TW201606304A - 測定治療反應之方法 - Google Patents

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強納森 魯賓
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Abstract

本發明一般而言係關於測定美他多辛(metadoxine)療法用在治療X染色體脆折症候群及其他認知疾病之反應的方法。本發明亦關於鑑認對美他多辛療法會產生反應之個體。

Description

測定治療反應之方法
本發明係主張2013年9月9日提交的美國臨時申請案USSN 61/875,384號，2013年9月26日提交的美國臨時申請案USSN 14/038258號以及2014年5月9日提交的美國臨時申請案USSN 61/991,351號的優先權與利益，以上臨時申請案每一者的內容均完整地併入本說明書之參考資料中。
本發明一般而言係關於美他多辛(metadoxine)療法用在治療X染色體脆折症候群及其他認知疾病之反應的測定方法。本發明亦關於鑑認對美他多辛療法會產生反應之個體。
X染色體脆折症候群(X染色體脆折症候群；FXS)如其病名所暗示與位在基因圖譜Xq27.3位置之細胞分裂中期染色體內以同染色體絲裂隙表現的一個易脆折位置有關。X染色體脆折症候群是一種由位在X染色體上的易折X智能遲滯基因1(FMR1)之5’-非轉譯區內的突變所引起的遺傳疾病。引起FXS的突變與易折X智能遲滯基因FMR1中的CGG重複片段相關。在大多數健康的個體當中，CGG重複片段的範圍從少於10個到40個，平均大約是29個。在X染色體脆折症候群中，CGG序列重複200次到多於大約1,000次。當一個實驗對象具有多於大約200個CGG重複片段時，該易折X基因就變得高度甲基化，使得該基因不表現。因此，易折X智能遲滯蛋白(FMRP)就不產出，或是減量產出，而該受試對象則顯現出FXS的症狀。
FMR1基因之前突變表現(55-200 CGG重複片段)在一般人群中是經常可見的，其估計盛行率為每259位女性中有一位和每812位男性中有一位。該前突變的攜帶者典型上具有正常的IQ，雖 然其情緒問題如焦慮是普遍常見的。較年長之前突變的男性攜帶者(50歲和更年長)會產生漸進的意向性顫抖和運動失調。這些動作性疾病經常伴隨漸進的認知和行為困難，包括記憶喪失、焦慮和執行功能欠缺、隱遁或易怒的行為，以及癡呆。此種疾病已被指定為脆折X染色體相關的顫抖/運動失調症候群(FXTAS)。患有FXTAS之實驗對象的核磁共振造影透露在中間的小腦腳和相鄰的小腦白質中的T2-加權信號強度增加。
FXS被分隔成為一種具低外顯率之X染色體連結的顯性病症。任何性別當帶有易折X染色體突變時會展現智力障礙，嚴重程度則可變。罹患FXS的孩童和成人具有不同程度的智力障礙或學習障礙和行為與情緒問題，包括似自閉的特徵和傾向。罹患FXS的幼小兒童經常在發育的里程碑如學習如何坐、行走和說話上延遲。受到影響的兒童可能具有經常發怒、注意力不集中、經常性發作(例如顳葉發作)，經常是高度焦慮、容易受打擊，可能具有感官過度反應的病症、消化道病症，並且具有語言問題和不尋常的行為，如拍手和咬手。
FXS可以用一種已建立的遺傳試驗在得自實驗對象的試樣(例如血液試樣、口頰試樣)來做診斷。該試驗能依據CGG重複序列的數目來測定是否有突變或前突變發生在實驗對象的FMR1基因上。
罹患FXS的實驗對象亦可能有自閉症。大約有5%之所有被診斷為自閉症的兒童在FMR1基因上有突變並且也具有X染色體脆折症候群(FXS)。泛自閉症疾患(ASD)在大約30%患有FXS的男性和20%患有FXS的女性身上發現，且有另外30%的FXS個體展現自閉症狀而未做過ASD診斷。雖然智力障礙是一個FXS的標籤特徵，但是罹患FXS的實驗對象經常表現出自閉的特徵，其表現從輕微案例的害羞、眼神接觸缺乏、以及社會性焦慮到嚴重受影響案例的拍手、咬手和固執性說話。罹患FXS的實驗對象會展現與自閉關聯的其他症狀如注意力缺乏和過動、發作、對於感官刺激過度敏感的強迫症行為和 改變的消化功能。FMR1突變阻撓或大量降低了單一蛋白(FMRP)的表現。缺乏FMRP的腦部發育被認為會引起FXS的主要症狀。
除了核心的症狀之外，罹患FXS的兒童經常具有嚴重的行為問題如易被激怒、侵略行為和自殘行為。在最近的研究當中報告具有FXS的男性(年齡8-24歲)在兩個月的觀察期中79%有自殘行為、75%有侵略行為。
目前對於罹患FXS人類的可獲得治療方案(treatment regimens)包括例如行為矯正和某一範圍的藥品包括抗憂鬱症和抗精神病藥物(未經FDA批准用於FXS)來治療。認知行為療法已被用於改進具有FXS和自閉症之個人的語言和社會化。在最近幾年，以非典型抗精神病之理斯必妥(risperidone)的藥理治療已經普遍採用於加強對自閉症個體治療之非藥理學方法。一項對自閉症兒童之隨機以安慰劑作為對照組的理斯必妥試驗證實在脫離常規行為檢查單(Aberrant Behavior Checklist)和臨床整體印象改進上(Clinical Global Impressions-Improvement)[McCracken,J.T.等人，《新英格蘭醫學雜誌》，第347期：314-321頁(2002年)]有顯著的改善。然而，副作用包括體重增加、食慾增加、疲倦無力、困倦、頭昏眼花和垂涎。社會脫離與溝通問題並未因施用理斯必妥(risperidone)而改善，並且負面的副作用如錐體外症候群和運動困難已經在使用理斯必妥的自閉兒童身上產生關聯。
本發明提供在已接受美他多辛(metadoxine)治療之患有X染色體脆折症候群或其他認知疾病的實驗對象身上評估美他多辛(metadoxine)治療攝生法之有效性的方法，藉著測量磷酸化ERK和Akt蛋白質在得自該對象的試樣中之含量：測量樣品中ERK和Akt蛋白質的總量；計算磷酸化ERK和Akt蛋白質含量相對於ERK和Akt蛋白質總量的比率並且將算出的比率與沒有疾病的實驗對象身上測到的計算比率相比較。當該實驗對象之計算比率相似於已知未罹病之對象的計算比率時，該治療即為有效。
本發明亦提供測定患有X染色體脆折症候群或其他認知疾病的實驗對象是否會從美他多辛治療攝生法獲得好處的方法，其乃藉著測量得自該實驗對象之試樣中磷酸化ERK和Akt蛋白質的含量；測量該試樣中ERK和Akt蛋白質的總量並將該對象之計算比率和從未罹病之對象測得的計算比率相比較。當該實驗對象之計算比率高過已知未罹病對象的計算比率時，實驗對象即從該美他多辛治療攝生法獲得好處。
本發明亦提供在罹患X染色體脆折症候群或其他認知疾病的實驗對象身上監測美他多辛治療攝生法的方法，藉著測量在第一時段取自受試對象第一個試樣中磷酸化ERK和Akt蛋白質的含量；測量第一時段第一試樣中ERK和Akt蛋白質的總量；計算磷酸化ERK和Akt蛋白質含量相對於ERK和Akt蛋白質總量的比率；測量在第二時段取自受試對象的第二個試樣中磷酸化ERK和Akt蛋白質的含量；測量第二時段之第二試樣中ERK和Akt蛋白質的總量；計算磷酸化ERK和Akt蛋白質含量相對於ERK和Akt蛋白質總量的第二項比率並且將第一項比率與第二項比率相互比較。當第二項比率比第一項比率要低時，該治療即為有效。
在某些方面，測量步驟包括一項免疫檢驗。在某些具體實例中，該試樣是全血或其部分收集物。在某些具體實例中，該試樣是周圍血液單核細胞(PBMC)。在某些具體實例中，PMBC是一個淋巴球或單核白血球。
除非另有定義，所有本說明書中使用的技術的和科學名詞具有與一般熟習本發明所屬技藝者普遍瞭解的同樣意義。雖然相似或相等於本說明書中說明之方法和材料可被用在實行本發明，但是適當的方法和材料則被說明於下。所有出版品、專利申請案、專利、以及其他本說明書提到的參考文獻均特意地以其完整內容併入本發明的參考文獻中。在有衝突的情況之中，本專利說明書，包括定義會做控制。此外，本說明書中所說明的材料、方法和實例僅係作為說明而非意圖加以限制。
本發明的其他特色和優點從以下詳細說明和專利申請範圍中可顯而易見並為其所涵蓋。
圖1顯示每日一次腹膜內(ip)施用運輸劑(V)或美他多辛(M)(100,150，或200mg/kg)在二個月大的Fmr1基因剔除鼠(KO)或野生型老鼠(WT)身上七日對於海馬迴依賴型環境恐懼制約的影響。特定言之，圖A顯示運輸劑或150mg/kg美他多辛的效果。長條圖C顯示運輸劑或200mg/kg美他多辛的效果。數據顯示平均值±標準差(sem)，N=10隻老鼠/每組。*p<0.05，****p<0.0001，以及NS=不顯著。
圖2顯示每日一次腹膜內(ip)施用運輸劑(V)或150mg/kg美他多辛(M)在二個月大的Fmr1基因剔除鼠(KO)或野生型老鼠(WT)身上七日對社會取向行為的影響。數據顯示平均值±標準差(sem)，N=10隻老鼠/每組。*p<0.05，****p<0.0001，以及NS=不顯著。
圖3顯示每日一次腹膜內(ip)施用運輸劑(V)或150mg/kg美他多辛(M)在二個月大的Fmr1基因剔除鼠(KO)或野生型老鼠(WT)身上七日對Y-迷宮自發性找路(長條圖A)、Y-迷宮報償性找路(長條圖B)或Y-迷宮水迷宮的空間識別(長條圖C)的影響。數據顯示平均值±標準差(sem)，N=10隻老鼠/每組。*p<0.001，****p<0.0001，以及NS=不顯著。
圖4顯示每日一次腹膜內(ip)施用運輸劑(V)或150mg/kg美他多辛(M)在二個月大的Fmr1基因剔除鼠(KO)或野生型老鼠(WT)身上七日對T-迷宮報償性找路的影響。數據顯示平均值±標準差(sem)，N=10隻老鼠/每組。****p<0.0001。
圖5顯示每日一次腹膜內(ip)施用運輸劑(V)或150mg/kg美他多辛(M)在每群N=10的二個月大野生型老鼠(WT)或Fmr1基因剔除鼠(KO)或野生型老鼠(WT)身上七日對連續小徑任務之行為的影響。該裝置的連續小徑會提供逐漸增加焦慮的環境以探測老鼠。因此從小徑走下來被評估為焦慮。此外，全部的活動程度亦可在該裝置中被定量出來。
圖6顯示每日一次腹膜內(ip)施用運輸劑(V)或150mg/kg美他多辛(M)在二個月大的Fmr1基因剔除鼠(KO)或野生型老鼠(WT)身上七日對全腦ERK磷酸化程度(以ERK的活性作為指示)和Akt磷酸化程度(以Akt的活性作為指示)的影響。數據顯示平均值±標準差(sem)，N=5隻老鼠/每組。**p<0.01,***p<0.001，****p<0.0001，且NS=不顯著。
圖7顯示每日一次腹膜內(ip)施用運輸劑(V)或150mg/kg美他多辛(M)在六個月大的Fmr1基因剔除鼠(KO)或野生型老鼠(WT)身上七日對海馬迴依賴型環境恐懼制約的影響。數據顯示平均值±標準差(sem)，N=10隻老鼠/每組。****p<0.0001，以及NS=不顯著。
圖8顯示每日一次腹膜內(ip)施用運輸劑(V)或150mg/kg美他多辛(M)在六個月大的Fmr1基因剔除鼠(KO)或野生型老鼠(WT)身上七日對社會取向(長條圖A和C)以及社會性記憶(長條圖B和D)行為的影響，該試驗係測量嗅聞次數或嗅聞的時間長短。數據顯示平均值±標準差(sem)，N=10隻老鼠/每組。*p<0.05，****p<0.0001，以及NS=不顯著。
圖9顯示每日一次腹膜內(ip)施用運輸劑(V)或150mg/kg美他多辛(M)在六個月大的Fmr1基因剔除鼠(KO)或野生型老鼠(WT)身上七日對全腦ERK磷酸化程度(長條圖A)和Akt磷酸化程度(長條圖B)的影響。數據顯示平均值±標準差(sem)，N=10隻老鼠/每組。**p<0.05,***p<0.01，****p<0.0001，且NS=不顯著。
圖10顯示每日一次腹膜內(ip)或口服(po)施用運輸劑(V)或150mg/kg美他多辛(M)在二個月大的Fmr1基因剔除鼠(KO)或野生型老鼠(WT)身上七日對海馬迴依賴型環境恐懼制約的影響。數據顯示平均值±標準差(sem)，N=10隻老鼠/每組。特定言之，長條圖A顯示在Fmr1基因剔除鼠(KO)和野生型老鼠身上以ip和口服施用運輸劑。長條圖B顯示在野生型老鼠身上以ip和口服施用美他多辛。長條圖C顯示在Fmr1基因剔除鼠(KO)身上以ip和口服施用美他多辛*p<0.01，****p<0.0001，以及NS=不顯著。
圖11顯示每日一次ip或口服(po)施用運輸劑(V)或150或300mg/kg美他多辛(M)在二個月大的Fmr1基因剔除鼠(KO)或野生型老鼠(WT)身上七日對社會取向(長條圖A)以及社會性記憶(長條圖B)的影響。數據顯示平均值±標準差(sem)，N=10隻老鼠/每組。*p<0.01，****p<0.0001，以及NS=不顯著。
圖12顯示每日一次ip或口服(po)施用運輸劑(V)或150或300mg/kg美他多辛(M)在二個月大的Fmr1基因剔除鼠(KO)或野生型老鼠(WT)身上七日以流式細胞儀評估對淋巴球生物標記的影響。顯示的生物標記是Fmr1基因剔除鼠(KO)或野生型老鼠(WT)的pAkt(長條圖A)和pERK(長條圖B)。數據顯示平均值±標準差(sem)，N=10隻老鼠/每組。****p<0.0001，以及NS=不顯著。
圖13顯示每日一次腹膜內施用運輸劑(V)或150mg/kg美他多辛(M)在二個月大的野生型老鼠(WT)和Fmr1基因剔除鼠(KO)身上七日對腦部區域中pERK濃度的影響。被分析的區域是Fmr1基因剔除鼠(KO)或野生型老鼠(WT)的海馬迴(長條圖A)、前額葉皮質(長條圖B)，和紋狀體(長條圖C)。數據顯示平均值±標準差(sem)，N=10隻老鼠/每組。****p<0.0001，以及NS=不顯著。
圖14顯示每日一次腹膜內施用運輸劑(V)或150mg/kg美他多辛(M)在二個月大的野生型老鼠(WT)和Fmr1基因剔除鼠(KO)身上七日對腦部區域中pAkt濃度的影響。被分析的區域是Fmr1基因剔除鼠(KO)或野生型老鼠(WT)的海馬迴(長條圖A)、前額葉皮質(長條圖B)，和紋狀體(長條圖C)。數據顯示平均值±標準差(sem)，N=10隻老鼠/每組。****p<0.0001，以及NS=不顯著。
圖15顯示用運輸劑(V)或300μM美他多辛(M)在體外處理五小時對於得自Fmr1基因剔除鼠(KO)或野生型老鼠(WT)之神經元之海馬迴培養物中細胞觸角密度(長條圖A)、長度(長條圖B)，和寬度(長條圖C)的影響。數據顯示平均值±標準差(sem)，(野生型，N=20個神經元且Fmr1基因剔除鼠，N=20個神經元)，**p<0.01，***p<0.001，以及NS=不顯著。
圖16顯示在體外用運輸劑(V)或300μM美他多辛(M) 處理對於Fmr1基因剔除鼠(KO)或野生型老鼠(WT)之400μM海馬迴切片之基礎從頭合成蛋白質的影響。數據顯示平均值±標準差(sem)，N=6片/每組，*p<0.001和****p<0.0001。
本發明係關於鑑認罹患X染色體脆折症候群(FXS)和其他認知疾病之個體對於美他多辛療法之反應相關聯的生物標記。特定言之，吾人發現美他多辛治療使實驗對象的試樣中磷酸化ERK和Akt蛋白質對ERK和Akt蛋白質總量的比率回歸到接近正常比率。正常比率意指在正常(沒有疾病的)實驗對象身上發現的磷酸化ERK和Akt蛋白質對ERK和Akt蛋白質總量的比率。而且，吾人為預期的發現到這些磷酸化ERK和Akt蛋白質對ERK和Akt蛋白質總量的比率的改變可在血液中測得。
因此，本發明提供監測進行美他多辛治療FXS或其他認知病患之對象的方法，藉著測定實驗對象的試樣中磷酸化ERK和Akt蛋白質對ERK和Akt蛋白質總量的比率。將該比率與對照組比率-如得自未受認知病症折磨的病患之比率相比較。一個相似於正常對照組比率之實驗對象比率指出該治療是有效的。
此外本發明提供挑選具有認知病症而能從美他多辛治療獲得好處的實驗對象，藉著測定實驗對象的試樣中磷酸化ERK和Akt蛋白質對ERK和Akt蛋白質總量的比率。將該比率與對照組的比率，例如得自未受認知病症折磨的病患之比率相比較。一個大於正常對照組比率之實驗對象比率指出該對象可從美他多辛治療獲得好處。然而其比率不大於正常對照組比率之對象可能無法從美他多辛治療獲得好處。
雖然比率的計算在本說明書中以單向說明，但是吾人應瞭解其涵蓋如熟習本技藝者顯然易知的倒數計算。而且，雖然如本說明書中所說明的計算比率在提供有用的比較數字上是有利的，但是計算磷酸化ERK和Akt蛋白質和ERK和Akt蛋白質總量之間，計算試 驗對象與對照組對象之間的絕對差值亦可被採用，並且能效使用在本發明的實行上。
定義
「準確度」係指測量或計算量(試驗報告值)相對於其實際(或正確)值之一致程度。臨床準確度係關於真正結果[真陽性(TP)或真陰性(TN)]相對於錯誤分類結果[假陽性(FP)或假陰性(FN)]的比率，並且可以陳述為敏感度、專一性、正向預測值(PPV)或負向預測值(NPV)，或者在其他測量中作為可能值、勝算比。
「生物標記」在本發明內容中係非限制性地涵蓋蛋白質、核酸和代謝物，與其多形性、突變、變異體、修飾物、次單元體、片段、蛋白質-配位基複合物，以及降解產物、蛋白質-配位基複合物、元素、相關代謝物，以及其他被分析物或得自試樣的測量物。生物標記亦可包括突變的蛋白質或突變的核酸。生物標記憶可涵蓋健康狀態的非血液運載因子或非被分析物之生理學標記，如本說明書中所定義之「臨床參數」，以及「傳統實驗室風險因子」，也被定義在本說明書中。生物標記也包括任何由數學產生之經計算出來的索引值，或任何一個或多於一個先前測量值的組合，包括暫時的趨勢與差異。當可獲得和除非在本說明書中另有說明，生物標記為基因產物者係根據國際人類基因組組織命名諮議會(HGNC)指派的正式字母縮寫或基因符號來鑑認，並且在此送件日期被登列在美國國家生技資訊中心(NCBI)的網站。
「臨床指標」係任何生理學數據單獨或與其他數據連結用於評估細胞集合或生物體之生理條件者。這項名詞包括臨床前指標。
「臨床參數」涵蓋實驗對象之健康情形或其他特徵如(非作為限制的)年齡(Age)、種族(RACE)、性別(Sex)、或家族史(FamHX)的所有非試樣或非分析物之生物標記。
「FN」是假陰性，用於疾病的狀態試驗意指將疾病對象錯誤歸類為無疾病或正常的。
「FP」是假陽性，用於疾病的狀態試驗意指將疾病對象錯誤歸類為有病。
「公式」、「演算法」，或「模型」係任何數學公式、演算法的、分析的或程式化的程序，或是統計學的技術，其使用到一個或多於一個連續或屬於某範疇的輸入值(在本說明書中稱為「參數」)並且計算輸出值，有時被稱為「指標」(index)或「指標值」，「非作為限制的『公式』」實例包括：加總的和、比率，和回歸運算子，如係數或指數，生物標記值的轉換和正規化(包括但不限於那些根據臨床參數如性別、年齡或種族的正規化圖解)、規則和指引、統計學的分類模型、以及對歷史量群進行訓練的神經網路。在長條圖與組合建構之中，令人尤有興趣的是結構與共同合作的統計分類演算法，以及風險指數的方法建構，利用模式辨認特徵，包括建立的技術如交叉相關性、主要成分分析(PCA)、因子旋轉、邏輯迴歸分析(LogReg)、線性判別分析(LDA)、特徵基因線性判別分析(ELDA)、支持向量機(SVM)、隨機森林(RF)、遞歸分割樹(RPART)，以及其他相關的決策樹分類技術，縮小中心法(SC)、StepAIC、K最近鄰法、Boosting演算法、決策樹、中性網絡、貝氏網路、支持向量機、隱馬爾可夫模型及其他。其他技術可被用於存活和時間對事件災害分析，包括熟習本技藝者已知的Cox,Weibull,Kaplan-Meier和Greenwood模型。這些技術中有許多有用於和挑選技術合併，如向前挑選、向後挑選、或逐步挑選，完全列舉出所有可能之某大小區域、遺傳演算法、或其本身可包括生物標記挑選方法學在其本身的技術之中。這些可與資訊準則如赤池資訊準則[Akaike's Information Criterion(AIC)]或貝氏資訊準則[Bayes Information Criterion(BIC)]結合，以定量另外的生物標記與模型改進之間的消長，並且有助於使過度符合的情形減到最小。所得到的預測模型可以在其他研究中證實，或在其原先於其中訓練之使用如Bootstrap、Leave-One-Out(LOO)和十倍交叉認證(10-Fold CV)的研究中被交叉證實。在許多步驟當中，可根據本技藝已知的技術藉由數值置換來估算錯誤發現率。「健康經濟效用函數」是得自某一範圍理想 化之可施行病患群體臨床結果的期望機率所組合成之公式，該結果是把診斷或治療介入到照護標準前與後兩種情形下所得到的。其涵蓋：估算出此種介入之精確度、效果與性能的特性，以及與每一結果相關的成本和/或價值測量(效用)，該結果可以得自確實的健康體系之照護花費(服務、供應、儀器裝置和藥物等)和/或以每次結果得到之每一品質調整壽年(QALY)的估算可接受值呈現。總括所有預測結果，該每一結果的預測群體大小乘以對應該結果之期望效用的乘積總和就是某一照護標準的總體健康經濟效用。(i)從介入照護標準計算出的總體健康經濟效用相對於(ii)沒有介入照護標準的總體健康經濟效用兩者間的差異可得到介入的總體測量健康經濟成本或價值。其本身可除以被分析的全體病患(或僅除以被介入的群體)以算出每一介入的單位成本，並且引導出如市場定位、訂價之決策以及對健康體系接受度的假設。此種健康經濟效用函數常用於比較醫療介入的成本-效果，但是亦可經轉換以估算健康照護體系對每QALY願意支付的可接受值，或是新的醫療介入所需的可接受成本-有效臨床表現特性。
對於本發明的診斷性(或預後的)介入而言，當每一結果(在一項疾病分類診斷試驗中可為TP、FP、TN、或FN)具有不同成本時，健康經濟效用函數會根據臨床情形和個別結果的成本和價值而偏好敏感度勝於專一性或是偏好PPV勝於NPV，因此提供可能與更直接臨床或分析性能相異之另一種測量的健康經濟性能和價值測量法。這些相異的測量法和相對的消長結果一般而言僅會在零誤差率的完美試驗情形下(又被稱為零錯分預測實驗對象結果或FP和FN)收斂趨同，所有性能測量會偏好不完美，但是程度不同。
「測量(measuring)」或「測量(measurement)」，或是「偵測(detecting)」或「偵測(detection)」意指評估臨床或實驗對象身上所得試樣中某物質的存在、不存在、含量或用量(其可能是一個有效用量)，包括取得此種物質之定性的或定量的濃度，或者評量實驗對象之非分析物臨床參數的價值或分類。
「陰性預測值」或「NPV」是藉由TN/(TN+FN)或所有陰性試驗結果之真陰性部分計算出來的。其亦本質上會受到疾病之流行程度與意圖受測試的群體之測試前機率影響。請參考例如：O'Marcaigh A S,Jacobson R M,〈估算診斷試驗之預測值，如何防止誤導令人困擾的結果〉，《臨床小兒科期刊(Clin.Ped.)》，1993年，第32期(8)：第485-491頁，其討論專一性、敏感性，以及陽姓與陰性的試驗(例如一項臨床診斷試驗)預測值。經常，對於利用連續診斷試驗測量的二元疾病狀態分類法，敏感度和專一性是藉由Pepe等人，〈放射線計測診斷、預後或篩檢標記物之勝算比的限制〉，《美國流行病學期刊》，2004年，第159期(9)：第882-890頁提出之受試者的操作特徵(Receiver Operating Characteristics；ROC)曲線來做簡要說明，並且由曲線下面積(Area Under the Curve；AUC)或是c-統計法-容許僅用一個單一數值代表試驗、檢驗或方法在整個試驗(或檢驗)分界點範圍內的敏感度和專一性做簡要說明。亦請參考例如：Shultz的〈實驗方法的臨床解讀〉，在第14章在Teitz《基礎臨床化學》，Burtis和Ashwood(編著)，第4.sup.th版，1996年，W.B.Saunders Company出版，第192-199頁；以及Zweig等人之〈ROC曲線分析：一項顯示鑑別罹患冠狀動脈疾病實驗對象時血脂與輔脂蛋白[Apo脂蛋白]濃度之間關係的實例〉，《臨床化學》，1992年，第38期(8)：第1425-1428頁。一項利用相似函數、勝算比、資訊理論、預測值、校正(包括適合度)以及重新分類測量的替代方法係根據Cook，〈利用和錯誤使用接受者操作特徵曲線在風險預測上〉，《循環》，2007年，第115期：第928-935頁做簡要的說明。最後，由試驗定義的實驗對象群中之災害比率和絕對與相對風險比率是對臨床準確度和用途的進一步測量。多重的方法經常被用在定義異常或疾病值，包括參考界限、區別界限，以及風險門檻。
「分析正確性」係指測量方法本身的複現性和可預測性，且其可在此種測量中以變異係數、和一致性試驗以及對於不同時間、使用者、設備和.或試劑之相同試樣或對照組的校正簡要的說明。 用於評估新穎生物標記之這些和其他考慮亦簡單說明於Vasan，2006年。
「性能」是一個與診斷或預後試驗的總體利用性和品質相關的用語，包括尤其是臨床和分析的正確性、其他分析和處理特性如使用特性(例如，穩定度、使用簡易)、健康的經濟價值、以及試驗成分之相對成本。任何這些因素均可作為優異性能從而作為試驗可用性的來源，並且可依照適切性使用適當的「性能衡量標準」如AUC、時間相對結果、貯存壽命等來測量。
「陽性預測值」或「PPV」是藉由TP/(TP+FP)或所有陽性試驗結果中確實的陽性反應部分來計算的。其本質上會受到疾病的流行程度和意圖受測試的群體之試驗前機率影響。
「風險」在本發明內容中係關於一個事件在一段特定時段中發生的機率，如在治療的反應之中，並且可意指一個實驗對象的「絕對」風險或「相對」風險。絕對風險可參考測量後確實觀察關聯的時間群組，或者是參考統計學上已被遵循用於關聯時間的可靠歷史群組產生的指標數值來進行測量。相對風險係指一個實驗對象的絕對風險相對於低風險群組或是群體平均風險的比率，其可能因評估的臨床風險因子而有變化。對某一試驗結果的勝算比-陽性事件相對於陰性事件的比率也經常使用(勝算是根據公式p/(1-p)計算的，其中p是事件機率且(1-p)是事件不發生的機率)於沒有轉變的情形。
「風險推估」或「評估風險」在本發明內容中涵蓋對於機率、勝算或是一個事件或疾病狀態發生的可能性、事件發生或從一個疾病狀態轉變的比例。風險推估亦可包括預測未來的臨床參數、傳統實驗風險因素值、或其他FXS的指標-依照先前測量的群體結果以絕對或相對用語表示。本發明的方法可用於連續或對某範疇的治療反應進行測量，從而診斷和定義某一範疇之被定義為有反應和沒有反應之受試對象的風險光譜。在分類方案之中，本發明可用在區分正常與其他具反應高風險的實驗對象群組。
在本發明的內容中「試樣」是一種從實驗對象分離出的生物樣品，並且可包括作為範例而非限制的：全血、血清、血漿、腦脊髓液(CSF)、腦細胞，或其他任何分泌物、排泄物，或其他體液。一種「試樣」可包括單細胞或多細胞或細胞碎片。該試樣可為組織試樣。該試樣即是或包含體細胞或淋巴球。較好該試樣是周圍血液單核細胞如淋巴球或單核白血球。
「敏感度」是由TP/(TP+FN)或真陽性部分之疾病實驗對象計算出來的。
「專一性」是由TN/(TN+FP)或真陰性之非疾病或正常實驗對象計算出來的。
「統計學顯著的」一詞意指改變大於可能被期望純粹隨機發生者(其可能為「假陽性」)。統計學上的顯著性可藉由任何本技藝中已知的方法測定。常用的顯著性測量法包括p-值，假設數據上的點是純粹隨機的結果，則呈現至少取得極端逼近該數據點之機率的結果。在p-值為等於或小於0.05時，結果被認為高度顯著。較好是p-值為0.04、0.03、0.02、0.01、0.005、0.001或更小。
本發明內容中「實驗對象」較好是哺乳類。該哺乳類可為人類、非人的靈長類、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或牛，但是並不限於這些實例。人以外的哺乳類可以有利地用作代表FXS動物模型的實驗對象。一個實驗對象可為雌性或雄性的。該對象具有或貝期望具有FXS或其他認知病症。
「TN」是真陰性，對於疾病狀態試驗而言意指被正確歸類為非疾病或正常的實驗對象。
「TN」是真陽性，對於疾病狀態試驗而言意指被正確歸類為有疾病的實驗對象。
「傳統實驗是風險因子」等於從實驗對象純化或取得之生物標記並且目前在臨床實驗室中被評估且在傳統的全面風險推估演算法中被使用者。其他對於X染色體脆折的傳統實驗室風險因子是熟習本技藝者既知的。
本發明之方法
本說明書中揭示之方法被使用在正進行美他多辛處理和/或治療FXS及其他認知病症的實驗對象以及已經被診斷有FXS及其他認知病症的實驗對象。
本發明的方法有用於監測實驗對象之FXS及其他認知病症的實驗對象的治療並且挑選出能從美他多辛處理獲得好處的實驗對象。
一般而言，FXS的症狀落在五個類別中：常與脆折X染色體關聯的或具有相同特性的智力與學習；身體、社會性與情緒、言語和官能疾病。例如，罹患FXS的個體具有損壞的智力功能、社會焦慮、語言困難和對某些知覺敏感。
認知病症包括心智運作功能障礙/損壞組成核心症狀學之病症群。認知病症包括神經產生的認知病症或行為的認知病症。
認知病症包括發育病症、注意力不集中過動症(ADHD)、自閉症譜系障礙、阿茲海默氏症、精神分裂症和腦血管疾病。
自閉症譜系障礙和自閉症狀常與患有X染色體脆折症候群的個體相關。自閉症的信號和症狀包括語言遲緩、社會性和溝通艱難，以極不尋常的行為和興趣。許多患有自閉症的人也具有智能障礙。
測定實驗對象的試樣中磷酸化ERK和Akt蛋白質含量相對於ERK和Akt蛋白質總量的比率使FXS或其他認知病症的治療過程得以被監測。在本方法中，生物樣品係由進行處理的實驗對象提供。若需要，生物樣品係在治療前、治療期間或治療後知不同的時間點取得。然後計算磷酸化ERK和Akt蛋白質含量相對於ERK和Akt蛋白質總量的比率並且和對照值做比較。對照值是一個磷酸化ERK和Akt蛋白質含量相對於ERK和Akt蛋白質總量狀態的比率已知的對照個體或群體狀態或是一個指標值。參考試樣或指標值可得自 一個或多於一個未患疾病(例如未受FXS和其他認知病症影響)的個體。或者，參考試樣或指標值考採取或得自先前被處理的對象。例如，樣品可從未接受初始處理和之後緊接處理的對象身上收集以監測處理之進展。該參考用試樣或指標值可採取或得自初始處理後的對象。例如，試樣可以從已接受FXS初始處理和緊接的處理之實驗對象以監測處理之進展。
在另一項具體實例中，參考值是一個指標值或底線值。指標值或底線值是得自未罹患FXS和其他認知病症之個體的磷酸化ERK和Akt蛋白質含量相對於ERK和Akt蛋白質總量比率的複合樣品。
該處理的效果可藉著測定經歷一段時間測定得自實驗對象的試樣中磷酸化ERK和Akt蛋白質含量相對於ERK和Akt蛋白質總量比率來監測。例如第一試樣可以在實驗對象接受處理之前取得，且在該對象接受處理後或處理期間採得一個或多於一個緊接的試樣。
「有效的」一詞意指該處理會引致磷酸化ERK和Akt蛋白質含量相對於ERK和Akt蛋白質總量比率相似於不具有FXS或期他認知病症的實驗對象。效果可結合任何已知用於診斷、鑑認、或治療FXS的方法進行測定。
磷酸化ERK和Akt蛋白質含量與ERK和Akt蛋白質總量可用任何本技藝已知的方法，如免疫檢驗法測定。
本發明之表現及測定正確性
本發明的成效與絕對和相對的臨床使用性可用多種如以上提出的方法來評估。該診斷、預測或預後試驗、檢驗或方法的正確性，關係到該試驗、檢驗或方法用於對美他多辛治療有反應和沒反應對象的區辨能力，是依據磷酸化ERK和Akt蛋白質含量相對於ERK和Akt蛋白質總量比率來決定的。正常者與異常者之比率的差異較好是統計學上顯著的。
因此，為了評估所提出之用於評估受試對象之狀況的醫學試驗、檢驗或方法之正確性和使用性，吾人應該總是把敏感度和專一性列入考慮，並且要注意在敏感度和專一性均被報導下的切分點所在，因為敏感度與切分點會在切分點的範圍區間裡顯著地改變。較好是使用涵蓋所有可能的切分點值之統計學方法如AUC於利用本發明測量大多類別風險測定上，但是對於連續的風險測量而言，則以對於觀察結果進行適合度與校正的統計學或其他黃金標準值為較佳。
利用此種統計學，在本說明書中「診斷正確性的可接受度」被定義為試驗或檢驗，其中AUC(用於試驗或檢驗之ROC曲線下的面積)至少為0.60，較好至少為0.65，更好至少為0.70，較佳至少為0.75，更佳至少為0.80，且最佳至少為0.85。
「非常高度的診斷正確性」一詞，意指試驗或檢驗其中AUC(用於試驗或檢驗之ROC曲線下的面積)至少為0.80，較好至少為0.85，更好至少為0.875，較佳至少為0.90，更佳至少為0.925，且最佳至少為0.95。
任何試驗的預測值視試驗的敏感度和專一性，以及被試驗群體之病狀流行程度而定。這項根據貝氏定理(Bayes' Theorem)的概念提出被篩檢的病狀存在於個體或在群體中(試驗前機率)的可能愈大，陽性試驗的確實性就愈大並且該結果為真陽性的可能就愈大。因此，利用一項試驗在病狀存在可能性低之任何群組中的問題是陽性結果的價值受限(亦即更有可能為假陽性)。相似地，在具有非常高風險的群體之中，陰性試驗結果較可能為假陰性。
因此，ROC和AUC臨床使用在低疾病流行程度之被試群體(被定義成每年少於1%比例之發生率，或一段指定時間範圍內少於10%的累積流行率)所進行的試驗上可能會造成誤導。或者，在本說明書之他處所定義之絕對風險與相對風險可被採用於測定臨床使用程度。待試驗的實驗對象亦可用試驗之測量值被分類成四分位數，其中最頂的四分之一(25%的群體)包含具有對醫療無反應之最高 相對風險的實驗對象群組，而最底的四分之一包含具有對醫療無反應之最低相對風險的實驗對象群組。一般而言，具有超過低流行率群體中最頂到最底四分位數2.5倍相對風險之試驗或檢驗數值，被認為具有「高度的診斷正確性」，且具有相對於每一四分位數5倍到7倍之相對風險的數值則被認為具有「非常高度的診斷正確性」，但是，僅具每一四分位數1.2到2.5倍相對風險的試驗或檢驗數值仍然在臨床上有用且被廣泛使用作疾病的風險因子；如同利用總膽固醇並對於許多發炎的生物標記在其預測未來狀況方面的案例。經常此種低診斷正確性的試驗必須與另外的參數合併以得到醫療介入上有意義的臨床閾值，這是使用先前之整體風險推估指數來達成的。
健康經濟效用函數是另一項測量某一試驗的性能和臨床價值的工具，包括根據對每一試驗臨床和經濟價值的實際測量來權衡可能的分類試驗結果價值。健康經濟性能與正確性緊密相關，因為健康經濟效用函數特定指派給正確分類的好處以及錯誤分類受試對象的成本一個經濟數值。作為一項性能測量，吾人需要一種試驗以達到某一程度的性能並非不尋常，亦即使每一試驗的健康經濟數值增加(在測試成本之前)超過該試驗之目標價格。
臨床演算法之建構
吾人可使用任何公式將結果合併成對本發明之實行有用的指標。如以上指示而並非作為限制地，此種指標在各種其他指標當中可以指示出對美他多辛反應的或然率、可能性、絕對或相對機會。這可能是對特定時間區段或範圍，或對餘命風險的指示，或僅只是提供相對於任何參考用之實驗對象群體的指標。
雖然本說明說中說明了各種較佳公式，但是本說明書中所提到和以上定義以外的數種其他模型與公式的型式卻是熟習本技藝者所詳知的。所使用的確切模型之型式或公式本身可依據其在訓練群體中結果的性能與準確度特徵選自可能的模型領域。較佳的公式包括廣大類別的統計分類演算法，且由其是使用判別分析。判別分析的目標是要從先前鑑認的一系列特性中預測出各類成員。在線性判 別分析(LDA)的情形中，係將特徵的線性組合鑑別出來，該分析可藉由某些論據而使群組間的分離最大化。對於LDA可利用不同閾值之以特徵基因為依據的方法(ELDA)或以多變量變異數分析(MANOVA)為依據的步進演算法來鑑認其特徵。可實行向前、向後、以及步進的演算法使根據Hotelling-Lawley統計學之未分離的或然率減到最小。
特徵基因線性判別分析(ELDA)(ELDA)一項由Shen等人(2006年)研發出的特徵挑選技術。該公式利用經修改過的特徵分析去鑑別與最重要的特徵向量關聯的特徵以求在多變量變異數的架構中挑選出特性(例如，生物標記)。「重要的」被定義成那些能解釋試樣差異中之大多數分歧的特徵向量，其中之試樣正試圖相對於某些閾值做分類。
支持向量機器(SVM)是一種試圖找尋將兩個類別切分之超平面的分類公式。此種超平面包含了支持向量、就位在該超平面邊界距離的數據點。在目前數據範圍未有切分超平面存在的可能情況之中，對原始變異數採非線性函數處理使數據投射到更大範圍會使維度大大地被擴充(Venables和Ripley,2002年)。雖然並不需要，但是對SVM進行特徵過濾通常會改善預測情形。用於支持向量機器的特徵(例如，生物標記)可利用非參數的Kruskal-Wallis(KW)試驗選出最佳的單變量特徵而被鑑認出來。隨機森林(RF，Breiman,2001年)或遞歸分割樹(RPART，Breiman等人，1984年)亦可被分開或合併使用以鑑認最重要的生物標記組合。KW和RF都需要從全部數據中挑選出數個特徵。RPART係利用一個次系列的可獲得生物標記來產生單一的分類樹。
在提報到預測公式之前可使用其他公式預先處理個別的ERK和/或Akt磷酸化測量結果以使其成為更有價值的資訊形式。最值得注意的是，利用常見數學轉換法如對數或邏輯函數、正規的或其他分布位置、相關於群體的平均值等任一方式使生物標記的結果正規化對於熟習本技藝者均為詳知者。特別有趣的是根據臨床參數如年齡、性別、種族、或性的一系列正規化結果，其中特定公式被單獨用 在一類實驗對象之中或是連續地合併一項臨床參數成為一項輸入值。在其他案例中，以分析物為依據的生物標記可以合併成經過計算的變量，該變量則緊接著被提報到一個公式。
除了可能已被正規化之實驗對象的個別參數值以外，對於所有實驗對象、或任何以之類別對象之完整預測公式本身可以被再校正或者根據群體之預期流行率以及平均生物標記參數值之調整另行調整，此係根據D'Agostino等人，(2001年)在JAMA第286期：第180-187頁列出的技術，或是其他相似的正規化和再校正技術。此種流行病學的調整統計學可經由連續透過提報給模型之以往登記的數據，其可能是機器可讀或不可讀的，或者經常透過追溯性的質問既已貯存的試樣或參考此種參數與統計學的歷史性研究而被捕獲、確認、改進與更新。另外的可能為公式再校正或其他調整之對象的實例包括被Pepe,M.S.等人，2004年用於勝算比之限制；Cook,N.R.,2007年關於ROC曲線之研究的統計學。最後，一項分類者公式本身的數字結果可藉由其參照實際的臨床群體和研究結果以及觀察到的端點經後處理轉化，以求較正成為絕對風險並對分類者或風險公式之變化的數字結果提供信賴區間。這方面的一個實例是在位於美國加州紅木市(Redwood City)的基因組健康公司(Genomic Health,Inc)的Oncotype Dx產品中提供利用實際的臨床研究、參考疾病復發之計分公式輸出值所得到的絕對風險，以及該風險的信賴區間。進一步的改進是對較小的研究次群作調整，該研究是依據分類者或風險公式輸出值並且由該次群的臨床參數，如年齡或性別加以定義和挑選。
實施例
實施例1：一般方法
本說明書所說明的實例是利用一般說明如下的試劑進行的。
實驗用動物
Fmr1剔除鼠(KO2)小鼠(荷蘭-比利時X染色體脆折症聯盟，1994年)，最初係得自傑克森實驗室，並且野生型(WT)的同 窩出生者是以C57BL/6J背景產生並且重複回交到C57BL/6J背景經八代以上。Fmr1剔除鼠以相同的基因型居住在一溫度和濕度經控制而具有12小時明暗循環交替的房間(光照是從早上7點到晚上7點；試驗是在光照期間進行的)。在該保存室中室溫與濕度被連續記錄而食物和水是隨意可取得的。試驗是在健康的Fmr1剔除鼠和其野生型的同窩出生小鼠身上進行(N=10隻小鼠每一試驗處理組)，在行為實驗的期間鼠齡為2或6個月大。使小鼠飼養在市售的塑膠籠中並且實驗是以一九八六年，英國動物(科學程序)保護法[UK Animals(Scientific Procedures)Act,1986]要求一致的方法進行的。所有實驗均由對基因型和施藥小鼠完全不知的實驗操作進行。在實行任何實驗之前，動物被容許有一週的最低環境適應期間。在環境適應期不施予任何預防的或治療性的處理。
藥物
對於研究1(實施例2)而言，將美他多辛溶解在鹽水中並以每天一次100,150或200mg/kg的劑量腹膜內施用七天。對於研究2(實施例3)體內試驗而言，將美他多辛溶解在鹽水中並以每天150mg/kg劑量進行腹膜內施用，或以150或300mg/kg/每天(體積0.1ml)的口服劑量施用七天。對於研究2體外試驗而言，以300μM的美他多辛濃度施用5小時。在所有情形中，使用鹽水作為運輸劑(對照組)。
行為試驗
社交與社會認知記憶：小鼠是一種社會動物，其忙於容易被吾人記分的社會行為，包括：靠近、跟隨、嗅聞、修飾、積極的衝突、性互動、養育行為、築窩，和群體擠在一團的睡。小鼠的社會取向是藉由對新進小鼠的嗅聞時間來評估。
將小鼠放置在一個數量級大小如同成鼠住籠的試驗活動場所/籠子中(40x23x12cm的籠子，有一個帕斯佩有機玻璃蓋(Perspex lid)能輔助觀察小鼠，且有新鮮的木屑在地板上。小鼠的背景氣味是在試驗前把某些未實驗小鼠放入該裝置中所製造的。試驗前將 小鼠移入該實驗空間經10-15分鐘。把試驗對象和一個初生鼠同時放入試驗的籠子裡。吾人對於被試驗小鼠之社會性探究的總時間與回數進行3分鐘評估，該探究係以其嗅聞和靠近的跟隨(與尾巴距離<2cm)用以刺激之初生鼠作定義。收集的數據參數是獲取和認知的總時間和總嗅聞回數。吾人得到之社會記憶比率被定義為試驗2/試驗1+2。因此，沒有記憶是例如20/(20+20)=0.5和有記憶試例如10/(20+10)=<0.5。
Y-迷宮交替：兩項工作被執行。第一件事不經學習的評估自發性在兩個臂狀入口之間作改變。第二件工作是空間的參考記憶任務，其中該動物必須學習兩個臂狀入口中何者有食物報償作為誘餌。在開始訓練的前一天，讓老師自由的探索迷宮5分鐘。接著，他們接受兩項測試，一項中食物位在左臂且另一項中食物位在右臂。
這個程序是防止對於兩臂之一者產生偏好
Y-迷宮水迷宮：使一個透明的Perspex Y-迷宮充滿20℃的水2cm。這驅使小鼠在涉水到位於一臂之遠端出口管子後離開迷宮。將此迷宮置放到被顯著的可見線索環繞之房間中央。
報償性之T迷宮替換：使用一個升高的或圍起來的T型裝置(水平放置)。將小鼠置放在T裝置底部並容許其選擇鄰接另一幹道末端的目標臂彎。迅速連續的進行兩項測試，第二項測試需要小鼠選擇先前未曾造訪的臂彎，反應對第一個選擇的記憶(自發的替換)。這種傾向會因使動物飢餓和若它做到替換時給它較佳的食物報償而增強。特定言之，在對於T-迷宮熟悉的四天期間後，小鼠被訓練能替換對臂彎的選擇而獲得煉乳作為酬償。
連續的小徑：該裝置由上漆的木料置作的四個連續安排成直線、漸增性地產生焦慮的小徑(每一連續的小徑被漆成較淡的顏色，具有較低的牆壁和/或比先前小徑較窄)。每一段落或小徑為25公分長。1號小徑具有25cm高的牆壁，8.5cm寬，並且被漆成黑色。下型0.5cm就到2號小徑，又是8.5cm寬，但是具有1.3cm高的牆壁和被漆成灰色。下行1.0cm就到3號小徑，其3.5cm寬，具有0.8cm 高的牆壁和被漆成白色。下行0.4cm就到4號小徑，亦為白色，但卻寬1.2公分並且牆高0.2公分。把1號小徑的背面固定到一個50cm高的支架上以使裝置升高。在3浩瀚4號臂彎下提供墊子以防小鼠摔落。將每一小鼠置放在面向牆壁之1號小徑封閉端。啟動計時器1)以計得試驗的總時間(5min)加上進到每一臂彎的潛伏時間，2)計得在1號小徑所花的時間。當小鼠的四腳都被放在下一個小徑上時，吾人就認定它已經進入該小徑。記錄每一小徑所花的總時間(全部四隻腳都在內)。
海馬迴依賴型環境恐懼制約：在恐懼制約實驗中，將小鼠放入一個新的環境中(黑箱)並且接收配對的暗示與足部電擊(0.2mA經1秒(研究1)或0.7mA經0.5秒sec(研究2)。緊接著，當以原先的訓練內容試驗時，小鼠表現出天然的防衛反應稱作凍僵[freezing](Blanchard，1969)或海馬迴依賴型環境恐懼制約。凍僵時間定義為小鼠除了呼吸之外花在定住不動之行為上的時間。該數據被表次成試驗期間的百分比。訓練期間之後的24小時，在試驗箱中以無驚嚇的外觀環境試驗測試小鼠5分鐘並觀察其凍僵行為。
統計學：採用對於變化進行的多重變因分析來跨數據的評估群組差異。對行為數據作重複性的測量ANOVA。在每一ANOVA中之統計學上顯著的影響被接著用事後比較(Post hoc Comparison)處理，係使用Newman-Keuls試驗(研究1)或使用Tukey試驗(研究2)進行。少於0.05的p-值被認為是顯著的。
生化試驗
磷酸化的ERK和Akt：Ras-Mek-ERK和PI3K-Akt-mToR信號發送途徑涉及調節突觸可塑性變化下基因轉錄中視活性而定的變更(Klann和Dever，2004年)。磷酸化的ERK和Akt蛋白質表顯係藉由如先前Lopez Verrilli(Lopez Verrilli等人，2009年)說明的西方墨點分析測量的。所採用的抗體是對抗Akt(1/1000)和激酶(ERK)1/2(1/2000)(細胞信號發送技術〔Cell Signaling Technology〕，位於美國麻州丹福市)。對抗磷酸化-ERK的抗體係偵 測磷酸化-ERK1/2(Thr202/Tyr204)的磷酸化作用，而對磷酸化-Akt的抗體則偵測磷酸化-Akt(Thr308)的磷酸化作用。全部Akt和ERK1/2蛋白質與磷酸化的ERK和Akt的含量係由具有抗磷酸化Akt(1/1000)和抗磷酸化ERK抗體(1/2000)的墨點法薄膜(細胞信號發送技術〔Cell Signaling Technology〕，位於美國麻州丹福市)評估的。Akt或ERK磷酸反應被正規化成為同一試樣中的蛋白質含量並且表是為相對於基礎條件的變化%，基礎含量被視為100%。以帶有β-肌動蛋白抗體(1/1000)(希格瑪-阿爾區公司[Sigma-Aldrich]出品，位於美國密蘇里州的聖路易市)的條狀再墨點薄膜來評估所裝載的蛋白質。血液的淋巴球中磷酸化ERK和Akt蛋白質之表現係藉由流動細胞計數法來測量。為了進行淋巴球生物標記測定，使用具有波長調整在488nm之激發雷射的FACStar plus儀器(Becton Dickinson)並經過一個515-545nm窄帶濾光片收集得自FITC(GST)的綠色螢光。相對於參考細胞的螢光值計算平均FITC螢光強度。平均螢光強度(MFI)直接正比於每個細胞所結合的Ab分子之平均數目。
神經元的形態學：從17.5個懷孕胚胎日(E17.5)的野生型和Fmr1 KO致命小鼠製備海馬迴細胞培養物。用頸椎脫臼法殺死小鼠並且將分離的海馬迴細胞分盤到15mm多孔容器中(Falcon Primaria公司出品)。體外五天之後，用綠色螢光蛋白質(GFP)轉移感染以輔助監測藥物處理後樹突之刺突形態發生(Ethell和Yamaguchi，1999年；Ethell等人，2001年，Henkemeyer等人，2003年)。樹突小棘在體外16天(DIV)左右形成。在第17天用300μM濃度的美他多辛體外處理培養物經5小時。
GFP轉移感染的神經元之絲狀偽足密度是藉著對堆疊的蔡司(Zeiss)共焦顯微鏡產生的影像(40×物鏡，20×0.2μm堆疊)進行修爾(Sholl)分析來定量的。利用Metamorph軟體，每一神經元的細胞體周圍畫出同中心之均等分隔開的圓圈(每一者為20μm)，並且緊接著計算出每一個圓圈中絲狀偽足的數量。將平均數量與不成對的雙尾學生T-試驗作比較。
GFP轉移感染的神經元之刺突成熟度是用Metamorph軟體(Molecular Devices公司，位於加州Sunnyvale市)進行分析的。對每一神經元挑出兩個70-100μm長的末梢樹突片段已進行形態量測分析。對每一刺突進行長度與寬度的測量。長度被定義成從突出物底部到尖端的距離；而寬度被定義成與刺突的長軸垂直的最大距離。將測量結果與不成對的雙尾學生T-試驗作比較並且進行ANOVA校正以便用於多重比較。
從頭的(de novo)海馬迴蛋白質合成：從六週大的Fmr1剔除鼠和WT鼠取得橫向海馬迴切片(400μm)。如先前說明使用非放射性之以螢光激發細胞分類為基礎的檢驗、轉譯之表面感測法(SUnSET)進行蛋白質合成檢驗，該方法容許監測和定量個別哺乳動物細胞中和異源細胞群中總體之蛋白質合成(Hoeffer，2011年)。在本研究中所使用的美他多辛濃度為300μM。
實施例2：美他多辛(100到200mg/kg)處理對於X染色體脆折症候群之Fmr1剔除鼠模型之學習與記憶不足和生化異常之影響(研究1)行為分析
海馬迴依賴型環境恐懼制約：初始的實驗試驗在N=10的WT和Fmr1剔除鼠體內以每天腹膜內施用一次運輸劑或150mg/kg美他多辛經過七天對於海馬迴依賴型環境恐懼制約的影響。運輸劑處理的Fmr1剔除鼠顯示在海馬迴依賴型環境恐懼制約範例中有學習不足，如其在試驗期間凍僵反應減少所反應的結果(圖1，長條圖A(p<0.0001))。美他多辛的施用逆轉了Fmr1剔除鼠之學習不足的效應，這種逆轉是不完全的，因而使得美他多辛處理的動物異於美他多辛處理的WT動物(p<0.05)。本實驗的複製實驗研究腹膜內施用運輸劑、100或200mg/kg美他多辛每天一次且經歷七天，對於N=10的WT和Fmr1剔除鼠群組之海馬迴依賴型環境恐懼制約的劑量相依性影響(圖1，長條圖s Band C)。本實驗中運輸劑處理的Fmr1剔除鼠與複製第一項實驗之運輸劑處理的WT小鼠相比顯示出學習不足(p<0.0001)。100mg/kg美他多辛在Fmr1剔除鼠體內產生學習不足之 逆轉現象(P<0.05)，但這是一種不完全的逆轉，因為美他多辛處理的Fmr1剔除鼠不同於美他多辛處理的野生型小鼠(p<0.0001)。在Fmr1剔除鼠身上見到的學習不足在腹膜內使用200mg/kg美他多辛處理之後完全逆轉(經處理的Fmr1小鼠不同於運輸劑處理的Fmr1剔除鼠(P<0.0001)但是並沒有不同於美他多辛處理的WT mice)。美他多辛處理在任一實驗中對於WT小鼠都沒有影響(圖1，長條圖A-C)。
社會取向：運輸劑處理的Fmr1剔除鼠顯示較少社會取向，如嗅聞回數的指標顯示(圖2(p<0.0001))。每天一次腹膜內施用150mg/kg美他多辛經七天會增加Fmr1剔除鼠的社會取向(p<0.0001，與運輸劑處理的Fmr1剔除鼠相比)。用美他多辛處理的Fmr1剔除鼠不同於美他多辛處理的WT小鼠(p<0.05)，雖然有一種靠近WT小鼠趨勢。美他多辛處理對WT小鼠沒有影響。
Y-迷宮自發性替換：在N=10的WT或Fmr1剔除鼠體內每天一次以運輸劑或150mg/kg美他多辛處理七天對於自發性替換的影響顯示於圖3，長條圖A中。運輸劑處理的Fmr1剔除鼠比運輸劑處理的WT小鼠顯示較少自發性替換(p<0.0001)。美他多辛處理比運輸劑處理在Fmr1剔除鼠會增加自發性替換，雖然美他多辛處理的Fmr1剔除鼠與美他多辛處理的WT小鼠相比顯示出不足(p<0.01)。因此美他多辛產生部分逆轉在Fmr1剔除鼠身上見到的不足。
Y-迷宮參考記憶任務：在N=10的WT或Fmr1剔除鼠體內每天一次以運輸劑或150mg/kg美他多辛處理七天對於報償性的參考記憶學習的影響顯示於圖3，長條圖B中。運輸劑處理的Fmr1剔除鼠比運輸劑處理的WT小鼠較少達到正確的臂彎入口(p<0.0001)。與運輸劑處理的Fmr1剔除鼠相比，使得美他多辛處理的Fmr1剔除鼠與美他多辛處理WT小鼠沒有不同。美他多辛處理對WT小鼠沒有影響。
Y-迷宮水迷宮左右識別：在N=10的WT或Fmr1剔除鼠中每天一次以運輸劑或150mg/kg美他多辛處理七天對於不願意被驅動的空間識別學習之影響顯示在圖3，長條圖C中。運輸劑處 理的Fmr1剔除鼠比運輸劑處理的WT小鼠顯示較多次數不正確的臂彎入口。此種不足因美他多辛處理而降低。
T-迷宮報償性替換任務：在N=10的WT或Fmr1剔除鼠體內每天一次以運輸劑或150mg/kg美他多辛處理七天對於報償性替換工作記憶的影響顯示於圖4。與運輸劑處理的WT小鼠相比，運輸劑處理的Fmr1剔除鼠顯示較大的潛因去到達正確的臂彎(p<0.0001)。在Fmr1剔除鼠身上美他多辛處理會比運輸劑處理減低這種不足(p<0.0001)，這種逆轉是部分的，因為美他多辛處理的Fmr1剔除鼠的反應要比WT小鼠來得慢(p<0.0001)。
連續小徑：在N=10的WT或Fmr1剔除鼠體內每天以運輸劑或150mg/kg美他多辛處理七天對於在連續小徑任務之行為表現的影響顯示在圖5中並且進一步說明如下。
連續小徑試驗有效的測量焦慮(進入小徑1的潛因)和過動(小徑2到4)。從小徑1通過連續小徑2、3、和4的行進與暴露在顏色鮮明度逐漸增加的環境而牆高逐漸降低和變窄，更為暴露的開放臂彎相關聯。到開放臂彎所花的時間和所進的入口指示出焦慮；相反的，在更多開放臂彎所花的時間增加則反應過動。這些因素容許吾人圈定一個似焦慮行為與過動的範圍來做敏感度的試驗。
小徑1：Fmr1剔除鼠要比WT小鼠顯示更多焦慮(p<0.001)。用美他多辛處理的Fmr1剔除鼠與運輸劑處理的Fmr1剔除鼠相比顯示焦慮改善(p<0.001)，因此產生完全正常化。美他多辛處理的Fmr1剔除和美他多辛處理的WT小鼠之間沒有任何差異。而且，美他多辛處理對於WT小鼠沒有影響。
小徑2：在與Fmr1剔除鼠比較時，WT小鼠在小徑2顯示較低的活性(p<0.0001)。用美他多辛處理降低在Fmr1剔除鼠身上的過動(p<0.001)，雖然這種過動的逆轉是部分的，因為美他多辛處理的Fmr1剔除和WT小鼠不同(p<0.001)。美他多辛處理對於WT小鼠沒有影響。
小徑3：Fmr1剔除鼠與WT小鼠相比顯示過動(p<0.0001)。這種過動不會被美他多辛逆轉，因為美他多辛處理的Fmr1剔除鼠與運輸劑處理的Fmr1剔除鼠並無不同。美他多辛處理對於WT小鼠沒有影響。
小徑4：Fmr1剔除鼠與WT小鼠相比顯示過動(p<0.01).美他多辛處理逆轉此種過動因為美他多辛處理的Fmr1剔除鼠比運輸劑處理的Fmr1剔除鼠相比顯示較低的活動力(p<0.01)。這種影響反應出正常化，因為美他多辛處理的Fmr1剔除鼠與美他多辛處理的WT小鼠並無不同。美他多辛處理對於WT小鼠沒有影響。
整體而言，吾人不希望受限於理論，連續的小徑試驗顯示剔除鼠與WT小鼠相比其焦慮與過動增加。美他多辛處理在Fmr1剔除鼠降低此種焦慮和過動而使WT小鼠不受影響。
生化分析
ERK和Akt的磷酸化：在N=5Fmr1剔除鼠或WT小鼠身上每天一次以運輸劑或150mg/kg美他多辛腹膜內進行處理對腦內全腦ERK或Akt磷酸化顯示於圖6中。磷酸化的程度係以磷酸化ERK相對於總共ERK的比率來作評估。增加的比率指出ERK被活化。相較於運輸劑對照組，運輸劑處理的Fmr1剔除鼠的ERK磷酸化增加(p<0.001)-此種影響複製了在罹患X染色體脆折症候群的人類實驗對象身上所見到的ERK之異常活化。(Wang等人，2012年)。這種影響會因美他多辛處理而減低(p<0.01)使得與美他多辛處理的WT小鼠相比沒有差異。美他多辛在WT小鼠體內對ERK的磷酸化沒有影響或在所有小鼠體內對總ERK的量沒有影響。運輸劑處理的Fmr1剔除鼠和運輸劑處理的WT小鼠相比，磷酸化的Akt相對於AKT總量的比率亦增加(p<0.0001)。用美他多辛處理會降低Fmr1剔除鼠磷酸化Akt的相對量(p<0.01)，使得Fmr1剔除鼠與對照組沒有不同。美他多辛處理對WT小鼠沒有影響，或對任何小鼠的總Akt量沒有影響。
實施例3：美他多辛在Fmr1剔除之X染色體脆折症小鼠模型上的評估(研究2) 美他多辛對六個月大剔除鼠的行為影響
海馬迴依賴型環境恐懼制約：一項初始實驗試驗在六個月大N=10的WT和Fmr1剔除鼠群組身上每日一次腹膜內施用運輸劑或150mg/kg美他多辛經七日對海馬迴依賴型環境恐懼制約的影響。與運輸劑處理的WT小鼠(WT-V)比較，運輸劑處理的Fmr1剔除鼠(KO-V)顯示在海馬迴依賴型環境恐懼制約範例中有學習不足，這是在試驗期間凍僵減少反應的結果(圖7(p<0.0001))。美他多辛的施用能逆轉Fmr1剔除鼠學習不足的結果(p<0.0001 KO-M-150相對於KO-V)。這是一個完全逆轉，因此美他多辛處理的KO小鼠不同於美他多辛處理的WT小鼠。
社會取向與社會記憶：社會取向數據(起始的試驗1)顯示在圖8，長條圖A(嗅聞回數)和長條圖C(在嗅聞期間)。社會記憶數據(在試驗1之後試驗2,24小時)顯示在圖8，長條圖B(嗅聞回數)和長條圖D(在嗅聞期間)。這些結果進而在以下作討論。
在試驗1的期間，與WT小鼠相比較，Fmr1剔除鼠顯示嗅聞回數增加(p<0.0001)(請參考圖8，長條圖A)和嗅聞時間減少(p<0.0001)(請參考圖8，長條圖C)。這些社會互動缺乏與那些被其他研究者所報導的Fmr1剔除鼠結果一致(Thomas等人，2011年).。對於嗅聞回數與時間兩者，美他多辛的治療在Fmr1剔除鼠會產生異常行為的逆轉(p<0.0001，KO-M-150相對於KO-V，對每一者而言[嗅聞回數與時間])，因此對於嗅聞回數的測量，美他多辛處理的Fmr1剔除鼠與美他多辛處理的WT小鼠並無不同。儘管嗅聞時間的測量顯示出狀況解救，但是這種結果是局部的，因為在美他多辛治療之後，與WT小鼠相比較，Fmr1剔除鼠仍保持相異(p<0.05)。美他多辛對於WT小鼠沒有作用。這些結果顯示在Fmr1剔除鼠身上的不正常社會取向行為能被美他多辛解救。
在試驗2期間，Fmr1剔除鼠顯示出與野生型小鼠作比較，嗅聞回數增加和嗅聞時間增加(p<0.0001，對於每一測量，分別對於圖8，長條圖B與D)。這樣的結果反應出不習慣，因此有社會記憶不足的狀況。美他多辛治療會降低這些差異(p<0.0001，KO-M-150相對於KO-V)。這些嗅聞次數逆轉是局部的，因為在美他多辛處理的Fmr1剔除鼠和美他多辛處理的WT小鼠之間保持互異之處(p<0.05)。這種美他多辛造成的逆轉對於嗅聞時間而言是全面的，因為在美他多辛處理的Fmr1剔除鼠和美他多辛處理的WT小鼠之間未觀察到差異。美他多辛處理對WT小鼠沒有作用。這些數據顯示美他多辛會降低Fmr1剔除鼠的社會記憶缺損。此種社會記憶不足降低藉由計算社會記憶比率(說明於實施例1中)於以下作說明：社會記憶比率定義為嗅聞回次的經歷時間：試驗2/試驗1+2。因此，沒有記憶的實例為例如20/(20+20)=0.5，而有記憶的實例為例如10/(20+10)=<0.5。
計算出的社會記憶比率如以下：WT-V試驗2/試驗1+試驗2：12.4/12.4+26.8=0.3,<0.5有記憶
KO-V試驗2/試驗1+試驗2：325/325+24.1=0.9，沒有記憶
WT-M試驗2/試驗1+試驗2：12.5/38.5+12.5=0.2,<0.5有記憶
KO-M試驗2/試驗1+試驗2：12.7/28.4+12.7=0.3,<0.5有記憶
美他多辛在六個月大Fmr1剔除鼠的生化作用
在以上說明的行為試驗之後，在N=10的Fmr1剔除鼠或WT小鼠體內以每天一次腹膜內施用運輸劑或150mg/kg美他多辛經過七天對於全腦pERK(圖9，長條圖A)和腦中pAkt(圖9，長條圖B)的影響顯示在圖9中。特定而言，圖9，長條圖A顯示與先前實驗中所見到的WT小鼠相比較，Fmr1剔除鼠腦的pAkt量增加(P<0.0001)。用美他多辛處理會逆轉此種腦內pAkt量增加(p<0.0001，對於KO-M-150相對於KO-V)，因此美他多辛處理的Fmr1剔除鼠並未不同於美他多辛處理的WT小鼠。圖9，長條圖B顯示與先前實驗中所見到的WT小鼠相比較，Fmr1剔除鼠腦的pERK量(p<0.0001，對於 KO-M-150相對於KO-V)。此種增加會因美他多辛處理而逆轉(p<0.0001)，因此美他多辛處理的Fmr1剔除鼠並未不同於美他多辛處理的WT小鼠。
腹膜內或口服施用之後美他多辛對兩個月大小鼠的行為影響
圖10顯示每天一次腹膜內150mg/kg或是口服150mg/kg或300mg/kg的劑量施用美他多辛經過七天對於兩個月大的Fmr1剔除鼠與WT小鼠之海馬迴依賴型環境恐懼制約的影響。特定言之，圖10，長條圖A顯示腹膜內或口服施用運輸劑之後得自Fmr1剔除鼠與WT小鼠之海馬迴依賴型環境恐懼制約數據。沒有見到任何與運輸劑施用途徑相關連的差異。在腹膜內和口服途經施用運輸劑之後，Fmr1剔除鼠與WT小鼠相比較顯示其凍僵行為減低(在每一情形中p<0.0001)。圖10，長條圖B顯示經由兩種途徑對WT小鼠進行美他多辛處理的影響。沒有發現任何作用。圖10，長條圖C顯示腹膜內150mg/kg或是口服150mg/kg或300mg/kg的劑量在Fmr1剔除鼠進行美他多辛處理會逆轉在Fmr1剔除鼠身上見到的凍僵行為減少(p<0.01,p<0.0001，和p<0.0001，分別對於KO-M-ip,KO-M-po150，和KO-M-po300相對於KO-V-ip以及KO-Vpo)。這些口服施用150mg/kg美他多辛的影響並未不同於口服施用300mg/kg美他多辛的影響。在Fmr1剔除鼠口服施用150mg/kg和300mg/kg美他多辛的影響並未不同於腹膜內施用150mg/kg美他多辛的影響。在每一情形之中，該逆轉次完全的，因為美他多辛處理的Fmr1剔除鼠並未不同於美他多辛處理的WT小鼠。
圖11顯示每天一次以腹膜內150mg/kg或是口服150mg/kg或300mg/kg的劑量施用美他多辛經七日對於Fmr1剔除鼠和WT小鼠之社會取向和社會記憶的影響。特定言之，圖11，長條圖A顯示以腹膜內150mg/kg或是口服150mg/kg或300mg/kg的劑量施用運輸劑或美他多辛對於Fmr1剔除鼠和WT小鼠之社會取向行為的影響。在After腹膜內或口服施用運輸劑之後，與WT小鼠相比較，Fmr1剔除鼠之嗅聞行為經歷時間降低(對每一者p<0.0001)。以任何劑 量進行美他多辛處理對WT小鼠都沒有影響。然而，以腹膜內150mg/kg或是口服150mg/kg或300mg/kg進行美他多辛處理會在Fmr1剔除鼠身上觀察到社會取向不足之逆轉產生(p<0.0001，分別對於KO-M-po150和KO-M-po300相對於KO-V po)。在150mg/kg和300mg/kg口服美他多辛的影響與劑量不相依。這種逆轉是全面的，因為美他多辛處理的Fmr1剔除鼠與美他多辛處理的WT小鼠並無不同。150mg/kg腹膜內美他多辛在Fmr1剔除鼠的影響並未不同於150mg/kg口服或300mg/kg口服美他多辛的影響。圖11，長條圖B顯示腹膜內150mg/kg或是口服150mg/kg或300mg/kg運輸劑或美他多辛在Fmr1剔除鼠或WT小鼠身上對於社會記憶的影響。腹膜內或口服運輸劑之後，與WT小鼠相比較，Fmr1剔除鼠的嗅聞行為的經歷時間會增加(對每一者p<0.0001)。美他多辛以任何劑量處理對WT小鼠都沒有影響。然而，以腹膜內150mg/kg或是口服150mg/kg或300mg/kg美他多辛處理會對Fmr1剔除鼠身上觀察到的社會取向不足產生逆轉影響(p<0.0001,p<0.05，和p<0.01分別是對KO-M-ip150,KO-M-po150，和KO-M-po 300相對於KO-V-ip和KO-V po)。此種逆轉是全面的，因為美他多辛處理的Fmr1剔除鼠與美他多辛處理的WT小鼠並無差異。在Fmr1剔除鼠以150mg/kg腹膜內施用美他多辛的影響並未不同於150mg/kg口服或300mg/kg口服美他多辛的影響。而且在150mg/kg和300mg/kg口服美他多辛的影響與劑量不相依。
在兩個月大的小鼠身上以腹膜內或口服施用後美他多辛對於生化標記的影響
周圍血液淋巴球：圖12顯示以150mg/kg腹膜內或150mg/kg和300mg/kg口服方式每天一次施用美他多辛經七天對於淋巴球pAkt(圖12，長條圖A)和pERK(圖12，長條圖B)的影響，此影響係以流動式細胞儀在兩個月大的Fmr1剔除鼠和WT小鼠身上測得。特定言之，圖12，長條圖A顯示運輸劑處理的Fmr1剔除鼠相較於接受同量運輸劑處理的WT小鼠展現其淋巴球Akt的磷酸化增加(對於 腹膜內施用和口服兩者均為p<0.0001)。以150mg/kg腹膜內或150mg/kg和300mg/kg口服方式每天一次施用美他多辛經七天使過度反應的Akt正規化，使得pAkt含量在美他多辛處理的Fmr1剔除鼠和接受相同處理的WT小鼠之間並無差異。圖12，長條圖B顯示運輸劑處理的Fmr1剔除鼠與接受等量運輸劑處理的WT小鼠相較，顯示其淋巴球ERK的磷酸化增加(對於腹膜內和口服施用均為p<0.0001)。以150mg/kg腹膜內或150mg/kg和300mg/kg口服方式每天一次施用美他多辛經七天使過度反應的ERK正規化，使得pERK含量在美他多辛處理的Fmr1剔除鼠和接受相同處理的WT小鼠之間並無差異。
腦區域：圖13顯示施用150mg/kg美他多辛經七天對於海馬迴、前額葉皮質和紋狀體中pERK含量的影響。pERK含量在Fmr1剔除鼠與WT小鼠在所有三個腦區相比較均增加(p<0.0001在所有的情形中)。pERK含量在美他多辛處理的Fmr1剔除鼠與運輸劑處理的Fmr1剔除鼠相較下均為減少(p<0.0001在所有的情形之中)。在海馬迴和紋狀體中KO-M和WT-M群組之間沒有差異，這顯示ERK的活化完全逆轉。這種影響在前額葉皮脂是部分發生的，KO-V和KO-M群組保持其差異(p<0.05)。美他多辛對WT小鼠沒有影響。
圖14顯示施用150mg/kg美他多辛七天對於海馬迴、前額葉皮質和紋狀體中pAkt含量的影響。pAkt含量在Fmr1剔除鼠與WT小鼠在所有三個腦區相比較均增加(p<0.0001在所有的情形之中)。pAkt含量在美他多辛處理的Fmr1剔除鼠與運輸劑處理的Fmr1剔除鼠在所有三個腦區相相較下均減少(p<0.0001在所有的情形之中)。在所有的情形中，KO-M和WT-M群組之間沒有差異，顯示Akt的活化完全逆轉。美他多辛對WT小鼠沒有作用。在腦和血液中增高的ERK和Akt磷酸化量降低與Fmr1剔除鼠改善的行為結果相關聯，這指出磷酸化含量就是美他多辛處理反應的生物標記。
美他多辛在體外對得自Fmr1剔除鼠之初代海馬迴神經元樹突的絲狀偽足密度與成熟度之影響
圖15(長條圖A-C)顯示用300μM美他多辛處理5小時的影響。將樹突分成10個長10μm的片段，每一段均依據其與細胞體的距離(由近到遠，由左到右)。在第3節中，Fmr1剔除鼠的神經元中刺突的密度相較於WT鼠神經元要增加。特定言之，圖15，長條圖A顯示神經元絲狀偽足的密度。得自Fmr1剔除鼠的初代海馬迴神經元展現增加的絲狀偽足密度(p<0.001)。用300μM美他多辛處理減少Fmr1剔除鼠神經元絲狀偽足異常增加(p<0.001)。Fmr1剔除鼠的神經元顯示絲狀偽足具有不成熟的特徵，其形狀較長(圖15，長條圖B(p<0.01))且較窄(圖15，長條圖C(p<0.01))。用美他多辛處理會逆轉此種絲狀偽足長度增加的情形(圖15，長條圖B(p<0.01))並且逆轉寬度減少的情形(圖15，長條圖C(p<0.001))。
美他多辛在對體外fmr1剔除鼠的海馬迴蛋白質從頭(de novo)合成之影響
圖16顯示運輸劑或300μM美他多辛處理對400μM得自fmr1剔除鼠或WT小鼠的海馬迴切片之基礎從頭蛋白質合成的影響。蛋白質合成在運輸劑處理的fmr1剔除鼠海馬迴要比運輸劑處理的WT對照組要來得高(p<0.0001)。美他多辛處理降低蛋白質在fmr1剔除鼠海馬迴中的合成速率。這種影響部分是因為得自fmr1剔除鼠海馬迴保留了比美他多辛處理的WT小鼠海馬迴要高的蛋白質合成速率(p<0.001)。

Claims (8)

  1. 一種評估美他多辛(metadoxine)治療方案在已接受美他多辛治療之患有X染色體脆折症候群或其他認知病症對象之效果的方法，其包括：a)測量得自對象之試樣中磷酸化的ERK和Akt蛋白質含量；b)測量試樣中ERK和Akt蛋白質的總量；c)計算步驟a)中測定之磷酸化的ERK和Akt蛋白質含量相對於步驟b)中測定之ERK和Akt蛋白質總量的比率；以及d)將步驟c)算出的比率與未患疾病之對象測出的計算比率相比較，其中當步驟c)的計算比率相似於未患疾病之對象之計算比率時，則指示出該治療是有效的。
  2. 一種測定罹患X染色體脆折症候群或其他認知病症的對象是否能從美他多辛治療方案獲利的方法，包括：a)測量得自對象之試樣中磷酸化的ERK和Akt蛋白質含量；b)測量試樣中ERK和Akt蛋白質的總量；c)計算步驟a)中測定之磷酸化的ERK和Akt蛋白質含量相對於步驟b)中測定之ERK和Akt蛋白質量的比率；以及d)將步驟c)算出的比率與未患疾病之對象測出的計算比率相比較，其中當步驟c)的計算比率高於未患疾病之對象之計算比率時，則指示出該對象會從美他多辛治療方案獲得好處。
  3. 一種在患有X染色體脆折症候群或其他認知疾病對象監測美他多辛治療方案之方法，包括：a)測量第一時段裡得自對象的第一試樣中磷酸化之ERK和Akt蛋白質的含量；b)測量第一時段裡第一試樣中ERK和Akt蛋白質的總量；c)計算步驟a)中測定之磷酸化的ERK和Akt蛋白質含量相對於步驟b)中測定之ERK和Akt蛋白質總量的第一比率；d)測量第二時段裡得自對象的第上試樣中磷酸化之ERK和Akt蛋白質的含量；e)測量第二時段裡第二試樣中ERK和Akt蛋白質的總量； f)計算步驟d)中測定之磷酸化的ERK和Akt蛋白質含量相對於步驟e)中測定之ERK和Akt蛋白質總量以產生第二比率；d)將第一比率與第二比率做比較。
  4. 根據申請專利範圍第3項的方法，其中當第二比率低於第一比率時，即指示該治療為有效。
  5. 根據前述申請專利範圍中任一項的方法，其中該測量步驟包括一項免疫檢驗。
  6. 根據前述申請專利範圍中任一項的方法，其中該試樣是全血或其部分物質。
  7. 根據前述申請專利範圍中任一項的方法，其中該試樣是周邊血液單核細胞(PBMC)。
  8. 根據申請專利範圍第7項的方法，其中PMBC是淋巴球或單核細胞。
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