影响。所示数据为平均值±sem，N＝10只小鼠/组。＊＊＊＊p＜0.0001。
图5示出了在N＝10野生型(WT)或Fmr1敲除(KO)2月龄小鼠的组中进行7天载剂(V)或150mg/kg美他多辛(M)的每天一次处理对在连续通道任务(successive alley task)中的行为的影响。设备的连续通道呈现出愈加致焦虑的环境以对小鼠进行研究。因此，从通道往下移动评估为焦虑。此外，还可在该设备中对整体活动水平进行量化。
图6示出了在2月龄Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠中进行7天载剂(V)或150mg/kg美他多辛(M)的每天一次腹膜内施用对ERK(指示ERK活性)(图A)和Akt(指示Akt活性)(图B)的整体脑磷酸化水平的影响。所示数据为平均值±sem，N＝5只小鼠/组。＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001、＊＊＊＊p＜0.0001且NS＝不显著。
图7示出了在6月龄Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠中每天一次地ip施用载剂(V)或150mg/kg美他多辛(M)7天对场景恐惧条件反射的影响。所示数据为平均值±sem，N＝10只小鼠/组。＊＊＊＊p＜0.0001且ns＝不显著。
图8示出了如通过嗅探回合次数或嗅探持续时间所测量的，在6月龄Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠中每天一次地ip施用载剂(V)或150mg/kg美他多辛(M)7天对社交接近(图A和C)和社交记忆(图B和D)行为的影响。所示数据为平均值±sem，N＝10只小鼠/组。＊p＜0.05、＊＊＊＊p＜0.0001且ns＝不显著。
图9示出了在6月龄Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠中每天一次地ip施用载剂(V)或150mg/kg美他多辛(M)7天对ERK(图A)和Akt(图B)的整体脑磷酸化水平的影响。所示数据为平均值±sem，N＝10只小鼠/组。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊＊p＜0.0001且ns＝不显著。
图10示出了在2月龄Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠中每天一次地ip或经口施用(oral administration，po)载剂(V)或150mg/kg和300mg/kg美他多辛(M)7天对场景恐惧条件反射的影响。所示数据为平均值±sem，N＝10只小鼠/组。具体地，图A示出了Fmr1敲除和野生型小鼠中使用载剂的ip或经口处理。图B示出了野生型小鼠中使用美他多辛的ip和经口处理。图C示出了Fmr1敲除小鼠中使用美他多辛的ip和经口处理。＊＊p＜0.01、＊＊＊＊p＜0.0001且ns＝不显著。
图11示出了在2月龄Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠中每天一次地ip或经口施用(po)载剂(V)或者150mg/kg或300mg/kg美他多辛(M)7天对社交接近(图A)和社交记忆(图B)的影响。所示数据为平均值±sem，N＝10只小鼠/组。＊＊p＜0.01、＊＊＊＊p＜0.0001且ns＝不显著。
图12示出了如使用流式细胞术所评估的，在2月龄Fmr1敲除(KO)和野生型(WT)小鼠中每天一次地ip或经口施用(po)载剂(V)或者150或300mg/kg美他多辛(M)7天对淋巴细胞生物标志物的影响。所示生物标志物为Fmr1敲除或野生型小鼠中的pAkt(图A)和pERK(图B)。所示数据为平均值±sem，N＝10只小鼠/组。＊＊＊＊p＜0.0001且ns＝不显著。
图13示出了每天一次地ip施用载剂(V)或者150mg/kg美他多辛(M)7天对2月龄野生型(WT)和Fmr1敲除(KO)小鼠脑区域中pERK水平的影响。所分析区域为Fmr1敲除或野生型小鼠中的海马(图A)、前额皮质(图B)和纹状体(图C)。所示数据为平均值±sem，N＝10只小鼠/组。＊＊＊＊p＜0.0001且ns＝不显著。
图14示出了每天一次地ip施用载剂(V)或者150mg/kg美他多辛(M)7天对2月龄野生型(WT)和Fmr1敲除(KO)小鼠脑区域中pAkt水平的影响。所分析区域为Fmr1敲除或野生型小鼠中的海马(图A)、前额皮质(图B)和纹状体(图C)。所示数据为平均值±sem，N＝10只小鼠/组。＊＊＊＊p＜0.0001且ns＝不显著。
图15示出了用载剂(V)或300μM美他多辛(M)进行5小时体外处理对来自Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠的神经元海马培养物中的丝足密度(filopodia density)(图A)、长度(图B)和宽度(图C)的影响。所示数据为平均值±sem(野生型，N＝20个神经元；Fmr1敲除小鼠，N＝20个神经元)。＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001并且ns＝不显著。
图16示出了用载剂(V)或300μM美他多辛(M)进行体外处理对来自Fmr1敲除(KO)或野生型(WT)小鼠之400μM海马切片中的蛋白质基础从头合成(basal de novo protein synthesis)的影响。所示数据为平均值±sem，N＝6个切片/组。＊p＜0.001且＊＊＊＊p＜0.0001。
发明详述
本发明涉及鉴定患有脆性X综合征(FXS)及其它认知障碍的个体之与针对美他多辛治疗的应答相关的生物标志物。具体地，发现美他多辛治疗使对象样品中磷酸化ERK和Akt蛋白与总ERK和Akt蛋白的比率恢复得更接近正常比率。正常比率意指见于正常(即未患病)对象中的磷酸化ERK和Akt蛋白与总ERK和Akt蛋白的比率。另外，意外地发现可在血液中检测到磷酸化ERK和Akt蛋白与总ERK和Akt蛋白之比率的这些变化。
因此，本发明提供了用于通过确定对象样品中磷酸化ERK和Akt蛋白与总ERK和Akt蛋白的比率监测因FXS或其它认知障碍而正接受美他多辛治疗的对象的方法。将该比率与对照比率(例如由未患认知障碍的对象获得的比率)进行比较。对象比率近似于正常对照比率指示所述治疗是有效的。
另外，本发明提供了通过确定对象样品中磷酸化ERK和Akt蛋白与总ERK和Akt蛋白的比率选择将从美他多辛治疗获益之患有认知障碍的对象的方法。将该比率与对照比率(例如由未患认知障碍的对象获得的比率)进行比较。对象比率大于正常对照比率指示所述对象可从美他多辛治疗获益。而比率不大于正常对照比率的对象可能不会从美他多辛治疗获益。
对普通技术人员显而易见的是，尽管本文中将比率的计算描述为单向，但是应理解其还涵盖对倒数进行计算。另外，尽管如本文中所述计算比率有益于提供可用的比较数值，但是还可采用磷酸化ERK和Akt蛋白水平与总ERK和Akt蛋白水平之间的绝对差以及受试对象与对照对象之间的绝对差的计算并且其将有效地用于实施本发明。
定义
“精确度”指测量或计算的量(测试报道值)与其实际(真实)值相符的程度。临床精确度涉及真实结果(真阳性(true positive，TP)或真阴性(true negative，TN))相对于错误分类结果(假阳性(false positive，FP)或假阴性(false negative，FN))的比例，并且可规定为灵敏度、特异性、阳性预测值(positive predictive value，PPV)或阴性预测值(negativepredictive value，NPV)，或者规定为可能性、比值比(odds ratio)以及其它量度。
在本发明的背景下，“生物标志”涵盖但不限于蛋白质、核酸和代谢物，以及其多态性、突变、变体、修饰、亚基、片段、蛋白质-配体复合物和降解产物、蛋白质-配体复合物、元素、相关代谢物及其它分析物或样品衍生量度。生物标志还可包括突变蛋白质或突变核酸。生物标志还涵盖健康状态的非血液携带因子或非分析物生理标志，例如本文中定义的“临床参数”以及本文中还定义的“常规实验室风险因子”。生物标志物还包括数学上生成的任何计算指数或前述任一种或更多种量度(包括时间趋势和时间差)的组合。在可用时并且除非本文中另有所述，否则基于官方字母缩写或基因符号来识别为基因产物的生物标志，所述官方字母缩写或基因符号由国际人类基因组组织命名委员会(Human GenomeOrganization Naming Committee，HGNC)分配并在此申请日列于美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)网站。
“临床指标”为在评价生物体或细胞群的生理状况中单独使用或与其它数据联合使用的任何生理数据。该术语包括临床前指标。
“临床参数”涵盖对象健康状态的所有非样品或非分析物生物标志或其它特征，例如但不限于年龄(Age)、种族(RACE)、性别(Sex)或家族史(FamHX)。
“FN”为假阴性，其对疾病状态测试而言意指将患病对象错误地分类为未患病或正常。
“FP”为假阳性，其对疾病状态测试而言意指将正常对象错误地分类为患病。
“公式”、“算法”或“模型”为任何数学方程，算法、分析或程序化方法，或采用一个或更多个连续或分类输入(本文中称为“参数”)并计算输出值(有时称为“指数”或“指数值”)的统计学技术。“公式”的非限制性实例包括和、比率和回归运算子(例如系数或指数)，生物标志值转换和归一化(包括但不限于基于临床参数例如性别、年龄或种族的那些归一化方案)，规则和指南，统计分类模型，和对历史群体训练的神经网络。在小组和组合构建(panel and combination construction)中，特别感兴趣的是结构和合作统计分类算法，和利用模式识别特征的风险指数构建方法，包括已建立的技术，例如交叉相关、主成分分析(PrincipalComponents Analysis，PCA)、因子旋转、逻辑回归(Logistic Regression，LogReg)、线性判别分析(Linear Discriminant Analysis，LDA)、Eigengene线性判别分析(Eigengene Linear Discriminant Analysis，ELDA)、支持向量机(Support Vector Machine，SVM)、随机森林(Random Forest，RF)、递归分割树(Recursive Partitioning Tree，RPART)及其它相关决策树分类技术、缩小重心(Shrunken Centroid，SC)、StepAIC、第k个最近邻居(Kth-Nearest Neighbor)、推进(Boosting)、决策树、神经网络、贝叶斯网络(Bayesian Network)、支持向量机和隐马尔可夫模型(Hidden Markov Model)等。存活和时间方面的事件危害分析可使用其它技术，包括本领域技术人员熟知的Cox、Weibull、Kaplan-Meier和Greenwood模型。这些技术中有很多可与诸如以下的选择技术组合使用或者其可在其自身的技术中本身包括生物标志选择方法学：向前选择、向后选择或逐步选择、给定大小的所有潜在组的完全列举、遗传算法。这些可与信息标准例如阿开克信息准则(Akaike′s Information Criterion，AIC)或贝叶斯信息准则(Bayes Information Criterion，BIC)结合以量化附加生物标志与模型改善之间的折衷并有助于最小化过拟合。得到的预测模型可在其它研究中进行验证或者可使用诸如Bootstrap、留一(Leave-One-Out，LOO)和10折交叉验证(10-Fold cross-validation，10-Fold CV)的技术在对其进行初始训练的研究中交叉验证。在各个步骤中，可根据本领域中已知的技术通过值置换(value permutation)评估假发现率。“健康经济效用函数(health economic utility function)”是这样的公式，其衍生自向护理标准中引入诊断性或治疗性干预前后两种情况下理想化适用患者群中发生一系列临床结果的预期概率的组合。其涵盖对此类干预之精确度、有效性和性能特征的评估以及对与每种结果相关之成本和/或价值测量(效用)的评估，所述成本和/或价值测量可获自产生每种结果的实际健康体系护理成本(服务、供应、装置和药物等)和/或作为产生每种结果的估计可接受值/质量调整寿命年(quality adjusted lifeyear，QALY)获得。贯穿所有预测结果，结果的预测群大小乘以相应结果之预测效用的乘积的总和为给定护理标准的总健康经济效用。(i)对具有干预之护理标准计算的总健康经济效用相对于(ii)无干预之护理标准的总健康经济效用的差异导致对所述干预之健康经济成本或价值的整体量度。这可本身在所分析的整个患者组中(或者仅在干预组中)分配以获得每单位干预的成本，并指导例如市场定位、定价和推测健康体系接受度的决策。这样的健康经济效用函数通常用于比较干预的成本有效性，但是还可被转化以评估健康护理体系愿意支付的可接受值/QALY或新干预所需的可接受的成本有效的临床成效特征。
对于本发明的诊断性(或预后)干预，由于每种结果(其在疾病分类诊断测试中可为TP、FP、TN或FN)需要不同的成本，因此基于临床情况以及各种结果成本和价值，健康经济效用函数可优先地相比于特异性偏向灵敏度，或者相比于NPV偏向PPV，并因此提供对健康经济成效和价值的另一种量度，其可不同于更直接的临床或分析成效量度。这些不同的测量结果和相对折衷一般将仅在具有零误差率的完美测试(又称为：零预测对象结果错误分类或FP和FN)的情况下汇合，然而所有的成效测量将偏向不完美，但是程度不同。
“测量”或其变化形式或者可替选地“检测”或其变化形式意指评估给定物质在临床样品或来源于对象的样品中的存在、不存在、数量或量(其可为有效量)，包括推导出此类物质的定性或定量浓度水平，或者另外地评价对象之非分析物临床参数的值或分类。
“阴性预测值”或“NPV”通过TN/(TN+FN)或所有阴性测试结果的真阴性分数来计算。其还固有地受意欲进行测试之群体的流行率和验前概率的影响。参见例如O′Marcaigh A S，Jacobson R M，″Estimating ThePredictive Value Of A Diagnostic Test，How To Prevent Misleading OrConfusing Results，″Clin.Ped.1993，32(8)：485-491，其讨论了测试(例如临床诊断测试)的特异性、灵敏度以及阳性和阴性预测值。通常来说，对于使用连续诊断测试测量的二进制疾病状态分类方法，灵敏度和特异性根据Pepe等，″Limitations of the Odds Ratio in Gauging the Performance ofa Diagnostic，Prognostic，or Screening Marker，″Am.J.Epidemiol 2004，159(9)：882-890通过接受者操作特征(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲线概括，并通过曲线下面积(Area Under the Curve，AUC)或c-统计量概括，其为允许用仅一个值来表示测试、测定或方法在整个测试(或测定)分割点范围内的特异性和灵敏度的指标。还参见例如Shultz，″Clinical Interpretation Of Laboratory Procedures，″Teitz中的第14章，Fundamentals of Clinical Chemistry，Burtis和Ashwood(编辑)，第4次增补版1996，W.B.Saunders Company，第192-199页；和Zweig等，″ROCCurve Analysis：An Example Showing The Relationships Among SerumLipid And Apolipoprotein Concentrations In Identifying Subjects WithCoronory Artery Disease，″Clin.Chem.，1992，38(8)：1425-1428。使用似然函数、比数比、信息论、预测值、校准(包括拟合优度)和重分类测量的替代方法根据Cook，″Use and Misuse of the Receiver OperatingCharacteristic Curve in Risk Prediction，″Circulation 2007，115：928-935进行概括。最后，通过测试确定的对象群中的危害比以及绝对和相对风险比是对临床精确度和效用的另一种量度。有多种方法常用于定义异常值或疾病值，包括参照界限、辨别界限和风险阈值。
“分析精确度”指测量方法本身的可重现性和可预测性，并且可在诸如变异系数的测量和用不同的时间、使用者、设备和/或试剂对同一样品或对照进行的一致性和校正测试中概括。评价新生物标志中的这些及其它考虑还在Vasan，2006中进行了概括。
“成效(performance)”是与诊断或预后测试的整体有用性和质量相关的术语，尤其包括临床和分析精确度、其它分析和方法特征(例如使用特征(例如稳定性、使用的容易性))、健康经济价值和测试要素的相对成本。任意这些因素可以是优异成效并由此是测试有用性的来源，并且在相关时可通过合适的“成效量度”(例如AUC、产生结果的时间、货架期等)测量。
“阳性预测值”或“PPV”通过TP/(TP+FP)或所有阳性测试结果的真阳性分数来计算。其固有地受意欲进行测试之群体的患病率和测试前概率的影响。
在本发明的背景下，“风险”涉及事件将在特定时期内发生的概率(如对治疗的响应性)，并且可意指对象的“绝对”风险或“相对”风险。绝对风险可参照在相关时间组群的实际观察后测量或者参照由已随访相关时期的统计学有效历史组群产生的指标值来测量。相对风险指对象的绝对风险相比较于低风险组群的绝对风险或平均群体风险的比率，其可随如何评估临床风险因子而改变。还常常使用比数比，即给定测试结果之阳性事件与阴性事件的比例(比数根据公式p/(1-p)，其中p是发生事件的概率并且(1-p)是不发生事件的概率)，且无转换。
在本发明的背景下，“风险评估”或“评估风险”涵盖预测事件或疾病状态可能发生的概率、比数或可能性，事件的发生率，或从一种疾病状态转变的发生率。风险评估还可包括参照之前测量的群体在绝对或相对方面预测FXS的未来临床参数、常规实验室风险因子值或其它指数。本发明的方法还可用于连续地或分类地测量针对治疗的响应，由此诊断和定义定义为应答者或非应答者的一类对象的风险谱。在该分类方案中，本发明可用于区分正常对象组群和其它处于较高应答风险之中的对象组群。
在本发明的背景下，“样品”是从对象分离的生物样品并且可包括例如但不限于全血、血清、血浆、脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)、脑细胞或任何其它分泌物、排泄物或其它体液。“样品”可包括单细胞或多细胞或细胞碎片。所述样品还是组织样品。所述样品是或者包含脑细胞或淋巴细胞。优选地，所述样品是外周血单个核细胞，例如淋巴细胞或单核细胞。
“灵敏度”通过TP/(TP+FN)或患病对象的真阳性分数来计算。
“特异性”通过TN/(TN+FP)或者未患病或正常对象的真阴性分数来计算。
“统计学上显著的”意指变化大于预期可能仅偶然发生的变化(其可以是“假阳性的”)。统计学显著性可通过本领域中已知的任何方法来确定。常用的显著性量度包括p值，其表示获得至少与给定数据点一样极端的结果的概率，假设该数据点仅为偶然的结果。当p值为0.05或更小时，认为结果高度显著。优选地，p值为0.04、0.03、0.02、0.01、0.005、0.001或更小。
在本发明的背景下，“对象”优选地是哺乳动物。所述哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。可有利地使用除人之外的哺乳动物作为代表FXS的动物模型的对象。对象可以是雄性或雌性的。所述对象患有或者怀疑患有FXS或其它认知障碍。
“TN”为真阴性，其对疾病状态测试而言意指将未患病或正常对象正确地分类。
“TP”为真阳性，其对疾病状态测试而言意指将患病对象正确地分类。
“常规实验室风险因子”对应于从对象样品分离或获得的这样的生物标志，其目前在临床实验室中进行评价并且用于常规的全局风险评估算法。脆性X的其它常规实验室风险因子是本领域技术人员已知的。
本发明的方法
本文中公开的方法用于因FXS及其它认知障碍而正接受美他多辛治疗和/或疗法的对象，并且用于已诊断为患有FXS及其它认知障碍的对象。
本发明的方法可用于在对象中监测FXS以及其它认知障碍的治疗，和选择将从美他多辛治疗获益的对象。
一般来说，FXS的体征和症状分为五类：智力和学习；身体，社交和情感，说话和语言以及感觉障碍，其通常与脆性X相关或者与脆性X具有共有特征。例如，患有FXS的个体具有受损的智力功能、社交焦虑、语言困难并且对某些感觉敏感。
认知障碍包括其中心理处理的功能障碍/损伤构成核心症状的障碍组。认知障碍包括神经源性认知障碍(neurogenetic cognitive disorder)或行为认知障碍。
认知障碍包括发育障碍、注意缺陷多动障碍(attention deficithyperactivity disorder，ADHD)、自闭症谱系障碍、阿尔茨海默病(Alzheimers disease)、精神分裂症和脑血管疾病。
自闭症谱系障碍和自闭症症状通常与患有脆性X综合征的个体相关。自闭症的体征和症状包括显著语言延迟，社交和交流困难，以及异常的行为和兴趣。患有自闭症性疾病的很多人还具有智力障碍。
确定对象样品中磷酸化ERK和Akt蛋白与总ERK和Akt蛋白的比率允许监测FXS或其它认知障碍的治疗过程。在该方法中，生物样品由正接受治疗的对象提供。如果期望的话，在治疗之前、期间或之后于不同时间点从该对象获取生物样品。然后，计算磷酸化ERK和Akt蛋白与总ERK和Akt蛋白的比率并将其与对照值进行比较。对照值为其磷酸化ERK和Akt蛋白与总ERK和Akt蛋白水平的比率是已知的或者为指数值的对照个体或群体。参照样品或指标值可取自或获自未患病(例如未患FXS或其它认知障碍)的一个或更多个个体。或者，参照样品或指标值可在治疗前从对象取得或获得。例如，可自尚未接受初始治疗的对象收集样品并且在后续治疗之后收集样品以监测治疗的进展。可在初始治疗之后从对象取得或获得参照样品或指标值。例如，可自已因FXS而接受初始治疗和后续治疗的对象收集样品以监测治疗的进展。
在另一个实施方案中，参照值为指标值或基线值。指标值或基线值是来自未患FXS或其它认知障碍之个体的磷酸化ERK和Akt蛋白与总ERK和Akt蛋白之比率的复合样品。
可如下监测治疗的有效性：确定自对象获得的样品中磷酸化ERK和Akt蛋白与总ERK和Akt蛋白随时间的比率并将比率进行比较。例如，可在对象接受治疗之前获取第一样品，而在对象治疗之后或期间获取一份或更多份后续样品。
“有效的”意指治疗导致磷酸化ERK和Akt蛋白与总ERK和Akt蛋白的比率近似于来自未患FXS或其它认知障碍的对象的比率。可联合用于诊断、鉴定或治疗FXS的任何已知方法来确定效力。
磷酸化ERK和Akt蛋白以及总ERK和Akt蛋白可通过本领域中已知的任何方法(例如免疫测定)来确定。
本发明的成效和精确度测量
本发明的成效以及由此的绝对和相对临床有用性可如上所述以多种方式进行评估。诊断、预测或预后测试、测定或方法的精确度涉及该测试、测定或方法区分响应于美他多辛治疗之对象和无响应之对象的能力，其基于磷酸化ERK和Akt蛋白与总ERK和Akt蛋白的比率。正常和异常之比的差异优选是统计学上显著的。
因此，在评估用于评估对象状况之建议医学测试、测定或方法的精确度和有用性中，应总是将灵敏度和特异性两者考虑在内并且应注意报道灵敏度和特异性的分割点，因为灵敏度和特异性可在分割点的范围内显著不同。对使用本发明的大多数分类风险测量来说，优选地使用涵盖所有潜在分割点值的诸如AUC的统计量，但是对于连续风险测量而言，优选相对于观察结果或其它金标准的拟合优度和校准的统计量。
使用这样的统计量，本文中将“可接受的诊断精确度”定义为这样的测试或测定，其中AUC(该测试或测定的ROC曲线下面积)为至少0.60，理想地至少0.65，更理想地至少0.70，优选地至少0.75，更优选地至少0.80并且最优选地至少0.85。
“非常高的诊断精确度”意指这样的测试或测定，其中AUC(该测试或测定的ROC曲线下面积)为至少0.80，理想地至少0.85，更理想地至少0.875，优选地至少0.90，更优选地至少0.925并且最优选地至少0.95。
任何测试的预测值均取决于该测试的灵敏度和特异性，并且取决于病症在受试群体中的流行率。基于贝叶斯定理，这一概念规定：所筛选的病症存在于个体中或群体中的可能性(测试前概率)越大，阳性测试的有效性越大并且结果为真阳性的可能性越大。因此，在病症存在可能性低的任何群体中使用测试的问题是阳性结果价值有限(即更可能为假阳性)。类似地，在处于非常高风险之中的群体中，阴性测试结果更可能为假阴性。
因此，对于测试在低疾病流行率受试群体(定义为每年的发生率(发病率)低于1％或在特定时间范围内的累积流行率低于10％的那些)中的临床效用，ROC和AUC可具有误导性。或者，可采用本公开内容中其它地方定义的绝对风险和相对风险比率来确定临床效用度。还可根据测试的测量值将待测试的对象群分类为四份，其中最高四分位数(群体的25％)包含对治疗无响应性具有最高相对风险的对象组，并且最低四分位数包含对治疗无响应性具有最低相对风险的对象组。一般来说，认为获自在低流行率群体中从最高到最低四分位数具有超过2.5倍相对风险的测试或测定的值为具有“高诊断精确度”，并且认为对每个四分位数具有5至7倍相对风险的那些为具有“非常高诊断精确度”。尽管如此，仍广泛地使用获自在临床上仍有用之对每个四分位数具有仅1.2至2.5倍相对风险的测试或测定的值作为疾病的风险因子；至于其对未来事件的预测，在总胆固醇的情况下和对很多炎性生物标志物而言也是如此。通常来说，这样的诊断精确度较低的测试必须与另外的参数组合以得到治疗性干预的有意义临床阈值，如与上述全局风险评估指数组合。
健康经济效用函数是测量给定测试的成效和临床价值的又一种方式，其由以下组成：基于各自临床和经济价值的实际测量来权权衡潜在的分类测试结果。健康经济成效与精确度密切相关，因为健康经济效用函数特别地分配受试对象之正确分类益处的经济价值和错误分类的成本。作为成效测量，通常要求测试实现导致每个测试的健康经济价值增加(在测试成本之前)超过该测试的目标价格的成效水平。
临床算法的构建
可使用任何公式来将结果组合成可用于实施本发明的指数。如上所述但不受限制，除多种其它指示之外，这样的指数还可指示对美他多辛作出响应的概率、可能性、绝对或相对机会。这可针对特定的时期或时间范围，或者针对剩余寿命风险，或者简单地提供为相对于另一参照对象群的指数。
尽管在此对多种优选公式进行了描述，但是除本文中和上述定义中提及的那些之外的数种其它模型和公式类型也是本领域技术人员公知的。基于所使用的实际模型类型或公式在训练群中之结果的成效和精确度特征，其本身可选自潜在模型的领域。优选的公式包括广泛种类的统计分类算法，特别是使用判别分析。判别分析的目的是由之前鉴别的特征组来预测类别隶属。在线性判别分析(linear discriminant analysis，LDA)的情况下，鉴别根据一些标准使组之间的分离最大化的线性特征组合。对于LDA而言，可使用具有不同阈值之基于eigengene的方法(ELDA)来鉴别特征，或者使用基于多元方差分析(multivariate analysis of variance，MANOVA)的步进算法来鉴别特征。可进行基于Hotelling-Lawley统计量使得无分离的概率最小化的向前、向后和逐步算法。
基于Eigengene的线性判别分析(Eigengene-based LinearDiscriminant Analysis，ELDA)是由Shen等(2006)开发的特征选择技术。该公式使用经改进的本征分析(eigen analysis)在多元框架中选择特征(例如生物标志)以鉴别与最重要本征向量相关的特征。“重要”定义为解释试图相对于某阈值进行分类之样品间差异的最大方差的那些本征向量。
支持向量机(SVM)是试图发现分离两种类别的超平面的分类公式。该超平面包含支持向量，即恰好为远离该超平面的边缘距离的数据点。在当前的数据尺寸中不存在分隔超平面的可能情况下，通过借助采用原始变量的非线性函数将数据映射到更大的尺寸，维度得到极大拓宽(Venables和Ripley，2002)。尽管不要求，但是过滤SVM的特征常常改善预测。对于支持向量机而言，使用非参数Kruskal-Wallis(KW)测试来鉴别特征(例如生物标志)以选择最佳的单变量特征。还可单独或者组合地使用随机森林(random forest，RF，Breiman，2001)或递归分割(recursivepartitioning，RPART，Breiman等，1984)来鉴别最重要的生物标志组合。KW和RF两者均要求从所有特征中选择多个特征。RPART使用可用生物标志的亚组生成单个分类树。
可使用其它公式来在其提交于预测公式之前将各个ERK和/或Akt磷酸化测量的结果预先处理成更具价值的信息形式。最显著的是，归一化生物标志结果、使用常见的数学转换(例如对数函数或逻辑函数)、作为正态或其它分布位置、参照群体的平均值等全部都是本领域人员公知的。特别感兴趣的是基于临床参数(例如年龄、性别、种族或性)的一组归一化，其中特定公式仅用于一类中的对象，或者将临床参数连续地组合为输入。在另一些情况下，可将基于分析物的生物标志组合成后续代入公式的计算变量。
除潜在归一化之一个对象的单独参数值之外，还可根据D′Agostino等，(2001)JAMA 286：180-187中概括的技术或其它类似的归一化和重校准技术基于对群体的预期流行率和平均生物标志参数值的调整来重校准或另外地调整用于所有对象或任何已知类对象的整体预测公式本身。这些流行病学调整统计量可如下不断捕获、确认、改善和更新：登陆提交于可机读模型或其它模型的过去数据，或者偶尔通过回溯查询储存的样品或参照对这样的参数和统计量的历史研究。可以是公式重校准或其它调整的对象的另外实例包括有关比数比限制之Pepe，M.S.等，2004的研究、涉及ROC曲线的Cook，N.R.，2007中使用的统计量。最后，可通过参照实际临床群体以及研究结果和观察终点对分类机公式的数值结果自身进行处理后转换，以相对于绝对风险进行校准并提供用于改变分类机或风险公式之数值结果的置信区间。其一个实例是给出绝对风险和该风险的置信区间，其使用参照Genomic Health，Inc.之Oncotype Dx产品(Redwood City，Calif)中复发评分公式的输出选择的实际临床研究得到。进一步的改进是基于分类机或风险公式的输出为了针对较小的研究亚群进行调整，并根据其临床参数(例如年龄或性别)来限定和选择。
实施例
实施例1：一般性方法
本文中所述的实施例是使用下文一般性描述的试剂和方法进行的。
实验动物
Fmr1敲除小鼠(KO2)(The Dutch-Belgium Fragile X Consortium，1994)最初从Jackson Laboratory获得，野生型(WT)同窝小鼠基于C57BL/6J背景产生并且在C57BL/6J背景上反复回交超过八代。将Fmr1敲除小鼠以相同基因型为组圈养在具有12小时照明/黑暗循环的温度和湿度受控室内(照明为7am至7pm；测试在照明期进行)。连续记录容纳室内的室温和湿度，同时食物和水可自由获取。在行为实验期间，对2或6月龄的健康Fmr1敲除小鼠及其野生型同窝小鼠(N＝10小鼠/处理组)进行测试。将小鼠圈养在市售的塑料笼中并根据UK Animals(Scientific Procedures)Act，1986的要求进行实验。所有实验均由对基因型和药物处理盲态的实验员进行。在进行任何实验之前，均允许动物具有最短一周的适应期。在适应期内不施用预防性或治疗性处理。
药物
对于研究1(实施例2)，将美他多辛溶解于盐水中并以100、150或200mg/kg的剂量每天一次地腹膜内施用7天。对于研究2(实施例3)，在体内测试中，将美他多辛溶解于盐水中并以150mg/kg/天的腹膜内剂量，或者以150或300mg/kg/天(以0.1ml的体积)的经口剂量每天一次地施用7天。对于研究2，在体外测试中，将美他多辛以300μM的浓度施用5小时。在所有情况下，均使用盐水作为载剂(对照)。
行为测试
社交相互作用和社交识别记忆：小鼠是社交性物种，其参与容易评分的社交行为，包括接近、跟随、嗅探、梳理、侵略性接触(aggressiveencounter)、性互动(sexual interaction)、亲职行为(parental behavior)、筑巢和成群蜷缩睡觉(sleeping in a group of huddle)。小鼠中的社交接近通过针对新小鼠的嗅探持续时间进行评价。
将小鼠置于尺寸与成年小鼠居住笼具有相同数量级并且地面上具有新鲜木屑的测试场地/笼中(40×23×12cm笼，具有有机玻璃盖以有利于观察小鼠)。背景小鼠气味通过在测试之前在设备中放入一些非实验小鼠产生。在测试前10至15分钟，将小鼠转移至实验室。将受试对象和幼仔同时置于测试笼中。评估社交研究的总持续时间和回合(bout)数3分钟，其限定为在受试小鼠对刺激幼仔的嗅探和亲密跟随(距离尾部＜2cm)。30分钟之后，使用相同的刺激幼仔来重复测试。收集的数据参数为用于获取和识别的嗅探回合的总持续时间和总次数。推导出社交记忆率(socialmemory ratio)，其定义为试验2/试验1+2。因此，无记忆(例如，20/(20+20)＝0.5，记忆(例如，10/(20+10)＝＜0.5。
Y形迷宫交替：进行两个任务。第一个任务是对臂进入之间的自发交替进行非学习性评估。第二个任务是空间参考记忆任务，其中动物必须学习记住两个臂中哪一个装有食物奖励诱饵。在开始训练前的当天，允许动物自由探索迷宫5分钟。接着，使其接受两个试验，在一个试验中，将食物放置在左臂，在一个试验中将食物定位在右臂。该操作防止发生偏向一个臂。
Y形迷宫水迷宫：透明的有机玻璃Y形迷宫填充有2cm的20℃水。这促使小鼠在趟水至一个臂远端的出口管后离开迷宫。将迷宫放置在突出视觉提示围绕的室的中间。
奖励性T形迷宫交替：使用T形式(水平放置时)的升高或封闭设备。将小鼠放置在T的底部并允许其选择邻接主干臂(stem)另一端的一个目标臂。快速连续地进行两个试验，第二个试验要求小鼠选择之前未访问过的臂，反映对第一次选择的记忆(自发交替)。如果其交替选择的话，则通过使动物饥饿并用偏爱的食物对其进行奖励来增强这一倾向。特别地，在T形迷宫上的4天适应期之后，训练小鼠交替臂选择以接受甜炼乳作为奖励。
连续通道：该设备由4个连续的、线性排列的、致焦虑作用递增的通道组成(每个后面的通道均涂成较浅的颜色、具有较低的壁和/或比前面的通道窄)，所述通道由涂漆的木材制成。每个部分或通道的长度为25cm。通道1具有25cm高的壁，宽度为8.5cm并且涂成黑色。0.5cm的步降(step down)导向通道2，其宽度也为8.5cm但是具有1.3cm高的壁并且为灰色。1.0cm的步降导向通道3，其宽度为3.5cm、具有0.8cm高的壁并且为白色。0.4cm的步降导向通道4，其也为白色但是宽度为1.2cm，并且具有0.2cm高的壁。通过将通道1的背面锚定至50cm高的台子升高设备。在臂3和4下方提供有垫料以防小鼠跌落。将每只小鼠放置在通道1的封闭端，面向壁。针对以下启动计时器：1)测试的总时长(5分钟)+进入每个壁的潜伏期，和2)在通道1中花费的时间。当小鼠将四肢全部放到下一个通道时，认为其已进入该通道。记录在每个通道中(四肢全部)花费的总时间。
场景恐惧条件反射：在恐惧条件反射实验中，将小鼠放置在新环境(暗室)中并使其接受成对的暗示和足电击(0.2mA持续1秒(研究1)或者0.7mA持续0.5秒(研究2))。随后，当在初始训练情境中测试时，小鼠表现出称为凝滞(freezing)(Blanchard，1969)的自然防御反应或场景恐惧条件反射。凝滞时间限定为小鼠在除呼吸之外的不活动行为中花费的时间。数据表示为测试时间的百分比。在训练期后24小时，在不提供电击下在训练室内对小鼠测试5分钟，并且观察凝滞行为。
统计学：采用多元方差分析来评估数据上的组差异。对行为数据进行重复测量ANOVA。在每个ANOVA中的统计学显著性影响之后使用Newman-Keuls检验(研究1)或Tukey检验(研究2)进行事后比较。认为小于0.05的p值是显著的。
生化测试：
磷酸化ERK和Akt：Ras-Mek-ERK和PI3K-Akt-mToR信号传导途径参与介导突触可塑性潜在变化的基因转录的活性依赖性改变(Klann和Dever，2004)。如Lopez Verrilli(Lopez Verrilli等，2009)先前所述通过western印迹分析测量磷酸化ERK和Akt蛋白的表达。所采用的抗体为针对Akt(1/1000)和激酶(ERK)1/2(1/2000)的抗磷酸特异性抗体(Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)。针对磷酸-ERK的抗体检测磷酸-ERK1/2的磷酸化(Thr202/Tyr204)而针对磷酸-Akt的抗体检测磷酸-Akt的磷酸化(Thr308)。Akt和ERK 1/2蛋白总含量以及磷酸化的ERK和Akt通过具有抗磷酸-Akt(1/1000)和抗磷酸-ERK抗体(1/2000)(Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)的印迹膜进行评价。Akt或ERK磷酸化根据同一样品中的蛋白质含量进行归一化并表示为相对于基础条件的变化％，认为基础水平为100％。如下评价蛋白质负载：剥离膜并用β-肌动蛋白抗体(1/1000)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)重新印迹膜。血液淋巴细胞中的磷酸化ERK和Akt蛋白表达通过流式细胞术测量。对于淋巴细胞生物标志物测定，使用激发激光调节在488nm的FACStar plus(Becton Dickinson)，并通过515nm至545nm的带通滤波器收集来自FITC的绿色荧光(GST)。平均FITC荧光强度相对于参照细胞的荧光进行计算。平均细胞荧光强度(mean cellularfluorescence intensity，MFI)与每个细胞所结合的Ab分子的平均数量成正比。
神经元形态：海马细胞培养物由在妊娠17.5的胚胎日(E17.5)的野生型和Fmr1KO胎儿小鼠制备。通过颈脱位处死小鼠并将经解离的海马细胞铺在15mm的多孔容器(Falcon Primaria)中。在体外5天后，转染绿色荧光蛋白(GFP)以有利于在药物处理之后监测树突棘形态发生(Ethell和Yamaguchi，1999；Ethell等，2001；Henkemeyer等，2003)。在体外约16天(DIV)时形成树突棘。在第17天，用300μM浓度的美他多辛体外处理培养物5小时。
经GFP转染的神经元的丝足密度通过对叠加蔡司透镜(Zeiss)的共焦生成图像(40×物镜，20×0.2μm的叠加)进行Sholl分析来量化。使用Metamorph软件，在每个神经元的细胞体周围画等距的同心圆(每20μm)，随后对每个圆的丝足数量进行计数。使用未配对的双尾Student T检验对计数的平均值进行比较。
经GFP转染的神经元的棘成熟度使用Metamorph软件(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)进行分析。每个神经元选择两个70μm至100μm的远端树突节段以用于进行棘形态测定分析。对于每个棘，对长度和宽度进行测量。将长度定义为从突出底部到突出末端的距离；而将宽度定义为垂直于棘长轴的最大距离。用已校正为用于多重比较的未配对的双尾Student T检验和ANOVA对测量结果进行比较。
海马蛋白从头合成：横向海马切片(400μm)获自6周大的Fmr1敲除和WT小鼠。蛋白质合成测定如先前所述使用基于非放射性荧光激活细胞分选的测定(翻译的表面感测(surface sensing of translation，SUnSET)方法)进行，其允许在单独哺乳动物细胞和异质细胞群中监测并量化整体蛋白质合成(Hoeffer，2011)。本研究中所使用的美他多辛浓度为300μM。
实施例2：在脆性X综合征的Fmr1敲除小鼠模型中，美他多辛(100至200mg/kg)处理对学习和记忆缺陷以及生化异常的影响(研究1)
行为分析
场景恐惧条件反射：初始实验在N＝10WT和Fmr1敲除小鼠的组中测试每天一次地腹膜内施用载剂或150mg/kg美他多辛7天对场景恐惧条件反射的影响。如在测试期期间凝滞降低所反映的，经载剂处理的Fmr1敲除小鼠在场景恐惧条件反射模式中表现出学习方面的缺陷(图1，图A(p＜0.0001))。美他多辛施用在Fmr1敲除小鼠中逆转学习缺陷作用，这种逆转是部分的，使得经美他多辛处理的动物与经美他多辛处理的WT动物具有差异(p＜0.05)。在N＝10WT和Fmr1敲除小鼠的组中重复该实验来研究每天一次地腹膜内施用载剂、100或200mg/kg美他多辛7天对场景恐惧条件反射的剂量依赖性影响(图1，图B和图C)。在该实验中，与经载剂处理的WT小鼠相比，经载剂处理的Fmr1敲除小鼠表现出学习缺陷(p＜0.0001)，复现第一实验。100mg/kg美他多辛在Fmr1敲除小鼠中产生缺陷逆转(P＜0.05)，但是这是部分逆转，因为经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠与经美他多辛处理的野生型小鼠具有差异(p＜0.0001)。在用200mg/kg i.p.美他多辛处理之后，在Fmr1敲除小鼠中观察到的学习缺陷完全逆转(经处理的Fmr1小鼠与经载剂处理的Fmr1敲除小鼠具有差异(P＜0.0001)，但是与经美他多辛处理的WT小鼠并无差异)。在任一实验中，美他多辛处理对WT小鼠均无影响(图1，图A-C)。
社交接近：如嗅探回合所指示的，经载剂处理的Fmr1敲除小鼠表现出较差的社交接近(图2(p＜0.0001))。用150mg/kg美他多辛每天一次地腹膜内处理7天在Fmr1敲除小鼠中提高社交接近(p＜0.0001，相比较于经载剂处理的Fmr1敲除小鼠)。经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠与经美他多辛处理的WT小鼠具有差异(p＜0.05)，但是具有接近WT小鼠的效应的趋势。美他多辛处理对WT小鼠无影响。
Y形迷宫自发交替：图3，图A中示出了在N＝10WT或Fmr1敲除小鼠的组中用载剂或150mg/kg美他多辛进行7天的每天一次处理对自发交替的影响。与经载剂处理的WT小鼠相比，经载剂处理的Fmr1敲除小鼠表现出较差的自发交替(p＜0.0001)。在Fmr1敲除小鼠中，与载剂处理相比，美他多辛处理提高自发交替(p＜0.0001)，但是相比较于经美他多辛处理的WT小鼠，经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠仍表现出缺陷(p＜0.01)。因此，美他多辛产生在Fmr1敲除小鼠中观察到的缺陷部分逆转。
Y形迷宫参考记忆任务：图3，图B中示出了在N＝10WT或Fmr1敲除小鼠的组中用载剂或150mg/kg美他多辛进行7天的每天一次处理对奖励性参考记忆学习的影响。与经载剂处理的WT小鼠相比，经载剂处理的Fmr1敲除小鼠表现出较不适当的臂进入(p＜0.0001)。与经载剂处理的Fmr1敲除小鼠相比，美他多辛处理降低这一缺陷(p＜0.0001)，使得经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠与经美他多辛处理的WT小鼠并无差异。美他多辛处理对WT小鼠无影响。
Y形迷宫水迷宫左右辨别：图3，图C中示出了在N＝10WT或Fmr1敲除小鼠的组中用载剂或150mg/kg美他多辛进行7天的每天一次处理对厌恶性激发空间辨别学习的影响。与经载剂处理的WT小鼠相比，经载剂处理的Fmr1敲除小鼠显示出较高的不正确臂进入次数。通过用美他多辛处理，这一缺陷得到降低。
T形迷宫奖励性交替任务：图4中示出了在N＝10WT或Fmr1敲除小鼠的组中用载剂或150mg/kg美他多辛进行7天的每天一次处理对奖励性交替工作记忆的影响。与经载剂处理的WT小鼠相比，经载剂处理的Fmr1敲除小鼠表现出较长的到达正确臂的潜伏期(p＜0.0001)。在Fmr1敲除小鼠中，与载剂处理相比，美他多辛处理降低这一缺陷(p＜0.0001)，这种逆转是部分的，因为相比较于WT小鼠，经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠响应较慢(p＜0.0001)。
连续通道：N＝10WT或Fmr1敲除小鼠的组中用载剂或150mg/kg美他多辛进行7天的每天一次处理对在连续通道任务中的表现的影响示于图5中，并且在下文进行了进一步描述。
连续通道测试有效地测量焦虑(进入通道1的潜伏期)和活动过度(通道2至4)。从通道1到通道2、3和4的进展与对颜色逐渐明亮的环境暴露有关，所述环境具有越来越低的壁和越来越窄的更加暴露的开放臂。时间花费在开放臂上并且进入开放臂指示焦虑；反之，在更多的开放臂中花费更久的时间反映活动过度。这些因素允许进行涵盖一系列焦虑样表现以及活动过度的敏感性测试。
通道1：与WT小鼠相比，Fmr1敲除小鼠表现得较为焦虑(p＜0.001)。与经载剂处理的Fmr1敲除小鼠相比，经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠表现出焦虑方面的改善(p＜0.001)，使得发生完全正常化。经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠与经美他多辛处理的WT小鼠之间不存在差异。此外，美他多辛处理对WT小鼠并无影响。
通道2：当与Fmr1敲除小鼠相比时，WT小鼠在通道2中表现得较不活跃(p＜0.0001)。在Fmr1敲除小鼠中，美他多辛处理降低活动过度(p＜0.001)，但是活动过度的这种逆转是部分的，因为经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠和WT小鼠具有差异(p＜0.001)。美他多辛处理对WT小鼠并无影响。
通道3：与WT小鼠相比，Fmr1敲除小鼠表现出活动过度(p＜0.0001)。这种活动过度不能通过美他多辛逆转，因为经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠与经载剂处理的Fmr1敲除小鼠并无差异。美他多辛处理对WT小鼠并无影响。
通道4：与WT小鼠相比，Fmr1敲除小鼠表现出活动过度(p＜0.01)。美他多辛处理逆转这种活动过度，因为经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠相比较于与经载剂处理的Fmr1敲除小鼠表现得较不活跃(p＜0.01)。该影响反应了正常化，因为经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠与经美他多辛处理的WT小鼠并无差异。美他多辛处理对WT小鼠并无影响。
总之，不期望受理论的限制，连续通道测试显示，与WT小鼠相比，Fmr1敲除小鼠的焦虑和活动过度增加。美他多辛处理在Fmr1敲除小鼠中降低这种焦虑和活动过度，而对WT小鼠并无影响。
生化分析
ERK和Akt的磷酸化：图6中示出了在N＝5Fmr1敲除或WT小鼠的组中用载剂或150mg/kg美他多辛进行7天的每天一次腹膜内处理对脑中ERK和Akt的整体脑磷酸化的影响。磷酸化水平以磷酸化ERK与总ERK的比率进行评估。该比率增加表示ERK被活化。与载剂对照相比，在经载剂处理的Fmr1敲除中ERK的磷酸化增加(p＜0.001)，这一效应复现在患有脆性X综合征的人对象中观察到的异常ERK活化(Wang等，2012)。美他多辛处理降低了这一效应(p＜0.01)，使得相比较于经美他多辛处理的WT小鼠并无差异。美他多辛对WT小鼠中的ERK磷酸化或任何小鼠中的总ERK水平无影响。与经载剂处理的WT小鼠相比，在经载剂处理的Fmr1敲除小鼠中磷酸化Akt与总AKT的比率也增加(p＜0.0001)。在Fmr1敲除小鼠中，用美他多辛处理降低磷酸化Akt的相对水平(p＜0.01)，使得Fmr1敲除小鼠与对照并无差异。美他多辛处理对WT小鼠或任何小鼠的总Akt水平并无影响。
实施例3.在Fmr1敲除脆性X小鼠模型中对美他多辛的评价(研究2)
美他多辛在6月龄Fmr1敲除小鼠中的行为影响
场景恐惧条件反射：初始实验在N＝10WT和Fmr1敲除6月龄小鼠的组中测试每天一次地腹膜内施用载剂或150mg/kg美他多辛7天对场景恐惧条件反射的影响。如在测试期期间凝滞降低所反映的，与经载剂处理的WT小鼠(WT-V)相比，经载剂处理的Fmr1敲除小鼠(KO-V)在场景恐惧条件反射模式中表现出学习方面的缺陷(图7(p＜0.0001))。在Fmr1敲除小鼠中，美他多辛施用逆转学习缺陷效应(p＜0.0001，KO-M-150相对于KO-V)。这是完全逆转，使得经美他多辛处理的KO小鼠与经美他多辛处理的WT小鼠没有差异。
社交接近和社交记忆：社交接近数据(初始试验1)示于图8，图A(嗅探回合次数)和图C(嗅探持续时间)中。社交记忆数据(试验2，试验1后24小时)示于图8，图B(嗅探回合次数)和图D(嗅探持续时间)中。这些结果在下文进一步讨论。
在试验1期间，与WT小鼠相比，Fmr1敲除小鼠显示嗅探回合次数增加(p＜0.0001)(参见图8，图A)而嗅探持续时间降低(p＜0.0001)(参见图8，图C)。这些社交相互作用缺陷与其它研究者对Fmr1敲除小鼠的报道的那些(Thomas等，2011)一致。对于嗅探回合次数和持续时间两者，使用美他多辛进行处理产生Fmr1敲除小鼠中的异常的逆转(均为p＜0.0001，KO-M-150相对于KO-V)，使得经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠与经美他多辛处理的WT小鼠在嗅探回合次数量度方面没有差异。同时，显示嗅探持续时间量度有所补救，但是这种效应是部分的，因为Fmr1敲除小鼠在美他多辛处理之后与WT小鼠相比仍具有差异(p＜0.05)。美他多辛对WT小鼠并无影响。这些数据表明，美他多辛补救Fmr1敲除小鼠中的异常社交接近行为。
在试验2期间，与野生型小鼠相比，Fmr1敲除小鼠显示嗅探回合次数增加并且嗅探持续时间增加(对于每个量度而言，p＜0.0001；分别为图8，图B和图D)。这反映适应失败，并且因此反映出社交记忆缺陷。美他多辛处理降低了这些差异(p＜0.0001，KO-M-150相对于KO-V)。对嗅探回合次数的逆转是部分的，因为经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠和经美他多辛处理的WT小鼠之间仍存在差异(p＜0.05)。通过美他多辛的逆转对嗅探持续时间而言是完全的，因为在经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠和经美他多辛处理的WT小鼠之间并未观察到差异。美他多辛对WT小鼠没有影响。这些数据表明，美他多辛在Fmr1敲除小鼠中降低社交记忆受损。下面通过社交记忆率(在实施例1中进行了描述)的计算来对社交记忆缺陷的这种降低进行举例说明：
社交记忆率定义为嗅探回合的持续时间：试验2/试验1+2。因此，无记忆的一个实例为(例如20/(20+20)＝0.5，而记忆的一个实例为(例如10/(20+10)＝＜0.5。
计算的社交记忆率如下：
WT-V试验2/试验1+试验2：12.4/12.4+26.8＝0.3，＜0.5记忆
KO-V试验2/试验1+试验2：325/325+24.1＝0.9，无记忆
WT-M试验2/试验1+试验2：12.5/38.5+12.5＝0.2，＜0.5记忆
KO-M试验2/试验1+试验2：12.7/28.4+12.7＝0.3，＜0.5记忆。
美他多辛在6月龄Fmr1敲除小鼠中的生化影响
继上述行为测试之后，图9中示出了在N＝10Fmr1敲除或WT小鼠中用载剂或150mg/kg美他多辛进行7天的每天一次ip处理对脑中的整体脑pERK(图9，图A)和pAkt(图9，图B)的影响。具体地，图9，图A示出了pAkt的脑水平，如在之前的实验中所观察到的，相比较于WT小鼠，在Fmr1敲除小鼠中pAkt的脑水平增加(P＜0.0001)。使用美他多辛进行处理逆转了脑pAkt的这一增加(p＜0.0001，KO-M-150相对于KO-V)，使得经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠与经美他多辛处理的WT小鼠没有差异。图9，图B示出了pERK的脑水平，如在之前实验中所观察到的，相比较于WT小鼠，在Fmr1敲除小鼠中pERK的脑水平增加(p＜0.0001，KO-M-150相对于KO-V)。美他多辛处理逆转了这一增加(p＜0.0001)，使得经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠与经美他多辛处理的WT小鼠没有差异。
美他多辛在腹膜内或经口施用之后对2月龄小鼠的行为的影响
图10示出了在2月龄Fmr1敲除和WT小鼠中以150mg/kg ip或者150和300mg/kg经口的剂量每日一次地施用美他多辛7天对场景恐惧条件反射的影响。具体地，图10，图A示出了来自用载剂ip和经口处理后的Fmr1敲除和WT小鼠的场景恐惧条件反射数据。对于载剂的施用途径来说，不存在差异。在通过ip和经口途径进行载剂处理之后，相比较于WT小鼠，Fmr1敲除小鼠显示了凝滞行为的降低(在任一情况下，p＜0.0001)。图10，图B示出了通过两种施用途径进行美他多辛处理对WT小鼠的影响。未观察到影响。图10，图C显示，Fmr1敲除小鼠中的ip 150mg/kg以及经口150和300mg/kg美他多辛处理逆转了在Fmr1敲除小鼠中所观察到的凝滞行为减轻(分别为p＜0.01、p＜0.0001和p＜0.0001，针对KO-M-ip、KO-M-po 150和KO-M-po 300相对于KO-V-ip和KO-Vpo)。施用150mg po美他多辛的影响与施用300mg/kg po美他多辛的影响没有差异。在Fmr1敲除小鼠中，150和300mg/kg经口美他多辛的影响与150mg/kg ip美他多辛的影响没有差异。在任一情况下，逆转都是完全的，因为经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠与经美他多辛处理的WT小鼠没有差异。
图11示出了在Fmr1敲除和WT小鼠中以150mg/kg ip或者150和300mg/kg经口的剂量每日一次地施用美他多辛7天对社交接近和社交记忆的影响。具体地，图11，图A示出了Fmr1敲除或WT小鼠中载剂或者150mg/kg ip或150和300mg/kg经口的美他多辛对社交接近行为的影响。在用载剂进行ip或经口处理之后，与WT小鼠相比，在Fmr1敲除小鼠中嗅探行为的持续时间缩短(均为p＜0.0001)。任意剂量的美他多辛处理对WT小鼠均无影响。然而，150mg/kg ip、150mg/kg和300mg/kg经口的美他多辛处理产生Fmr1敲除小鼠中所观察到的社交接近缺陷逆转(分别为p＜0.0001，针对KO-M-po 150和KO-M-po 300相对于KO-Vpo)。经口美他多辛的影响在150mg/kg和300mg/kg之间不是剂量依赖性的。这种逆转是完全的，因为经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠与经美他多辛处理的WT小鼠没有差异。在Fmr1敲除小鼠中，150mg/kg ip美他多辛的影响与150mg/kg经口或300mg/kg经口美他多辛的影响没有差异。图11，图B示出了Fmr1敲除或WT小鼠中载剂或者150mg/kg ip或150和300mg/kg经口的美他多辛对社交记忆的影响。在用载剂进行ip或经口处理之后，与WT小鼠相比，在Fmr1敲除小鼠中嗅探行为的持续时间延长(均为p＜0.0001)。任意剂量的美他多辛处理对WT小鼠均无影响。然而，150mg/kg ip、150mg/kg经口和300mg/kg经口的美他多辛处理产生Fmr1敲除小鼠中所观察到的社交接近缺陷逆转(分别为p＜0.0001、＜0.05和p＜0.01，针对KO-M-ip 150、O-M-po 50和KO-M-po 300相对于KO-V-ip和KO-V po)。这种逆转是完全的，因为经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠与经美他多辛处理的WT小鼠没有差异。在Fmr1敲除小鼠中，150mg/kg ip美他多辛的影响与150mg/kg经口或300mg/kg经口美他多辛的影响没有差异。此外，经口美他多辛处理的影响在150mg/kg和300mg/kg之间不存在剂量依赖性。
在2月龄小鼠中美他多辛在腹膜内或经口施用之后对生化标志物的影响
外周淋巴细胞：图12示出了如通过流式细胞术所测量的，在2月龄Fmr1敲除和WT小鼠中以150mg/kg ip或150mg/kg和300mg/kg经口的剂量每天一次地施用美他多辛7天对淋巴细胞pAkt(图12，图A)和pERK(图12，图B)的影响。具体地，图12，图A显示：与接受等量载剂处理的WT小鼠相比，经载剂处理的Fmr1敲除小鼠表现出增加的淋巴细胞Akt磷酸化(p＜0.0001，针对ip和经口施用两者)。用美他多辛以150mg/kg ip或者150mg/kg或300mg/kg的经口剂量每天一次地处理7天使过度活化的Akt正常化，使得pAkt水平在经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠和接受相同处理的WT小鼠之间没有差异。图12，图B显示：与接受等量载剂处理的WT小鼠相比，经载剂处理的Fmr1敲除小鼠表现出增加的淋巴细胞ERK磷酸化(p＜0.0001，针对ip和经口施用两者)。用美他多辛以150mg/kg ip或者150mg/kg或300mg/kg的经口剂量每天一次地处理7天使过度活化的ERK正常化，使得pERK水平在经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠和接受相同处理的WT小鼠之间没有差异。
脑区域：图13示出了施用150mg/kg美他多辛7天对海马、前额皮质和纹状体中的pERK水平的影响。在所有三个脑区域中，相比较于WT小鼠，在Fmr1敲除小鼠中pERK水平均提高(在所有情况下，p＜0.0001)。与经载剂处理的Fmr1敲除小鼠相比，在经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠中pERK水平降低(在所有情况下，p＜0.0001)。KO-M和WT-M组之间在海马和纹状体中没有差异，表明ERK活化的完全逆转。在前额皮质中的影响是部分的，KO-V和KO-M组保持不同(p＜0.05)。美他多辛对WT小鼠并无影响。
图14示出了施用150mg/kg美他多辛7天对海马、前额皮质和纹状体中的pAkt水平的影响。在所有三个脑区域中，相比较于WT小鼠，在Fmr1敲除小鼠中pAkt水平均提高(在所有情况下，p＜0.0001)。在所有三个脑区域中，与经载剂处理的Fmr1敲除小鼠相比，在经美他多辛处理的Fmr1敲除小鼠中pAkt水平均降低(在所有情况下，p＜0.0001)。在所有情况下，KO-M和WT-M组之间均没有差异，表明Akt活化的完全逆转。美他多辛对WT小鼠并无影响。脑和血液高水平的磷酸化ERT和Akt的降低与Fmr1敲除小鼠的行为改善结果有关，表明磷酸化水平是美他多辛处理响应的生物标志。
美他多辛对来自Fmr1敲除小鼠之原代海马神经元中的树突丝足密度和成熟的体外影响。
图15(图A至C)示出了用300μM美他多辛处理5小时的影响。将树突分成10个10μμm的节段，每个均基于离胞体的距离(近端至远端，从左到右)。在节段3中，与来自WT小鼠的神经元相比，在来自Fmr1敲除小鼠的神经元中棘密度增加。具体地，图15，图A示出了神经元丝足的密度。来自Fmr1敲除小鼠的原代海马神经元显示丝足密度增加(p＜0.001)。用300μμM美他多辛处理在Fmr1敲除小鼠中降低了神经元丝足密度的异常增加(p＜0.001)。来自Fmr1敲除小鼠的神经元示出具有不成熟特征的较长(图15，图B(p＜0.01))和较窄(图15，图C(p＜0.01))的丝足。用美他多辛处理逆转丝足长度的这种增加(图15，图B(p＜0.01))并且逆转宽度的减小(图15，图C(p＜0.01))。
美他多辛对Fmr1敲除小鼠中的海马蛋白质从头合成的体外影响
图16示出了来自Fmr1敲除或WT小鼠的400μM海马切片中用载剂或300μM美他多辛处理对蛋白质基础从头合成的影响。与经载剂处理的WT对照海马相比，在经载剂处理的来自Fmr1敲除小鼠的海马中蛋白质合成较高(p＜0.0001)。在Fmr1敲除小鼠的海马中，美他多辛处理降低了蛋白质合成速率。这种影响是部分的，因为来自Fmr1敲除小鼠的海马相比较于经美他多辛处理之来自WT小鼠的海马保持较高的蛋白质合成速率(p＜0.001)。

Claims (8)

1.在已接受美他多辛治疗之患有脆性X综合征或其它认知障碍的对象中评估美他多辛治疗方案之有效性的方法，其包括：
a)测量源自所述对象的样品中磷酸化ERK和Akt蛋白的量；
b)测量所述样品中ERK和Akt蛋白的总量；
c)计算步骤(a)中确定的磷酸化ERK和Akt蛋白量与步骤b)中确定的ERK和Akt蛋白量的比率；和
d)将步骤c)的计算比率与由未患病对象测量的计算比率进行比较，其中当步骤c)的计算比率与所述未患病对象的计算比率近似时，指示所述治疗是有效的。
2.确定患有脆性X综合征或其它认知障碍的对象是否将从美他多辛治疗方案获益的方法，其包括：
a)测量源自所述对象的样品中磷酸化ERK和Akt蛋白的量；
b)测量所述样品中ERK和Akt蛋白的总量；
c)计算步骤(a)中确定的磷酸化ERK和Akt蛋白量与步骤b)中确定的ERK和Akt蛋白量的比率；和
d)将步骤c)的计算比率与由未患病对象测量的计算比率进行比较，其中当步骤c)的计算比率高于所述未患病对象的计算比率时，指示所述对象将从所述美他多辛治疗方案获益。
3.在患有脆性X综合征或其它认知障碍的对象中监测美他多辛治疗方案的方法，其包括：
a)在第一时期测量来自所述对象的第一样品中磷酸化ERK和Akt蛋白的量；
b)在所述第一时期测量所述第一样品中ERK和Akt蛋白的总量；
c)计算步骤a)中确定的磷酸化ERK和Akt蛋白量与步骤b)中确定的总ERK和Akt蛋白量的第一比率；
d)在第二时期测量来自所述对象的第二样品中磷酸化ERK和Akt蛋白的量；
e)在所述第二时期测量所述第二样品中ERK和Akt蛋白的总量；
f)计算步骤d)中确定的磷酸化ERK和Akt蛋白量与步骤e)中确定的ERK和Akt蛋白总量的第二比率以生成第二比率；
d)将所述第一比率与所述第二比率进行比较。
4.权利要求3所述的方法，其中当所述第二比率低于所述第一比率时，指示所述治疗是有效的。
5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测量步骤包括免疫测定。
6.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是全血或其级分。
7.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是外周血单个核细胞(PBMC)。
8.权利要求7所述的方法，其中所述PMBC是淋巴细胞或单核细胞。
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