JP3994088B2 - 薬物トランスポーター及びその用途 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、新規な薬物トランスポーターの用途に関する。更に詳細には、ＡＢＣＡ８として知られているＡＢＣトランスポーターの新規な用途に関し、ＡＢＣＡ８の活性を促進又は阻害する化合物のスクリーニング方法、薬剤耐性克服薬としての使用等に関する。
背景技術
薬剤が薬としての効果を発揮するには、薬剤が体内に入り十分な時間、適切な薬効濃度でターゲット部位に存在しなければならない。薬剤代謝酵素と薬物トランスポーターは薬物の体内動態プロファイル（吸収、分布、代謝、排泄及びターゲット部位における薬剤実効濃度）を規定し、薬剤の全体的な薬理効果が決定される。ターゲット部位における薬剤実効濃度が低い場合には薬理効果が期待できず、一方、ターゲット部位における薬剤濃度が高い場合には副作用の起こることが予想される。
従って、良好な薬理効果を得るためには、薬物トランスポーター（流入及び排出）と薬物代謝酵素との共同作用によってターゲット部位における薬剤実効濃度が制御される必要がある。
薬物トランスポーターは小腸や腎臓の上皮細胞、肝細胞、脳血管内皮細胞に発現して薬物の体内動態においてきわめて重要な役割を果たしている。薬物トランスポーターは、小腸上皮細胞や脳血管内皮細胞に発現し、経口的に又は非経口的に投与された薬剤のバイオアベイラビリティーや中枢神経系への薬剤移行に大きく影響を与える。一方、癌の化学療法の分野においてはＰ−糖蛋白（ＭＤＲ１）やＧＳ−Ｘポンプ（ＭＲＰ）が過剰発現すると制癌剤に対して癌細胞が耐性になることが知られている。このようなＭＤＲ１及びＭＲＰはＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターファミリーに属するトランスポーターである。
ＡＢＣトランスポーターファミリーはＡＴＰ結合カセットや、特徴的な膜貫通領域を有しており、ＡＴＰに依存した内因的物質や異物、それらの代謝物の輸送に関与することが明らかになっている。近年において、多くのＡＢＣタンパク質遺伝子が発見され、現時点で５０以上のものが知られている。
ＡＢＣトランスポーターが薬剤の小腸による吸収や脳への移行に関与していることが明らかになってきている。
上述したように、薬剤が薬としての効果を発揮するためには薬物トランスポーターの役割が重要である。
本発明は、上述したような薬物トランスポーター活性を有するタンパク質、薬物トランスポーターの活性を促進又は阻害する化合物のスクリーニング方法、該方法を用いて得られる化合物、薬物トランスポーターに対する抗体又はそれを含有する医薬組成物等を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明者らは、鋭意検討した結果、ＥＳＴ−データベース（Ｇｅｎｅｂａｎｋデータベース）をスクリーニングすることにより得られた、特定の塩基配列を有するＤＮＡから発現されるタンパク質の解析を行い、該タンパク質が薬物トランスポーター活性を有するという知見を得、本発明を完成した。
すなわち、本発明者らは、Ｇｅｎｅｂａｎｋでブラスト・サーチをかけて、膜貫通部分とＡＢＣとを有するタンパク質のスクリーニングを行い、以下に説明する本発明を完成した。
また、ＡＢＣＡ８と命名されている薬物トランスポーター（薬物動態、Ｘｅｎｏｂｉｏ．Ｍｅｔａｎｏｌ．Ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓ．１５（１）：８−１９（２０００）；ヒトＡＢＣトランスポーター遺伝子の新命名法）の機能を解明するため、機能研究を進め、ｋ該薬物トランスポーターが抱合型ビリルビンやインドキシル硫酸等の有機アニオン化合物を輸送する活性を有するという知見を得、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、薬物トランスポーター活性を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、薬物トランスポーター活性を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を提供するものである。
また、本発明は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、有機アニオン輸送活性を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、有機アニオン輸送活性を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を提供するものである。
また、本発明は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の活性を促進又は阻害する化合物のスクリーニング方法を提供するものである。
また、本発明は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の基質となる化合物のスクリーニング方法を提供するものである。
また、本発明は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の活性を促進又は阻害する化合物のスクリーニング用キットを提供するものである。
また、本発明は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の基質となる化合物のスクリーニング用キットを提供するものである。
また、本発明は、上記スクリーニング方法又は上記スクリーニング用キットを用いて得られる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の活性を促進又は阻害する化合物、又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の基質となる化合物を提供するものである。
また、本発明は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、薬物トランスポーター活性を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、薬物トランスポーター活性を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩、又は
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、有機アニオン輸送活性を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、有機アニオン輸送活性を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を含有する医薬組成物を提供するものである。
また、本発明は、上記化合物またはその塩を含有する医薬組成物を提供するものである。
また、本発明は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩に対する抗体を提供するものである。
また、本発明は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換ベクターを提供するものである。
また、本発明は、上記組換ベクターで形質転換された形質転換体を提供するものである。
また、本発明は、上記形質転換体を培養し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を生成、蓄積し、該タンパク質を採取することを特徴とする、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の製造方法を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において用いられる配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質（以下、本明細書において、本発明の薬物トランスポーターともいう）について説明する。
上記タンパク質は、例えば人やその他の温血動物等に由来するタンパク質であってもよく、または合成タンパク質であってもよい。また、後述する、本発明の薬物トランスポーターの製造方法によって得られる、いわゆる組換えタンパク質であってもよい。
本発明においては、財団法人かずさＤＮＡ研究所から得たＥＳＴ−データベースからスクリーニングしたＤＮＡを用い、該ＤＮＡから生産した組換タンパク質を用いる。なお、該ＤＮＡはヒト脳から得られた全長ｃＤＮＡの１つとしてクローニングされ、ＮＣＢＩ（米国バイオテクノロジー情報センター）に、寄託番号ＡＢ０２０６２９として寄託されており、５６７７塩基対を有する。また、該ＤＮＡの情報についてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｈｕｇｅ／ｇｆｐａｇｅ／ＫＩＡＡ０８２２／に記載されている。
本明細書において、「実質的に同一」とは、タンパク質の活性、例えば薬物輸送活性（ＡＢＣトランスポーター活性）等が実質的に同一であることを意味する。一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加された場合、その欠失、置換又は付加がなされたタンパク質は欠失、置換又は付加されていないものと実質的に同一である。
一般的に、配列番号：１で表わされる全アミノ酸配列との相同性の程度が、全体の約８０％以上、好ましくは９０％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であれば、実質的に同一であると解釈される。従って、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の一部（好ましくは１〜２０個、更に好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなるタンパク質も実質的に同一である。
本発明の薬物トランスポーターとしては、例えば有機アニオン輸送活性を有するものが挙げられる。有機アニオンとは、アニオン基を有する有機化合物のことを意味する。上記有機アニオンとしては、例えば有機アニオン性抗がん剤及び有機アニオン性抗ＨＩＶ剤等が挙げられる。有機アニオン性抗がん剤としては、例えばｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ、ｍｏｎｏｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｙｌｔｈｉｏｔｅｐａ、ａｒｓｅｎｉｃ ｔｒｉｏｘｉｄｅ等が挙げられ、有機アニオン性抗ＨＩＶ剤としては、例えば９−（２−ｐｈｏｓｐｈｏｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）ａｄｅｎｉｎｅ（ＰＭＥＲ）、ｉｎｄｉｎａｖｉｒ、ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ、ｒｉｔｏｎａｖｉｒ、ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ等が挙げられる。
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質としては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡで形質転換された形質転換体を用いて製造されたものを用いることができる。
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡが用いられる。また、配列番号：２で表わされるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
配列番号：２で表わされるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以上、更に好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡである。ハイブリダイゼーションは、従来より公知の方法、又はそれに準ずる方法、例えばモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合には、添付された使用説明書に記載された方法に従って行うことができる。本明細書に置いて、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）でプローブをラベルした場合に、３２℃のＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）中でハイブリダイズさせ、４０℃の０．１ｘＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１ｘＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）でのサザンブロットハイブリダイゼーションで本発明ＤＮＡプローブにハイブリダイズする程度の条件をいう。
上記配列番号：２で表わされるＤＮＡ、又は配列番号：２で表わされるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡをクローニングする手段としては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質の部分等の適当な塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｑ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素キット（インビトロジェン社）等を用いて、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法などの公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。クローン化されたポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換ベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作製することが出来る。例えば、（１）配列番号：２で表わされるＤＮＡ、又は配列番号：２で表わされるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ断片を切り出し、（２）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８又はｐＵＣ１１８）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５又はｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９又はｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス又はバキュロウイルスなどの動物ウイルス等を利用することが出来る。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ＸＹＬプロモーター、ＨＷＰプロモーター、ＣＷＰプロモーターなどが、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。また、昆虫細胞を宿主として用いる場合はポリヘドリンプロモーター、ＯｐｌＥ２プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合、がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされた蛋白質を他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ及びプロテインＡ）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、部位特異的プロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することが出来る。
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）），ＪＭ１０３（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）），ＪＡ２２１（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）），ＨＢ１０１（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９））、ＤＨ５α及びＪＭ１０９等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）），２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕及びバチルス・ブレビス等が用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びハンセヌラ・ポリモーファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）等が用いられる。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞及びＨＥＫ２９３細胞などが用いられる。
上述した宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことが出来る。例えば、以下に記載の文献に宿主細胞を形質転換する方法が記載されている。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）；Ｇｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）；細胞工学別冊８ 新 細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及びＶｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）。
上述のようにして得られた、配列番号：２で表わされるＤＮＡ、又は配列番号：２で表わされるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡを含む、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質の遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体は、公知の方法に従って培養される。例えば、宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約１２〜４８時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常、約３０〜４０℃で約１２〜１００時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培養は通常、ｐＨ約５〜８に調整された培地を用いて約２０℃〜３５℃で約２４〜１００時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、ｐＨは約６〜８に調整された培地を用いて、通常約３０℃〜４０℃で約２４〜１００時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
上記培養物から配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を分離精製する方法としては、例えば、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る方法が挙げられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標）などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。こうして得られた本発明ポリペプチド（蛋白質）は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。更に、組換え体が産生する蛋白質を、精製前または精製後に、トリプシン及びキモトリプシンのような適当な蛋白分解酵素を作用させることにより、任意に断片化することもできる。また、キナーゼ等のタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えることもできる。本発明の薬物トランスポーター又はその塩の存在は、様々な結合アッセイ及び特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ等により測定することができる。
上述した、本発明の薬物トランスポーターは、以下に述べるように化合物をスクリーニングするために用いたり、抗体を産生するために用いることができ、また本発明の薬物トランスポーターをコードするＤＮＡを含有する組換ベクターで形質転換された形質転換体を用いて体外循環型人工臓器を製造することができる。
また、本発明の薬物トランスポーターは、薬物、特に有機アニオン性抗ガン剤や有機アニオン性抗ＨＩＶ剤等の有機アニオン等を特異的に輸送することのできるタンパク質であるので、それ自体を医薬組成物として用いることが可能である。例えば、抗ガン剤や免疫抑制剤を部位特異的に投与したり、毒物を排除するための医薬組成物として用いることができる。具体的には、本発明の薬物トランスポーターの膜通過ドメイン領域を切除し、薬物とＡＴＰ結合カセット領域のみのタンパク質を作製したり、またターゲット部位に特異的な抗体を先導させ、部位特定的に薬物を輸送することができる。また、本発明の薬物トランスポーターと有機アニオン性抗がん剤又は有機アニオン性抗ＨＩＶ剤とを含む医薬組成物として用いてもよい。
また、本発明の薬物トランスポーターは、抱合型ビリルビンを輸送する活性を有するので、肝機能不全治療を目的とした医薬組成物として使用することができる。
また、本発明の薬物トランスポーターは、インドキシル硫酸を輸送する活性を有するので、腎機能不全治療を目的とした医薬組成物として使用することができる。
また、本発明の薬物トランスポーターは、本発明の薬物トランスポーターの基質となり得る化合物をスクリーニングするために用いることができる。本発明の薬物トランスポーターによる輸送効率を、あらかじめ開発中の化合物に対して評価することにより、その化合物のバイオアベイラビリティーを推定することが可能となる。
以下、本発明の化合物のスクリーニング方法について説明する。
本発明のスクリーニング方法は、上述のようにして得られた、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を用いて、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の活性を促進又は阻害する化合物のスクリーニング方法である。
本発明の化合物のスクリーニング方法において用いられるタンパク質は、通常Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルエステルなどが挙げられる。
また、上記タンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものを用いることもできる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明の蛋白質には、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン酸残基がピログルタミン化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上にある、例えばＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＳＨなどが適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
また、上記部分ペプチドとは、前記タンパク質の部分ペプチドであって、実質的に同質の活性を有するものであれば、いずれのものも用い得る。例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有し、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の生物学的活性を有するペプチドなどが用いられる。又、上記部分ペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、前記した本発明の蛋白質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。さらに、上記部分ペプチドには、前記した本発明の蛋白質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
上記タンパク質又はその部分ペプチドの塩としては、特に生理学的に許容される酸付加塩であることが好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法は、上記配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする。
上記タンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の活性を促進又は阻害する化合物をスクリーニングする方法としては、従来公知の方法を用いることができる。具体的には、上記タンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の薬物トランスポーター活性を測定し、次いで上記タンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の活性を促進又は阻害する化合物の候補となる化合物を混合して薬物トランスポーター活性を測定し、両者の活性を比較することにより行う。
具体的な方法としては、上記タンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡに対するｃＤＮＡ、又はｃＤＮＡを逆転写酵素によりＲＮＡ化したものを細胞内にインジェクションし、標識した化合物（例えば、放射活性物質、酵素及び蛍光物質等により標識した化合物）と共にインキュベートし、一定時間経過後に、細胞内に取り込まれた放射活性、酵素活性又は蛍光強度等を測定することにより実施することができる。また、促進又は阻害する化合物のスクリーニングは、上述系中に、候補化合物を混合し、インキュベートした後、放射活性、酵素活性又は蛍光強度等を測定し、候補化合物を混合していない場合と比較することにより実施する。
また、上記タンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩をコードするＤＮＡを含有する組換ベクターで形質転換された形質転換体を接着させたビーズを、多穴を有する（例えば９６穴）マイクロプレートに入れ、標識した化合物（例えば、放射活性物質、酵素及び蛍光物質等により標識した化合物）と共にインキュベートし、一定時間経過後に、形質転換細胞内に取り込まれた放射活性、酵素活性又は蛍光強度等を測定することにより実施することができる。また、促進又は阻害する化合物のスクリーニングは、上述系中に、候補化合物を混合し、インキュベートした後、放射活性、酵素活性又は蛍光強度等を測定し、候補化合物を混合していない場合と比較することにより実施する。
上述のように、化合物の標識は放射活性物質、酵素及び蛍光物質等により実施することができるが、酵素標識及び蛍光標識等によれば、アイソトープ施設を使用せずに実施できる。上述したように、本発明のスクリーニング方法においては、放射活性物質、酵素又は蛍光物質等により標識した化合物を用いて実施することができるが、化合物を標識する方法は例示したものに限定されず、従来公知のどのような方法によっても標識することができる。
なお、上記候補化合物としては、種々のものが用いられ、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等に含まれる化合物が挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物は、新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
本発明のスクリーニング用キットは、上述したスクリーニング方法を実施するための材料を含んだものであり、例えばスクリーニング方法を実施するためのタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩、及びスクリーニングに用いる細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法又は本発明のスクリーニング用キットを用いて得られる、本発明の薬物トランスポーターもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の活性を促進又は阻害する化合物は、上記試験を行った化合物の中から選ばれた化合物であり、上記本発明の薬物トランスポーターもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の薬物トランスポーター活性を促進又は阻害する化合物である。このような化合物は、例えば薬物の薬理効果をコントロールするために利用することができる。例えば、ある特定の薬物の薬理効果を向上させたい場合、上記本発明の薬物トランスポーターもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩が、その薬物の細胞内への流入を促進する効果を有する際に、その効果を促進する化合物を投与することにより、その薬理効果を向上することができる。一方、薬理効果レベルと副作用レベルとの範囲が狭い薬物の場合、上記タンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物を投与することにより、副作用を低減することが可能である。
また、上記本発明の薬物トランスポーターもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩が、特定の薬物の細胞外への排出を促進する効果を有する場合には、薬理効果を向上させるために、阻害剤を投与する。
本発明の医薬組成物は、上記本発明の薬物トランスポーターもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の活性を促進又は阻害する化合物またはその塩を含有する。該化合物の塩としては、前述した、タンパク質の塩と同様のものが用いられる。
本発明の医薬組成物は、常套手段に従って、製剤化され、経口的または非経口的に投与することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤等として投与することができる。このようにして得られる製剤は安全かつ低毒性であり、ヒト又は温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等）に対して投与することができる。該化合物またはその塩の投与量は、その目的により異なる。
以下、本発明の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩に対する抗体について説明する。
本発明の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩に対する抗体は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。該抗体は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を抗原として用い、従来公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の作製方法について、以下に説明する。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、温血動物に対して皮下注射等の投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６、４９５（１９７５）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質抗原を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。ハイブリドーマの選択は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。増殖用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、標識化タンパク質と培養上清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより求めることができる。
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から血液を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやグロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。また、融合タンパク質を発現するＤＮＡと本発明の薬物トランスポーターを発現するＤＮＡとを融合したＤＮＡを作製し、これを用いて組換ベクターを作製し、この組換ベクターを適当な宿主に形質転換して、融合タンパク質を製造し、抗原として用いてもよい。融合タンパク質は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、標識化タンパク質と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
上述のようにして作製された抗体は、例えば上述したように、上記タンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物と同様に利用することができる。この場合、モノクローナル抗体を用いた場合は、上記タンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の阻害活性が単一であるため、使用しやすいという利点がある。
また、上述のようにして作製された抗体は、薬物トランスポーターに関する種々の診断に用いることが可能である。例えば、ヒト由来のサンプル（例えばバイオプシー等）を採取し、どのようなトランスポーターがどのくらいの量発現されているかを検査することに、上記抗体を用いることができる。
以下、本発明の体外循環型人工臓器について説明する。
本発明の体外循環型人工臓器は、細胞が付着したホローファイバーを備えてなり、該細胞が、上述した形質転換体であることを特徴とする。
肝臓は、物質代謝とその調節を担う臓器であり、種々の化合物の代謝や、内因性・外因性物質の解毒、排泄等の生体に必要な複雑かつ膨大な機能を担っている。従来より用いられている人工臓器としては、例えば人工透析等の装置に活性炭を入れ、薬物を吸着させている。しかし、このような人工臓器では、目的とする薬物以外に生体に必要な、例えば赤血球や血小板等の物質も除去してしまうという問題がある。
本発明の体外循環型人工臓器は、上記タンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換ベクターで形質転換された形質転換体が付着されている。従って、薬物の特異的な排出を行うことが可能となり、薬物中毒の治療に用いることができる。
例えば、本発明の薬物トランスポーターは、抱合型ビリルビンを輸送する活性を有するので、肝機能不全治療を目的として、本発明の薬物トランスポーターをコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された形質転換体を人工肝臓として用いることができる。すなわち、肝機能不全患者に適用することができる。例えば、ヒト肝由来のＨｅｐＧ２細胞に、薬物を特異的に分解するＰ４５０のｃＤＮＡとｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔすることにより、薬物の排出及び分解を行い、薬物中毒の治療を行うことができる。
また、本発明の薬物トランスポーターは、インドキシル硫酸を輸送する活性を有するので、腎機能不全治療を目的として、本発明の薬物トランスポーターをコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された形質転換体を人工腎臓として用いることができる。すなわち、腎機能不全患者に適用することができる。
また、本発明の人工臓器において用いられるホローファイバーとしては、従来から人工腎臓、人工肝臓等として用いられている多孔性のものが用いられる。ホローファイバーの材質としては、例えば親水性ポリオレフィン及びキュプラアンモニュームレーヨン等が挙げられる。また、ホローファイバーの膜厚は、通常、５〜７０μｍであり、好ましくは１０〜５０μｍである。また、膜の内径は、通常、１００〜４００μｍであり、好ましくは１８０〜３３０μｍである。さらに、孔径は、通常、０．０１〜３μｍであり、好ましくは０．１〜０．３μｍである。本発明の人工臓器におけるホローファイバーの膜面積は、通常、１５０〜３００ｃｍ２であり、好ましくは１６０〜２００ｃｍ２である。
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
メスの成熟アフリカツメガエルを浜松動物から購入し、通常の状態で飼育した後、ステージＶの卵母細胞を選択し、８８ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＫＣｌ，２．４ｍＭ ＮａＨＣＯ３，１５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，０．３ｍＭ ＣａＮＯ３，０．８２ｍＭ ＭｇＳＯ４，０．４１ｍＭ ＣａＣｌ２及び１０μｇ／ｍｌペニシリン及び１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む改変バース溶液（ＭＢＳ）中でインキュベートした。成熟したアフリカツメガエル卵母細胞に、従来公知の方法により、配列番号：１で表わされる塩基配列のＤＮＡを用いてｃＲＮＡを作製し、次いで得られたｃＲＮＡの水溶液をマイクロインジェクションした。マイクロインジェクションは、自動インジェクター（ＩＭ２００Ｊ，Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ，Ｊａｐａｎ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで５’末端をキャップしたｃＲＮＡ又は水５０ｎｌをインジェクションした。インジェクションした卵母細胞をＭＢＳ中で、毎日培地を交換しながら、１７℃で３日間培養した。３日培養後に卵母細胞は薬物トランスポーターを発現していた。
なお、上述したマイクロインジェクションの方法については、Ｏｈｋｉ Ｇ，Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｔ，Ｍｕｒａｔａ Ｍ，Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ Ｋ，Ｉｍａｉ Ｍ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｍ．Ａ ｃａｌｃｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｔｉｏｎ ｃｕｒｒｅｎｔ ｂｙ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ ｓｐｌｉｃｅｄ ｆｏｒｍ ｏｆ Ｔｒｐ３ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０００ Ｄｅｃ １５；２７５（５０）：３９０５５−６０に開示されている。
用いたｃＲＮＡは、かずさＤＮＡ研究所から得た、ヒト脳から得られた全長ｃＤＮＡの１つとしてクローニングされ、ＮＣＢＩ（米国バイオテクノロジー情報センター）に、寄託番号ＡＢ０２０６２９として寄託されているｃＤＮＡを逆転写して得られたものである。
培養した卵母細胞（ｎ＝１０〜２０）を、２〜３ｍｌの培地、及びアイソトープラベルした化合物と共に小さい培養器に入れた。アイソトープラベルした化合物の添加を行った後、経時的に細胞を少量サンプリングし、各卵母細胞を新しいＭＢＳで３回洗浄し、１０％ＳＤＳ溶液を用いて室温で３０分間溶解させた。なお、アイソトープラベルした化合物としては、ＡＢＣトランスポーターファミリーのメンバーの１つである、ＭＲＰ（多剤耐性関連タンパク質：ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）用モデルプローブである１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドを使用した。次いで、シンチレーションカクテル剤（ＡＣＳ２、アマシャム（株）製）を加えた後、卵母細胞に取り込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ−３５００，アロカ株式会社製）を用いて測定した。
図１に、１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドを用いた場合の結果を示す。この場合、培地中の１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの濃度は３７ｎＭであった。図１に示すように、ｃＲＮＡをインジェクションした卵母細胞中において、１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの摂取量は約６０分後までは直線的に増加した。１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの６０分後の細胞内への摂取量は１３８±５．５ｆｍｏｌ／ｈｒ／ｅｇｇであり、水をインジェクションしたグループにおいては、ほとんど無視できる程度であった（４ｆｍｏｌ／ｈｒ／ｅｇｇ）。図１に示す結果より、本発明の薬物トランスポーターは、上記化合物を細胞内に取り込む活性を有することがわかる。また、ビリルビンはアイソトープラベルすることが困難であるため、エストラジオールを用いて実験を行った。１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドを細胞内に取り込む活性を有することより、本発明の薬物トランスポーターは、抱合型ビリルビンを細胞内に取り込む活性を有することが明らかである。なお、１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドと抱合型ビリルビンとが類似の輸送特性を示すことについては、Ｓｕｚｕｋｉ Ｙ，Ｓｕｇｉｙａｍａ Ｙ．Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ＧＳＳＧ ａｎｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＭＲＰ １ ａｎｄ ｃＭＯＡＴ／ＭＲＰ２．Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ １９９８；１８（４）：３５９−３７６に記載されている。
１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの摂取は、動力学及びそれに続くミカエリス−メンテン式を示す（図２参照）。Ｋｍ及びＶｍａｘは、それぞれ３０．４μＭ及び８．３７ｐｍｏｌ／ｈｒ／ｅｇｇであった。
また、発現したタンパク質について、ハイドロパシー解析を行った。ハイドロパシー解析の結果を図３に示す。図３の結果から明らかなように、本発明の薬物トランスポーターは１４個の膜通過ドメイン、及び２個のＡＴＰ結合カセットを有していた。
実施例２
配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡによってコードされるタンパク質はＡＴＰ結合カセットを有しているので、１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの摂取におけるＡＴＰ依存性について試験を行った。試験は、上述した１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの摂取量の測定において、ＡＴＰを添加し、同様の操作を行い、１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの摂取最を測定した。結果を図４に示す。
図４に示すように、細胞内への１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの摂取は、ＡＴＰの濃度を上昇させると共に増加し、ＡＴＰ濃度５ｍＭまで増加した。この結果は、他のＡＢＣトランスポーターファミリーに属する遺伝子のデータと一致する。
実施例３
配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡによってコードされるタンパク質の阻害実験を行った。実験は、上述した１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの摂取量の測定において、反応培地中にあらかじめ各種の化合物を添加することにより、１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの摂取が阻害されるか否かを試験した。
用いた化合物は、以下の通りである。
ベラパミル：ＭＤＲの基質（添加量：１ｍＭ）
ジゴキシン：ＭＤＲの基質（添加量：０．２５ｍＭ）
ＭＳ−２０９：ＭＲＰの阻害剤（添加量：１０μＭ）
プロベネシド：ＯＡＴの基質（添加量：１ｍＭ）
シメチジン：ＯＣＴの基質（添加量：１ｍＭ）
ＭＫ−５７１：ＭＲＰの阻害剤（添加量：１０μＭ）
オクラトキシンＡ：ＭＲＰの基質（添加量：５０μＭ）
結果を図５に示す。図５に示されるように、ＭＫ−５７１及びＭＳ−２０９の添加により、シス阻害効果が示され、これらの化合物の添加により摂取量は約３０％にまで減少した。また、オクラトキシンＡも阻害効果を示した。また、ベラパミル及びジゴキシンは少量であるが阻害効果を示した。また、プロベネシドは少量の阻害を示したが、シメチジンは阻害効果を示さなかった。
以上の結果に示されるように、上述した系により、本発明の薬物トランスポーターの活性を阻害する化合物を検出する系を組むことが可能であり、本発明の薬物トランスポーターをコードするＤＮＡを用いることにより、本発明の薬物トランスポーターの活性を阻害する（促進する）化合物をスクリーニングする系を組むことが可能である。
更に、抗ガン剤の耐性克服剤として開発されたＭＳ−２０９、ＭＫ−５７１及びアニオン輸送活性を有するＭＲＰの基質であるオクラトキシンＡが阻害効果を示したことより、配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡによってコードされるタンパク質は有機アニオン輸送活性を有することが示された。また、有機アニオン性薬剤の薬剤耐性克服剤としての使用の可能性が示唆された。
実施例４
次に、種々のアイソトープラベル化合物の細胞への摂取について測定を行った。測定は、化合物として以下のものを使用した以外は実施例１と同様に行った。
ＬＴＣ４（ロイコトリエンＣ４）：ＭＲＰの基質（添加量：２０μＭ）
タウロコール酸：ＯＡＴの基質（添加量：１００μＭ）
ＴＥＡ（テトラエチルアンモニウム）：ＯＣＴの基質（添加量：１０ｎＭ）
ジゴキシン：ＭＤＲの基質（添加量：１００ｎＭ）
ドキソルビシン：ＭＤＲの基質（添加量：１０μｇ／ｍｌ）
ＰＡＨ（パラアミノ馬尿酸）：ＭＲＰ及びＯＡＴの基質（添加量：１ｍＭ）
結果を図６に示す。図６に示すように、ＰＡＨ、ＬＴＣ−４、タウロコール酸は卵母細胞に取り込まれ、ジゴキシンは排出（または本来の取り込みが阻害）されることがわかった。
また、図６に示す結果から明らかなように、本発明の薬物トランスポーターは、アニオン輸送活性を有するＭＲＰ又はＯＡＴの基質である、ＰＡＨ、ＬＴＣ４及びタウロコール酸を輸送する機能を有しており、カチオン輸送活性を有するＭＤＲ又はＯＣＴの基質である、ドキソルビシン及びＴＥＡについては輸送する機能を有していないことがわかる。
実施例５
ノーザンブロッティング法により、組織分布を測定し、本発明の薬物トランスポーターの組織分布を検討した。すなわち、以下の方法により、組織分布の測定を行った。種々の器官由来のヒト全ＲＮＡを有するトランスファーフィルターはＭＴＮ ｂｌｏｔ（クロンテック社製）を用いた。トランスファーフィルターを、ランダムなプライミングによって〔α−３２Ｐ〕−ｄＣＴＰでラベルしたプロープ（ｃＤＮＡの全長）を含むハイブリダイゼーション溶液（Ｑｕｉｃｋｈｙｂ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）中で、６８℃の温度で３時間ハイブリダイズした。次いで、フィルターを０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳにより５５℃の温度で３０分間洗浄を行い、２枚の増感紙（Ｋｏｄａｃ社製）に挟み、−７０℃の温度でＸ線フィルムに感光させた。ノーザンブロッティング法による結果は、本発明の薬物トランスポーターは多くの組織において検出されたが、特に心臓及び小腸において検出量は高かった（図示せず）。
実施例６
化合物として、３Ｈでアイソトープラベルした、尿毒素の一種であるインドキシル硫酸を２μＭ濃度で用いた以外は実施例１と同様に操作を行った。また、同時に、更にプロベネシドを１ｍＭ濃度で加えた系、及びｃＲＮＡに代え水を加えた系についても実験を行った。結果を図７に示す。
図７に示すように、水をインジェクションした系においては、３Ｈ−インドキシル硫酸の取り込みはほとんど観察されなかったが、ｃＲＮＡをインジェクションした系においては、３Ｈ−インドキシル硫酸の細胞内への取り込み量は経時的に比例して直線的に増加した。なお、プロベネシドの添加により、３Ｈ−インドキシル硫酸の細胞内への取り込み量は減少した。なお、推定Ｋｍは２５．５μＭであり、Ｖｍａｘは５．５ｐｍｏｌ／ｈｒ／ｅｇｇであった。
実施例７
本発明の薬物トランスポーターに対する抗体を作成した。免疫源としては、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）と配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の１３８０番目のグルタミン酸から１５７９番目のグルタミン酸までのペプチドとを融合させた融合タンパク質を抗原として用いた。免疫動物としては、ウサギ（日本白色種）の生後半年以内のものを用いた。
免疫は、抗原０．２ｍｇ〜０．４ｍｇを生理食塩水に溶解した抗原溶液を、２週間おきに４回〜７回、背皮内に投与した。初回免疫のみ、完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）を用い、その後の免疫には全て、不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）を用いた。最終免疫の１０日後に抗血清を集め、飽和硫酸アンモニウム溶液で塩析し、次いで生理食塩加リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で透析を行い、塩析抗体を得た。
次いで、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の１３８０番目のグルタミン酸から１５７９番目のグルタミン酸までのペプチドとを融合させた融合タンパク質を精製し、その融合タンパク質溶液を、０．５Ｍ食塩加炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．３）で置換した後、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄセファロース（アマシャム社製）樹脂カラムに注入添加して樹脂に固定化した。樹脂上の未反応活性基は０．５Ｍモノエタノールアミン溶液（ｐＨ８．３）で不活化させた。次いで、塩析抗体溶液をカラムに注入添加し、樹脂量の６倍容分の生理食塩加リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、０．１Ｍグリシン塩酸（ｐＨ２．７）溶液を樹脂量の５倍容分を注入添加した。カラムより溶出された溶液を分取して直ちに１Ｍトリス溶液（ｐＨ９．０）で中和した後、生理食塩加リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に透析し、特異抗体を得た。
なお、全ての工程において、抗体の力価、特異性は、ＥＬＩＳＡ法により確認した。
以上詳述した通り、本発明の薬物トランスポーターをコードするＤＮＡは、本発明の薬物トランスポーターの活性を阻害する（促進する）化合物をスクリーニングすることができる。また、本発明の薬物トランスポーターは、本発明の薬物トランスポーターの活性を促進又は阻害する化合物のスクリーニングのための試薬として有用である。さらに、有機アニオン性薬剤の薬剤耐性克服剤として有用である。
また、本発明の薬物トランスポーターは尿毒素の一種であるインドキシル硫酸の輸送能を有しており、本発明の薬物トランスポーターを発現した上皮細胞が得られれば、ホロファイバーへの培養により、通常の血液透析で除去しにくい（蛋白結合率が高い）尿毒素除去が行える可能性がある。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの卵母細胞への摂取量のタイムコースを示す図である。
図２は、１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの摂取量のミカエリス−メンテン式である。
図３は、本発明の薬物トランスポーターのハイドロパシー解析の結果を示す図である。
図４は、ＡＴＰ濃度による １４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの卵母細胞への摂取量の影響を示す図である。
図５は、各種化合物による、１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの卵母細胞への摂取の阻害効果を示す図である。
図６は、各種化合物の、卵母細胞への摂取量を示す図である。
図７は、３Ｈ−インドキシル硫酸の卵母細胞への摂取量のタイムコース及びプロベネシドによる３Ｈ−インドキシル硫酸の卵母細胞への摂取の阻害効果を示す図である。
本発明は、新規な薬物トランスポーターの用途に関する。更に詳細には、ＡＢＣＡ８として知られているＡＢＣトランスポーターの新規な用途に関し、ＡＢＣＡ８の活性を促進又は阻害する化合物のスクリーニング方法、薬剤耐性克服薬としての使用等に関する。
背景技術
薬剤が薬としての効果を発揮するには、薬剤が体内に入り十分な時間、適切な薬効濃度でターゲット部位に存在しなければならない。薬剤代謝酵素と薬物トランスポーターは薬物の体内動態プロファイル（吸収、分布、代謝、排泄及びターゲット部位における薬剤実効濃度）を規定し、薬剤の全体的な薬理効果が決定される。ターゲット部位における薬剤実効濃度が低い場合には薬理効果が期待できず、一方、ターゲット部位における薬剤濃度が高い場合には副作用の起こることが予想される。
従って、良好な薬理効果を得るためには、薬物トランスポーター（流入及び排出）と薬物代謝酵素との共同作用によってターゲット部位における薬剤実効濃度が制御される必要がある。
薬物トランスポーターは小腸や腎臓の上皮細胞、肝細胞、脳血管内皮細胞に発現して薬物の体内動態においてきわめて重要な役割を果たしている。薬物トランスポーターは、小腸上皮細胞や脳血管内皮細胞に発現し、経口的に又は非経口的に投与された薬剤のバイオアベイラビリティーや中枢神経系への薬剤移行に大きく影響を与える。一方、癌の化学療法の分野においてはＰ−糖蛋白（ＭＤＲ１）やＧＳ−Ｘポンプ（ＭＲＰ）が過剰発現すると制癌剤に対して癌細胞が耐性になることが知られている。このようなＭＤＲ１及びＭＲＰはＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターファミリーに属するトランスポーターである。
ＡＢＣトランスポーターファミリーはＡＴＰ結合カセットや、特徴的な膜貫通領域を有しており、ＡＴＰに依存した内因的物質や異物、それらの代謝物の輸送に関与することが明らかになっている。近年において、多くのＡＢＣタンパク質遺伝子が発見され、現時点で５０以上のものが知られている。
ＡＢＣトランスポーターが薬剤の小腸による吸収や脳への移行に関与していることが明らかになってきている。
上述したように、薬剤が薬としての効果を発揮するためには薬物トランスポーターの役割が重要である。
本発明は、上述したような薬物トランスポーター活性を有するタンパク質、薬物トランスポーターの活性を促進又は阻害する化合物のスクリーニング方法、該方法を用いて得られる化合物、薬物トランスポーターに対する抗体又はそれを含有する医薬組成物等を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明者らは、鋭意検討した結果、ＥＳＴ−データベース（Ｇｅｎｅｂａｎｋデータベース）をスクリーニングすることにより得られた、特定の塩基配列を有するＤＮＡから発現されるタンパク質の解析を行い、該タンパク質が薬物トランスポーター活性を有するという知見を得、本発明を完成した。
すなわち、本発明者らは、Ｇｅｎｅｂａｎｋでブラスト・サーチをかけて、膜貫通部分とＡＢＣとを有するタンパク質のスクリーニングを行い、以下に説明する本発明を完成した。
また、ＡＢＣＡ８と命名されている薬物トランスポーター（薬物動態、Ｘｅｎｏｂｉｏ．Ｍｅｔａｎｏｌ．Ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓ．１５（１）：８−１９（２０００）；ヒトＡＢＣトランスポーター遺伝子の新命名法）の機能を解明するため、機能研究を進め、ｋ該薬物トランスポーターが抱合型ビリルビンやインドキシル硫酸等の有機アニオン化合物を輸送する活性を有するという知見を得、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、薬物トランスポーター活性を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、薬物トランスポーター活性を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を提供するものである。
また、本発明は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、有機アニオン輸送活性を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、有機アニオン輸送活性を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を提供するものである。
また、本発明は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の活性を促進又は阻害する化合物のスクリーニング方法を提供するものである。
また、本発明は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の基質となる化合物のスクリーニング方法を提供するものである。
また、本発明は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の活性を促進又は阻害する化合物のスクリーニング用キットを提供するものである。
また、本発明は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の基質となる化合物のスクリーニング用キットを提供するものである。
また、本発明は、上記スクリーニング方法又は上記スクリーニング用キットを用いて得られる、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の活性を促進又は阻害する化合物、又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の基質となる化合物を提供するものである。
また、本発明は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、薬物トランスポーター活性を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、薬物トランスポーター活性を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩、又は
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、有機アニオン輸送活性を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、有機アニオン輸送活性を有するタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を含有する医薬組成物を提供するものである。
また、本発明は、上記化合物またはその塩を含有する医薬組成物を提供するものである。
また、本発明は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩に対する抗体を提供するものである。
また、本発明は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換ベクターを提供するものである。
また、本発明は、上記組換ベクターで形質転換された形質転換体を提供するものである。
また、本発明は、上記形質転換体を培養し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を生成、蓄積し、該タンパク質を採取することを特徴とする、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の製造方法を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において用いられる配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質（以下、本明細書において、本発明の薬物トランスポーターともいう）について説明する。
上記タンパク質は、例えば人やその他の温血動物等に由来するタンパク質であってもよく、または合成タンパク質であってもよい。また、後述する、本発明の薬物トランスポーターの製造方法によって得られる、いわゆる組換えタンパク質であってもよい。
本発明においては、財団法人かずさＤＮＡ研究所から得たＥＳＴ−データベースからスクリーニングしたＤＮＡを用い、該ＤＮＡから生産した組換タンパク質を用いる。なお、該ＤＮＡはヒト脳から得られた全長ｃＤＮＡの１つとしてクローニングされ、ＮＣＢＩ（米国バイオテクノロジー情報センター）に、寄託番号ＡＢ０２０６２９として寄託されており、５６７７塩基対を有する。また、該ＤＮＡの情報についてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｈｕｇｅ／ｇｆｐａｇｅ／ＫＩＡＡ０８２２／に記載されている。
本明細書において、「実質的に同一」とは、タンパク質の活性、例えば薬物輸送活性（ＡＢＣトランスポーター活性）等が実質的に同一であることを意味する。一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加された場合、その欠失、置換又は付加がなされたタンパク質は欠失、置換又は付加されていないものと実質的に同一である。
一般的に、配列番号：１で表わされる全アミノ酸配列との相同性の程度が、全体の約８０％以上、好ましくは９０％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であれば、実質的に同一であると解釈される。従って、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の一部（好ましくは１〜２０個、更に好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなるタンパク質も実質的に同一である。
本発明の薬物トランスポーターとしては、例えば有機アニオン輸送活性を有するものが挙げられる。有機アニオンとは、アニオン基を有する有機化合物のことを意味する。上記有機アニオンとしては、例えば有機アニオン性抗がん剤及び有機アニオン性抗ＨＩＶ剤等が挙げられる。有機アニオン性抗がん剤としては、例えばｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ、ｍｏｎｏｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｙｌｔｈｉｏｔｅｐａ、ａｒｓｅｎｉｃ ｔｒｉｏｘｉｄｅ等が挙げられ、有機アニオン性抗ＨＩＶ剤としては、例えば９−（２−ｐｈｏｓｐｈｏｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）ａｄｅｎｉｎｅ（ＰＭＥＲ）、ｉｎｄｉｎａｖｉｒ、ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ、ｒｉｔｏｎａｖｉｒ、ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ等が挙げられる。
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質としては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡで形質転換された形質転換体を用いて製造されたものを用いることができる。
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡが用いられる。また、配列番号：２で表わされるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
配列番号：２で表わされるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以上、更に好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡである。ハイブリダイゼーションは、従来より公知の方法、又はそれに準ずる方法、例えばモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合には、添付された使用説明書に記載された方法に従って行うことができる。本明細書に置いて、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）でプローブをラベルした場合に、３２℃のＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）中でハイブリダイズさせ、４０℃の０．１ｘＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１ｘＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）でのサザンブロットハイブリダイゼーションで本発明ＤＮＡプローブにハイブリダイズする程度の条件をいう。
上記配列番号：２で表わされるＤＮＡ、又は配列番号：２で表わされるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡをクローニングする手段としては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質の部分等の適当な塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｑ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素キット（インビトロジェン社）等を用いて、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法などの公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。クローン化されたポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換ベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作製することが出来る。例えば、（１）配列番号：２で表わされるＤＮＡ、又は配列番号：２で表わされるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ断片を切り出し、（２）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８又はｐＵＣ１１８）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５又はｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９又はｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス又はバキュロウイルスなどの動物ウイルス等を利用することが出来る。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ＸＹＬプロモーター、ＨＷＰプロモーター、ＣＷＰプロモーターなどが、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。また、昆虫細胞を宿主として用いる場合はポリヘドリンプロモーター、ＯｐｌＥ２プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合、がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされた蛋白質を他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ及びプロテインＡ）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、部位特異的プロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することが出来る。
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）），ＪＭ１０３（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）），ＪＡ２２１（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）），ＨＢ１０１（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９））、ＤＨ５α及びＪＭ１０９等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）），２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕及びバチルス・ブレビス等が用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びハンセヌラ・ポリモーファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）等が用いられる。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞及びＨＥＫ２９３細胞などが用いられる。
上述した宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことが出来る。例えば、以下に記載の文献に宿主細胞を形質転換する方法が記載されている。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）；Ｇｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）；細胞工学別冊８ 新 細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及びＶｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）。
上述のようにして得られた、配列番号：２で表わされるＤＮＡ、又は配列番号：２で表わされるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡを含む、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質の遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体は、公知の方法に従って培養される。例えば、宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約１２〜４８時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常、約３０〜４０℃で約１２〜１００時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培養は通常、ｐＨ約５〜８に調整された培地を用いて約２０℃〜３５℃で約２４〜１００時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、ｐＨは約６〜８に調整された培地を用いて、通常約３０℃〜４０℃で約２４〜１００時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
上記培養物から配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を分離精製する方法としては、例えば、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る方法が挙げられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標）などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。こうして得られた本発明ポリペプチド（蛋白質）は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。更に、組換え体が産生する蛋白質を、精製前または精製後に、トリプシン及びキモトリプシンのような適当な蛋白分解酵素を作用させることにより、任意に断片化することもできる。また、キナーゼ等のタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えることもできる。本発明の薬物トランスポーター又はその塩の存在は、様々な結合アッセイ及び特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ等により測定することができる。
上述した、本発明の薬物トランスポーターは、以下に述べるように化合物をスクリーニングするために用いたり、抗体を産生するために用いることができ、また本発明の薬物トランスポーターをコードするＤＮＡを含有する組換ベクターで形質転換された形質転換体を用いて体外循環型人工臓器を製造することができる。
また、本発明の薬物トランスポーターは、薬物、特に有機アニオン性抗ガン剤や有機アニオン性抗ＨＩＶ剤等の有機アニオン等を特異的に輸送することのできるタンパク質であるので、それ自体を医薬組成物として用いることが可能である。例えば、抗ガン剤や免疫抑制剤を部位特異的に投与したり、毒物を排除するための医薬組成物として用いることができる。具体的には、本発明の薬物トランスポーターの膜通過ドメイン領域を切除し、薬物とＡＴＰ結合カセット領域のみのタンパク質を作製したり、またターゲット部位に特異的な抗体を先導させ、部位特定的に薬物を輸送することができる。また、本発明の薬物トランスポーターと有機アニオン性抗がん剤又は有機アニオン性抗ＨＩＶ剤とを含む医薬組成物として用いてもよい。
また、本発明の薬物トランスポーターは、抱合型ビリルビンを輸送する活性を有するので、肝機能不全治療を目的とした医薬組成物として使用することができる。
また、本発明の薬物トランスポーターは、インドキシル硫酸を輸送する活性を有するので、腎機能不全治療を目的とした医薬組成物として使用することができる。
また、本発明の薬物トランスポーターは、本発明の薬物トランスポーターの基質となり得る化合物をスクリーニングするために用いることができる。本発明の薬物トランスポーターによる輸送効率を、あらかじめ開発中の化合物に対して評価することにより、その化合物のバイオアベイラビリティーを推定することが可能となる。
以下、本発明の化合物のスクリーニング方法について説明する。
本発明のスクリーニング方法は、上述のようにして得られた、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を用いて、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の活性を促進又は阻害する化合物のスクリーニング方法である。
本発明の化合物のスクリーニング方法において用いられるタンパク質は、通常Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルエステルなどが挙げられる。
また、上記タンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものを用いることもできる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明の蛋白質には、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン酸残基がピログルタミン化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上にある、例えばＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＳＨなどが適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
また、上記部分ペプチドとは、前記タンパク質の部分ペプチドであって、実質的に同質の活性を有するものであれば、いずれのものも用い得る。例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有し、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の生物学的活性を有するペプチドなどが用いられる。又、上記部分ペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、前記した本発明の蛋白質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。さらに、上記部分ペプチドには、前記した本発明の蛋白質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
上記タンパク質又はその部分ペプチドの塩としては、特に生理学的に許容される酸付加塩であることが好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法は、上記配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする。
上記タンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の活性を促進又は阻害する化合物をスクリーニングする方法としては、従来公知の方法を用いることができる。具体的には、上記タンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の薬物トランスポーター活性を測定し、次いで上記タンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の活性を促進又は阻害する化合物の候補となる化合物を混合して薬物トランスポーター活性を測定し、両者の活性を比較することにより行う。
具体的な方法としては、上記タンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡに対するｃＤＮＡ、又はｃＤＮＡを逆転写酵素によりＲＮＡ化したものを細胞内にインジェクションし、標識した化合物（例えば、放射活性物質、酵素及び蛍光物質等により標識した化合物）と共にインキュベートし、一定時間経過後に、細胞内に取り込まれた放射活性、酵素活性又は蛍光強度等を測定することにより実施することができる。また、促進又は阻害する化合物のスクリーニングは、上述系中に、候補化合物を混合し、インキュベートした後、放射活性、酵素活性又は蛍光強度等を測定し、候補化合物を混合していない場合と比較することにより実施する。
また、上記タンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩をコードするＤＮＡを含有する組換ベクターで形質転換された形質転換体を接着させたビーズを、多穴を有する（例えば９６穴）マイクロプレートに入れ、標識した化合物（例えば、放射活性物質、酵素及び蛍光物質等により標識した化合物）と共にインキュベートし、一定時間経過後に、形質転換細胞内に取り込まれた放射活性、酵素活性又は蛍光強度等を測定することにより実施することができる。また、促進又は阻害する化合物のスクリーニングは、上述系中に、候補化合物を混合し、インキュベートした後、放射活性、酵素活性又は蛍光強度等を測定し、候補化合物を混合していない場合と比較することにより実施する。
上述のように、化合物の標識は放射活性物質、酵素及び蛍光物質等により実施することができるが、酵素標識及び蛍光標識等によれば、アイソトープ施設を使用せずに実施できる。上述したように、本発明のスクリーニング方法においては、放射活性物質、酵素又は蛍光物質等により標識した化合物を用いて実施することができるが、化合物を標識する方法は例示したものに限定されず、従来公知のどのような方法によっても標識することができる。
なお、上記候補化合物としては、種々のものが用いられ、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等に含まれる化合物が挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物は、新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
本発明のスクリーニング用キットは、上述したスクリーニング方法を実施するための材料を含んだものであり、例えばスクリーニング方法を実施するためのタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩、及びスクリーニングに用いる細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法又は本発明のスクリーニング用キットを用いて得られる、本発明の薬物トランスポーターもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の活性を促進又は阻害する化合物は、上記試験を行った化合物の中から選ばれた化合物であり、上記本発明の薬物トランスポーターもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の薬物トランスポーター活性を促進又は阻害する化合物である。このような化合物は、例えば薬物の薬理効果をコントロールするために利用することができる。例えば、ある特定の薬物の薬理効果を向上させたい場合、上記本発明の薬物トランスポーターもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩が、その薬物の細胞内への流入を促進する効果を有する際に、その効果を促進する化合物を投与することにより、その薬理効果を向上することができる。一方、薬理効果レベルと副作用レベルとの範囲が狭い薬物の場合、上記タンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物を投与することにより、副作用を低減することが可能である。
また、上記本発明の薬物トランスポーターもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩が、特定の薬物の細胞外への排出を促進する効果を有する場合には、薬理効果を向上させるために、阻害剤を投与する。
本発明の医薬組成物は、上記本発明の薬物トランスポーターもしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の活性を促進又は阻害する化合物またはその塩を含有する。該化合物の塩としては、前述した、タンパク質の塩と同様のものが用いられる。
本発明の医薬組成物は、常套手段に従って、製剤化され、経口的または非経口的に投与することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤等として投与することができる。このようにして得られる製剤は安全かつ低毒性であり、ヒト又は温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等）に対して投与することができる。該化合物またはその塩の投与量は、その目的により異なる。
以下、本発明の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩に対する抗体について説明する。
本発明の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩に対する抗体は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。該抗体は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩を抗原として用い、従来公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の作製方法について、以下に説明する。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、温血動物に対して皮下注射等の投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６、４９５（１９７５）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質抗原を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。ハイブリドーマの選択は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。増殖用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、標識化タンパク質と培養上清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより求めることができる。
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から血液を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやグロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。また、融合タンパク質を発現するＤＮＡと本発明の薬物トランスポーターを発現するＤＮＡとを融合したＤＮＡを作製し、これを用いて組換ベクターを作製し、この組換ベクターを適当な宿主に形質転換して、融合タンパク質を製造し、抗原として用いてもよい。融合タンパク質は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、標識化タンパク質と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
上述のようにして作製された抗体は、例えば上述したように、上記タンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物と同様に利用することができる。この場合、モノクローナル抗体を用いた場合は、上記タンパク質もしくはその部分ペプチドもしくはそのアミド又はそのエステルまたはその塩の阻害活性が単一であるため、使用しやすいという利点がある。
また、上述のようにして作製された抗体は、薬物トランスポーターに関する種々の診断に用いることが可能である。例えば、ヒト由来のサンプル（例えばバイオプシー等）を採取し、どのようなトランスポーターがどのくらいの量発現されているかを検査することに、上記抗体を用いることができる。
以下、本発明の体外循環型人工臓器について説明する。
本発明の体外循環型人工臓器は、細胞が付着したホローファイバーを備えてなり、該細胞が、上述した形質転換体であることを特徴とする。
肝臓は、物質代謝とその調節を担う臓器であり、種々の化合物の代謝や、内因性・外因性物質の解毒、排泄等の生体に必要な複雑かつ膨大な機能を担っている。従来より用いられている人工臓器としては、例えば人工透析等の装置に活性炭を入れ、薬物を吸着させている。しかし、このような人工臓器では、目的とする薬物以外に生体に必要な、例えば赤血球や血小板等の物質も除去してしまうという問題がある。
本発明の体外循環型人工臓器は、上記タンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換ベクターで形質転換された形質転換体が付着されている。従って、薬物の特異的な排出を行うことが可能となり、薬物中毒の治療に用いることができる。
例えば、本発明の薬物トランスポーターは、抱合型ビリルビンを輸送する活性を有するので、肝機能不全治療を目的として、本発明の薬物トランスポーターをコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された形質転換体を人工肝臓として用いることができる。すなわち、肝機能不全患者に適用することができる。例えば、ヒト肝由来のＨｅｐＧ２細胞に、薬物を特異的に分解するＰ４５０のｃＤＮＡとｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔすることにより、薬物の排出及び分解を行い、薬物中毒の治療を行うことができる。
また、本発明の薬物トランスポーターは、インドキシル硫酸を輸送する活性を有するので、腎機能不全治療を目的として、本発明の薬物トランスポーターをコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された形質転換体を人工腎臓として用いることができる。すなわち、腎機能不全患者に適用することができる。
また、本発明の人工臓器において用いられるホローファイバーとしては、従来から人工腎臓、人工肝臓等として用いられている多孔性のものが用いられる。ホローファイバーの材質としては、例えば親水性ポリオレフィン及びキュプラアンモニュームレーヨン等が挙げられる。また、ホローファイバーの膜厚は、通常、５〜７０μｍであり、好ましくは１０〜５０μｍである。また、膜の内径は、通常、１００〜４００μｍであり、好ましくは１８０〜３３０μｍである。さらに、孔径は、通常、０．０１〜３μｍであり、好ましくは０．１〜０．３μｍである。本発明の人工臓器におけるホローファイバーの膜面積は、通常、１５０〜３００ｃｍ２であり、好ましくは１６０〜２００ｃｍ２である。
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
メスの成熟アフリカツメガエルを浜松動物から購入し、通常の状態で飼育した後、ステージＶの卵母細胞を選択し、８８ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＫＣｌ，２．４ｍＭ ＮａＨＣＯ３，１５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，０．３ｍＭ ＣａＮＯ３，０．８２ｍＭ ＭｇＳＯ４，０．４１ｍＭ ＣａＣｌ２及び１０μｇ／ｍｌペニシリン及び１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む改変バース溶液（ＭＢＳ）中でインキュベートした。成熟したアフリカツメガエル卵母細胞に、従来公知の方法により、配列番号：１で表わされる塩基配列のＤＮＡを用いてｃＲＮＡを作製し、次いで得られたｃＲＮＡの水溶液をマイクロインジェクションした。マイクロインジェクションは、自動インジェクター（ＩＭ２００Ｊ，Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ，Ｊａｐａｎ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで５’末端をキャップしたｃＲＮＡ又は水５０ｎｌをインジェクションした。インジェクションした卵母細胞をＭＢＳ中で、毎日培地を交換しながら、１７℃で３日間培養した。３日培養後に卵母細胞は薬物トランスポーターを発現していた。
なお、上述したマイクロインジェクションの方法については、Ｏｈｋｉ Ｇ，Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｔ，Ｍｕｒａｔａ Ｍ，Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ Ｋ，Ｉｍａｉ Ｍ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｍ．Ａ ｃａｌｃｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｔｉｏｎ ｃｕｒｒｅｎｔ ｂｙ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ ｓｐｌｉｃｅｄ ｆｏｒｍ ｏｆ Ｔｒｐ３ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０００ Ｄｅｃ １５；２７５（５０）：３９０５５−６０に開示されている。
用いたｃＲＮＡは、かずさＤＮＡ研究所から得た、ヒト脳から得られた全長ｃＤＮＡの１つとしてクローニングされ、ＮＣＢＩ（米国バイオテクノロジー情報センター）に、寄託番号ＡＢ０２０６２９として寄託されているｃＤＮＡを逆転写して得られたものである。
培養した卵母細胞（ｎ＝１０〜２０）を、２〜３ｍｌの培地、及びアイソトープラベルした化合物と共に小さい培養器に入れた。アイソトープラベルした化合物の添加を行った後、経時的に細胞を少量サンプリングし、各卵母細胞を新しいＭＢＳで３回洗浄し、１０％ＳＤＳ溶液を用いて室温で３０分間溶解させた。なお、アイソトープラベルした化合物としては、ＡＢＣトランスポーターファミリーのメンバーの１つである、ＭＲＰ（多剤耐性関連タンパク質：ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）用モデルプローブである１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドを使用した。次いで、シンチレーションカクテル剤（ＡＣＳ２、アマシャム（株）製）を加えた後、卵母細胞に取り込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ−３５００，アロカ株式会社製）を用いて測定した。
図１に、１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドを用いた場合の結果を示す。この場合、培地中の１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの濃度は３７ｎＭであった。図１に示すように、ｃＲＮＡをインジェクションした卵母細胞中において、１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの摂取量は約６０分後までは直線的に増加した。１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの６０分後の細胞内への摂取量は１３８±５．５ｆｍｏｌ／ｈｒ／ｅｇｇであり、水をインジェクションしたグループにおいては、ほとんど無視できる程度であった（４ｆｍｏｌ／ｈｒ／ｅｇｇ）。図１に示す結果より、本発明の薬物トランスポーターは、上記化合物を細胞内に取り込む活性を有することがわかる。また、ビリルビンはアイソトープラベルすることが困難であるため、エストラジオールを用いて実験を行った。１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドを細胞内に取り込む活性を有することより、本発明の薬物トランスポーターは、抱合型ビリルビンを細胞内に取り込む活性を有することが明らかである。なお、１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドと抱合型ビリルビンとが類似の輸送特性を示すことについては、Ｓｕｚｕｋｉ Ｙ，Ｓｕｇｉｙａｍａ Ｙ．Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ＧＳＳＧ ａｎｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＭＲＰ １ ａｎｄ ｃＭＯＡＴ／ＭＲＰ２．Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ １９９８；１８（４）：３５９−３７６に記載されている。
１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの摂取は、動力学及びそれに続くミカエリス−メンテン式を示す（図２参照）。Ｋｍ及びＶｍａｘは、それぞれ３０．４μＭ及び８．３７ｐｍｏｌ／ｈｒ／ｅｇｇであった。
また、発現したタンパク質について、ハイドロパシー解析を行った。ハイドロパシー解析の結果を図３に示す。図３の結果から明らかなように、本発明の薬物トランスポーターは１４個の膜通過ドメイン、及び２個のＡＴＰ結合カセットを有していた。
実施例２
配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡによってコードされるタンパク質はＡＴＰ結合カセットを有しているので、１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの摂取におけるＡＴＰ依存性について試験を行った。試験は、上述した１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの摂取量の測定において、ＡＴＰを添加し、同様の操作を行い、１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの摂取最を測定した。結果を図４に示す。
図４に示すように、細胞内への１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの摂取は、ＡＴＰの濃度を上昇させると共に増加し、ＡＴＰ濃度５ｍＭまで増加した。この結果は、他のＡＢＣトランスポーターファミリーに属する遺伝子のデータと一致する。
実施例３
配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡによってコードされるタンパク質の阻害実験を行った。実験は、上述した１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの摂取量の測定において、反応培地中にあらかじめ各種の化合物を添加することにより、１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの摂取が阻害されるか否かを試験した。
用いた化合物は、以下の通りである。
ベラパミル：ＭＤＲの基質（添加量：１ｍＭ）
ジゴキシン：ＭＤＲの基質（添加量：０．２５ｍＭ）
ＭＳ−２０９：ＭＲＰの阻害剤（添加量：１０μＭ）
プロベネシド：ＯＡＴの基質（添加量：１ｍＭ）
シメチジン：ＯＣＴの基質（添加量：１ｍＭ）
ＭＫ−５７１：ＭＲＰの阻害剤（添加量：１０μＭ）
オクラトキシンＡ：ＭＲＰの基質（添加量：５０μＭ）
結果を図５に示す。図５に示されるように、ＭＫ−５７１及びＭＳ−２０９の添加により、シス阻害効果が示され、これらの化合物の添加により摂取量は約３０％にまで減少した。また、オクラトキシンＡも阻害効果を示した。また、ベラパミル及びジゴキシンは少量であるが阻害効果を示した。また、プロベネシドは少量の阻害を示したが、シメチジンは阻害効果を示さなかった。
以上の結果に示されるように、上述した系により、本発明の薬物トランスポーターの活性を阻害する化合物を検出する系を組むことが可能であり、本発明の薬物トランスポーターをコードするＤＮＡを用いることにより、本発明の薬物トランスポーターの活性を阻害する（促進する）化合物をスクリーニングする系を組むことが可能である。
更に、抗ガン剤の耐性克服剤として開発されたＭＳ−２０９、ＭＫ−５７１及びアニオン輸送活性を有するＭＲＰの基質であるオクラトキシンＡが阻害効果を示したことより、配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡによってコードされるタンパク質は有機アニオン輸送活性を有することが示された。また、有機アニオン性薬剤の薬剤耐性克服剤としての使用の可能性が示唆された。
実施例４
次に、種々のアイソトープラベル化合物の細胞への摂取について測定を行った。測定は、化合物として以下のものを使用した以外は実施例１と同様に行った。
ＬＴＣ４（ロイコトリエンＣ４）：ＭＲＰの基質（添加量：２０μＭ）
タウロコール酸：ＯＡＴの基質（添加量：１００μＭ）
ＴＥＡ（テトラエチルアンモニウム）：ＯＣＴの基質（添加量：１０ｎＭ）
ジゴキシン：ＭＤＲの基質（添加量：１００ｎＭ）
ドキソルビシン：ＭＤＲの基質（添加量：１０μｇ／ｍｌ）
ＰＡＨ（パラアミノ馬尿酸）：ＭＲＰ及びＯＡＴの基質（添加量：１ｍＭ）
結果を図６に示す。図６に示すように、ＰＡＨ、ＬＴＣ−４、タウロコール酸は卵母細胞に取り込まれ、ジゴキシンは排出（または本来の取り込みが阻害）されることがわかった。
また、図６に示す結果から明らかなように、本発明の薬物トランスポーターは、アニオン輸送活性を有するＭＲＰ又はＯＡＴの基質である、ＰＡＨ、ＬＴＣ４及びタウロコール酸を輸送する機能を有しており、カチオン輸送活性を有するＭＤＲ又はＯＣＴの基質である、ドキソルビシン及びＴＥＡについては輸送する機能を有していないことがわかる。
実施例５
ノーザンブロッティング法により、組織分布を測定し、本発明の薬物トランスポーターの組織分布を検討した。すなわち、以下の方法により、組織分布の測定を行った。種々の器官由来のヒト全ＲＮＡを有するトランスファーフィルターはＭＴＮ ｂｌｏｔ（クロンテック社製）を用いた。トランスファーフィルターを、ランダムなプライミングによって〔α−３２Ｐ〕−ｄＣＴＰでラベルしたプロープ（ｃＤＮＡの全長）を含むハイブリダイゼーション溶液（Ｑｕｉｃｋｈｙｂ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）中で、６８℃の温度で３時間ハイブリダイズした。次いで、フィルターを０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳにより５５℃の温度で３０分間洗浄を行い、２枚の増感紙（Ｋｏｄａｃ社製）に挟み、−７０℃の温度でＸ線フィルムに感光させた。ノーザンブロッティング法による結果は、本発明の薬物トランスポーターは多くの組織において検出されたが、特に心臓及び小腸において検出量は高かった（図示せず）。
実施例６
化合物として、３Ｈでアイソトープラベルした、尿毒素の一種であるインドキシル硫酸を２μＭ濃度で用いた以外は実施例１と同様に操作を行った。また、同時に、更にプロベネシドを１ｍＭ濃度で加えた系、及びｃＲＮＡに代え水を加えた系についても実験を行った。結果を図７に示す。
図７に示すように、水をインジェクションした系においては、３Ｈ−インドキシル硫酸の取り込みはほとんど観察されなかったが、ｃＲＮＡをインジェクションした系においては、３Ｈ−インドキシル硫酸の細胞内への取り込み量は経時的に比例して直線的に増加した。なお、プロベネシドの添加により、３Ｈ−インドキシル硫酸の細胞内への取り込み量は減少した。なお、推定Ｋｍは２５．５μＭであり、Ｖｍａｘは５．５ｐｍｏｌ／ｈｒ／ｅｇｇであった。
実施例７
本発明の薬物トランスポーターに対する抗体を作成した。免疫源としては、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）と配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の１３８０番目のグルタミン酸から１５７９番目のグルタミン酸までのペプチドとを融合させた融合タンパク質を抗原として用いた。免疫動物としては、ウサギ（日本白色種）の生後半年以内のものを用いた。
免疫は、抗原０．２ｍｇ〜０．４ｍｇを生理食塩水に溶解した抗原溶液を、２週間おきに４回〜７回、背皮内に投与した。初回免疫のみ、完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）を用い、その後の免疫には全て、不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）を用いた。最終免疫の１０日後に抗血清を集め、飽和硫酸アンモニウム溶液で塩析し、次いで生理食塩加リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で透析を行い、塩析抗体を得た。
次いで、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の１３８０番目のグルタミン酸から１５７９番目のグルタミン酸までのペプチドとを融合させた融合タンパク質を精製し、その融合タンパク質溶液を、０．５Ｍ食塩加炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．３）で置換した後、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄセファロース（アマシャム社製）樹脂カラムに注入添加して樹脂に固定化した。樹脂上の未反応活性基は０．５Ｍモノエタノールアミン溶液（ｐＨ８．３）で不活化させた。次いで、塩析抗体溶液をカラムに注入添加し、樹脂量の６倍容分の生理食塩加リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、０．１Ｍグリシン塩酸（ｐＨ２．７）溶液を樹脂量の５倍容分を注入添加した。カラムより溶出された溶液を分取して直ちに１Ｍトリス溶液（ｐＨ９．０）で中和した後、生理食塩加リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に透析し、特異抗体を得た。
なお、全ての工程において、抗体の力価、特異性は、ＥＬＩＳＡ法により確認した。
以上詳述した通り、本発明の薬物トランスポーターをコードするＤＮＡは、本発明の薬物トランスポーターの活性を阻害する（促進する）化合物をスクリーニングすることができる。また、本発明の薬物トランスポーターは、本発明の薬物トランスポーターの活性を促進又は阻害する化合物のスクリーニングのための試薬として有用である。さらに、有機アニオン性薬剤の薬剤耐性克服剤として有用である。
また、本発明の薬物トランスポーターは尿毒素の一種であるインドキシル硫酸の輸送能を有しており、本発明の薬物トランスポーターを発現した上皮細胞が得られれば、ホロファイバーへの培養により、通常の血液透析で除去しにくい（蛋白結合率が高い）尿毒素除去が行える可能性がある。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの卵母細胞への摂取量のタイムコースを示す図である。
図２は、１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの摂取量のミカエリス−メンテン式である。
図３は、本発明の薬物トランスポーターのハイドロパシー解析の結果を示す図である。
図４は、ＡＴＰ濃度による １４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの卵母細胞への摂取量の影響を示す図である。
図５は、各種化合物による、１４Ｃ−エストラジオール−β−グルクロニドの卵母細胞への摂取の阻害効果を示す図である。
図６は、各種化合物の、卵母細胞への摂取量を示す図である。
図７は、３Ｈ−インドキシル硫酸の卵母細胞への摂取量のタイムコース及びプロベネシドによる３Ｈ−インドキシル硫酸の卵母細胞への摂取の阻害効果を示す図である。
Claims (4)
- 細胞が付着したホローファイバーを備えてなる体外循環型人工臓器であって、上記細胞が、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、薬物トランスポーター活性又は有機アニオン輸送活性を有するタンパク質、又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、薬物トランスポーター活性又は有機アニオン輸送活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換ベクターで形質転換された形質転換体である、体外循環型人工臓器。
- 上記ＤＮＡが、配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号：２で表わされるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、薬物トランスポーター活性又は有機アニオン輸送活性を有するタンパク質、又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、薬物トランスポーター活性又は有機アニオン輸送活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、請求項１に記載の体外循環型人工臓器。
- 腎機能不全患者に適用される、請求項１又は２に記載の体外循環型人工臓器。
- 肝機能不全患者に適用される、請求項１又は２に記載の体外循環型人工臓器。
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