CN114231494B - USP10基因和/或Ascl1基因在诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的应用及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开USP10基因和/或Ascl1基因在诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的应用及方法。本发明首先公开了USP10基因和/或Ascl1基因在诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的应用或在制备诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的产品中的应用。本发明进一步公开了诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法。本发明基于Ascl1的特性筛选得到了提高Ascl1蛋白的稳定性和对Ascl1去泛素化的USP10。将USP10基因和Ascl1基因应用于将成纤维细胞转化为神经元细胞的过程中，可高效获得GABA能神经元细胞，弥补了不能高效获得神经元细胞的不足，对于神经相关疾病的治疗具有重要的意义。

Description

USP10基因和/或Ascl1基因在诱导成纤维细胞转分化为神经 元细胞的应用及方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域。更具体地，涉及USP10基因和/或Ascl1基因在诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的应用及方法。
背景技术
人类以及绝大多数的动植物是由许多细胞构成的，这些细胞在发育过程中逐渐形成特异的形态和功能，最终在每个器官中实现精确的作用，将这些细胞称之为分化细胞。一般细胞会保持它们的特异性，直到死去，但是在某种特殊情况下，一些细胞能改变状态替代另一种特异细胞发挥功能，这被称为“转分化”。如果可以找到一种有效的方法，让已分化的有功能的成体细胞转变为另一种有功能的细胞，将对于治疗许多重大疾病具有非常重要的意义。
2010年2月，Vierbuchen等人(Vierbuchen T,Ostermeier A,Pang ZP,et al.Direct conversion of fibroblasts into functional neurons by definedfactors.Nature,2010,463:1035-41.)从十九个转录因子候选基因库中挑出三个基因Ascl1，Brn2和Myt11(ABM)，过表达这三个基因即可直接转化胚胎及出生后小鼠成纤维细胞为有功能的神经元。此过程不经过中间干细胞的状态，目的细胞可以高表达神经特异性基因，发成动作电位及建立突出联系，这种获得的细胞称为诱导神经元(induced neuronal,iN cells)。此外直接的转化可以避免干细胞非特异性分化所造成的成瘤危险和细胞污染。所以，直接重编程技术在未来的应用中具有巨大的优势。
如今的直接转分化技术已经取得了非常大的发展，为了获得高转化效率和成熟的特异性神经元，目前转分化的研究主要集中于转录水平以及表观遗传水平，像一些转录因子和MicroRNA。但是，转分化翻译后水平的研究鲜有报道。而在翻译后水平的调控中，泛素化与去泛素化对于调控细胞内蛋白的降解及稳定性发挥了至关重要的作用。泛素(ubiquitin)是一类在真核生物中普遍存在且高度保守的小分子多肽，共76个氨基酸，全长包含7个赖氨酸位点(K6、 K11、K27、K29、K33、K48、K63)和1个位于C端的甘氨酸位点。泛素以单体和多聚体形式，经由酶促反应与底物蛋白结合并发生共价修饰的过程称为泛素化。泛素化的主要功能是参与底物蛋白的降解和异常蛋白的清除。绝大多数的降解反应由泛素-蛋白酶体系统介导。去泛素化酶的存在使得泛素修饰的调节具有平衡性。去泛素化是指泛素化的底物蛋白在去泛素化酶 (deubiquitylating enzymes，DUB)的作用下移除泛素的过程。
在神经的转分化研究中，许多诱导因子的组合中都包含了转录因子Ascl1 (DeGregorio R,Pulcrano S,De Sanctis C,et al.MiR-34b/c regulates Wnt1 andenhances mesencephalic dopaminergic neuron differentiation.Stem Cell Reports,2018,10(4):1237-1250；Rivetti Di Val Cervo P,Romanov R A,Spigolon G,etal.Induction of functional dopamine neurons from human astrocytes in vitroand mouse astrocytes in a Parkinson's disease model.Nature Biotechnology,2017,35(5):444-452；Nan Yang,Yi Han Ng,Zhiping P.Pang,et al.Induced NeuronalCells:How to Make and Define a Neuron.Cell Stem Cell,2011,9(6):517-25.)。之前的报道也证明了Ascl1作为“先驱因子”在成纤维细胞向神经元的转化过程中发了关键的作用(Wapinski,O.L.et al.Hierarchical mechanisms for direct reprogramming offibroblasts to neurons.Cell,2013,155,621–635.)。Ascl1是一种短寿命蛋白，通过泛素连接酶Huwe1介导的泛素化过程，Ascl1可以被迅速的降解掉(Return to quiescence ofmouse neural stem cells by degradation of a proactivation protein.Science,2016,353,(6296):292-5.)。但是Ascl1的去泛素化过程却没有相关的报道。
因此，开发出一种能通过对Ascl1去泛素化促进诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法以弥补无法高效获得神经元细胞的不足，对于神经相关疾病的治疗具有重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的在于提供USP10基因和/或Ascl1基因在诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法，以高效获得神经元细胞。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明首先提供了USP10基因和/或Ascl1基因在诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的应用或在制备诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的产品中的应用。
进一步，所述应用中USP10基因是通过对Ascl1去泛素化诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞。
本发明人在研究中发现Ascl1具有如下特性：(1)Ascl1在各种细胞内的半衰期极短；(2)Ascl1的降解主要依赖于泛素化途径；(3)Ascl1可以被USP10去泛素化进而延长其半衰期。基于上述特性筛选得到了提高Ascl1 蛋白的稳定性和对Ascl1去泛素化的USP10，将USP10基因和Ascl1基因导入成纤维细胞通过对Ascl1去泛素化诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞。
进一步，所述神经元细胞是GABA能神经元细胞。
本发明进一步还提供了一种诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
1)将Ascl1基因和USP10基因导入成纤维细胞，得到导入Ascl1基因和 USP10基因的成纤维细胞；
2)用神经元培养基诱导培养导入Ascl1基因和USP10基因的成纤维细胞，得到神经元细胞。
进一步，所述成纤维细胞可为来源于任何哺乳动物的成纤维细胞。
在本发明具体的实施方式中，所述成纤维细胞为鼠成纤维细胞。
进一步，所述成纤维细胞采用DMEM培养基加10％胎牛血清培养基进行培养。
在本发明具体的实施方式中，所述成纤维细胞的制备方法为：
选取孕13.5～14.5天的小鼠胚胎取皮肤组织，用2mg/ml木瓜蛋白酶消化后使用DMEM培养基加10％胎牛血清培养基培养，2天后传代一次，得到成纤维细胞。
进一步，所述Ascl1基因和USP10基因使用腺病毒载体导入成纤维细胞中。
在本发明具体的实施方式中，所述Ascl1基因和USP10基因通过 pENTRTM 3C-GFPDual SelectionVector构建到腺病毒pAd载体，然后感染成纤维细胞，从而将Ascl1基因和USP10基因导入成纤维细胞。
进一步，所述用神经元培养基诱导培养导入Ascl1基因和USP10基因的成纤维细胞为将导入Ascl1基因和USP10基因的成纤维细胞隔天半量换液，诱导培养7天后，得到神经元细胞。所述隔天半量换液是指吸弃1/2体积的原神经元培养基，加1/2体积的新鲜的神经元培养基。
进一步，所述神经元培养基由以下组分组成：低糖DMEM培养基、Ham`s F12、Neuralbasal培养基、非必需氨基酸、Glutamax、胎牛血清、B-27添加剂、脑源性神经营养因子、视黄酸和Forskolin；所述低糖DMEM培养基中L-葡萄糖的含量为1g/L。
在本发明具体的实施方式中，所述各组分在神经元培养基的含量分别为：低糖DMEM培养基的体积含量为38.4％、Ham`s F12的体积含量为38.4％、 Neural basal培养基的体积含量为19.2％、非必需氨基酸的体积含量为0.5％、 Glutamax的体积含量为1％、胎牛血清的体积含量为0.5％、B-27添加剂的体积含量为2％、脑源性神经营养因子的含量为10ng/mL、视黄酸的含量为0.5μM 和Forskolin的含量为20μM，其中，所述脑源性神经营养因子、视黄酸和 Forskolin用Ham`s F12溶解。
上述方法获得的神经元细胞也在本发明的保护范围之内。
在本发明中，所述USP10基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述Ascl1基因的序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的有益效果如下：
本发明基于Ascl1蛋白的特性筛选得到了提高Ascl1蛋白的稳定性和对 Ascl1去泛素化的USP10。将USP10基因和Ascl1基因应用于将成纤维细胞转化为神经元细胞的过程中，可高效获得GABA能神经元细胞，弥补了不能高效获得神经元细胞的不足，对于神经相关疾病的治疗具有重要的意义。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为Western Blot检验不同细胞中不同CHX处理时间的Ascl1蛋白的含量及相对含量统计图；其中，A为N2A中不同CHX处理时间的Ascl1蛋白的含量，B为MEF中不同CHX处理时间的Ascl1蛋白的含量，C为NSC 中不同CHX处理时间的Ascl1蛋白的含量，D为293T中不同CHX处理时间的Ascl1蛋白的含量，E为A、B、C和D图的Ascl1蛋白的相对含量统计； F为DMSO、MG132、3-MA、NH4Cl处理后再经CHX处理1h后的Ascl1蛋白的含量。
图2为Western Blot检验共同过表达USP家族中的12个分子与Ascl1的 293T中Ascl1蛋白的含量及相对含量统计；其中，A为USP家族中的12个分子对细胞内Ascl1蛋白的含量影响，B为A图的Ascl1蛋白的相对含量统计； C为293T中不同CHX处理时间Ascl1蛋白和USP10蛋白的含量，D为C图的Ascl1蛋白的相对表达量统计。
图3为Western Blot检测USP10对Ascl1去泛素化的作用图；其中，A 为WesternBlot检测Ascl1与USP10的体内结合情况，B为Western Blot检测体外Ascl1与USP10的直接结合情况，C为Western Blot检测Ascl1的泛素化情况。
图4为实施例2获得的转分化细胞的Map2和Tuj1的免疫组化染色结果及Map2细胞与Tuj1细胞的数量比；其中，Map2代表分化成熟神经元细胞的免疫组化染色结果图；Tuj1代表初级神经元细胞的免疫组化染色结果图；Merge (合并)代表分化成熟神经元细胞和初级神经元细胞的免疫组化染色结果图的合并图层，Map2细胞与Tuj1细胞的数量比代表分化成熟神经元细胞与初级神经元细胞的数量比。
图5为实施例2获得的转分化细胞的GABA的免疫组化染色结果及 GABA细胞数占GFP细胞数的百分比；其中，GFP代表感染病毒的所有细胞的免疫组化染色结果图；GABA代表GABA能神经元细胞的免疫组化染色结果图；Merge(合并)代表感染病毒的所有细胞与GABA能神经元细胞的免疫组化染色结果图的合并图层，GABA细胞数占GFP细胞数的百分比代表GABA能神经元占感染病毒的所有细胞的百分比。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
除非特别指明，以下实施例中所用的小鼠为C57BL/6J小鼠，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
下述实施例中所述USP10基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述Ascl1基因的序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例1筛选得到提高Ascl1蛋白的稳定性和对Ascl1去泛素化的USP10
一、Ascl1蛋白的稳定性检测
利用脂质体转染或病毒感染的方式在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、人胚肾细胞(293T)、小鼠成神经瘤细胞(N2A)和小鼠神经干细胞(NSC) 中过表达Ascl1，具体步骤如下：
构建Ascl1的过表达质粒(包括PCDH-Ascl1质粒和pAD-Ascl1质粒)： PCDH-Ascl1质粒的构建如下：首先在小鼠胚胎期(E13)大脑的cDNA库中扩增得到Ascl1基因片段，扩增引物为：Ascl1-Xba1-F：5’ -TCTAGAATGGAGAGCTCTGGCAAGATG-3’(如SEQID NO.3所示)；Ascl1-Ecor1-R:5’-GAATTC TCAGAACCAGTTGGTAAAGTCC-3’(如SEQ ID NO.4所示)；然后利用限制性内切酶Xba1和EcoR1对PCDH质粒以及Ascl1 基因片段分别进行酶切。酶切之后的PCDH质粒和Ascl1基因片段使用NEB 公司的T4连接酶，16℃连接过夜，连接成功后即可获得PCDH-Ascl1质粒。 pAD-Ascl1质粒的构建如下：首先通过限制性内切酶Ecor1和Kpn1切割及T4连接酶连接的方式将Ascl1基因(CDS序列)连接到pENTRTM 3C-GFP DualSelectionVector(pENTR)(Invitrogen)载体上，得到pENTR-Ascl1质粒。然后利用pENTRTM3C-GFP Dual SelectionVector和pAD载体上的重组序列，以重组酶 (CRE)重组的方式将Ascl1的基因序列构建到腺病毒pAD载体上，即通过用 LRCIonase II酶混合物，使pAD载体上的attR1、attR2与PEIG质粒上的attL1、 attL2发生LR同源重组，将外源性基因转移到pAD载体上，反应体系为1μL pAD载体、1μL pENTR-Ascl1、0.5μL LR Clonase II混合物，室温反应4小时，得到pAD-Ascl1质粒。
利用脂质体转染的方式将PCDH-Ascl1质粒转入N2A和293T，得到过表达Ascl1的N2A和293T：取两个灭菌的1.5mL的EP管(即A管和B管)，分别加入100μL DMEM；A管加入3μg的PCDH-Ascl1质粒，B管加入3 倍的GenEscort1(即9μL)，静置5min。将B管中的液体全部转移到A管中，轻轻混匀，静置15min。将AB的混合液分别均匀滴加到有N2A和293T 的3.5cm的培养皿中进行转染，获得过表达Ascl1的N2A和293T。
利用病毒感染的方式将pAD-Ascl1质粒导入MEF和NSC中以过表达 Ascl1，得到过表达Ascl1的MEF和NSC：1)腺病毒包装：293A细胞，50 万孔，铺于六孔板中，37℃培养过夜。将pAD-Ascl1质粒(5μg)利用PacI酶切并回收，得到线性的pAD-Ascl1质粒；将线性的pAD-Ascl1质粒利用脂质体转染的方式转入293A细胞中，在新鲜含10％FBS的DMEM培养基培养一天。消化传代至10cm培养皿中，传代的步骤如下：当细胞的覆盖面积达到培养皿的80％时，吸弃培养液，用5mL无菌的PBS清洗细胞一次，尽量去除残留的培养液；加入2.5mL用无菌PBS配置的0.05％的消化液-胰酶，常温下静置2min 以消化贴壁的细胞；待细胞开始部分脱落时，吸弃消化液，加入5mL的高糖DMEM(10％FBS)以终止消化，细胞吹悬并置于无菌离心管中，水平离心1200 rpm，5min；弃去上清，对于细胞系传代，加入10mL高糖DMEM(10％FBS) 吹悬细胞，将细胞全部接种至10cm培养皿中。继续培养，隔天换液，直至85％ -90％细胞脱落，收集培养液和细胞，放于-80℃，反复冻融2次，得P1腺病毒。用P1腺病毒感染MEF或NSC，直至85％-90％细胞脱落，收集培养液和细胞，放于-80℃，反复冻融2次，得P2腺病毒。同上，得P3腺病毒 (即包装好的Ascl1腺病毒颗粒)，可用于后续实验；2)病毒感染：将6万个MEF或NSC铺到24孔板的一个孔，将包装好的Ascl1腺病毒颗粒(P3腺病毒)感染MEF或NSC，将Ascl1基因导入MEF或NSC，得到过表达Ascl1 的MEF和NSC。感染步骤：第一次感染：取P3腺病毒，以Ascl1(15MOI)+Usp10(15MOI)的量与Polybrene终浓度为4mg/ml混匀后，加于孔板中，并混匀，8小时后换过渡培养基(低糖DMEM加5％血清)。第二次感染：同第一次感染。
转染或感染完成24小时后加入放线菌酮(CHX)进行处理，在CHX处理后的0，20，40，60分钟分别收集细胞。利用Western Blot检验不同细胞中不同CHX处理时间Ascl1蛋白的含量并统计相对含量，结果如图1所示，结果显示用CHX处理后的过表达Ascl1的N2A、MEF、NSC和293T中Ascl1蛋白的含量(分别如图1中A、B、C和D所示)和相对含量(图1中E所示) 随CHX处理时间的延长Ascl1蛋白的含量均逐渐下降，Ascl1蛋白的半衰期较短平均低于20分钟，说明Ascl1蛋白在细胞内的稳定性很低，极易被降解。
二、Ascl1蛋白的主要降解方式
同步骤一将Ascl1的过表达质粒PCDH-Ascl1利用脂质体转染的方式在 293T中过表达Ascl1，获得过表达Ascl1的293T；分别用试剂DMSO(溶剂，对照组)、MG132(抑制细胞的蛋白酶体)、3-MA(抑制细胞的自噬)、 NH4Cl(抑制溶菌酶)处理16小时，用CHX处理1小时收集过表达Ascl1 的293T，利用Western Blot检验不同试剂处理的过表达Ascl1的293T中Ascl1 蛋白的含量，结果如图1中F所示，结果显示：相对于其他处理，用MG132 处理过表达Ascl1的293T时，Ascl1蛋白的含量最高，表明MG132抑制细胞的蛋白酶体时Ascl1蛋白的降解被抑制，说明Ascl1的主要降解方式是泛素化途径。
三、USP10提高Ascl1蛋白的稳定性试验
挑选了USP家族中的12个分子(即USP1、USP3、USP10、USP12、USP15、USP18、USP21、USP22、USP33、USP44、USP46和USP51)，分别将USP的过表达质粒PCDH-USP(USP替换为相应的USP1、USP3、USP10、 USP12、USP15、USP18、USP21、USP22、USP33、USP44、USP46和USP51) 与Ascl1的过表达质粒PCDH-Ascl1同步骤一利用脂质体转染的方式共转入 293T中得到共同过表达USP与Ascl1的293T作为相应的USP1、USP3、 USP10、USP12、USP15、USP18、USP21、USP22、USP33、USP44、USP46 和USP51组，以只过表达Ascl1的293T为对照(Control)，转染完成24小时后加入放线菌酮(CHX)进行处理，在CHX处理后的30分钟分别收集共同过表达USP与Ascl1的293T和只过表达Ascl1的293T，裂解提取蛋白， Western Blot检测Ascl1蛋白的含量并统计相对含量，结果如图2中A和B 所示，发现USP10相对于USP家族中的其他分子在与Ascl1共同过表达的情况下，Ascl1蛋白的稳定性明显升高，说明USP10可显著提高Ascl1蛋白的稳定性。
将带有标签Flag的USP10(Flag-USP10)的过表达质粒 PCDH-3Flag-USP10(获得方式同实施例1中的PCDH-Ascl1的构建过程)与带有标签HA的Ascl1(HA-Ascl1)的过表达质粒PCDH-3HA-Ascl1(获得方式同实施例1中的PCDH-Ascl1的构建过程)同步骤一利用脂质体转染的方式共转入293T中，得到共同过表达Flag-USP10与HA-Ascl1的293T，即Flag-USP10+HA-Ascl1组；将带有标签HA的Ascl1(HA-Ascl1)的过表达质粒PCDH-HA-Ascl1利用脂质体转染的方式转入293T中，得到过表达 HA-Ascl1的293T，即Control+HA-Ascl1组。两组均在转染后24小时后加入 CHX进行处理，在CHX处理后的0，20，40，60分钟收集细胞。利用WesternBlot检验细胞中不同CHX处理时间HA-Ascl1蛋白和Flag-USP10蛋白的含量并统计Ascl1蛋白的相对表达量，结果如图2中C和D所示，发现用CHX 处理后的Flag-USP10+HA-Ascl1组中共同过表达Flag-USP10与HA-Ascl1的 293T中Ascl1蛋白的含量和相对表达量随CHX处理时间的延长相较于Control+HA-Ascl1组来说变化较小，Ascl1的半衰期延长，说明USP10可明显延长Ascl1的半衰期。
四、USP10对Ascl1去泛素化的试验
将步骤三中的过表达质粒PCDH-3flag-USP10与PCDH-3HA-Ascl1利用脂质体转染的方式共转入293T中，得到共同过表达Flag-USP10与HA-Ascl1 的293T，转染36小时后将细胞裂解获得蛋白裂解液(取部分蛋白裂解液作为input组)，用带HA抗体的磁珠与部分蛋白裂解液孵育，4℃过夜，收集带HA抗体的磁珠(作为IP:HA组)，用带IgG抗体(非特异抗体)的磁珠与部分蛋白裂解液孵育，4℃过夜，收集带IgG抗体的磁珠(作为IgG组，即对照组)，利用Western Blot验证Ascl1与USP10的体内结合情况(图3 中A)，结果显示：与对照组相比，IP:HA组中HA的磁珠可以明显的将 HA-Ascl1和Flag-USP10共同拉下，说明Ascl1与USP10在体内有较强的结合作用。
将Ascl1基因构建入pet28a质粒得到质粒pet28a-Ascl1和将USP10基因构建入PGEX-6P-1质粒得到质粒PGEX-6P-1-USP10(获得方式同实施例1 中的PCDH-Ascl1的构建过程)；利用钙离子热激法(具体方法为：将约100 μg质粒加入50μl感受态状的BL21细胞液中，冰浴30min后，放于42℃热击90s，然后冰浴2.5min即可)分别将质粒pet28a-Ascl1和 PGEX-6P-1-USP10转入BL21感受态细胞，分别获得含有pet28a-Ascl1和PGEX-6P-1-USP10的BL21细胞后，分别培养于5ml LB培养基，37℃，250 转摇过夜；以体积比为1：100转入200ml LB培养基，37℃，250转，2小时；以16℃，250转，过夜培养。分别向PGEX-6P-1-USP10的BL21细胞和pet28a-Ascl1的BL21细胞中加入IPTG(异丙基β半乳糖苷，终浓度为 0.5mM)，30℃恒温培养摇床中，250rpm，培养4小时诱导蛋白表达，离心，收集菌体沉淀，PBS内冰浴超声破碎菌体，4℃，12000g，10min收集上清，即分别得到GST-USP10蛋白溶液和His-Ascl1蛋白溶液。用Glutathione Sepharose 4B珠子(GE Healthcare)分别与GST和GST-USP10蛋白溶液孵育后分别与His-Ascl1蛋白溶液4℃孵育过夜，收集Glutathione Sepharose 4B珠子得His-Ascl1 GST组和His-Ascl1 USP10组。Western Blot验证体外Ascl1 与USP10的直接结合情况，利用Ascl1抗体检测收集的Glutathione Sepharose 4B珠子中(pull down)和Ascl1蛋白溶液(WCE)中Ascl1的蛋白量，用GST 抗体检测Glutathione Sepharose 4B珠子中GST和GST-USP10的蛋白含量，结果如图3中B所示，结果显示：His-Ascl1 USP10组相比于His-Ascl1 GST组(只表达GST蛋白)中有很强的Ascl1信号，Glutathione Sepharose 4B珠子中也有明显的GST-USP10信号，说明Ascl1与USP10体外有很强的结合作用。
将过表达质粒PCDH-3Flag-Ascl1(获得方式同实施例1中的PCDH-Ascl1 的构建过程)、PCDH-3HA-Ubiquitin(获得方式同实施例1中的PCDH-Ascl1 的构建过程)和PCDH-USP10(获得方式同实施例1中的PCDH-Ascl1的构建过程)利用脂质体转染的方式共转入293T中，得到共同过表达Flag-Ascl1、 HA-Ubiquitin(Ub)和USP10的293T，作为HA-Ub+Flag-Ascl1 USP10组，以共同过表达Flag-Ascl1、HA-Ubiquitin(Ub)的293T作为HA-Ub+Flag-Ascl1Control组(即对照组)。转染36小时后将细胞裂解获得蛋白裂解液(WCE)，用连有Flag抗体的磁珠与蛋白裂解液孵育，4℃过夜，收集连有Flag抗体的磁珠，通过连有Flag抗体的磁珠拉下Ascl1，Western Blot检测Ascl1的泛素化情况，即用HA的抗体标记Ub分子，同时用Flag的抗体和USP10的抗体标记蛋白裂解液中Ascl1和USP10的表达量。结果如图3中C所示，拉下 Ascl1后用HA的抗体标记HA，因为Ub带HA标签，所以HA的信号可以代表Ub分子，因此Ascl1(Ub)n代表Ascl1分子上的的Ub信号；IP:Flag代表拉下Flag蛋白，IB:HA代表抗体标记HA蛋白。结果表明：与对照组相比，HA-Ub+Flag-Ascl1 USP10组中在过表达USP10的情况下Ascl1泛素化水平明显降低，说明USP10在体内可以很明显的清除Ascl1的泛素分子。
通过以上试验结果证明USP10可以直接结合Ascl1并使其去泛素化。
实施例2诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞
1、腺病毒载体构建
首先通过限制性内切酶Ecor1和Kpn1切割及T4连接酶连接的方式将 USP10基因(CDS序列，如SEQ ID NO.1所示)和Ascl1基因(CDS序列，如 SEQ ID NO.2所示)连接到pENTRTM 3C-GFP Dual SelectionVector(pENTR) (Invitrogen)载体上，得到pENTR-USP10和pENTR-Ascl1质粒。然后利用 pENTRTM 3C-GFP Dual SelectionVector和pAD载体上的重组序列，以重组酶 (CRE)重组的方式将USP10和Ascl1的基因序列构建到腺病毒pAD载体上，即通过用LRCIonase II酶混合物，使pAD载体上的attR1、attR2与PEIG质粒上的attL1、attL2发生LR同源重组，将外源性基因转移到pAD载体上，反应体系为1μL pAD载体、1μLpENTR-USP10或pENTR-Ascl1、0.5μL LR Clonase II混合物，室温反应4小时，得到pAD-USP10和pAD-Ascl1质粒。
2、腺病毒包装
293A细胞，50万孔，铺于六孔板中，37℃培养过夜。同时将步骤1获得的pAD-USP10和pAD-Ascl1质粒(5μg)利用PacI酶切并回收，得到线性的 pAD-USP10和pAD-Ascl1质粒；将线性的pAD-USP10和pAD-Ascl1质粒利用脂质体转染的方式转入293A中，在新鲜含10％FBS的DMEM培养基培养一天。消化传代至10cm培养皿中，传代的步骤如下：当细胞的覆盖面积达到培养皿的80％时，吸弃培养液，用5mL无菌的PBS清洗细胞一次，尽量去除残留的培养液；加入2.5mL用无菌PBS配置的0.05％的消化液-胰酶，常温下静置2min以消化贴壁的细胞；待细胞开始部分脱落时，吸弃消化液，加入5mL 的高糖DMEM(10％FBS)以终止消化，细胞吹悬并置于无菌离心管中，水平离心1200rpm，5min；弃去上清，对于细胞系传代，加入10mL高糖DMEM (10％FBS)吹悬细胞，将细胞全部接种至10cm培养皿中。继续培养，隔天换液，直至85％-90％细胞脱落，收集培养液和细胞，放于-80℃，反复冻融2次，得P1腺病毒。用P1腺病毒感染293A，直至85％-90％细胞脱落，收集培养液和细胞，放于-80℃，反复冻融2次，得P2腺病毒。同上，得P3腺病毒 (即包装好的Ascl1和USP10腺病毒颗粒)，可用于后续实验。
3、小鼠成纤维细胞细胞的制备
选取孕14.5天的小鼠胚胎，去头、尾、脊柱、内脏和生殖腺后，取皮肤组织，用2mg/ml木瓜蛋白酶(Papain)消化5分钟后，把消化后的皮肤组织铺到含有DMEM加10％胎牛血清的10厘米培养皿中，进行培养，2天后传代一次，获得小鼠成纤维细胞。
4、病毒感染
将6万个小鼠成纤维细胞铺到24孔板的一个孔，将包装好的Ascl1和 USP10腺病毒颗粒(P3腺病毒)感染成纤维细胞，将Ascl1基因和USP10基因导入成纤维细胞，得到导入Ascl1基因和USP10基因的成纤维细胞。感染步骤：第一次感染：取P3腺病毒，以Ascl1(15MOI)+Usp10(15MOI)的量与Polybrene终浓度为4mg/ml混匀后，加于孔板中，并混匀，8小时后换过渡培养基(低糖DMEM加5％血清)。第二次感染：同第一次感染。
5、转分化神经元细胞
将导入Ascl1基因和USP10基因的成纤维细胞在神经元培养基培养，隔天半量换液(吸弃1/2体积的原神经元培养基，加1/2体积的新鲜的神经元培养基)，依此隔天半量换液，诱导培养7天后，得到转分化细胞，进一步鉴定转分化细胞是否为神经元细胞。
其中，所述神经元培养基由低糖DMEM培养基(1g/L L-葡萄糖)(购自 Invitrogen，货号是11885-084)、Ham`s F12(Ham`s Nutrient Mixture F12，购自Invitrogen，货号是31765035)、Neural basal培养基(购自Invitrogen，货号是21103-049)、非必需氨基酸(Non-essential amino acid，购自Invitrogen，货号是11140-050)、Glutamax(谷氨酰胺替代物，购自Invitrogen，货号是 10565-018)、胎牛血清(Fetal Bovine Serum，购自Biochrom，货号是S4115)、 B-27添加剂(购自Invitrogen，货号是17504-044)、脑源性神经营养因子(简称BDNF，购自Peprotech，货号是450-02)、视黄酸(Retinoic Acid，简称RA，购自Sigma，货号是R2625)和Forskolin(腺苷酸环化酶激活剂，购自Sigma，货号是F6886)组成。
其中，各组分在神经元培养基的含量分别为：低糖DMEM培养基(1g/L L- 葡萄糖)的体积含量为38.4％、Ham`s F12的体积含量为38.4％、Neural basal 培养基的体积含量为19.2％、非必需氨基酸的体积含量为0.5％、Glutamax的体积含量为1％、胎牛血清的体积含量为0.5％、B-27添加剂的体积含量为2％、脑源性神经营养因子的含量为10ng/mL、视黄酸的含量为0.5μM和Forskolin 的含量为20μM，其中，所述脑源性神经营养因子、视黄酸和Forskolin用Ham`s F12溶解。
6、神经元细胞鉴定
免疫组化染色：将转分细胞通过4％多聚甲醛固定，之后用5％BSA封闭，之后分别用兔的一抗(即初级神经元抗体Tuj1、分化成熟神经元抗体Map2和γ-氨基丁酸抗体GABA)孵育过夜，第二天用PBS洗3遍，然后用荧光蛋白(cy3) 链接的驴抗兔的二抗孵育1小时，在荧光显微镜下观测不同抗体的阳性细胞数量的免疫组化染色结果并对免疫组化染色结果中不同抗体的阳性细胞的数量比进行统计。
以上试验作为试验组，即Ascl1+Usp10组；将Ascl1基因和USP10基因替换为Ascl1基因按照步骤1-5进行试验作为对照组，即Ascl1+control组。
初级神经元抗体Tuj1和分化成熟神经元抗体Map2的免疫组化染色结果及 Map2细胞与Tuj1细胞的数量比如图4所示，从图中可以看出，Ascl1+Usp10 组与Ascl1+control组相比，Map2细胞与Tuj1细胞的数量比更高，即分化成熟神经元细胞与初级神经元细胞的数量比更高，表明通过病毒感染的方式在鼠成纤维细胞中共同过表达Ascl1和USP10时得到的转分化细胞为神经元细胞，且USP10可以显著促进诱导神经元细胞的成熟。
γ-氨基丁酸抗体GABA的免疫组化染色结果及GABA细胞数占GFP细胞数的百分比如图5所示，从图中可以看出，Ascl1+Usp10组与Ascl1+control 组相比，GABA细胞数占GFP细胞数的百分比更高，即GABA能神经元占感染病毒的所有细胞的百分比更高，表明在USP10作用下转分化得到的神经元细胞是GABA能神经元细胞。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院动物研究所
<120> USP10基因和/或Ascl1基因在诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的应用及
方法
<130> JLP21I1322
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2382
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccctcc acaacccaca gtatatcttt ggcgatttca gccctgatga attcaatcag 60
ttttttgtga ctccccgctc ttctgttgag ctccctccat acagtgggac tctgtgtagc 120
atacaggctg aagatgaact gccagatgca ggacaggagc accagaggat cgagtttggt 180
gtagatgaag tcatcgaacc tagtgagggg ctgccgccaa ctcctagcta cagtatttca 240
agcaccttga acccccaggc acccgaattt atccttggtt gtacgacttc taaaaagatc 300
cctgaagccg ttgaaaaaga tgagacctac agctccattg accagtaccc cgcctcggcc 360
ttggctctgg aaagcaactc taacgcagag gctgagaccc tggagaacga cagtggtgcc 420
ggcggccttg gtcagaggga acggaaaaag aagaagaagc ggccccctgg gtactacagt 480
tatttgaaag atggcggtga ggacagtgct tccccagcca ccctggtcaa cggccatgcc 540
acctcagtgg gcacgagcgg cgaggctgtg gaggacgccg agttcatgga cgtgcttcct 600
ccagtcatgc ccaggacttg tgacagccct cagaatcctg tggacttcat cagtggccct 660
gtccctgaca gtccgttccc caggacacta ggaggcgatg ccaggactgc agggctgtgt 720
gagggctgcc atgaagctga ctttgagcag ccctgcctcc ctgcagacag cctgctaagg 780
acagctggga cgcagcccta cgttggcacc gatactactg agaacttcgc agttgctaat 840
gggaaaatac ttgaatcccc gggcgaggac actgctgcca acggggcaga actgcacacc 900
gacgagggtg cagacctgga ccctgcgaag ccggagagcc agtcacctcc tgccgaaagt 960
gcgctctctg cctctggcgc catccccatt agccagcctg caaagtcctg ggctagtctc 1020
tttcatgatt ctaagccctc tgcctcctca cccatggcgt atgtggaaac taagtgttcc 1080
ccccctgtcc catcccccct ggcctctgaa aaacagatgg aagtcaaaga agggcttgtt 1140
ccagtgtcag aggatcctgt agccataaag attgcagagt tattggagac tgtaacccta 1200
atacataagc cagtgtcatt gcaaccccgt gggctgatca ataaaggaaa ctggtgctac 1260
attaatgcca ccctgcaggc attggtggct tgccctccga tgtatcacct gatgaagttc 1320
attcctctgt actcaaaagt gcagcggcct tgcacatcaa cgcccatgat agatagcttt 1380
gttcggctca tgaatgagtt cactaacatg ccagtgcctc ccaaaccccg ccaagctctc 1440
ggggataaaa tcgtgagaga tatccgccca ggggctgcct ttgaacccac atacatatac 1500
agactcctga cagtcatcaa gtcgagcctg tctgaaaagg gccggcagga ggacgcagag 1560
gagtatctag gtttcatcct caatggactc catgaagaga tgctgagcct gaagaagcta 1620
ctctcaccca cgcacgaaaa acactctgtt tccaatgggc ccagaagcga cttgatagag 1680
gacgaggagc tggaagacac gggcaagggc agcgaggacg agtgggagca agtgggtccc 1740
aagaataaga cgtccatcac ccggcaggcg gacttcgtcc agacgcccat cactggcatt 1800
tttgggggac acatcaggtc tgtggtctac cagcagagtt ccaaagagtc agctactctg 1860
caactgtttt tcacgctgca gttggacatc cagtctgaca agatacgcac agtccaggat 1920
gcgctggaga gcttggtggc cagggagtct gtccaaggtt acaccaccaa aaccaagcag 1980
gaggttgagg tgagccgcag agtgactctg gagaagctgc cccctgtcct cgtgctccac 2040
ctgaagcgct ttgtctatga gaagacaggt ggatgccaga agctggtcaa gaacattgac 2100
taccctgtgg acttggagat cagcagagaa ctactttctc caggcatcaa aaataaaaat 2160
tttaaatgcc agagaaccta taggctgttt gcagtggtct accaccatgg caacagcgct 2220
acaggcggcc actacactac ggacgtcttc cagattgggc ttaatggctg gctacgaatc 2280
gatgaccaaa cggtcaaggt tattaaccag taccaggtgg tgaaaccgcc tgccgaccgc 2340
acagcctacc tcctatatta ccgccgcgtg gacctgctgt aa 2382
<210> 2
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggagagct ctggcaagat ggagagtgga gccggccagc agccgcagcc cccgcagccc 60
ttcctgcctc ccgcagcctg cttctttgcg accgcggcgg cggcggcagc ggcggcggcc 120
gcggcagctc agagcgcgca gcagcaacag ccgcaggcgc cgccgcagca ggcgccgcag 180
ctgagcccgg tggccgacag ccagccctca gggggcggtc acaagtcagc ggccaagcag 240
gtcaagcgcc agcgctcgtc ctctccggaa ctgatgcgct gcaaacgccg gctcaacttc 300
agcggcttcg gctacagcct gccacagcag cagccggccg ccgtggcgcg ccgcaacgag 360
cgcgagcgca accgggtcaa gttggtcaac ctgggttttg ccaccctccg ggagcatgtc 420
cccaacggcg cggccaacaa gaagatgagc aaggtggaga cgctgcgctc ggcggtcgag 480
tacatccgcg cgctgcagca gctgctggac gagcacgacg cggtgagcgc tgcctttcag 540
gcgggcgtcc tgtcgcccac catctccccc aactactcca acgacttgaa ctctatggcg 600
ggttctccgg tctcgtccta ctcctccgac gagggatcct acgaccctct tagcccagag 660
gaacaagagc tgctggactt taccaactgg ttctga 696
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctagaatgg agagctctgg caagatg 27
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaattctcag aaccagttgg taaagtcc 28

Claims (9)

1.USP10基因和Ascl1基因在体外诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的应用或在制备诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用中USP10基因是通过对Ascl1去泛素化诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述神经元细胞是GABA能神经元细胞。
4.一种体外诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将Ascl1基因和USP10基因导入成纤维细胞，得到导入Ascl1基因和USP10基因的成纤维细胞；
用神经元培养基诱导培养导入Ascl1基因和USP10基因的成纤维细胞，得到神经元细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述成纤维细胞为鼠成纤维细胞。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述Ascl1基因和USP10基因使用腺病毒载体导入成纤维细胞中。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述神经元培养基由以下组分组成：低糖DMEM培养基、Ham`s F12、Neural basal培养基、非必需氨基酸、Glutamax、胎牛血清、B-27添加剂、脑源性神经营养因子、视黄酸和Forskolin。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述各组分在神经元培养基的含量分别为：低糖DMEM培养基的体积含量为38.4%、Ham`s F12的体积含量为38.4%、Neural basal培养基的体积含量为19.2%、非必需氨基酸的体积含量为0.5%、Glutamax的体积含量为1%、胎牛血清的体积含量为0.5%、B-27添加剂的体积含量为2%、脑源性神经营养因子的含量为10ng/mL、视黄酸的含量为0.5 μM和Forskolin的含量为20 μM。
9.权利要求4-8任一所述的方法获得的神经元细胞。
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