JP2007051162A - 形態形成蛋白質溶解型複合体、及びその組成 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】形態形質活性を有する特定された2量体構造と関連する一対の蛋白質サブユニットからなり、各該サブユニットはモルフォジェンファミリーに特徴的なシステイン残基パタ−ンを有する少なくとも100アミノ酸配列からなり、該サブユニットのすくなくとも1つはモルフォジェンファミリーの一員又は対立形質遺伝子変異、種間変異若しくはそれらの配列変異のサブユニットの成熟型からなり、モルフォジェンファミリーの一員又は種の若しくはそれらの配列変種のプロ領域からなるペプチドと非共有的に結合して、複合体を形成していないサブユニット対より水溶液中ではより溶解性のある複合体を形成する2量体蛋白質。
【選択図】なし
Description
本発明は全般に形態形成蛋白質に関する、さらに詳しくは水系溶媒に改善された溶解度を有する組成に関する。
形態形成蛋白質(モルフォジェン)はよく知られており、先行技術に述べられている。例えば、U、S、Pat.Nos.4,968,590;5,011,691;5,018.753;PCT U S 92/01968及びPCT US92/07432;やOzkaynakらの(1992)J.Biol.Chem. 267:25220−25227及び0zkaynakらの(1991)Biochem.Biophys.Res.Comm.179:116−123を含めて科学文献に発行されているいろいろな論文などを参照できる。
(1)形態形質活性を有する特定された2量体構造と関連する一対の蛋白質サブユニットからなり、各該サブユニットはモルフォジェンファミリーに特徴的なシステイン残基パターンを有する少なくとも100アミノ酸配列からなり、該サブユニットのすくなくとも1つはモルフォジェンファミリーの一員又は対立形質遺伝子変異、種間変異若しくはそれらの配列変異のサブユニットの成熟型からなり、モルフォジェンファミリーの一員又は種の若しくはそれらの配列変種のプロ領域からなるペプチドと非共有的に結合して、複合体を形成していないサブユニット対より水溶液中ではより溶解性のある複合体を形成する2量体蛋白質。
(2)当該サブユニットが共にモルフォジェンファミリーの一員又は対立形質の、又は種の若しくはそれらの配列変種であるサプユニッドの成熟型からなり、該ペプチドと非共有的に複合体を形成する請求項1の蛋白質。
(3)各、当該サブユニットが成熟型のヒトOP−1、又は種の、若しくは対立形質のそれらの変種である請求項1記載の蛋白質。
(4)ペプチドがヒトOP−1のプロ領域、又は種間変異、若しくは対立形質遺伝子変異、若しくは配列のそれらの変異からなる請求項1、2、又は3記載の蛋白質
(5)当該ペプチドが、当該プロ領域を特定するアミノ酸配列の少なくとも最初の18のアミノ酸からなる請求項1記載の蛋白質。
(6)当該ペプチドが、Seq.IDNos.1−16のプロ領域、又はその配列変種を特定するアミノ酸配列の少なくとも最初の18のアミノ酸からなる請求項1記載の蛋白質。
(7)当該ペプチドが、当該プロ領域の全長からなる請求項1、又は6記載の蛋白質。
(8)当該プロ領域ペプチドが、Seq.ID No.1の残基30−48、30−292、及び48−292で特定される配列から選択されたアミノ酸配列からなる請求項1記載の蛋白質。
(9)当該プロ領域ペプチドが、Seq.ID Nos.1−19のプロ領域配列のN末端の18のアミノ酸をコードするDNAと厳密な条件下でハイプリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列からなる請求項1記載の蛋白質。
(10)当該プロ領域が、Seq.ID No.1の136−192の、又はSeq.ID No.5の157−211のヌクレオチドにより特定されるDNAと厳密な条件下でハイプリダイズする核酸からなる請求項1、又は9記載の蛋白質。
(11)当該サブユニット配列変種が、キメラ型モルフォジェンアミノ酸配列からなる請求項1記載の蛋白質。
(12)当該ペプチドが、キメラ型プロ領域アミノ酸配列からなる請求項1記載の蛋白質。
(13)当該サブユニットが、一般配列7、又は一般配列8で特定される配列からなる請求項1記載の蛋白質。
(14)当該サブユニットが、Seq.ID No.1の残基335−431で特定される配列と60%のアミノ酸同一性を有する配列からなる請求項1記載の蛋白質。
(15)当該サブユニットが、Seq.ID No.5−19のいずれかの配列で特定される成熟型サブユニットからなる請求項1記載の蛋白質。
(16)当該サブユニットが、Seq.ID No.1のヌクレオチド1036−1341、又はSeq.ID No.5のヌクレオチド1390−1695により特定されるDNAとハイプリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列からなる請求項1記載の蛋白質。
(17)当該複合体の安定性を増強する事が出来る分子をさらに含む請求項1記載の蛋白質。
(18)請求項1、2、5−9、又は11−17のいずれかの蛋白質からなる治療剤組成。
(19)各当該サブユニットが、成熟型ヒトOP−1、又は種の、若しくは対立形質のそれらの変種である請求項1記載の蛋白質からなる治療剤組成。
(20)当該ペプチドが、ヒトOP−1のプロ領域の一部、若しくは全部、又は種間変異、若しくは対立形質遺伝子変異からなる請求項1記載の蛋白質からなる、治療剤組成。
(21)当該サブユニットが、Seq.ID No.s.5−19のいずれかの配列で特定されるサブユニットの成熟型からなる請求項1記載の蛋白質からなる、請求項18記載の治療剤組成。
(22)請求項3、4、又は10の蛋白質からなる治療剤組成。
(23)さらに補助因子を含有する請求項18、又は22の治療剤組成。
(24)当該補助因子が症状緩和補助因子である請求項23の治療剤組成。
(25)組織不全を診断する、又は哺乳類の損失した、若しくは損傷した組織の再生治療の効果を評価するキットで、以下のものからなるキット;a)当該哺乳類からの細胞、又は体液サンプルを採取する手段。
(b)当該サンプル中の溶解型モルフォジェン複合体と特異的に相互作用する事が出来る結合蛋白質。
(c)当該溶解型モルフォジェン複合体に結合した結合蛋白質を検出する手段。
(26)当該結合蛋白質が、抗体である請求項25記載のキット。
(27)組織の状態を評価する方法で、体液サンプル中のモルフォジェン量と対照サンプル中のモルフォジェン量を比較する工程からなる方法。
(28)哺乳類の損失、又は損傷した組織の再生治療の効果を評価する方法で、体液サンプル中のモルフォジェン量を対照サンプル中のモルフォジェン量と比較する工程からなる方法。
(29)哺乳類の組織不全を診断する方法で、体液サンプル中のモルフォジェン量を対照サンプル中のモルフォジェン量と比較する工程からなる方法。
(30)当該モルフォジェンが、形態形質活性を有する特定された2量体構造と関連する一対の蛋白質サブユニットからなる2量体蛋白質であり、各該サブユニットはモルフォジェンファミリーに特徴的なシステイン残基パターンを有する少なくとも100アミノ酸配列からなり、該サブユニットのすくなくとも1つはモルフォジェンファミリーの一員又は対立形質遺伝子変異、種間変異若しくは配列の変異のサブユニットの成熟型からなり、モルフォジェンファミリーの一員又は種の若しくはそれらの配列変異のプロ領域からなるペプチドと非共有的に結合して、複合体を形成していないサブユニット対より水溶液中ではより溶解性のある複合体を形成する、請求項25、26、27または28の発明。
(31)当該モルフォジェン量が、イムノアッセイで検出される請求項25、26、27、又は28記載の発明。
(32)当該モルフォジェン量が、サンプル液中の溶解型モルフォジェンを離別する事が出来る抗体により検出する請求項25、26、27、又は28記載の発明。
(33)当該体液サンプルが血清からなる請求項25、26、27、又は28記載の発明。
(34)当該組織不全が、骨組織不全である請求項25、又は28記載の発明。
(35)当該骨組織不全が骨肉腫、骨粗鬆症及びバジェット病からなる群より選択される請求項34記載の発明。
(36)組織の状態を評価する方法で、組織、又は体液サンプル中の抗モルフォジェン抗体の存在を検出する工程よりなる方法。
(37)損失、又は損傷した組織の再生治療の効果を評価する方法で、組織あるいは体液サンプル中の抗モルフォジェン抗体の存在を検出する工程よりなる方法。
(38)組織不全を診断する方法で、組織、又は体液サンプル中の抗モルフォジェン抗体を検出する工程よりなる方法。
(39)組織不全を診断する、又は哺乳類の損失した、若しくは損傷した組織の再生治療の効果を評価するキットで、以下のものからなるキット;a)当該哺乳類からの細胞、又は体液サンプルを採取する手段。
(b)当該サンプル中の内因性抗モルフォジェン抗体と特異的に相互作用する事が出来る結合蛋白質。
(c)当該内因性抗モルフォジェン抗体に結合した結合蛋白質を検出する手段。
哺乳動物細胞から培養培地へ分泌する形態形成蛋白質は、分泌蛋白質のかなりの留分として溶解型蛋白質を含む事が判明し、そしてこの溶解型が非共存結合で少なくとも一つの、好ましくは二つのプロドメインと結合している成熟2量体(それらの端を切った形のものも含む)からなることが判明した。さらに抗体が当該蛋白質のこれらの二つ型を識別するのに使用できる事も判明した。これらの抗体は、形態形成蛋白性の成熟型と溶解型を選択的に単離し、また産生される成熟型と溶解型の量を定量する精製工程の一部として使用してもよい。これらの抗体は、また体液中の形態形成蛋白質の濃度を追跡したり、各種の型の蛋白濃度の変動を検出する診断方法の一部として用いてもよい。抗体や蛋白質は、さらに、生体中の各種のこれらの蛋白質に対する、内因性の抗モルフォジェン抗体の濃度を検出、及び追跡する診断アッセイにも使用してもよい。
ここで本質的に当該蛋白質のアミノ酸配列から組成される溶解型の形態形成蛋白質が本発明により判明した。溶解型はプロドメイン、またはそれらのフラグメントからなる非共有結合的に結合している複合体で、形態形成活性を有する2量体蛋白種と非共存結合的に結合し、または複合体を形成する。200未満のアミノ酸からなる2量体の各ポリペプチドは、それぞれSeq.ID No.1の残基330−431と335−431で特定される、少なくともC末端6、好ましくは7個のシステイン骨格からなる。好ましくは、2量体種のポリペプチド鎖は、これらの配列の成熟型か、またはそれらの切断型からなる。好ましい切断型は、インタクトのC末端ドメインを含み、少なくとも10個のアミノ酸のN末延長部分配列からなる。これらの溶解型の形態形成蛋白質は、培養細胞培地や哺乳類の体液から分離してもよいし、in vitroでつくってもよい。
本発明の有用なモルフォジェンの中でOP−1,OP−2、CBMP2蛋白質のような骨形成蛋白や、DPP(猩々蝿から)、Vgl(爪蛙から)、Vgr−1(マウスから、U.S.5,(011,691 Oppermannら参照)、GDF−1(マウスから、Lee(1991)PNAS 88:4250−4254参照)、60A蛋白(猩々蝿から、Seq.ID No.124、Whartonら(1991)PNAS 88:9214−9218参照)や最近、同定されたOP−3のようなアミノ酸配列関連蛋白質として、もともと同定された蛋白質である。
”OP−1”はそれらの対立形質や種の変種、例えばヒトOP−1(”hOP−1”)、又はマウスOP−1(”mOP−1”)なども含むOP−1蛋白質をコードするDNA配列の、一部若しくは全部から発現された形態形成活性を存する蛋白質の群を総称的に指して云う。蛋白質の全長をコードするcDNA及びアミノ酸配列はSeq.ID Nos.lと2(hOPl)とSeq.ID Nos.3と4(mOPl)に示されている。成熟蛋白質は残基293−431(hOPl)と292−430(mOP1)に特定されている。ここで保存された7個のシステイン骨格が、それぞれ、残基330−431と329−430に、N末端延長部分は、それぞれ、残基293−329と292−329に特定されている。当該蛋白質のプロ領域は開裂されて成熟で、形態形成活性を存する蛋白質を生じるが、本質的に残基30−292(hOPl)と残基30−291 mOPl)により特定される。
”OP−2” はそれらの対立形質や種の変種、例えばヒトOP−2(”hOP−2”)、又はマウスOP−2(”mOP−2”)なども含むOP−2蛋白質をコードするDNA配列の一部、若しくは全部から発現された活性を有する蛋白質の群を総称的に指して云う。蛋白質の全長はSeq.ID Nos.5と6(hOP2)とSeq.ID Nos.7と8(mOP2)に示されている。成熟蛋白質は本質的に残基264−402(hOP2)と261−399(mOP2)に特定されている。ここで保存された7個のシステイン骨格が、それぞれ、残基301−402と298−399に、N末端延長部分は、それぞれ、残基264−300と261−297に特定されている。当該蛋白質のプロ領域は開裂されて成熟で、形態形成活性を有する蛋白質を生じるが、本質的に残基18−263(hOP2)と残基18−260(mOP2)により特定される。(他の開裂部位も両方のOP−2蛋白質の上流21残基のところで起きる。)
”OP−3” はそれらの対立形質や種の変種、例えばマウスOP−3(”mOP−3’)なども含むOP−3蛋白質をコードするDNA配列の一部、又は全部から発現された活性を有する蛋白質の群を総称的に指して云う。蛋白質の全長はSeq.ID Nos.9に示されている。成熟蛋白質は本質的に残基261−399又は264−399に特定されている。ここで保存された7個のシステイン骨格が、残基29B−399に、N末端延長部分は、残基264−297又は261−297に特定されている。当該蛋白質のプロ領域は開裂されて成熟で、形態形成活性を有する蛋白質を生じるが、本質的に残基20−262により特定される。
”BMP2/BMP4” は、ヒト−BMP2とBMP4の遺伝子でコードされる蛋白質配列を指して云う。蛋白質全長のアミノ酸配列はBMP2AやBMP2B、又はBMP2やBMP4として文献に言及されておりSeq.ID Nos.10と11に及びWozneyら(1988)Science 242:1528−1534.に、それぞれ記載されている。BMP2(BMP2A)のプロドメインは残基25−248、または25−282を含んでおり;成熟蛋白質は残基249−396、または283−396を含んでいるが、その残基249−296/283−296はN末端延長部分を特定し、295−396はC末端ドメインを特定する。BMP4(BMP2B)のプロ領域は、残基25−256、または25−292を含む;成熟蛋白質は残基257−408、または293−408を含み、その257−307/293−307はN末端延長部分を特定し308−408はC末端ドメインを特定する。
”DPP” は猩々蝿のDPP遺伝子によりコードされる蛋白質の配列を指して云う。蛋白質全長のアミノ酸配列は成熟型やプロ領域も含んでSeq.ID No.12とPadgettら(1987)Nature 325:81−84に発表されている。プロドメインは、シグナルペプチド開裂部位から残基456まで続いている。成熟蛋白質は、残基457−588で特定されるし、ここで残基457−586はN末端延長部分を特定し487−588はC末端ドメインを特定する。
”Vgr” は爪蛙のVgl遺伝子によりコードされる蛋白質配列を指して云う。蛋白質の全長のアミノ酸配列は成功型やプロ領域も含みSeq.ID No.13とWeeks(1987)Cell 51:861−867に記載されている。プロドメインはシグナルペプチド開裂部位から残基246まで続いている;成熟蛋白質は残基247−360で特定できるし、その残基247−258はN末端の延長部分を特定し、259−360はC末端ドメインを特定する。
”Vgr−1” はマウスVgr−1遺伝子によりコードされる蛋白質配列を指して云う。蛋白質の全長のアミノ酸配列は成熟型やプロ領域も含みSeq.ID No.14とLyonsら(1989)PNAS 86:4554−4558に記載されている。プロドメインはシグナルペプチド開裂部位から残基299まで続いている;成熟蛋白質は残基300−438で特定できるし、その残基の300−336はN末端の延長部分を特定し、337−438はC末端を特定する。
”GDF−1” はヒトGDF−1遺伝子によりコ−ドされる蛋白質配列を指して云う。蛋白質の全長のcDNAおよびコードされたアミノ酸配列はSeq.ID No.15とLee (1991)PNAS 88:4250−4254に記載されている。プロドメインは、シグナルペプチド開裂部位から残基314まで続いている;成熟蛋白質は残基215−372で特定できるし、その残基215−256はN末端の延長部分を特定し、257−372はC末端を特定する。
”60A” は猩々蝿60A遺伝子によりコードされる蛋白質配列を指して云う。蛋白質の全長のアミノ酸配列は、Seq.ID No.16とWhartOnら(1991)PNAS 87:9214−9218に記載されている。プロドメインはシグナルペプチド開裂部位から残基324まで続いている。成熟蛋白質は残基325−455で特定できるし、その残基325−353はN末端の延長部分を特定し、残基354−455はC末端を特定する。
”BMP3” はヒトBMP3遺伝子によりコードされる蛋白質配列を指して云う。蛋白質の全長のアミノ酸配列は、Seq.ID No.17とWozeneyらScience 242:1528−1534に記載されている。プロドメインはシグナルペプチド開裂部位から残基290まで続いている。成熟蛋白質は残基291−472で特定できるし、その残基291−370はN末端の延長部分を特定し、残基371−472はC末端を特定する。
”BMP5” はヒトBMP5遺伝子によりコードされる蛋白質配列を指して云う。蛋白質の全長のアミノ酸配列は成熟型やプロ領域も含みSeq.ID No.18とCe1esteら(1990)PNAS 87 :9843−9847に記載されている。プロドメインはシグナルペプチド開裂部位から残基316まで続いている;成熟蛋白質は残基317−454で特定できるし、その残基317−352はN末端を特定し、352−454はC末端を特定する。
”BMP 6” はヒトBMP6遺伝子によりコードされる蛋白質配列を指して云う。蛋白質の全長のアミノ酸配列は成熟型やプロ領域も含みSeq.ID No.16とC1esteら(1990)PNAS 87:9843−9847に記載されている。プロドメインはシグナルペプチド開裂部位から残基374まで続いている;成熟蛋白質は残基375−513で特定できるし、その残基375−411はN末端を特定し、412−513はC末端を特定する。
溶解型モルフォジェン複合体は、標準的な組み換え体発現技術を用いて、真核宿主細胞、好ましくは哺乳動物細胞から生産できる。現在のところ好ましい模範的なプロトコルは以下に示されるが、特別のベクター構成とチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株を用いる。当業者の技術では、他のベクターや他の細胞系なども含め、他の発現系も有用であるが、本発明は以下に詳述する方法によってのみ生産できる溶解型形態形成蛋白質複合体に限るものではない。COSやBSC細胞用に開発した組み換え体発現系を用いても、ここで開示しである結果と類似の結果が観察された。
III.培地や体液から溶解型モルフォジェン複合体の単離
モルフォジェンは補乳動吻細胞から溶解型複合体として発現する。一般に、しかしながら、複合体は精製過程で、一般的には精製溶液によく添加される変性剤、例えば洗剤、アルコール、有機溶媒、水構造破壊剤や溶液のpHを下げるのに添加される化合物などに曝された時に解離する。以下に、調整培地、(別の選択では、血清、脳を髄液、腹水などの体)からの溶解型蛋白質の現在もっとも好ましい精製プロトコルは変性剤のない条件で行う。当該方法は早く、再現性もよく実質的に純粋な形で溶解型モルフォジェン複合体が単離される。
本実験ではOP−1は上記の如くCHO細胞で発現された。0.5%FBSを含むCHO細胞調整培地は、最初に、固定化金属イオン・アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)で精製された。調整培地由来の溶解型OP−1複合体は選択的にZn−IMAC樹脂に結合し、その結合した複合体を効果的に溶出させるには、高濃度のイミダゾール(50mMイミダゾール、pH8)が必要である。Zn−IMAC段階では、最初の流しの時及び35mMイミダゾール洗浄分画に溶出する多くのコンタミしている血清蛋白質から、溶解型OP−1を分離する。Zn−IMAC精製溶解型OP−1は次に20mM NaPO4(pH7.0)と50mM NaClで平衡化されたS−セファロース・カチオン交換カラムに適用される。このS−セファロース段階ではさらに精製して次のゲル濾過工程への調製に溶解型OP−1複合体を濃縮するのに役立っている。蛋白質はTBSで平衡化されたセファクリルS−200HRカラムに載せられる。実質的に同じプロトコルを利用して、溶解型モルフォジェンを血清、脳脊髄液、腹水を含む一つ以上の体液から単離してもよい。
培養培地や体液から、溶解型複合体を精製する別の方法として、溶解型複合体は精製プロドメインや成熟2量体種からつくることもできる。複合体形成が成功するにはジスルフィド結合に影響せず、これらの分子の折りたたまれた構造を緩和するのに十分な変性条件下で成分の解離が必要である。好ましくは、変性条件が、切断プロドメインが、緩和された折りたたみ条件下で、成熟2量体種と結合する機会をもてるに十分な分子内小孔の環境を擬似することである。そこで変性剤の溶液中の濃度は制御され、好ましくは、プロドメインが2量体と結合したままで、2量体とプロ領域の適切なりフォールデイングが許容できるように段階的に減少させる。有用な変性剤としては、pH4−10、好ましくはpH6−8の緩衝液中で、4−6Mの尿素、グアニジン塩酸塩(GuHCl)を含む、そして、溶解型複合体は調節された透析か、変性剤の最終濃度が0.1−2M 以下の尿素、又はGuHCl、好ましくは1−2M以下の尿素、又はGuHClの溶液、ここで好ましくは生理緩衝液に、希釈する事によって作られる。蛋白質精製や変性操作や考察については従来技術によく開示されており、適切な変性プロトコルをすぐに開発するための詳細は当業者の通常の技術を有するものにより決められる。一つの有用なテキストは、例えば、Guide to Protein Purification、M、DeutscherSW、Academic Press、San Diego、1990、特に第V節。
複合体形成は一つ以上のシャペロン蛋白質を加えることにより支援される。
生理緩衝液中、例えば、トリス緩衝生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水など、での高度に精製された溶解型モルフォジェンの安定性は、いろいろな手段で増強できる。現在好ましくは、プロ配列(例えば、OP−1のSeq.ID No.1の残基30−47)のすくなくとも最初の18個のアミノ酸、好ましくはプロ領域の全長、からなるプロ領域によるものである。残基30−47は他のモルフォジェンのN末端部分と配列相同性を示し、全てのモルフォジェンの複合体安定性を増強するのに特に有用と考えられている。
プロドメインと成熟2量体種との結合は異なる活性測定により示されるようにin vivoでの蛋白質の形態形成性活性に影響を与えない。特に、標準的なラット骨減少症モデルに投与された溶解型OP−1複合体は、成熟モルフォジェンを使用したときに得られる結果と類似した様式で、骨成長やオステオカルシン産生を有意に増加する。(以下の表IIを参照)
アッセイは国際出願 US92/07432(WO93/05751)に開示している骨粗鬆症モデルに類似しているが卵巣摘除の動物ではなく、むしろ老齢の雌性ラットを使用している。簡単には若齢及び老齢の雌性ラット(チャールズリバーラボ、それぞれ、115−145、335−460gの体重)に毎日7日間、尾静脈注射で、20μg/kg体重 の溶解型OP−1、あるいは100μg/kg体重 の溶解型OP−1を投与した。対照群の若年及び老年の雌性ラットにはトリス緩衝生理食塩水(TBS)のみを投与した。水や餌は全ての動物に自由に摂取させた。14日後、動物は屠殺され、新しい骨成長を標準的な組織病理学的方法により測定した。血清中のオステオカルシン濃度も測定した。モルフォジェン投与による好ましくない効果は体重や組織重量の変化の測定や、血液学的プロフイールによる測定では認められなかった。
以下にポリクロナル及びモノクロナル抗体産生の標準的プロトコルを開示する。溶解型複合体のみを認識する抗体のために、好ましくは単離されたプロ領域が抗原として使用されることである;ここでは成熱蛋白に対する特異的な抗体が望まれており、抗原は好ましくは、少なくともC末端ドメインかインタクトな成熟配列からなるのがよい。
溶液中のモルフォジェンを検出したり、溶解型と成熟型2量体モルフォジェンの型を識別する能力は診断検査に貴重な手段を提供しており、血清や他の体液中のモルフォジェンの濃度や型を追跡したり、診断方法や他の組織評価キットを開発したりすることができる。
血清アッセイについては、好ましくは、まず、血清は血清アルブミンのような過剰な、コンタミしている血清蛋白質をのぞく為に、部分精製する。好ましくは血清は硫安(例えば45%)沈澱により抽出され、複合体は沈殿する。血清中に存在する他の蛋白質の溶解度と比較して、溶解型あるいは成熟型モルフォジェンの溶解度が区別出来ることを利点としてさらに精製ができる。更なる精製は公知のクロマトグラフィー技術でも出来る。溶解型OP−1は、以下のように、ELISA法でOP−1プロドメインに特異的なポリクロナル抗体を用いて検出できる。1μg/100μlのアフィニティー精製したOP−1プロに特異的なポリクロナルウサギIgGを96穴プレートの各ウエルに加え、37℃で1時間インキュベートする。各ウェルを4回、pH8.2、Tween20を含む0.15M NACl、0.167M ほう酸ナトリウム緩衝液(BSA)で洗浄する。非特異的結合を最小限におさえるため、ウェルをBSB中1%牛血清アルブミン(BSA)で完全に満たしてブロックし37℃で1時間インキュベートする。ウエルはその後4回、0.1%のTween20含むBSBで洗浄する。100μlの培養上清か血清の検査サンプルの適当な希釈溶液を、各ウエルにn=3で加え、37℃で30分インキュベートした。インキュベートした後、100μlのビオチン化ウサギ抗プロ血清(ストック溶液は約1mg/mlで使用前に1%BSAを含むBSBに1:400で希釈する)を各ウエルに加え37℃ 30分インキュベートする。ウエルをその後4回、0.1%のTween20含むBSBで洗浄する。100μlのストレパビディン−アルカリ(Southern Biotechnology Associates、Inc.Birmingham、Alabama、使用前に0.1%のTween20含むBSBで1:2000に希釈する)を各ウエルに加え、37℃ 30分インキュベートする。プレートを4回pH0,2,0,5M)リス緩衝食塩水で洗浄する。50μlの基質(ELISA増幅システムキット、Life Technologies,Inc.、Bethesda、MD)を15分間、室温でインキュベートしである各ウエルに加えた。その後、50μlの増幅剤(同じ増幅システムキットから)を加え、さらに15分間、室温でインキュベートした。反応は50μlの0.3M硫酸を加えて停止させた。
本発明の溶解型モルフォジェンは哺乳類、特にヒトの病気、あるいは損傷した組織を再生する治療薬として特に有用である。溶解型複合体は損傷した、病気の肺臓、肝臓、心臓、腎臓、神経組織、膵臓組織の再生に、又はこれらの組織、骨髄、皮膚、消化管粘膜や他の生体組織の移植や植接に特別な利点をもって使用することができる。
本発明は、その精神、又は本質的な特徴から離れることなく他の特定の形で具体化できる0本実施例は、従って、全ての点について実例として考慮されるべきものであるが、限定するものではない。前述の明細書によるものより、むしろ添付の請求項記載の発明の範囲、及び請求項と等価の意味と範囲内での全ての変化は、従って、本発明に包含されるものである。
Claims (1)
- 単離された多量体蛋白質複合体であって、以下:
(a)ジスルフィド結合するポリペプチド鎖の対を含む二量体蛋白質であって、該鎖の各々は、少なくとも100アミノ酸を含み、そして、配列(i)ヒトOP−1のC末端の7つのシステイン配列(配列番号1の残基330−431)と少なくとも70%のアミノ酸配列相同性を有するか、または(ii)一般配列7(配列番号20)によって規定されるか、または(iii)一般配列8(配列番号21)によって規定されるか、または(iv)ヒトOP−1のC末端の7つのシステイン配列(配列番号1のヌクレオチド1036−1341)をコードするDNAまたはRNA分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるか;あるいは
(b)該二量体蛋白質と非共有結合的に複合体化されることにより多量体蛋白質複合体を形成するペプチドであって、該多量体蛋白質複合体は、該二量体蛋白質よりも水性の溶媒においてより溶解性であり、
該ペプチドは、(i)ヒトOP−1のC末端の7つのシステイン配列(配列番号1の残基330−431)と少なくとも70%のアミノ酸配列相同性を有するか、または(ii)ヒトOP−1のC末端の7つのシステイン配列(配列番号1のヌクレオチド1036−1341)をコードするDNAまたはRNA分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされる、少なくとも100アミノ酸を含む、天然に存在するポリペプチドのプロ形態において成熟ポリペプチドのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する、
単離された多量体蛋白質複合体。
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