JPH05504679A - ラクトペルオキシダーゼの組み換え体の生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ラクトペルオキシダーゼの組み換え体の生産技術分野 本発明は、哺乳類のラクトペルオキシダーゼをコードする遺伝子のクローニング および発現に関する。この蛋白質のウシおよびヒト型をコードするＤＮＡが回収 され配列決定される。

背景技術 乳汁中および関連の分泌線中に、ペルオキシダーゼ活性を有する酵素が存在する ことが、ここ数１０年間に知られてきた。Ｃａｒｌｓｔｒｏｍ、　Ａ、、　Ａｃ ｔａ　Ｃｈｅｗ　５ｃａｎｄ　（１９６９）　２３：１８５−２０２では、これ ら起源のペルオキシダーゼの異質性について、当時の知識が要約された。ペルオ キシダーゼ活性は、互変異性の蛋白質または糖蛋白質の画分の多くに存在するら しいことが確かめられた。その後の研究者、例えば５ｉｅｖｅｒｓ、　Ｇ、、■ 旺Ｌｅｔｔｅｒｓ　（１９８１）　ｌｐ：２５３−２５６は、ウシの蛋白質を、 グリコジル化された、Ｎ末端にロイシンを有する単鎖の蛋白質であるとし、アミ ノ酸組成を決定した。その蛋白質はグリコジル化の程度が一定不変でな（、約７ ８ｋｄの分子量を有することが示された。その蛋白質は活性部位にヘム基（プロ トヘム■）を含む。ウシ蛋白質の異質型について、より詳細な研究がＰａｕｌ、 　Ｋ、−Ｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｓｅｒ　（１９８３）　２７：１５−２９によ り発表された。

Ｌａｎｇｂａｋｋ、　Ｂら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　（１９８４）　１７４：３０ ０−３０３は、ラクトペルオキシダーゼがヒト初乳に存在することを示し、この 酵素の部分精製法を開示した。これらの著者は、ヒト初乳から単離された酵素が 、牛乳から単離されたラクトペルオキシダーゼと、安定性、クロマトグラフ的性 質および免疫反応性において良く似ていることを報告した。

ラクトペルオキシダーゼは、抗微生物活性を有し、防腐剤の必要な製品においで あるいは治療に、抗カビ、抗ウィルス、抗プロトシアおよび抗細菌の目的で、使 用可能な有用な蛋白質である。さらに、ペルオキシダーゼ活性を有することから 、種々の診断および分析アッセイの実施において標識試薬および／または、連結 試薬として用いられ得る。この蛋白質の組み換え体での生産は、この重要な蛋白 質の信頼出来るおよび再現性のある原料を提供する。

発明の開示 本発明は、哺乳類のラクトペルオキシダーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列および 組み換えラクトベルオキシダーゼ蛋白質生産のための組み換え体発現システムを 提供する。生産された蛋白質は、ヒトおよび動物において、広汎な工業上、病気 治療上、および診断の適用を有する。

このように、−面では、本発明は、実貫的に純粋形である組み換え哺乳類ラクト ペルオキシダーゼに向けられている。

別の面では、本発明は、これら蛋白質をコードする単離されたＤＮＡ配列、これ ら蛋白質を生産出来る発現システム、これら発現７ステムで形質転換された組み 換え宿主細胞、ならびに、これら／ステムおよび細胞を用いた生産方法に向けら れている。さらに、本発明は、本発明による組み換えラクトペルオキシダーゼ蛋 白質を含む薬剤組成物および診断ならびに工業上の使用に適した処方に向けられ ている。本発明はまた、ラクトペルオキシダーゼを用いる有機組成物の保存方法 および本酵素の作用を受け得る種々の条件の治療方法に同は図１は、ウシのラク トペルオキシダーゼのプレプロ酵素をコードする完全ＤＮＡ配列および推定アミ ノ酸配列を示す。

図２は、多（の哺乳類ペルオキシダーゼのアミノ酸配列の比較を示す。

図３は、ヒトｃＤＮＡクローンの配列を示す。

免豆旦裏１旦且 本明細書に用いられている、′哺乳類”ラクトペルオキシダーゼとは、標準的な 酵素学的試験法によりアッセイした時にペルオキシダーゼ活性を有する蛋白質の ことであって、乳汁分泌腺の分泌液中および腺目体に存在する蛋白質を言う。

そのようなペルオキシダーゼ活性を測定する通常の方法は、市販されており、Ｍ ｅｔ　ｏｄｓ　ｉｎ　ｎ　ｍｏｌ　のような標準的な文献にも記載されている。

このような蛋白質の例として、図１に示されたアミノ酸配列を有するウシ蛋白質 および関連のヒトの配列がある。しかし、また、そこで示されたＤＮＡ配列の対 立遺伝子の変異によりコードされる蛋白質およびこれら乳汁関連蛋白質を提供す る他のいかなる種類の遺伝子群によりコードされる蛋白質、および他の種類の哺 乳類の蛋白質も含まれる。

さらに、本発明のラクトペルオキシダーゼの群には、影響しない欠失、置換、ま たは、アミノ酸配列の改変の結果得られるこれら哺乳類のラクトペルオキシダー ゼの改変型も含まれる。さらに、ペルオキシダーゼ活性を保持するこれら配列の 断片も含まれる。

”精製された”とは、本発明のラクトペルオキシダーゼが、通常、共存すると結 合する蛋白質および他の物質と会合していないことを意味する。クレームされた 蛋白質は組み換えにより生産されるので、これら組み換え体起源から典型的に精 製された哺乳類蛋白質において、そのような会合物質の痕跡はない。

”作動可能に連結された”とは、成分がそれらの有用な機能を遂行するように配 置された並置状態を言う。従って、コーディング配列に作動可能に連結したコン トロール配列、あるいはプロモーターは、コーディング配列の発現に影響を与え 得る。

”コントロール配列”とは、適切に所望のコーディング配列に連結された時に、 そのような配列と適合する宿主中での発現に影響を与え得るようなりＮＡ配列、 または、複数のＤＮＡ配列を言う。これらの配列は、原核生物宿主および真核生 物宿主両方において、少なくともプロモーターを、そして必要に応じて転写終止 シグナルを含む。発現に影響を与えることにおいて、必要とされる、または助け となる付加的な配列もまた同種と認められ得ならびに含まれ得る。本明細書で用 いられる”コントロール配列”には、使用される特定宿主中で作動可能に連結し たコーディング配列の発現に影響を及ぼすのに必要ないかなるＤＮＡ配列をも包 含される。

”細胞”もしくは“細胞培養物”または”宿主細胞”は、文脈から明かであるよ うにしばしば、相互変換的に用いる。

これらの用語は、直接作用を受ける細胞ならびに当然その子孫を含む。すべての 子孫は、変異の機会または環境の違いにより親細胞と正確には同じではないが、 初めに形質転換された細胞に関して確立された性質に相当する性質を保持してい る限り、これらの用語に含まれる。現在の場合、例えば、該当する子孫は、所望 のラクトペルオキシダーゼの生産に影響を与え得る発現システムを保持している ものである。

本発明の例となるウシおよびヒトのラクトペルオキシダーゼをコードするＤＮＡ 配列は、ウシおよびヒト乳腺から得られたＣＤＮＡライブラリーから得られた。

これらの例の蛋白質の場合、ウシラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）は市販ノラ クトペルオキシダーゼ標品から精製した。また、内部アミノ酸配列情報は、精製 物質のＣＮＢｒ断片から得た。これら決定された配列から設計されたプローブは 、ウシ乳腺からのＣＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用い、図１ に示されたウシＬＰＯ配列をコードする３つのクローンが得られた。この配列は 、シグナル配列およびプロ配列を含む７１２個のアミノ酸を含む。２箇所の想定 シグナルペプチダーゼ切断部位（ｌおよび２）および２箇所の可能な切断プロペ プチド（ＡおよびＢ）の末端を図に示した。この様に成熟蛋白質は１０１位のＡ ｓｐまたは１２９位のＬｅｕから始まり得る。

ゲノムＤＮＡはまた、ウシのライブラリーから調製され、得られたｌ：＋ＬＰｏ 配列はゲノムバンクのＳＤＳゲル上でサザーンプロット法を実施するために用い た。これらのサザーンプロット法の結果は、複数遺伝子がウシのラクトペルオキ シダーゼ蛋白質をコードしていることを示した。しかし、見いだされた複数バン ドはまた、関連のペルオキシダーゼに起因し得る。

ウシクローンはまた、ヒト乳房組織のＣＤＮＡライブラリーをスクリーニングす るために用い、ＬＰＯのヒトｃＤＮＡのカルボ牛ン末端３２４残基をコードする クローンが単離された。図３に示したヒトの配列は、ウシ蛋白質に高い相同性を 有することが見い出された。

図示したウシおよびヒト配列により、ｃＤＮＡまたは他の哺乳類から調製された ゲノムライブラリーから、相当するＬＰＯコード遺伝子の回収が可能となる。こ れらの種間では高い相同性が期待されるので、厳重な条件が用いられ得、従って 、偽陽性を避ける。厳重な条件の例として、６５°Ｃで４ＸＳＳＣ中のハイブリ ダイゼーション、その後の６５℃で０゜ｌＸ５ＳＣ中の一時間洗浄、または、４ ２°Ｃで５０％ホルムアミド、ａＸＳＳＣ中のハイブリダイゼーション、その後 の６５°ＣでＯ，ｌＸ５ＳＣ中の一時間洗浄がある。

このように、ウシの配列は入手可能であり、ｃＤＮＡまたは他の哺乳類起源に存 在するラクトペルオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡもまた、この配列をプ ローブとして用いることでゲノムまたはｃＤＮＡバンクから回収出来る。高度に 厳重な条件下、図１のＤＮＡとのハイブリダイゼーシヨンは哺乳動物におけるラ クトペルオキシダーゼの相同性のために可能である。さらに、ラクトペルオキシ ダーゼは乳腺から調製されたＣＤＮＡライブラリーから厳重な条件下、図１に示 されたアミノ酸配列を容易にコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーシ ョンで回収され得る。即ち、示されたｃ　ＤＮＡ配列はコードが余分なため変質 し得る。

本発明に包含される哺乳類の細胞からのラクトペルオキシダーゼは以下の特徴を 示す＝１）ペルオキシダーゼ活性とコードするＤＮＡ配列との組み合わせであっ て、該ＤＮＡ配列が図１に実例をもって示されたウシラクトペルオキシダーゼを コードするｃＤＮＡと厳重な条件下で１１イブリダイズするもの；または、２） ペルオキシダーゼ活性とコードするＤＮＡ配列の組み合わせであって、該ＤＮＡ が図１に図示されたウシのラクトペルオキシダーゼをコードするＤＮＡおよび乳 分泌腺細胞からのｍＲＮＡの逆転写物中の前記ＤＮＡの起源と厳重な条件下でハ イブリダイズするもの；または、３）べルオキシダーゼ活性を保持し前述の定義 によりラクトペルオキシダーゼに分類される蛋白質と少なくとも８０％の相同性 、好ましくは９０％の相同性、最も好ましくは９５％の相同性有する蛋白質。

処理」−郵り交５ 本発明のペルオキシダーゼは、−面では、治療関係および種々の腐敗しやすい製 品を保存するために抗微生物剤として有用である。本発明のラクトペルオキシダ ーゼは、カビ、ウィルス、プロトシアおよび細菌を殺し得、感染症および悪性腫 瘍、自己免疫疾患、および移植組織拒絶反応などの免疫系の疾患に有効な薬剤で ある。

治療の目的には、本発明のラクトペルオキシダーゼは、蛋白質様の活性成分の処 方に関する標準手法に従って処方される０その概説は、Ｒｅｌｌ１ｉｎ　ｔｏｎ ’ｓ　Ｐｈａｒｉａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ ｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｅａｓｔｏｎ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉ ａの最新線にある。治療用組成物は投与され、好ましくは、全身的に、最も一般 的には静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内注射により投与される。注射用の処 方は一般的には水溶液またはハング液もしくはリンゲル液のような生理的適合性 のある緩衝液中の＃＆濁物である。さらに、蛋白質は固形に処方され得る。

例えば、凍結乾燥後被験体に投与するために適当な液体中に再構成され得る。

さらに、胆汁酸塩またはフンジン酸およびその類似物のような膜貫通刺胞（ｍｅ ｍｂｒａｎｅ　ｐｅｎｅｔｒａｎｔ）を用いた経皮または経粘膜投与により全身 投与をなし得る。適当な薬学的に受容可能な毒性のない界面活性剤も使用し得る 。膜を介する投与は、傷を受け易い部位では、特に、鼻噴霧または座薬の形態で 行い得る。

より挑戦的には、本発明の蛋白質は適正に消化されないように処方された時には 、経口的に投与され得る。

さらに、最近には、被験体を形質転換する遺伝子の発現の結果、インサイチ二生 産を介しての投与が可能である。このように、投与の代替の経路は遺伝子治療を 通じて遺伝子導入被験体を得ることである。

さらに、本発明のラクトペルオキシダーゼは、例えば、局所感染や局所悪性腸瘍 を中和するために局所投与し得る。

そのような局所投与は、軟膏、クリーム、膏薬もしくは、ゲルの形態でなし得る 。または、制限量の薬剤を含む経皮的にあて布もしくは、局所皮下注射でなし得 る。

投与量および投与経路は被験体の性質、治療される状態の性質、ならびに、医師 または獣医の判断に大きく依存する。

しかし、感染症の手当について適正な投与量の範囲は、０．０１−１００ｇｇ／ ｋｇ／ｄａｙである。

治療薬としての使用に加えて、本発明の蛋白質は、食品、飲料、化粧品等腐敗し 易い製品の安定化のために使用し得る。

これらの適用いは、このタンパク質は、典型的には、物質に対して０．０１−５ ％の量が添加される。

最後に、本発明のラクトペルオキシダーゼは免疫アッセイまたは池の特異的結合 アッセイのための標識試薬として用い得る。この用途には、本酵素は、例えば、 ある病状に特徴的な分析物を同定するために設計された試験システムの成分と連 結する。ＥＬＩＳＡアッセイにおける適用は、例えば、これらシステムにおける わさびペルオキシダーゼの使用と類似している。

ウシラクトペルオキ７−ゼ゛　のロ ウ／乳房の乳腺細胞から、以下の標準法に従い、ｃＤＮＡライブラリーを調製し た：これらの細胞から、標準抽出法およびオリゴ−ｄＴクロマトグラフ法を用い て、ｍＲＮＡ画分を得た。次にｃ　ＤＮＡライブラリーを、例えば、Ｈｕｙｎｈ 、　Ｖ、Ｔ、ら、ＤＮＡ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ：　Ａ　Ｐｒａ ｃｔｉｃａｌ　Ａ　ｒｏａｃｈ　（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、１９ ８４）のλ−ｇｔｌＯ／λ−ｇ　ｔ　１１ベクターを用いて調製する。この実験 では、市販されているＳｔａｔａｔｅｇｅｎｅ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡの λ−ＺＡＰ−ＩＩベクターを採用し、製造者の指示に従って用いた。

次にこのライブラリーは、単離されたウシのラクトペルオキシダーゼ蛋白質から 得られる配列に対応するように設計されたプローブでスクリーニングされる。ウ シのラクトペルオキシダーゼは市販の蛋白質からｆ（ＰＬＣカラムを用いて、単 一ピークとして回収精製される。次に、回収された蛋白質はＣＮＢ　ｒを用いて 加水分解され、断片は配列決定される。一連のオリゴヌクレオチドプローブは、 全長蛋白質中から得られる二つの配列を基に設計される。

ウシ乳房からのライブラリーは、２種のキナーゼ処理されたオリゴマーを用いて 探査され、両方にハイブリダイズする３つのクローンが回収された。スクリーニ ングは標準の中程度に厳重な条件で行われた。回収された３つのクローンのすべ ては７１２個のアミノ酸をフードする図１に示したオーブンシーディグフレーム 部分を含んでおり、１つのクローンは図１に示した完全配列を含んでいた。この クローンは、ｐＩＤＮｂＬＰＯ−１と命名され、そして１９８９年１１月２日、 Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏ ｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤに、ブタベスト条約の条件に従いＡＴＴＣ受託ｎｏ、　 とじて寄託された。成熟蛋白質は示された１０１位のアスパラギン酸残基から始 まる。ラクトペルオキ／ダーゼは分泌蛋白質であるため、上流部分には／グナル およびブローＬＰＯ配列を含む。

ヒトのクローン、ｐ　Ｉ　ＤＮｈＬＰＯ−３は、図３に示した配列を有し、１９ ８９年１１月２日、ＡＴＴＣにブタベスト条約の条件に従いＡＴＴＣ受託ｎｏ、 　□とじて寄託された。

得られたクローンは、適正な発現システムに連結され、蛋白質の生産のため、宿 主細胞に形質転換される。ＬＰＯはリーダーおよびプロ配列をコードするＤＮＡ を除去し、Ｎ末端アスパラギン酸残基の上流のＡＴＧ開始コドン位に挿入するこ とにより細胞内蛋白質として生産し得る。あるいは、蛋白質分泌を行うために異 種または同種の／グナル配列を使用し得る。

種々の宿主で作動可能な発現／ステムの構築は当業者の技術範囲内である。所望 の蛋白質をコードする回収ｃＤＮＡ、または、合成りＮＡもしくは部分合成りＮ Ａは、目的宿主に適したコントロール配列に連結される。適当なコントロール配 列に連結されたコーディング配列は、酵母または原核生物宿主が用いられる場合 には、通常用いられるように、自己増殖ベクターに含まれるコントロール配列に 連結される。あるいは、哺乳類細胞宿主の場合には、しばしば用いられるように 、宿主染色体に組み込まれる。

原核生物を用いる発現用の適切なプロモーターには、調節可能なｔｒｐプロモー ター、調節可能なｌａｃプロモーター、または、これらシステムのｔｒｃもしく はｔａｃプロモーターと種々称される市販のハイブリッドが含まれる。細菌で作 動可能なシグナル配列としては、ベニシリナーゼ遺伝子由来のものが入手可能で あり、それ自身のプロモーターとともに使用し得る。Ｅ、　ｃｏｌｉの形質転換 に適した典型的な複製ベクターには、例えば、ｐＢＲ３２２由来のベクターおよ びｐＵＣシリーズに関係するベクターがある。ベクターのコントロールシステム に適当な改変を加えた他の細菌宿主、たとえば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉ ｌｌｕｓ、種々のｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓおよび近縁の宿主株が使用し得る。

しかし、Ｅ、　ｃｏｌｉ、における発現が、通常、最も簡便である。

酵母はまた、真核生物宿主として通常用いられており、そして多くのプロモータ ー、特に解糖系酵素の合成に使われる３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ ）プロモーター、エノラーゼプロモーター、または、Ｌｅｕ２遺伝子に連結され たプロモーターなど固有のプロモーターが使用され得る。

酵母で作動可能なシグナル配列としてはα−ファクター遺伝子由来のものがある 。酵母ベクターは、普通、２μレブゾコンのような複製部位を有する。

適正な哺乳類発現システムは、通常、ＳＶ４０、ポリオーマ、７デノウイルス、 ウシのパピローマウィルス（ＢＰＶ）、または、鳥類のザルコーマウィルスのプ ロモーターなどのウィルスプロモーターを包含している。しかし、また哺乳類シ ステムでは調節可能なメタロチオネインプロモーターなどのような固有のプロモ ーターも有用である。哺乳類システムにおいては、通常、転写の終止配列および 種々のエンＩ・ンサーのような付加的なコントロール配列が必要である。哺乳類 システムで使用可能なシグナル配列には、種々の生長ホルモンやインン二リンの ような通常の分泌哺乳類蛋白質に結合したものを包含する。

さらに、簡便さに劣るが、植物細胞もまた、ノパリンンンセターゼプロモーター のような適正なコントロール配列を用いることで、宿主として使用し得る。組み 換え蛋白質の生産に用いられるシステムは、バ牛ユロウイルス／ｊｌ宿主システ ムを包含する。

発現システムにおけるその他の形態としては、例えば、哺乳類システムにおいて 、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をフードするような増幅可能な遺伝子 との共形質転換による増幅が包含される。

選択された発現システムの性質により、組み換えにより形質転換された宿主から 所望のラクトペルオキシダーゼが回収され、精製される。宿主細胞はラクトペル オキシダーゼ遺伝子の発現に好適な条件で培養される。例えば、原核生物システ ムでは、発現がｔｒｐプロモーターのコントロールの下で行われる場合には、ト リプトファンの極低濃度、または、インドール酢酸のようなトリプトファンイン ヒビターの存在であり、ラクトペルオキシダーゼ遺伝子がメタロチオネインシス テムのコントロールの下にある哺乳類システムの場合には、本プロモーターを誘 導出来る金属イオンの存在である。

ラクトペルオキシダーゼが細胞内蛋白質として生産される場合には、細胞は溶解 され、ラクトペルオキシダーゼは細胞内蛋白質から分離される。一般的には、ラ クトペルオキシダーゼを分泌蛋白質として生産し、狭雑蛋白質のより少な（為培 地から回収するのがより簡便である。

標準的な精製法として、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマ トグラフィー、分画遠心分離法、硫酸アンモニウム沈澱、ゲル濾過などが採用さ れる。

先生立型１ 本発明のＭ製された組み換えラクトペルレオ半シダーゼは、この蛋白質と特異的 に免疫反応する抗体の形成を誘導するのに使用し得る。抗体は、ウサギまたはマ ウスのような適当な応答宿主中に通常の免疫化のプロトコ、−ルを用０形成され る。

次に、高力価のポリクローナル抗血清が、そこで回収され、あるいは、末梢血リ ンパ球もしくは肺臓細胞が、ラクトペルオキシダーゼに免疫反応性を宵するモノ クローナル抗体を分泌し得る永久増殖細胞を得るために標準法を用いて永久増殖 化され得る。

ＥｃｏＲＩ　−ＣＡ　ＧＡＡ　ＴＣＴ　ＴＴＣＣＴＴ　ＣＴＣＧＧＣＴＴｒ　Ｔ ＣＩ’　２６２７　ＣＴＧ　烏ＴＴＡ　ＡＣＴ　ｃｒｒ　ＧＡＴ　ＡＧＡ　ＣＧ Ｇ　ＴＡＴ　５３　ＦＩＧ、　ｌ　１５９４　ＡＧＧ　ＧＣＧ　ＣＴＧ　ＧＣＧ 　ＣＧＣＴＧ（：　ＣＴに　ＣＣＧ　ＧＣＧ　６２０１５８　Ａｒｑ　Ａｌａ　 Ｌｅｕ　Ａｌａ　入ｒｇ−Ｔｒｐ’−１Ｉ４Ｉｕ　Ｐｒｏ　入１ａ　１６６６７ ５　ＡＡＣＧＧＣＴＴＣＣＧＣＧＴＣＣＣＧ　Ｃ’ｒ’Ｇ　Ｇｅｅ　ＣＧＧ　７ ０１１８５　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　ｋｔｑ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌ＠ｕ　Ａｌ ａ　Ａｒｇ　１９３７０２　ＧＡＧ　ＧＴＡ　ＴＣＣＭＣＡＡＡ　ＡＴＴ　ＧＴ Ａ　ＧＧＣＴＡＣ７２８１９４Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｓｉｒ　Ｍｎ　Ｌｙｓ工１ｓ＋ 　Ｖａｌ　Ｇａｙ　Ｔｙｒ　２０２７２９　ＣＴＧ　にＡＣＧＡＡ　ＧＡＧ　Ｇ ＧＴ　ＧＴｒ　ＣＴＧ　ＧＡＣＣＡＡ　７５５２０３　Ｌａｕ＾ｓｐ　Ｇｌｕ　 Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　２１．１７５６　ＡＡＣＡ ＧＧ　ＴＣＣＣＴＧ　ＣＴＣＴｒＣＡＴＧ　ＣＡＧ　ＴＧＧ　７Ｂ２２１２　Ａ ｓｎ　Ａｒｇ　５＊ｒ　Ｌａｕ　Ｌ４Ｉｕ　Ｐｈａ　Ｍａｔ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　 ２２゜７８３　ＧＧＴ　ＣＡＧ　ＡＣＴ　ＧＴＧ　ＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣＴＧ　 ＧＡＣ８０９２２１Ｇｌｙ　にＩｎ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　ｈｐ　Ｈｌｓ　Ａｓｐ　 ＸＪ＠ｕ　八ｌｉｐ　２２９８１０　ＴＴＣＧＣＣＣＣＧ　ＧＡＡ　ＡＣＧ　Ｇ ＡＡ　ＣＴＧ　ＧＧＧ　ＡＧＣ８３６２３０Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　 Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｂａｒ　２］Ｂ８３７　ＡＡＣＣＲＡＧ　Ｃ ＡＣＴＣＴ　ＡＡＡ　Ａｃｅ　（ＪＧ　ＴＧＴ　ＧＡＧ　！＋６４２３９　Ａｓ ｎ　Ｇｌｕ　Ｈｌｓ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｒ＋　ＣｙＩＩＧｌｕ　２ ４７８６４　ＧＡＧ　ＴＡＣＴＧＴ　ＡＴＣＣＡＧ　ＧＧＡ　ＧＡＣＡＡＣＴＧ Ｃ８９０２４８Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｃｙ＠工１＊　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｇ ｎ　Ｃｙｍ　２５６８９１　Ｔ’ｒＣＣＣＣＡＴＣＡＴＧ　Ｔ’ｒＣＣＣＧ　Ａ ＡＡ　ＡＡＴ　ＧＡＴ　９１７２５７　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　Ｉｌａ　Ｍａｔ　Ｐｈ ｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｅ　Ａｇｎ　Ａ！ＩＰ　２６５９１８　ＣＣＣ入ＡＧ　ＴＴＧ 　ＡＡＧ　ＡＣＴ　ＣＡＡ　ＧＧ（：　入ＡＡ　ＴＧＣ９４４２６６Ｐｒｏ　Ｌ ｙＩＩＬ＠ｕ　ＬｙＩＩＴｈｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　ＬｙＩＩｃｙｓ　２７４９４ ５　ＡＴＧ　ＣＣＴ　ＴＴＣＴＴＣＣＧＡ　ＧＣＣＧＧＧ　ｆｆｌ　に丁ｃ　９ 〕１２フ５　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｐｈａ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｇｕｙ　Ｐｈ ｅ　Ｖａｌ　２８３９７２　ＴＧＣＣＣＣＡＣＴ　ＣＣＡ　ＣＣＴ　ＴＡＣＣＡ Ｇ　ＴＣＧ　ＴＴＧ　９９１１２１＋４　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐ ｒｏ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｓｉｒ　Ｌ＠ｕ　２９２９９９　Ｇｅｅ　ＣＧＡ　ＧＡ Ａ　ＣＡＧ　ＡＴＣ＋ＪＬＡＴ　ＧｃＴＧＴＧ　ＡＣＣ１０２５コ９フ　Ａｌａ 　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｌｒ＋　Ｘ１ｍ　Ａｇｎ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　：１ Ｏ１１０２６ＴＣＣＴＴＣＣＴＧ　ＧＡＣＧｅｅ　ＡＧＣＴＴＡ　ＧＴＧ　ＴＡ Ｃ１０５２１０２Ｂａｒ　Ｐｈａ　Ｌｅｕ　Ａｇｐ　Ａｌａ　Ｂａｒ　Ｌ＠ｕ　 Ｖａｌ　Ｔｙｒ　コ１゜１０５］　ＧＧＣＴＣＴ　ＧＡＧ　ＣＣＣＡＧＴ　ＣＴ Ｇ　ＧＣＣＡＧＣＣＧＴ　１０７９：ｌｌｌ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ 　Ｓｉｒ　ＸＡｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　３１９１０８０　ＣＴＣＣＧＧ　 ＡＡＣＣＴＣＡにＣＡＧＣＣＣＧ　ＣＴＧ　ＧＧＣ１１０６３２０ｔａｕ　Ａｒ ｇ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓａｒ　Ｂａｒ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　３２８１１０ ７　ＣＴＣＡＴＧ　ＧＣＴＧＴＣＡＡＣＣＡＡ　ＧＡＡ　ＧＣＣＴＧＧ　１１３ ３３２９　Ｌａｕ　ＭＣセ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　入１ａ 　Ｔｒｐ　３３１１１３４　ＧＡＣＣＡＣにＧＧ　ＣＴＧＧＣＣＴＡＣＣＴＧ　 ＣＣＣＴＴＴ　１１６０３３８　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｇｕｙ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｔ ｙｒ　Ｌ＠ｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　３４６１１６１　ＡＡＣＡＡＣＡＡＧ　ＡＡＧ 　ＣＣＧ　ＡＧＣＣＣＣＴＧＴ　ＧＡＧ　１ＩＢ７３４７　Ａｓｈ　Ａｓｎ　Ｌ ｙＩＩ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｂａｒ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　３５５１１８８　 ＴＴＣＡＴＣＡＡＣＡｃｅ　ＡＣＣＧＣＣＣＧＣＧＴＧ　ＣＣＣ１２１４３５６ Ｐｈｅ　工ｌｅ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ＾ｌａ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　３ ６４１２１５　ＴＧＴ　ＴＴＣＣＴＧ　ＧＣＧ　ＧＧＡ　ＣＡＴ　ｆｆＴ　ＣＧ Ａ　ＧＣＣ１２４１１６５Ｃｙｓ　Ｐｈｓ　ｔＪｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　入ｓｐ　 Ｐｈｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　コア３　ＦＩＧ、　１−３１２４２　ＴＣＡ　ＧＡＧ 　ＣＡＧ　ＡＴｒ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＣＣＡＣＴ　ＧＣＣ１２６Ｂ１７４　Ｓ ｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｘｉ＠　ＸＡｕ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　３ ８２１２６９　ＣＡＣＡＣＣＣＴＣＣＴＴ　ＣＴＣＣＧＧ　ＧＡＣＣＡＣＡＡＣ １２９５３８３Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　ＩＪｕ　Ｌａｕ　Ｉ７＠Ｉｕ　八ｒｇ　Ｇｌｕ 　）ｌｉｅ　Ａｇｎ　３９１１２９６　ＣＧＧ　ＣＴＧ　ＧＣＣＡＧＡ　Ｃ入Ａ ＣＴ入　入ＡＧ　入入入　ＣＴＣ１３２２３９２Ａｒｇ　Ｌａｕ＾ｌａ　Ａｒｇ 　Ｇｌｕ　ＩＪｕ　Ｌｙｅ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　４００１３２］　ＡＡＣＣＣＴ　 ＣＡＣＴＧＧ　ＡＡＴ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＣＴＣ１１４９４０１Ａｓｎ 　Ｐｒｏ　Ｈｌｓ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｙｇ　Ｌｅｕ　４０９ 】コ５０　丁ＡＣＣＡＧ　ＧＡＡ　ＧＣＣＣＣ，Ｇ　ＡＡＡ　ＡＴＣＣＴＧ　Ｇ ＧＡ　１３７６４１０　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｌｙｅ　Ｉ ｌｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　４１１１】コア７　ＧＣＣＴＴＣＡＴＡ　ＣＡＧ　ＡＴ ＣＡＴＣ＾ＣＣｆｆｒＡにＧ　１４０：１４１９　Ａｌａ　Ｐｈａ　工Ｒｅ　Ｇ ｉｎ　Ｘ３．ｅ　Ｉｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　入ｒｇ　４２７１４０４　ＧＡＣＴ ＡＣＣＴＡ　ＣＣＣＡＴＴ　ＧＴＧ　ＣＴＡ　ＧＧＴ　ＡＣＴ　１４：１０４２ Ｂ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｘｌｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｂａ ｒ　４３６１０１　ＧＡＧ　ＡＴＧ　ＣＡＧ　ＡＡＧ　ＴＧＧ　ＡＴＣＣＣＧ　 ＣＣＣＴＡＣ１４５フ４：１７　Ｇｌｕ　Ｍｅ七Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｉｌ ａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　４４５＋４５８　ＣＡＡ　ＧＧＣＴＡＴ　ＡＡＴ 　ＡＡＣＴＣＴ　ＧＴＧ　ＣＡＴ　ＣＣＣ１４８４４４６Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｙ ｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｂａｒ　Ｖａｌ　Ａ１１ｐ　Ｐｒｏ　４５４＋４８５　Ｃ ＧＡ　ＡＴＴ　ＴＣＣＡＡＴ　ＧＴＣＴＴＣＡＣＣＴｒＴ　ＧＣＣ１５１１４５ ５Ａｒｇ　ＩＩｓ　Ｂａｒ　Ａｇｎ　Ｖａｌ　Ｐｈａ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　Ａｌａ 　４６３！５１２　ＴＴＣＣＧＣｆｆｒ　ＧＧＣＣＡＣＡＴＧ　ＧＡＧ　ＧＴＴ 　ＣＣＣ１５コＢ４６４　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｐｈ＠ｃｌｙ　Ｈｌｓ　Ｍａｔ　Ｇ ｌｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　４７２１５］９　ＴＣＣＡＣＴ　ＧＴＧ　ＴＣＣＣＧＣ ＣＴＧ　ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＡＡＴ　１５６５＜７］　Ｓｅｔ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　 Ｓａｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｇｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　４８１１５６６　ＴＡＣＣ ＡＧ　ＣＣＡ　ＴＧＧ　ＧＧＴ　ＣＣＧ　ＧＡＡ　ＧＣＡ　ＧＡＧ　１５９２４ １１２　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　 Ｇｌｕ　４９０１５９３　ＣＴＣＣＣＣＣＴＡ　ＣＡＣＡＣＣＣＴＣＴｒＣＴｒ Ｃ入ＡＣ１６１９４９１Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｌ＠ｕ　Ｈｌｓ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｐ ｈａ　Ｐｈａ　入ｓｎ　４９９）６２０　ＡＣＣＴＧＧ　ＡＧＧ　ＡＴＡ　ＡＴ ＣＡＡＡ　ＧＡＣＧＧＴ　ＣＧＡ　１６４６５００　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　 工１１Ｉ　工ｌｅ　Ｌｙｅ　入ｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　５０ｇ１６４７　ＡＴｒ 　ＧＡＣＣＣＴ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＣＧＧ　ＧＧＴ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　１６７３ ５０９　１１ｅ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　ｔＪｕ　 し川５１７１６７４　ＧＣＣＭＧ　ＡＡＧ　ＴＣＣＡＡＡ　ＣＴＧ　ＡＴＧ　Ａ ＡＴ　ＣＡＧ　１７００５１８　Ａｌａ　ＬｙｇＬＹ！ｌ　ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌ ｅｕ　Ｍａｔ　Ａｇｎ　Ｇｉｎ　５２ｇ＋７０１　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＡＴＧ　Ｇ ＴＧ　ＡＣＧ　ＡＧＴ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＣＧＣ１７２７５２７Ａｇｐ　Ｌｙｓ ＋　Ｍａｔ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｃ１ｕ　Ｌ４ｕ　Ａｒｇ　５３５１７２ ８　ＡＡＣＡＡＧ　ＣＴｒ　ＴＴＣＣＡＧ　ＣＣＣＡＣＴ　ＣＡＣＭＧ　１７５ ４５コロ　八ｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌ＠ｕ　Ｐｈｓ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｈｌｍ 　Ｌｙｅ　５４４】フ５５　ＡＴＣＣＡＣＧＧＣｆｆｌ　ＧＡＣＣＴＧ　ＧＣＴ 　ＧＣＴ　ＡＴＣ１７８１５４５１１＠Ｈ１ｓ　Ｇｌｙ　Ｐｈ＠Ａｓｐ　ＬＩ＠ ｕ＾ｌａ　Ａｌａ　工１＠　５５３１７８２　ＡＡＣＴＴＡ　ＣＡＧ　ＣＧＴ　 ＴＧＣＣＧＡ　ＣＡＣＣＡＴ　にＧＧ　１８０Ｂ５５４　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉ ｎ　Ａｒｇ　Ｃｙｇ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｈｌｍ　Ｇｌｙ　５Ｇ２ユ８０９　ＡＴ Ｇ　ＣＣＴ　ＧＧＧ　ＴＡＣ入へＣＴＣＣＴＧＧ　ＡＧＧ　ＧにＣ１８）５５６ ３　ＭｅセＰｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｂａｒ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ 　５７１０Ｇ、１−４１Ｂ３６　ＴＴＣＴＧＴ　ＧＧＣＣＴＣＴＣＡ　ＣＡＣＣ ＣＣ入ＡＧ　ＡＣＡ　１８６２５７２　Ｐｈａ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌ４ｕ　Ｂａ ｒ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｅ　Ｔｈｒ　５８０１１１６３　ＣＴＣＡＡＧ　にＧ Ｇ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＡＣＴ　ＧＴＧ　Ｃ１’ＣＡＡＧ　１８Ｂ９５１１Ｌ　Ｌ ４ｕ　Ｌｙｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　ｒＡｕ　Ｌｙｇ　５ １１９１８９０　ＡＡＣＡＡＧ　ＡＴＡ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　Ｔ ＴＡ　ＡＴＧ　１９１ｇ５９０　Ｍｎ　Ｌｙｓ　工ｌ＠Ｌ＠ｕ　Ａｌａ　Ｌｙｅ 　Ｌｙｅ　Ｌａｕ　Ｍｔ　５９Ｂ１９１１　ＧＡＴ　ＣＴＣＴＡＴ　ＡＡＧ　Ａ ＣＣＣＣＣＧＡＣ入ＡＣＡＴＴ　１９４：＋５９９　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　 Ｌｙｅ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　ｋｔｘｐ　Ａｓｎ　ＩＩｓ　６０７１９４４　ＧＡＣ ＡＴＣＴＧＧ　ＡＴＴ　ＧＧＡ　ＧＧＣ入＾ＣＣＣＴ　ＧＡＧ　１９７０６０８ 　Ａｇｐ　Ｉｌ＠Ｔｒｐ工Ｉｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｉｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　６ １６１９７１　ＣＣＣＡＴＧ　ＧＴＡ　ＣＡＡ　八ＧＧ　ＧＧＣＣＧＧ　ＧＴＧ 　ＧＧＧ　１９９７６１７　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｕｙ 　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　６２５１９９８　ＣＣＡ　ＣＴＣＣＴＧ　ＧＣＣＴ ＧＣＣＴＣＣＴＡ　ＧＧＧ　ＡＧＧ　２０２４６２６　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｉａｕ 　Ａｌａ　Ｃｙｍ　Ｌ＠ｕ　ｔａｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　６コ４２０２５　ＣＡＡ 　ＴＴＣＣＡＧ　ＣＡＧ　ＡＴＡ　ＣＧＴ　ＣＡＴ　ＧＧＧ　ＧＡＣ２０５１６ ３５Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌ’ｎ　Ｇｉｎ　ｌＩｌ＠　Ａｒｇ　Ａｇｐ　Ｇｌｙ　 Ａｓｐ　６４３２０５２　ＡＧＧ　ＴＴＣＴＧＧ　ＴＧＧ　ＧＪＸＩ；　ＡＡＣ ＣＣＴ　ＧＧＧ　にＴＣ２０７Ｂ６４４　Ａｒｑ　Ｐｈ＠Ｔｒｐ　Ｔｒｐ　Ｇｌ ｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　６５２２０７９　ＴＴＣＡＣＴ　ＧＡＧ 　ＡＡＧ　ＣＡＧ　ＣＧＧ　ＧＡＣＴＣＴ　ＣＴＡ　２１０５６５３　Ｐｈｅ　 Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｅ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｓｓｒ　ＩＡｕ　６６１２ １０６　ＣＡＧ　ＡＡＡ　ＧＴＧ　ＴＣＣＴＴＣＴＣＡ　ＣＧＣＣＴＣＡＴＣ２ １３２６６２Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ｐｈ＠Ｓ＠ｒ　Ａｒｇ　Ｌ４ｕ 　Ｉｌａ６７０２１３３　ＴＧＴ　ＧＡＣＡＡＣＡｃＣＣＡＣＡＴＣＡＣＧ　Ａ ＡＧ　ＧＴＣ２１５９６７）　ＣｙｇＡｓｐ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｈｌｓ　）ｌ叡 Ｔｈｒ　Ｌｙｅ　Ｖａｌ　６７９２１６０　ＣＣＧ　ＣＴＧ　ＣＡＴ　ＧＣＣ’ ｉＴｃ　ＣＡＧ　ＧＣＣＡＡＣＡＡＣ２１８６６８０Ｐｒｏ　１．ａｕ　Ｈｌｓ 　Ａｌａ　Ｐｈ＠Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ａｇｎ　Ａ＊ｒ＋　６８８２１８フ　ＴＡＣ ＣＣＡ　ＣＡＴ　（：ＡＣＴＴｒ　ＧＴＧ　ＧＡＴ　ＴＧＣＴＣＡ　２２１３６ ｓ９　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　）ｌｉｓ　Ａｓｐ　Ｐｈａ　Ｖａｌ＾ｍｐ　ｃｙｓ　Ｂ ａｒ　６９７２２１４　ＡＣＣＧＴＴ　ＣＡＴ　ＡＡＧ　ＣＴＣＧＡＴ　ＣＴＣ ＴＣＡ　ＣＣＣ２２４０６９８Ｔｈｒ　ＶａＩ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　ＸＪ＠ｕ　Ａ ｓｐ　Ｌ４ｕ　Ｂａｒ　Ｐｒｏ　７０６２２４１　ＴＧＧ　ＧＣＣＴＣＣＡＧＧ 　ＧＡＧ　ＭＴ　ＴＡＧ　ＧＧＧ　ＣＣＣ２２６７７０７Ｔｒｐ　ＡｌａＳ＠ｒ 　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　７１２２２６８　ＧＧＡ　ＣＴＣＣＡＣＡＧＣＣＴ ＣＣＣＡ　ＣＡＣＴＧＴ　ＧＣＡ　２２９４２２９５　ＧＴＡ　ＧＡに　ＣＴＣ ＣＣＣＴＴＧ　ＧＣＣＡＣＧ　ＡＴＧ　ＣＣＡ　２３２１２コ２２　ＴＴｒ　Ｃ ＡＡ　ＧＴＡ　ＧＡＣＴＣＡ　ＧＴＧ　ＡＣＣ丁ＧＧ　ＣＣＣ２３４＆２３４９ 　ＣＴＴ　ＣＧＧ　ＧＣＴ　ＣＣＣＴＡＣＣＣＣＧＣＣＣＣＡ　ＧＧＣ２コア５ ２３７６　ＣＴＴ　ＣＴＧ　ＴＣＣＡＧＣＣＧＡ　ＧＴＣＴＣ’ｒ　ＣＴＧ　Ｃ ＡＣ２４０２２４０３ＧＣＣＣＣＣＣＡＡ　ＧＣＡ　ＣＡＣＣＴＡ　（ＣＴ　Ｏ Ｊ　ＧＣＣ２４２９２４３０ＣＡＡ　ＧＧＣＡＧＣＣＧＣＣＴＴＧＣＣＧＣＴ　 ＣＣＡ　ＧＣＴ　２４５６２４５７　ＣＴｒ　ＣＣＣＡ？？　ＧＡＡ　’Ｉ’Ｃ ＣＣＡＣＡＴＣＣＴＣ’！’Ｃ（２４８：１２４８４　ＧＴＣＴＴＣｃａｘ　Ａ ＡＣＣＣＴ　ＣＯＴ　＝畳ＡＡＧ　２５１０　Ｆｌ（、１，５２５１１ＡｃＴ　 ＴＡＧ　ＡｃＣＣＴＣＣＡＡ　ＡＡＴ　ＧＣＣＴＴＣＴｌ：Ａ　２５３７２５コ ８　ＴＣＴ　ＴＧＣＴＴＧ　ＣＣＡ　（ａＴ　ＧＴＣＡＣＣＣＡ？　ＣＣＴ　２ ５６４２５６５　ＴＴＣＣＣＣＡＡＡ　入ＡＡ　＾ＧＴ　ＣＴＴ　ＧＧＣＴＣＡ 　ＧＧＣ２５９１２５９２ＴＣ；Ｔ　ＧＧＣＣＴｒ　ＧＡＣＡＣＣＴｒ　ＡＴＣ ＴＣＴ　ＣＣＴ　２６１Ｂ２５１９　ＣＣＣＣＴＴ　ＧＡＡ　Ｃ’ｌ”Ａ　ＧＡ ’ｌ’　ＴＣ：ｒ　ＭＡ　ＣＴ！’　Ｃ’ｎ’　２６４５２６４６　ＧＡＧ　Ｃ ＴＴ　ＧＧＣＣＴＴ　ＣＡＡ　ＣＣＴ　ＧＣＴ　ＴＣＣ入λＧ　２６］２２６７ コ　ＴＧＴ　ＧＣＣＣＴＣＧＧＧ　ＣＣＣＣＣＡ　ＧＣＧ　ＴＡＧ　ＴＣＣ２６ ９９２７００ＴＴＧ　ＧＣＡ　ＣＡＣＡＧ−ＥｃｏＲ工　２７１゜（εＣ口Ｒ工 　″　７０−二、２゛　シンｐ〜　）ｇ−ψＣひ−−デー　ず１　ずＣ −一ひひαか　のめ　いい　〜〜 ９７１　ＡＡＴ　ＴＡＧ　ＧＧＧ　ＣＣＣＧＣＧ　ＣＴＧ　ＣＡＣＡにＧ　ＡＡ Ａ　９９７９９８　ＧＴｒ　ＣＣＣＴＩＴ　にＧＴ　ＣＣＡ　ＣＡＣＧＧＣＣＡ Ｔ　ＴｒＣ１０２４１０７９ＣＴｒ　ＴＧＣＡＧＣＴＧＧ　ＧＣＣＴＣＴ　ＣＴ Ａ　ＴＡＣＣＣＣ１１０５１１６０ＴＡＣＡＣＴ　ＣＡＧ　ＣＴＣＣＡＧ　ＴＧ Ｇ　ＣＴＴ　ＣＴＣＣＴｒ　１１８６１１８７　ＴＣＴ　ＧＴＣＡＡＧ　ＡＣＴ 　ＴＡＧ　ＣＣＣＣＧＣＴＧＡ　ＧＡＴ　１２１３１２４１　ＴＡＣＣＴＧ　Ｔ ＣＣＴＣＴ　ＴＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＧ　ＴＣＴ　１２６フ１３２２　ＴＧＧ　 ＧＣＣＡＧＧ　ＡＣＴ　ＴＣＡ　ＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＧＡ　１コ４８ユ３４９ 　ＧＧＧ　ＴＣＣＣＣＴ　ＧＴＧ　ＧＣｋ　ＣＣＴ　ｋＧＣＡＴＧ　ＧＴＧ　ｌ コア５１３１６　ＣＡＣＡＧＣＡＣＡ　ＴＴＡ　ＧＡＡ　（Ｔに　ＣＴＣＡＡＡ 　１コ９Ｐ−（非−ＬＰＯ％’Ｊ１．／）（ｉ　ｔＪｏＦ’ｂｔｊｇ　’（Ｅ： ｏＲ工　ｍ　７０−二〉〕　ソンカー）国際調査報告 Ｇｒｎ＋＋ｐ　ｒてＴ、Ｃ１Ｃ１５ｌ　１１　ａｎｄ　１２．　ｄｒ＋ｖｖｎ　 計ｏ　ｓ　ｃｒＯ＊ｓｌｉｎｋｉｎｇ　＋＊ｅｔｈｏｄ　ａ獅■ ＩＩＩＩｈｅｌＨｎｇ　ｍｅｔ、ｈｏｄ、　Ｃ１ｎｎ５ｉｒｊ＠ｄｉｎ　ｃｌａ ａｓ　４３５．５ｕｂｃｌｓｓｓ　ＩＭＭ。

丁ｈｅ　ｉｎ％’ｌ’！ｎｔｉｒｌｎｑ　ＲｒＱ　ｄｉ＊ｒｉｎ＋：ｔ　、ｅａ Ｃｈ　［ｒｒ＋ｌｌ　ｊｈｌ！　ｎｔ、ｈｅｒ　ｈ？ＣａｕW’＊　Ｏｒ　ｊｈ ｅ ｆｏｌｌ【＋ｗｉｎｇ　ｒｅｓｐｏｎｓ：ｃｔＯｕｐｓ　ｔ、ＴＴ、　Ａｎｄ　 丁ＴＴ　ａｒｅ　ｍｌｌｔｌｌａｌｌ％’　Ｔ！Ｘ＋：１１１１１１Ｖ１！　＋ １ｎ＠Ｂ　０ｒＩ１１ｃｔｏｐｅｒｏｓｉｃ５ａｓｅ。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．以下のａおよびｂにより特徴づけられ、組み換えにより生産される、ラクト ペルオキシダーゼ：ａ）ペルオキシダーゼ活性を示すこと；ｂ）図１に示される ウシのラクトペルオキシダーゼをコードするｃＤＮＡ配列と、厳重な条件下でハ イブリダイズするｃＤＮＡ配列でコードされること。
2. ２．以下のａ、ｂおよびｃにより特徴づけられ、組み換えにより生産される、哺 乳類のラクトペルオキシダーゼ：ａ）ペルオキシダーゼ活性を示すこと；ｂ）図 １のウシのラクトペルオキシダーゼをコードするＤＮＡと、厳重な条件下でハイ ブリダイズするＤＮＡでコードされること；および ｃ）該ＤＮＡが、哺乳類乳分泌腺から構築されたｃＤＮＡライブラリーから得ら れること。
3. ３．以下のａおよびｂにより特徴づけられ、組み換えにより生産されるラクトペ ルオキシダーゼ：ａ）ペルオキシダーゼ活性を示すこと；およびｂ）図１に示さ れるアミノ酸残基１２９−７１２と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸 配列を有すること。
4. ４．哺乳類ラクトペルオキシダーゼの精製型であって、通常それと会合している 物質を含まない、哺乳類ラクトペルオキシダーゼ。
5. ５．組み換え宿主細胞中に包含される場合、ラクトペルオキシダーゼをコードす るＤＮＡ配列を発現し得る発現システムであって、ここにおいて、該発現システ ムが、該宿主と適合するコントロールシステムに作動可能に連結された該コーデ ィングＤＮＡを包含する、発現システム。
6. ６．請求項５に記載の発現システムを含む組み換え宿主細胞。
7. ７．ラクトペルオキシダーゼを生産する方法であって、該方法が、請求項６に記 載の組み換え宿主細胞を、該ラクトベルオキシダーゼをコードするＤＮＡの発現 に好適な条件下に培養すること、および生産されたラクトペルオキシダーゼを回 収することを包含する、方法。
8. ８．感染症の治療に用いる薬剤組成であって、薬学的に受容可能な賦形剤との混 合物中に組み換えにより生産されたラクトペルオキシダーゼの有効量を含有する 、組成物。
9. ９．動物被験体において感染症を治療する方法であって、該方法が、このような 治療を必要とする被験体に、有効量の組み換えラクトペルオキシダーゼを投与す ることを包含する、方法。
10. １０．腐敗し易い製品を保存する方法であって、該方法が、該製品に、該製品の 保存に有効な量の、組み換えにより生産されたラクトペルオキシダーゼを添加す ることを包含する、方法。
11. １１．蛋白質にリガンドを架橋する方法であって、組み換えラクトペルオキシダ ーゼを該蛋白質および該リガンドに連結することを包含する、方法。
12. １２．免疫アッセイ試薬を標識する方法であって、該試薬を組み換えラクトペル オキシダーゼと連結することを包含する、方法。