CN101538558A - Aβ1-40重组腺病毒以及采用该病毒制作阿尔茨海默病模型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程领域，具体地说是提供了一种Aβ1－40重组腺病毒以及利用该重组腺病毒制作阿尔茨海默病模型的方法。本发明通过利用病毒高效表达及高效转染的特点，人工合成Aβ1－40，再以腺病毒为载体，构建Aβ1－40重组腺病毒(Ad Aβ1－40)，用Ad Aβ1－40来制作阿尔茨海默病动物模型。此模型的优点在于减少了以往Aβ1－40需要多次重复注射，成本高，有批间差异的缺点，而且行为学分析及病理表现优于常规的Aβ1－40制作的阿尔茨海默病动物模型。

Description

Aβ1-40重组腺病毒以及采用该病毒制作阿尔茨海默病模型的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种重组腺病毒及采用该病毒制作阿尔茨海默病模型的方法。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是一种病因未明的疾病，主要症状是智能的全面下降，导致生活能力的丧失，是导致老年人残疾的重要疾病之一。病因及发病机制尚不完全清楚，脑内特征性病理改变为老年斑(senile plaque，SP)、神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)及神经元丢失。这些损伤主要发生于前脑基底、海马和大脑皮质。对AD的最后诊断需要脑病理学的确诊，但目前没有办法在活体中进行，因此临床诊断主要根据症状学、病史、影像学，因此对AD的发生机制、药物研制带来极大的困难。建立理想的AD动物模型对探明AD的病因、病机和病理过程以及筛选防治AD新药至关重要。

目前常用的模型主要有转基因模型、Aβ注射模型等。但是在这些动物模型的制作中，存在以下几个问题：

1、基因模型具有一定的优势：脑病理变化与人类相似，可模拟AD的年龄依赖性老年斑的形成、胶质细胞增生和突触减少等部分神经病理特征，并表现出与AD临床相似的行为学障碍。但也有明显的不足：缺乏Tau蛋白改变，如NFT的形成和AD相似的神经元变性，而且费用昂贵，一般实验室不具备制作该模型的条件。另外，AD是一种多基因疾病，尽管转基因模型是AD动物模型中较理想者，但转基因模型大部分只模拟了AD的某一方面病理特征，而不能全面模拟AD发病。

2、Aβ注射模型模拟了Aβ沉积神经变性的优点，但存在以下的不足：(1)对动物导入Aβ的同时，注射本身将对脑组织形成局灶性穿透性损伤；(2)大量的Aβ聚集在注射位点局部而不是弥散地分布到脑内；(3)不能体现NFT等病理改变，由于Aβ的自身清除机制，沉积达不到满意的效果。

3、其它动物模型的制作，主要存在与病理改变过程或与AD实际病理改变关系不密切，如铝中毒模型、胆碱能神经损害模型、D-半乳糖制作脑老化小鼠衰老模型、快速老化模型等。

因此，如果能建立一种较理想的AD动物模型，对AD的研究有良好的科学意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用可诱导阿尔茨海默病的基因Aβ1-40cDNA重组的腺病毒，其特征在于，该重组腺病毒包含有Aβ1-40基因。

所述重组腺病毒的构建过程包括如下步骤：

一、合成全长Aβ1-40基因。

二、用高保真Taq酶(pyrobest)扩增第一步得到的Aβ1-40基因片段，并纯化，得到Aβ1-40PCR纯化物。

三、用BgLII和Hind III分别双酶切PSC质粒和第二步得到的Aβ1-40PCR纯化物，将两者的酶切产物纯化后洗脱DNA，然后进行连接反应，得到重组PSC-Aβ1-40穿梭载体。

四、用PmeI酶切第三步得到的重组PSC-Aβ1-40穿梭载体后纯化，将纯化的酶切产物在BJ5183-AD-1感受态细菌中电转化，使重组PSC-Aβ1-40穿梭载体定向插入Adeno-X腺病毒表达载体，得到Aβ1-40重组腺病毒载体质粒。

五、用第四步得到的Aβ1-40重组腺病毒载体质粒在AD293细胞溶液中进行转染，获得Aβ1-40重组腺病毒。

本发明中获得重组腺病毒的活性可以分别用Western-blot检测Ad-Aβ1-40在PC-12细胞中的表达；以及用MTT法、流式细胞仪检测Ad Aβ1-40对PC-12细胞凋亡的影响来检测Ad Aβ1-40的活性。

本发明所述的Aβ1-40重组腺病毒具有高效表达及高效转染的特点，与Aβ1-40多肽相比，作用更持久。

本发明的另一个目的是提供一种用Aβ1-40重组腺病毒制作阿尔茨海默病模型的方法，其特征在于，采用本发明提供的包含有Aβ1-40基因的重组腺病毒制作阿尔茨海默病模型。具体的说，是在实验体大脑的海马部位注射Aβ1-40重组腺病毒溶液。

其具体过程为：将大鼠麻醉后，将AdAβ1-40注射至左、右侧海马齿状回背侧细胞带区。4周后观察大鼠学习记忆的变化及脑组织的病理变化。

本发明用Aβ1-40重组腺病毒制作阿尔茨海默病模型，其过程中构建好AdAβ1-40重组腺病毒后，可以利用病毒的特点，通过细胞培养，将Ad Aβ1-40重组腺病毒传代，获得的Ad Aβ1-40重组腺病毒成本相对低，而且病毒表达稳定，持续均一。有效的避免了以往的模型制作时注射次数多，并且受多肽质量的影响，制作的模型受Aβ1-40批间差异影响等缺点。

附图说明

图1：Aβ1-40重组腺病毒载体构建示意图。

图2：Aβ1-40基因片段的扩增结果，M：DL2000 DNA MarkerLane，1：Aβ1-40gene(140bp)。

图3：PSC与Aβ1-40酶切后连接产物转化DH5a细菌，并经37℃孵育过夜所产生的克隆，挑取中小、透亮度好的菌落进行扩增并鉴定。两图为同一平板。

图4：PSC-LacZ经IPTG诱导分解培养板中的X-gal从而产生蓝色菌落。挑取蓝色菌落进行扩增并鉴定。两图为同一平板。

图5：为线性化PSC-Aβ1-40电转化至BJ5183-AD-1细菌，孵育过夜后所获得的克隆平板。两图为同一平板。

图6：为线性化PSC-LacZ电转化至BJ5183-AD-1电转化感受态细菌中。孵育并经IPTG诱导分解X-gal产生蓝色菌落。两图为同一平板。

图7：相差显微镜下，均为200×放大。A.AD293细胞达50％-70％融合率.B.正常对照AD293细胞培养至13天时，未传代。C.病毒包装第10天时出现局部细胞病变效应，细胞失去原有的多边形形状，逐渐成为椭圆或梭型。D.第11天时出现较大面积细胞病变效应，细胞肿大变圆，上浮。E.第12天时70％-80％的细胞出现病变效应。F.第13天时培养皿中细胞90％出现细胞病变效应，细胞成串或成团上浮，贴壁细胞也都变圆。

图8：Ad-Aβ1-40在PC-12细胞中的表达结果。M：低分子量蛋白标准；1，Ad-Aβ1-40感染后24小时；2，Ad-Aβ1-40感染后48小时；3，Ad-LacZ感染后48小时；4，PC-12细胞对照。

图9：Highman甲醇刚果红染色法对脑组织病理学变化检测结果。其中，图a是正常组，图b是生理盐水组，图c是Aβ1-40模型组，图d是Ad Aβ1-40模型组。图10：Bielschowsky银染法对脑组织病理学变化检测结果。其中，图a是正常组，图b是生理盐水组，图c是Aβ1-40模型组，图d是Ad Aβ1-40模型组。

具体实施方式

下面通过具体实验过程进一步说明本发明。所述实验过程主要包括三大部分：

Ad Aβ1-40重组腺病毒的构建，Aβ1-40重组腺病毒在PC-12细胞中的表达，以及阿尔茨海默病动物模型的制作及观察。

一、Ad Aβ1-40重组腺病毒的构建。

(一)设计和制备引物、PCR模板及扩增基因序列。

1、根据美国NIH(National institute of Health)Nucleotide提供的序列(NM_201414.1 GI：41406056)设计并合成全长Aβ1-40基因和引物。全长基因序列如下：GCAGATCT ATG gatgcaga attccgacat gactcaggat atgaagttca tcatcaaaaattggtgttct ttgcagaaga tgtgggttca aacaaaggtg caatcattgg actcatggtg ggcggtgttgtc TGA AAGCTT CG

上游引物P1：5’-GCAGATCT ATG GAT GCA GAA TTC CGA CAT-3’

下游引物P2：5’-CGAAGCTT TCA GAC AAC ACC GCC CAC CAT-3’

全长序列和上游引物的5’端包含BgLII酶切序列AGATCT和ATG起始密码，全长序列3’端和下游引物的5’端包含HindIII酶切序列AAGCTT和终止密码TGA。2、扩增Aβ1-40基因

(1)用高保真Taq酶(pyrobest)扩增Aβ1-40基因片段。

PCR反应体系：10×PCR reaction buffer    5μl

             10×dNTP mix               1μl

             40pM Primer 1              0.5μl

             40pM Primer 2              0.5μl

             Aβ1-40cDNA                2μl

             Taq(5U/μl)                1μl

             ddH₂O(无菌三蒸水)          40μl

                                                        

             Total Volume               50μl

PCR反应条件：94℃    3min    1cycle

             94℃    30sec

             58℃    30sec

             72℃    1min    35cycles

             72℃    7min    1cycle

(2)取5ml扩增产物，在2％琼脂糖凝胶中电泳证实有预期长度片段(140bp左右)后将PCR产物用PCR purification kit纯化，最后得20ml纯化产物。

(二)构建PSC-Aβ1-40穿梭载体。

1、用BgLII和Hind III双酶切PSC质粒和Aβ1-40PCR纯化物。

酶切反应体系A：Aβ1-40fragment         20μl

               HindIII(10U/μl)        2μl

               BgLII(10U/μl)          2μl

               10×K buffer            4μl

               ddH₂O                   12μl

                                                        

               Total Volume            40μl

酶切反应体系B：PSC                     20μl

               Hind III(10U/μl)       4μl

               BgLII(10U/μl)          4μl

               10×buffer              8μl

               ddH₂O                   44μl

                                                             

               Total Volume            80μl

置37℃水浴2h后，各取3μl电泳，确证pShuttle-CMV完全线性化，余酶切产物用

PCR purification kit纯化，最后各以20μl水洗脱DNA，再行连接反应。

连接反应体系：线性化PSC                1μl

              酶切后Aβ1-40fragment    0.5μl

              T4 Ligase(3U/μl)        1μl

              10×buffer               1μl

              ddH₂O                    6.5μl

                                                        

              Total Volume             10μl

室温反应2h，然后4℃过夜，获得重组PSC-Aβ1-40穿梭载体。

2、感受态细菌制备。

(1)从LB平板上挑取单菌落DH5a，接种于5ml液体LB，37℃振摇培养过夜。

(2)吸取0.4ml培养菌液接种于40ml液体LB，37℃振摇培养3h，置冰浴10min。

(3)于4℃4000rpm离心10min，弃去上清。

(4)以5ml冰预冷CaCl₂(0.1M)重悬细菌，置冰浴30min。

(5)于4℃4000rpm离心10min，弃去上清。

(6)加1ml冰预冷CaCl₂(0.1M)重悬细菌，分装暂存4℃。

3、PSC-Aβ1-40重组质粒及对照质粒PSC-LacZ的转化。

(1)取10μl连接产物及1μl对照质粒加入100μl感受态细菌，混匀后冰浴30min。

(2)换置42℃水浴90sec，再置冰浴2min。

(3)加入1ml液体LB，37℃200rpm振摇培养1h。

(4)于4℃4000rpm离心5min，弃去上清。

(5)加100μl液体LB重悬转化菌液，均匀涂在含有卡那霉素的固体LB平板(对照质粒用平板事先涂IPTG和X-gal)上，37℃培养18h。

4.阳性克隆的筛选和鉴定。

(1)阳性克隆的筛选：重组质粒经卡那霉素抗性、对照质粒经卡那霉素和蓝白菌落初步筛选后，重组质粒挑取10个中等大小白色生长单菌落、对照质粒挑选2个蓝色单菌落接种于3ml液体LB(含有卡那霉素50mg/ml)，37℃振摇培养12h。用小量超纯质粒DNA抽提试剂盒提取质粒DNA，最后溶解在30μl无菌水中。

(2)重组质粒酶切法鉴定：用Hind III和BgLII双酶切5μl重组质粒DNA，酶切后产物取7.5μl于1％琼脂糖凝胶中电泳，有140bp左右插入片段释放出者视为阳性重组体。

酶切反应体系：PSC-Aβ1-40质粒DNA    5μl

              BgLII                 0.5μl

              Hind III              0.5μl

              10×K buffer          2μl

              ddH₂O                 12μl

                                                   

              Total Volume          20μl

反应条件：37℃水浴2h。

(3)PCR法鉴定：取0.5μl重组质粒DNA，用PCR法扩增插入片段。扩增产物于1％琼脂糖凝胶中电泳，有140bp左右片段产物者视为阳性重组体。

PCR反应体系：10×PCR reaction buffer    2.5μl

             10×dNTP mix               0.5μl

             40pM P1                    0.5μl

             40pM P2                    0.5μl

             PSC-Aβ1-40                0.5μl

             Taq(5U/μl)                0.3μl

             ddH₂O                      20.2μl

                                                         

             Total Volume               25μl

PCR反应条件同pyrobest高保真酶扩增的反应条件。

(4)测序鉴定：将10μl上下游引物及10μl重组质粒送至上海博亚基因公司进行序列鉴定。

(三)Ad-Aβ1-40与Ad-LacZ的构建

1.PmeI酶切使PSC-Aβ1-40和PSC-LacZ线性化

酶切反应体系A：PSC-Aβ1-40质粒DNA    22μl

               PmeI                  4μl

               10×NEBuffer4         20μl

               100×BSA              2μl

               ddH₂O                 152μl

                                                         

               Total Volume          200μl

反应条件：37℃水浴4h。

酶切反应体系B：PSC-LacZ质粒          22μl

               PmeI                  4μl

               10×NEBuffer4         20μl

               100×BSA              2μl

               ddH₂O                 152μl

                                                       

               Total Volume          200μl

酶切反应条件：37℃水浴4h

各取3μl 1％琼脂糖凝胶电泳，确证PSC-Aβ1-40及PSC-LacZ已完全线性化，余酶切产物用

PCR purification kit纯化，最后各以20μl水洗脱DNA，再行电转化。

2.电转化。

(1)准备：在-20℃预处理电转杯、在冰上融化BJ5183-AD-1感受态细菌、37℃预温2ml液体LB、预冷2支1.5ml ep管。

(2)设定电转仪：电压2.5KV、电容25μF、电阻200Ω。

(3)取2μl已纯化好的酶切产物，分别放入预冷的1.5ml ep管中，再加40μlBJ5183-AD-1，混匀，并将混合物注入预冷的电转杯中。

(4)电转化：将电转杯插入电击通道，按下按钮，时间分别是PSC-Aβ1-404.62ms，PSC-LacZ 4.66ms。

(5)在电击后的电转杯中加入预温的200μl LB，充分混匀，将其吸出至余下的800μlLB中。

(6)37℃225rpm振摇1h。

(7)取50μl菌液均匀涂于含卡那霉素(50mg/ml)的平板上，37℃孵育过夜。

(8)余下菌液3000rpm 10min，去除上清，加入100μl LB重悬细菌，混匀后均匀涂于含卡那霉素的平板上，37℃孵育过夜。

3.阳性重组腺病毒载体质粒的鉴定。

(1)阳性克隆的筛选：Ad Aβ1-40重组子经卡那霉素抗性、AdLacZ质粒经卡那霉素和蓝白菌落初步筛选后，Ad Aβ1-40挑取10个中、小白色生长单菌落、AdLacZ挑取10个中、小蓝色单菌落接种于3ml液体LB(含有卡那霉素50mg/ml)，37℃振摇培养8h，再加入17ml含卡那霉素的LB，37℃振摇培养16h。

(2)用碱裂解法中量抽提重组腺病毒质粒DNA。

①将9ml振摇过夜的细菌于4℃ 12000rpm 1min，去尽上清。

②用100μl溶液I重悬细菌沉淀，剧烈振荡混匀。

③加入200μl新配制的溶液II，盖紧管口，快速颠倒5次，以混合内容物。将ep管冰上放置5min。

④加入150μl溶液III，盖紧管口，将管倒置后温和地振荡10sec，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上5min。

⑤于4℃ 12000rpm 8min，将上清转移到另一1.5ml ep管中。加等体积氛：氯仿，振荡混匀，于4℃ 12000rpm 2min，将上清转移至另一1.5ml ep管中。

⑥2倍体积的无水乙醇于室温沉淀DNA。振荡混匀，于室温放置2min。

⑦4℃ 12000rpm 5min。

⑧去上清，用1ml 70％乙醇于于4℃洗涤DNA沉淀，去上清。

⑨4℃ 12000rpm 5min。

⑩真空抽干机于35℃3min，用35μl ddH2O溶解质粒，加入1μl RNA酶，55℃水浴10min。

(3)将抽提得到的质粒转化入XL10-Gold感受态细菌中。用小量超纯质粒DNA抽提试剂盒提取质粒DNA，最后溶解在30μl无菌水中。

(4)0.75％凝胶电泳显示Ad Aβ1-40与Lamda/HindIII Marker比较，主要片段在23kb以上者作PacI单酶切、BgLII和HindIII双酶切及PCR鉴定；AdLacZ只作PacI酶切鉴定。

(5)重组腺病毒质粒酶切法鉴定：用Hind III和BgLII双酶切7μl重组腺病毒质粒DNA，酶切后产物取8μl于0.75％琼脂糖凝胶中电泳鉴定目的基因Aβ1-40(140bp左右)。PacI酶切7μl重组腺病毒质粒，酶切后取8μl于0.75％琼脂糖凝胶中电泳，若有4.5kb或3.0kb片段释放出者视为阳性重组体。

双酶切反应体系：Ad Aβ1-40质粒        7μl

                BgLII                 0.5μl

                Hind III              0.5μl

                10×K buffer          2μl

                ddH₂O                 10μl

                                                        

                Total Volume          20μl

反应条件：37℃水浴2h。

PacI酶切体系Ad Aβ1-40质粒            7μl

            10×NEBuffer1             2μl

            100×BSA                  0.2μl

            PacI                      0.3μl

            ddH₂O                     10.5μl

                                                    

            Total Volume              20μl

反应条件：37℃水浴2h。

(6)PCR法鉴定：取1μl重组Ad Aβ1-40，用PCR法扩增插入片断。扩增产物于1％琼脂糖凝胶中电泳，有140bp左右片段产物者视为阳性重组体。

PCR反应体系：10×PCR reaction buffer    2.5μl

             10×dNTP mix               0.5μl

             40pM Primer 1              0.5μl

             40pM Primer 2              0.5μl

             Ad Aβ1-40质粒             1μl

             Taq(5U/μl)                0.3μl

             ddH₂O                      19.7μl

                                                          

             Total Volume               25μl

PCR反应条件与pyrobest高保真酶的反应条件相同。

4.Aβ1-40重组腺病毒载体质粒包装及第二代感染病毒的初步鉴定。

(1)Aβ1-40重组腺病毒载体质粒在AD293细胞中的包装细胞培养。

AD293细胞用含有10％FCS的DMEM培养传代。复苏后细胞传至3~20代用于转染实验。转染前细胞用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化细胞，计数后在60mm培养皿上接种1~2×10⁵/孔，于37℃、5％CO₂孵箱中培养24h以上，细胞生长达50％-70％融合率用于转染。

(2)质粒DNA细胞转染。

①用不含血清的DMEM洗涤60mm培养皿中细胞2次。

②加入4ml含MBS溶液III及0.1％氯喹的无血清DMEM，37℃孵育20-30min。

③将5μg重组质粒溶解在225μl纯净水中，加入25μl MBS溶液I，轻轻混匀。

④加入250μl MBS溶液II混匀，室温10min后添加入培养皿细胞内。

⑤于37℃、5％CO₂孵箱中继续培养3h，再换为含有10％FCS及0.1％氯喹的DMEM4ml继续培养，7h后换成含10％FCS的完全DMEM培养基中。

⑥包装期间每隔3-4天换用新鲜完全培养基。

⑦在包装至13天时收获病毒，-70℃-37℃反复冻融3次，剧烈振荡。

⑧4℃，12000rpm，10min。取上清-70℃备用，为原代病毒。

(3)用原代病毒感染AD293细胞，获取第二代病毒。

将原代病毒上清加入小体积培养基培养的AD293细胞中，于37℃、5％CO₂孵箱孵育2h，添加培养基至一般培养的培养基量。第三天收获病毒，步骤同原代病毒包装细胞。

5.重组腺病毒载体的扩增和滴度鉴定。

AD293细胞，于37℃、5％CO2培养，当其生长占培养瓶面积60～70％时，倒尽原培养基，加1mL含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养基，再加10μL重组腺病毒载体(Ad-Aβ1-40)，置于37℃、5％CO2培养箱，每10分钟摇晃一次，放置30分钟后，加10mL10％FCS的RPMI1640，放置37℃、5％CO2培养箱。培养3天后收获，超速离心弃上清，加入适量培养液混匀。经超声处理，过滤除菌，用空斑形成试验测定病毒滴度。

病毒空斑形成试验的具体操作：每60mm直径的平皿接种2×10⁶/mL AD293细胞，置于37℃、5％CO2培养2-3天；用4ml D-Hank’s液洗一次，加入各种稀释度的病毒0.2mL，37℃、5％CO2培养2-3小时，在此期间每隔20-25分钟摇动一次，以使病毒液均匀覆盖细胞，防止干燥；加入10mL营养琼脂(含0.8％琼脂，2％胎牛血清，1％、1.25mol/L MgCl2，1％谷氨酰胺，2％的5.6％NaHCO3，1％青链霉素)，待琼脂凝固后，将平皿倒置，放37℃、5％CO2培养箱9天；再加入染色琼脂(上述琼脂液中加入1％的1.4％中性红)，置37℃、5％CO2培养箱2-3天，镜下进行空斑计数。得Ad-Aβ1-40为1.9×10⁹pfu/mL，AdLacZ为3.7×10⁹pfu/mL。

二、Ad-Aβ1-40在PC-12细胞中的表达

1.Western-blot检测Ad-Aβ1-40在PC-12细胞中的表达。

将PC-12细胞1×10⁶个/孔接种于6孔板中，待细胞完全贴壁后弃上清，按重复感染度(Multiplicity of infection，MOI)1∶50加入Ad Aβ1-40重组腺病毒稀释液0.5mL，同时设转染表达LacZ基因重组腺病毒为病毒对照和PC-12细胞为细胞对照，于37℃、5％CO2温箱中温育60分钟，期间每10分钟摇晃一次，洗去残留病毒液，补充RPMI1640 1mL，然后在转染后24、48小时收集细胞，提取全细胞蛋白，用Western-blot测定Aβ1-40蛋白表达。

Western-blot免疫印迹方法：用全细胞蛋白质抽提试剂盒提取各组PC-12细胞蛋白质，用紫外分析仪测定各样品蛋白质含量。每组取40μg蛋白质样品加上样缓冲液煮沸变性后，进行10％SDS-PAGE，并转移至硝酸纤维素膜，用含5％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS，pH8.0)封闭1小时，分别加抗Aβ1-40抗体，于杂交炉中37℃滚动反应2小时；洗膜3次每次5分钟，加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温反应2小时；洗膜后作ECL化学发光，X片曝光显影。

2.MTT法检测Ad Aβ1-40对PC-12细胞的增殖抑制试验。

取状态良好，对数生长期细胞PC-12细胞，96孔培养板每孔加入2×10⁴/ml0.2ml，并用重组腺病毒MOI 50处理细胞，每组设六个复孔，37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下培养24h、48h、72h，检测时每孔加入5mg/ml(PH 7.2PBS配制)的MTT10μl，继续培养3h，弃去上清，每孔加入二甲基亚砜0.2ml，混匀，于Clinibio128C全自动酶标仪550nm处测定光吸收值(A值)，以A值表示细胞增殖程度。

3.细胞后流式细胞仪检测Ad Aβ1-40对PC-12细胞周期和细胞凋亡的影响。

PC-12细胞以含5％FCS的完全培养基在CO2培养箱中常规培养，密度达50％-60％时换为无血清培养基培养使同步化。试验组按50MOI感染PC-12细胞(无血清)2小时，期间每15分钟摇匀1次培养液，2小时后换为含5％FCS的培养；对照组包括加病毒Ad-LacZ(病毒对照组)和不加病毒组(空白对照组)。分别作用48小时后收集细胞，胰蛋白酶消化后细胞离心(1000r，5分钟)，弃上清，加入适量PBS调整细胞浓度至10⁶/ml，取100μl细胞悬液，加入DNA-PREP^TMLPR 200μl混匀，静置30分钟后流式细胞仪检测细胞周期。同时用Anniex V/PI标记检测凋亡发生情况。

三、第一部分和第二部分实验过程的研究结果。

(一)、Aβ1-40基因片段的扩增。

已人工合成的基因片段为模板，应用特异引物及高保真聚合酶扩增。2％琼脂糖凝胶电泳显示，与Marker比较，获得特异性条带Aβ1-40基因片段(140bp左右)。如图2所示。

(二)、构建成功PSC-Aβ1-40穿梭载体质粒及其鉴定结果。

通过BgLII、HindIII双酶切Aβ1-40PCR扩增片段及PSC空载体，纯化、回收，再由T4 DNA连接酶连接。反应一段时间后将连接产物转化入DH5a感受态细菌中，37℃孵育过夜，挑取阳性克隆。如图3。而对照PSC-LacZ通过IPTG诱导分解X-gal产生蓝色菌落。如图4。扩增PSC-Aβ1-40阳性克隆，通过PCR、双酶切鉴定与原始PCR产物相比在相应位置都有同等大小片段。

测序结果如下：测序结果与Nucleotide中所提供的序列在DNAssist 2.0软件上分析比对，将测序结果在此软件上翻译成蛋白序列，比较没有发现氨基酸突变。该测序结果显示插入片段为正确的Aβ1-40基因序列。

(三)、构建完成Aβ1-40重组腺病毒质粒(Ad-Aβ1-40)与LacZ重组腺病毒质粒(AdLacZ)并鉴定其正确性。

1。电转化结果。

PSC-Aβ1-40、PSC-LacZ经PmeI酶切完全线性化，纯化回收。取200ng回收产物与BJ5183-AD-1电转化感受态细菌混合，并进行电转化，经37℃孵育过夜获得克隆平板。Ad Aβ1-40质粒为白色透明菌落，按照单克隆直径大小大致分为大、中、小克隆。如图5所示。AdLacZ质粒为蓝色菌落。如图6所示。

2.重组腺病毒质粒鉴定结果。

Ad Aβ1-40质粒：挑选平板上最小类型的克隆，扩增并抽提质粒，凝胶电泳显示浅淡条带，位置在23kb以上。再分别转化入DH5a感受态细菌和XL10-Gold感受态细菌中孵育并挑取克隆扩增，重组腺病毒质粒在两个不同的感受态细菌中扩增效率相似。抽提质粒，原始PCR产物作为阳性对照，结果PCR，BglII、HindIII双酶切显示都有140bp左右的条带，PacI酶切显示有4.5kb或者3.0kb的片段释放出来。Ad-LacZ质粒：挑选平板上蓝色菌落，扩增并抽提质粒，转化入DH5a感受态细菌中孵育并挑取克隆扩增并抽提质粒，PacI酶切显示有4.5kb或者3.0kb的片段释放出来。

3.重组腺病毒质粒在AD293细胞中包装及第二代病毒感染结果。

当AD293细胞在60mm培养皿中达50％-70％的融合度时，将重组腺病毒质粒转入，10％FCS-DMEM培养，37℃孵育。在培养至第10天时出现局部的细胞病变效应，AD293细胞变圆、胀大并成团或成串脱落。在第13天时90％的细胞出现病变效应，如图12。将其吹下，收获，在-70℃-37℃反复冻融3次，离心取上清。一部分上清-70℃备用，一部分上清感染AD293细胞，第3天时，90％细胞出现病变效应。如图7所示。

4.重组腺病毒载体的扩增和滴度鉴定。

重组腺病毒再AD293细胞大量扩增后，用病毒空斑形成试验测定病毒的滴度。结果Ad-Aβ1-40为1.9×10⁹pfu/mL，AdLacZ为3.7×10⁹pfu/mL。

5.Western-blot检测Ad-Aβ1-40在PC-12细胞中的表达。

将PC-12细胞1×10⁶个/孔接种于6孔板中，待细胞完全贴壁后弃上清，按重复感染度(Multiplicity of infection，MOI)1∶100加入Ad Aβ1-40重组腺病毒稀释液0.5mL，同时设转染表达LacZ基因重组腺病毒为病毒对照和PC-12细胞为细胞对照，于37℃、5％CO2温箱中温育30分钟，期间每五分钟摇晃一次，洗去残留病毒液，补充RPMI1640 1mL，然后在转染后24、48小时收集细胞，提取全细胞蛋白，用Western-blot测定Aβ1-40蛋白表达。结果见图8：

6.MTT法检测AdAβ1-40对PC-12细胞的增殖抑制试验。

取状态良好，对数生长期细胞PC-12细胞，96孔培养板每孔加入2×10⁴/ml0.2ml，并用重组腺病毒MOI 50处理细胞，每组设六个复孔，37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下培养24h、48h、72h，检测时每孔加入5mg/ml(PH 7.2PBS配制)的MTT10μl，继续培养3h，弃去上清，每孔加入二甲基亚砜0.2ml，混匀，于Clinibio 128C全自动酶标仪550nm处测定光吸收值(A值)，以A值表示细胞增殖程度。列表如表1

表1：Ad Aβ1-40对PC-12细胞增殖抑制作用(x±s)

7.细胞后流式细胞仪检测AdAβ1-40对PC-12细胞周期的影响。

PC-12细胞以含5％FCS的完全培养基在CO2培养箱中常规培养，密度达50％-60％时换为无血清培养基培养使同步化。试验组按50MOI感染PC-12细胞(无血清)2小时，期间每15分钟摇匀1次培养液，2小时后换为含5％FCS的培养；对照组包括加病毒Ad-LacZ(病毒对照组)和不加病毒组(空白对照组)。分别作用48小时后收集细胞，胰蛋白酶消化后细胞离心(1000r，5分钟)，弃上清，加入适量PBS调整细胞浓度至10⁶/ml，取100μl细胞悬液，加入DNA-PREP^TMLPR 200μl混匀，静置30分钟后流式细胞仪检测细胞周期。同时用Anniex V/PI标记检测凋亡发生情况。检测结果见表2。

表2：Ad Aβ1-40对PC-12细胞周期的影响(x±s)

结果显示：Ad-LacZ对照组和空白对照组G0/G1期比例逐渐下降，S期比例上升，表明G0/G1→S的过程非常迅速，细胞增殖活跃。而Ad Aβ1-40组G0/G1期比例较高，S期比例下降，与对照组相比差异有显著性(p＜0.05)，细胞发生G1期阻滞，细胞增殖受到抑制。表明AdAβ1-40能抑制PC-12细胞的增殖。

8.Ad Aβ1-40对PC-12细胞凋亡的影响

Ad Aβ1-40转染PC-12细胞培养48小时后，与Ad-LacZ对照组和空白对照组相比，细胞凋亡率明显增高(p＜0.05)，Ad-LacZ对照组和空白对照组差异无显著性。

详见表3。

表3：AdAβ1-40对PC-12细胞凋亡的影响(x±s)

注：与Ad-LacZ对照组和空白对照组相比，Ad p27kip1组细胞凋亡率增高，p＜0.05

四、AdAβ1-40制作阿尔茨海默病动物模型的观察

1.Aβ1-40的孵育：

用无菌生理盐水将Aβ1-40(Sigma公司)稀释成2μg/μl，37℃孵育1周，使其变为凝聚态的Aβ1-40。

选体重(230±20)g雄性SD大鼠60只，先在Morris水迷宫测试，选取找寻平台时间相近的大鼠40只，随机分为AdAβ1-40模型组，Aβ1-40模型组、生理盐水组及正常组四组各10只。腹腔注射5％戊巴比妥(40mg/kg)麻醉动物。将大鼠立体定位仪上，常规备皮消毒，切开皮肤，暴露前囟，参照包新民等的《大鼠脑立体定位图谱》选左、右侧海马齿状回(dentate gyrus，DG)背侧细胞带为注射区。定位坐标为前囟后3.0mm，左侧旁开2.0mm，硬脑膜下3.5mm，门齿钩平面低于耳间线平面2.4mm。用牙科钻钻开颅骨，用5μl微量注射器垂直进针，用微量注射器注射Aβ1-40溶液2μl(10μg/μl)，Ad Aβ1-40溶液2μl(含有10⁷PFU重组腺病毒)，控制注射速度为0.2μl/min，留针5min以保证溶液充分弥散，然后缓慢撤针。生理盐水组只注射等量生理盐水，余操作同上。正常组不注射任何溶液。

2.大鼠学习和记忆的行为测试(Morris水迷宫测试)：

各组大鼠在术后30d开始水迷宫检测。水迷宫为直径90cm，高40cm的水池，水深30cm，在水池壁上标明4个入水点，由此将其等分为四个象限，于其中一象限中心置一有机玻璃圆形平台，平台低于水面1cm，水温(24±2)℃，水池周围参照物保持不变。测试包括：①定位航行试验，历时4d，每天分上、下午两个时间段，每个时间段4次，分别从四个不同的标记点，将大鼠面向池壁放入水中，记录2min内寻找平台所需时间(逃避潜伏期)。若大鼠入水后2min内未能找到平台，则将其置于平台上并停留10s，逃避潜伏期记录为2min。每次训练间隔60s。②空间探索试验，定位航行试验结束后撤除平台，任选一个入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录2min内跨越原平台位置的次数。结果见表4

表4：各组大鼠在四天训练中搜索平台潜伏期

	正常组	生理盐水组	Aβ1-40模型组	AdAβ1-40模型组
					1	82.85±21.23	90.35±16.34	106.15±9.85	112.07±3.45
2	46.23±12.08	51.34±11.24	94.64±15.72	95.72±15.87
					3	24.16±13.32	28.12±27.84	63.75±12.89	76.22±14.35
4	15.11±7.57	17.22±9.01	45.38±10.85	69.18±8.16

采用单因素方差分析，F检验表明：模型制作后一月后，Aβ1-40模型组大鼠搜索平台的潜伏期比正常组明显延长(P＜0.01)。Ad Aβ1-40模型组大鼠搜索平台潜伏期比正常组延长(P＜0.01)。生理盐水组比正常组大鼠搜索平台潜伏期稍长，但未见显著性差异(p＞0.05)。模型组大鼠之间比较，在第1天的定向航行试验中，AdAβ1-40模型组搜索平台的潜伏期与Aβ1-40模型组之间无显著性差异(P＞0.05)，但第四天，Ad Aβ1-40模型组大鼠搜索平台潜伏期比Aβ1-40模型组组明显延长(p＜0.05)。

第五天的空间探索试验检测大鼠的空间记忆能力，记录数据列表如表5。结果见大鼠在规定时间(120sec)内经过平台所在位置的次数分别为8.32±2.13，6.0±1.37，比正常组(16.1±2.12)明显减少(P＜0.01)。模型组鼠之间，经过平台次数比较，但AdAβ1-40模型组明显减少(P＜0.01)。

表5：各组大鼠空间探索试验

	正常组	生理盐水组	Aβ1-40模型组	AdAβ1-40模型组
					穿越平台次数	16.1±2.12	17.01±1.55	8.32±2.13	6.0±1.37

3.脑组织的病理学改变。

实验结束后将大鼠处死，取脑做石蜡包埋切片，每片厚6～8μm，分为两套，分别做及银染。

Highman甲醇刚果红染色法：甲醇刚果红染液试剂配制：刚果红0.5g甲醇80ml甘油20ml；碱性乙醇分化液：氢氧化钾0.2g 80％乙醇100ml。染色步骤：将切片脱蜡至水；甲醇刚果红染液染10～20分钟，用碱性乙醇分化液分化数秒，水洗，再用苏木素复染2分钟水洗，脱水，透明，封固。在显微镜下观察淀粉样改变

观察神经纤维样缠结：试剂配制(1)、20％硝酸银水溶液30ml中加入20ml无水乙醇，混合；加氨水，出现沉淀后继续加氨水直至沉淀完全溶解；继续加氨水1-2ml；过滤三次；置于棕色瓶中避光保存。(2)、5％硫代硫酸钠固定液，5g硫代硫酸钠，溶于100ml双蒸水中，避光保存。实验步骤：将已在37度恒温箱中的切片，二甲苯-70％脱蜡及脱水。用双蒸水清洗三次。4％硝酸银水溶液中37度避光浸银30min。倾去硝酸银水溶液，双蒸水清洗三次。10％甲醛水溶液还原5min至切片呈微黄色，再用双蒸水清洗三次。擦干切片背面及组织周围水分，一次5片置于湿盒中。滴加氨银乙醇液5分钟，每片200ul。擦去组织周围及背面氨银液。8％甲醛水溶液中浸泡，注意转动切片，到黄色不再加深。蒸馏水清洗三次。直到显微镜下可清晰观察到斑块为止。蒸馏水清洗5min。脱水及透明，封片。在显微镜下观察。结果见图9、图10：

参照图9，刚果红染色，正常组大鼠脑内未见到明显的淀粉样物质沉着，染色为阴性。与正常组比较，模型组大鼠低剂量与高剂量组均有淀粉样物质沉着，刚果红阳性。

参照图10，银染色可见，正常组与生理盐水组大鼠神经纤维排列整齐、紧密。与正常组比较，Aβ1-40模型组大鼠神经纤维增粗、肿胀，密集融合成宽带状，排列紊乱、扭曲、稀疏，间隙扩大，可见少量的老年斑(SP)和神经纤维缠结(NFT)。AdAβ1-40模型鼠神经纤维见神经纤维有经纤维增粗、肿胀，密集融合成宽带状，排列紊乱、扭曲、稀疏，间隙扩大等异常改变，大鼠皮质和海马内出现了散在SP和NFT，这是老年性痴呆特征性病理改变。并且比Aβ1-40模型鼠变化更明显。

可以理解到的是，上述实验过程只是通过具体的实验来证明本发明提供的技术案的可行性和优越性，但不是对本发明保护范围的限定。本发明的特点在于，用Aβ1-40重组腺病毒制作阿尔茨海默病动物模型。

Claims (5)

1、一种Aβ1-40重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒中包括有Aβ1-40基因。

2、根据权利要求1所述的一种Aβ1-40重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒为经过如下过程获得的重组腺病毒：

一、合成全长Aβ1-40基因；

二、用高保真Taq酶(pyrobest)扩增第一步得到的Aβ1-40基因片段，并纯化，得到Aβ1-40PCR纯化物；

三、用BgLII和HindIII分别双酶切PSC质粒和第二步得到的Aβ1-40PCR纯化物，将两者的酶切产物进行连接反应，得到重组PSC-Aβ1-40穿梭载体；

四、用PmeI酶切第三步得到的重组PSC-Aβ1-40穿梭载体后纯化，将纯化的酶切产物在BJ5183-AD-1感受态细菌中电转化，得到Aβ1-40重组腺病毒载体质粒；

五、用Aβ1-40重组腺病毒载体质粒在AD293细胞溶液中进行转染，获得Aβ1-40重组腺病毒。

3、一种阿尔茨海默病模型制作方法，其特征在于，利用权利要求1所述Aβ1-40重组腺病毒制作阿尔茨海默病模型。

4、根据权利要求3所述的阿尔茨海默病模型制作方法，其特征在于，在实验体大脑的海马部位注射Aβ1-40重组腺病毒溶液。

5、根据权利要求4所述的阿尔茨海默病模型制作方法，其特征在于，Aβ1-40重组腺病毒的注射量为10⁷PFU。

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