KR20230123959A - 화학 가교 알긴산을 사용한 이식용 디바이스 - Google Patents

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쇼지 후루사코
나오토 츠다
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모찌다 세이야쿠 가부시끼가이샤
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Abstract

여기에서는, 인슐린 분비 세포 또는 췌도가 봉입된 하이드로겔을 포함하는 이식용 디바이스이며, 상기 하이드로겔이 알긴산 유도체를 화학 가교에 의해 겔화한 것인, 이식용 디바이스가 제공된다. 이에 의해, 신규의 이식용 디바이스가 제공된다.

Description

화학 가교 알긴산을 사용한 이식용 디바이스
본 발명은, 세포 등을 생체에 이식하기 위한 디바이스에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 화학 가교 알긴산을 사용한 이식용 디바이스, 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
I형 당뇨병의 치료법으로서는, 종래의 인슐린 주사나 췌장 이식 외에도, 국내외에서 췌도 이식도 실시되고 있기는 하지만, 특히 국내에서는 도너 부족 등의 문제도 있고, 아직 소수예에 한정되어 있다. 돼지 췌도를 사용한 이종 이식은, 이 도너 부족을 해소하는 유효한 기술이 될 수는 있지만, 동종 이식도 이종 이식의 경우도, 면역에 의한 거절 반응은 피할 수 없고, 장기에 걸친는 면역 제어제의 복용이 필수가 되어, 그것에 의한 합병증의 위험성이나 잔존하는 이식 췌도의 악영향의 가능성도 보고되어 있다(비특허문헌 1: Organ Biology, VOL24, No.1, 7-12 페이지, 2017).
이것을 해결하는 기술로서, 레시피언트의 면역 세포 등으로부터는 격리 가능하며, 영양분이나 인슐린 등은 투과 가능한 고분자 겔이나 반투막 등으로 췌도를 피복(캡슐화)하고, 체 내에 이식하는 바이오 인공 췌장(bioartificial pancreas(BAP), 바이오 인공 췌도라고도 함)의 기술이 이전부터 검토되어 오고 있다(특허문헌 1: 일본 특허 공개 소55-157502호 공보, 특허문헌 2: 일본 특허 공개 소60-258121호 공보, 특허문헌 3: 국제 공개 제95/28480호 팸플릿, 특허문헌 4: 국제 공개 제92/19195호 팸플릿, 특허문헌 5: 일본 특허 공개 제2017-196150호 공보).
바이오 인공 췌도의 종류에 대해서는, 주로 (1) 개개의 췌도를 고분자 겔 등으로 피복한 「마이크로 캡슐형」, (2) 다수의 췌도를 고분자 겔이나 반투막 등으로 피복한 「매크로 캡슐형」, (3) 반투막으로 제작된 면역 격리 디바이스나 중공사 모듈 등에 췌도를 봉입하고, 디바이스 중에 혈액을 관류시키는 「혈액 관류형」으로 분류된다(비특허문헌 1).
마이크로 캡슐형은, 면역 세포로부터의 격리가 가능하며 영양분이나 인슐린 등은 투과 가능한 고분자 겔을 사용하여 개개의 췌도를 캡슐화하고, 통상의 췌도 이식과 마찬가지로 체 내(주로 복강 내)에 이식하는 기술이다. 레시피언트의 면역 세포로부터 격리할 수 있을 뿐 아니라, 비교적 격리막 두께가 얇기 때문에 확산에 의한 투과 시간이 짧고, 영양분의 투과나 세포의 응답이 빨라진다는 장점이 있지만, 췌도의 기능이 저하될 때에 회수하는 것은 곤란하다.
혈액 관류형은, 췌도를 반투막으로 격리한 유로에 혈액을 관류시키는 기술로, 인공 투석이나 바이오 인공 간장 등의 기술의 축적을 응용하고 있으며, 다수의 기초 연구가 행해져 왔지만, 장치 사이즈가 커지는 것이나 혈전 형성의 리스크가 큰 것이 과제이며, 장기 사용 시에 혈전을 만들어 막히기 쉽다는 결점이 있어, 실용화에는 이르지 못하였다.
매크로 캡슐형은 마이크로 캡슐형의 결점, 즉, 췌도의 기능 저하 시의 적출을 가능하게 할 목적으로 개량된 기술이다. 그러나, 매크로 캡슐형의 이종 췌도를 사용한 췌도 이식에 있어서의 연구에서는, 우수한 성적을 나타내는 것은 아직 보고되어 있지 않고, 도너 부족, 면역 제어제의 사용, 췌도의 장기 생착·기능 유지 등의 췌도 이식에 있어서의 문제점을 극복하는, 이종 췌도를 사용한 바이오 인공 췌도는 아직 발견되지 않았다.
클릭 반응을 사용한 알긴산히드로겔 캡슐의 합성과 그들의 안정성, 수팽윤 및 확산의 이온 가교 알긴산염 캡슐의 비교에 관한 보고가 있다(비특허문헌 2: JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH, PartB/VOL103B, ISSUE 5, P1120-1132(2015)). 당해 문헌에는, 클릭 반응으로 형성되는 알긴산 캡슐은 이온 가교(C2+) 가교보다 안정된 것이 개시되어 있다.
일본 특허 공개 소55-157502호 공보 일본 특허 공개 소60-258121호 공보 국제 공개 제95/28480호 팸플릿 국제 공개 제92/19195팸플릿 일본 특허 공개 제2017-196150호 공보
Organ Biology, VOL24, No.1, 7-12 페이지, 2017 JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH, PartB/VOL103B, ISSUE 5, P1120-1132(2015)
상기와 같은 상황에 있어서, 실용 가능한 새로운 이식용 디바이스 등이 요구되고 있었다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 이하의 (1) 내지 (10)을 알아내고, 이들 지견에 기초하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
(1) 여기에서 사용되는 신규의 알긴산 유도체(예를 들어, 식 (HA-I) 및 식 (HA-II)의 알긴산 유도체)는, 예를 들어 화학 가교 형성으로 하이드로겔화되는 것이며, 당해 화학 가교하는 알긴산 유도체를 사용하여 평판형으로 조제한 알긴산 겔이, 생체 내(건강 마우스의 복강 내)에 이식한 바, 5주일 후에도 평판형 겔의 사이즈에 큰 변화가 없고, 당해 겔이 용해되지 않고 형상을 유지하여, 생체 내 안정성이 우수한 것.
(2) 또한, 당해 마우스의 복강 내의 유착이나 염증이 보이지 않는 것.
(3) 평판형 겔 내에 Min6 세포를 포매시켜 3 내지 4주일 배양한 바, Min6 클러스터의 생존을 확인할 수 있고, 증식이 양호하고, 세포 독성은 없는 것.
(4) 돼지 췌도를 포매한 화학 가교 알긴산 겔을 반투막으로 피복한 이식용 디바이스를 당뇨병 모델 마우스에 이식한 바, 75일간에 달하는 혈당값 억제 효과가 나타내진 것.
(5) 상기 (4)에 있어서, 이식 후 10주 경과하고 나서 당해 이식용 디바이스를 적출한 바, 유착, 혈관 신생 및 염증 등의 장애는 확인되지 않은 것. 또한, 이식용 디바이스 중의 췌도에 대하여 디티존 염색에 의해 그 생존을 확인했을 때, 충분히 생존하고 있는 것이 확인된 것. 또한, 이식 후 10주일 후 적출한 이식용 디바이스를 개방하여, 가운데의 알긴산 겔을 확인한 바, 그 형상 상태가 유지되고 있었던 것.
(6) 디바이스 내외로의 물질 투과성이 우수한 것.
(7) 하이드로겔의 두께가 500㎛ 미만인 박형의 디바이스일 경우에, 500㎛ 이상인 경우와 비교하여, 디바이스를 이식한 동물의 치유율이 높은 것.
(8) 하이드로겔의 두께가 500㎛ 미만인 박형의 디바이스일 경우에, 500㎛ 이상인 경우와 비교하여, 디바이스의 표면에 대한 중심부의 산소 농도의 비율이 높은 것.
(9) 하이드로겔을 진탕한 경우에 있어서, 하이드로겔이 붕괴되지 않거나 또는 하기 어려운 것.
(10) 하이드로겔을 진탕한 경우에 있어서, 하이드로겔 중에 포함되는 췌도의 겔로부터의 탈락이 적은 것.
여기서 사용되는 신규의 알긴산 유도체(예를 들어, 식 (HA-I) 및 식 (HA-II)의 알긴산 유도체)는, 예를 들어 화학 가교 형성에 사용할 수 있는 것이며, 즉, 화학 가교 형성에 사용할 수 있는 반응성기 또는 당해 반응성기의 상보적인 반응성기가 도입된 것이다.
상기 화학 가교 형성은, 예를 들어 화학 가교 형성에 사용할 수 있는 반응성기가 도입된 알긴산 유도체와 당해 반응성기의 상보적인 반응성기가 도입된 알긴산 유도체 사이에서 발생해도 된다. 반응성기와 당해 반응성기의 상보적인 반응성기는 알긴산의 1 분자 중에 양쪽 모두 도입되어 있어도 되고, 따로따로 도입되어 있어도 된다. 또한, 상기 화학 가교 형성은 알긴산 유도체의 분자 내에서 행해져도 되고, 분자간에서 행해져도 되고, 반응성기 또는 당해 반응성기의 상보적인 반응성기가 도입된 다른 분자와 행해져도 된다.
상기 화학 가교 형성은, 예를 들어 위스헨(Huisgen) 반응(1,3-쌍극자 부가 환화 반응)에 의한 가교 반응으로 행해지고, 예를 들어 식 (HA-I) 및 식 (HA-II)의 알긴산 유도체간에서 행해져도 되고, 또는 예를 들어 식 (HA-I)의 알긴산 유도체와 아지드기를 갖는 다른 분자간에서 행해져도 되고, 또는 식 (HA-II)의 알긴산 유도체와 알킨기를 갖는 다른 분자간에서 행해져도 된다.
또한, 상기 화학 가교 형성은, 예를 들어 위스헨 반응(1,3-쌍극자 부가 환화 반응)에 의한 가교 반응으로 행해지고, 예를 들어 식 (HB-I) 및 식 (HB-II)의 알긴산 유도체간에서 행해져도 되고, 또는 예를 들어 식 (HB-I)의 알긴산 유도체와 아지드기를 갖는 다른 분자간에서 행해져도 되고, 또는 식 (HB-II)의 알긴산 유도체와 알킨기를 갖는 다른 분자간에서 행해져도 된다.
여기에서는, 화학 가교에 의해 겔화되는 알긴산 유도체를 사용하여 조제된, 세포 등을 생체에 이식하기 위한 디바이스, 보다 구체적으로는, 예를 들어 인슐린 분비 세포 또는 췌도 등이 포매된 화학 가교 알긴산 겔과, 필요에 따라서 당해 겔을 피복하는 반투막을 포함하는 이식용 디바이스, 그의 제조 방법 등이 제공된다. 화학 가교에 의해 겔화되는 알긴산 유도체는, 예를 들어 알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에, 아미드 결합 및 2가의 링커를 통해 환상 알킨기 또는 아지드기가 도입된 식 (HA-I) 또는 식 (HA-II)의 알긴산 유도체이며, 식 (HA-I) 및 식 (HA-II)의 알긴산 유도체를 사용하여 위스헨 반응(1,3-쌍극자 부가 환화 반응)을 행함으로써 신규의 가교 알긴산이 얻어진다.
혹은, 화학 가교에 의해 겔화되는 알긴산 유도체는, 예를 들어 알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에, 아미드 결합 및 2가의 링커를 통해 환상 알킨기 또는 아지드기가 도입된 식 (HB-I) 또는 식 (HB-II)의 알긴산 유도체이며, 식 (HB-I) 및 식 (HB-II)의 알긴산 유도체를 사용하여 위스헨 반응(1,3-쌍극자 부가 환화 반응)을 행함으로써 신규의 가교 알긴산이 얻어진다.
예시적인 양태는 이하의 [1-1] 내지 [3-4]와 같을 수 있다.
또한, 본 명세서에 있어서, 식 (HA-I) 및 식 (HB-I)에 관한 알긴산 유도체는, 모두 공통되게 식 (I)의 구조를 갖는다. 따라서, 식 (HA-I) 및 식 (HB-I)에 관한 알긴산 유도체의 일반식은 모두 식 (I)으로 표시된다.
또한, 본 명세서에 있어서, 식 (HA-II) 및 식 (HB-II)에 관한 알긴산 유도체는, 모두 공통되게 식 (II)의 구조를 갖는다. 따라서, 식 (HA-II) 및 식 (HB-II)에 관한 알긴산 유도체의 일반식은 모두 식 (II)으로 표시된다.
또한, 본 명세서에 있어서, 식 (HA-III-L) 및 식 (HB-III-L)에 관한 가교 알긴산은, 모두 공통되게 식 (III-L)의 구조를 갖는다. 따라서, 식 (HA-III-L) 및 식 (HB-III-L)에 관한 가교 알긴산의 일반식은 모두 식 (III-L)로 표시된다.
본 발명의 제1 양태는 이하의 [1-1] 내지 [1-34]와 같을 수 있다.
[1-1] 인슐린 분비 세포 또는 췌도가 봉입된 하이드로겔을 포함하는 이식용 디바이스이며, 상기 하이드로겔이 알긴산 유도체를 화학 가교에 의해 겔화한 것인, 이식용 디바이스.
[1-2] 상기 하이드로겔이, 가교로서 알긴산 유도체간에 형성되는 화학 가교를 포함하는, 상기 [1-1]에 기재된 이식용 디바이스.
[1-3] 상기 하이드로겔이, 가교로서 위스헨 반응에 의해 형성되는 트리아졸환에 의한 화학 가교를 포함하는, 상기 [1-1] 또는 [1-2]에 기재된 이식용 디바이스.
[1-4] 상기 화학 가교가, 알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 도입된 환상 알킨기와, 알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 도입된 아지드기로부터 발생하는, 상기 [1-1] 내지 [1-3] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[1-5] 상기 화학 가교가, 제1 알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 도입된 환상 알킨기와, 제2 알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 도입된 아지드기로부터 발생하는, 상기 [1-4]에 기재된 이식용 디바이스.
[1-6] 상기 화학 가교가, 이하의 (A) 및 (B)에 기재된 알긴산 유도체의 조합에 의한 화학 가교인, 상기 [1-1] 내지 [1-5] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스
(A):
알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 아미드 결합 및 2가의 링커(-L1-)를 통해, 환상 알킨기(Akn)가 도입된, 하기 식 (HA-I):
Figure pct00001
[식 (HA-I) 중, (ALG)는 알긴산을 나타내고; -NHCO-는 알긴산의 임의의 카르복실기를 통한 아미드 결합을 나타내고; -L1-는 하기 부분 구조식[각 식 중, 양단의 파선 외측은 포함하지 않음]:
Figure pct00002
의 군에서 선택되는 2가의 링커를 나타내고; Akn은 하기 부분 구조식[각 식 중, 파선 우측은 포함하지 않음]:
Figure pct00003
의 군에서 선택되는 환상 알킨기를 나타내고, 별표는 키랄 중심을 나타냄]로 표시되는 알긴산 유도체;
(B):
알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 아미드 결합 및 2가의 링커(-L2-)를 통해, 아지드기가 도입된, 하기 식 (HA-II):
Figure pct00004
[식 (HA-II) 중, (ALG)는 알긴산을 나타내고; -NHCO-는 알긴산의 임의의 카르복실기를 통한 아미드 결합을 나타내고; -L2-는 하기 부분 구조식[각 식 중, 양단의 파선 외측은 포함하지 않음]:
Figure pct00005
의 군에서 선택되는 2가의 링커를 나타냄]로 표시되는 알긴산 유도체.
[1-7] 상기 화학 가교된 알긴산 유도체가, 제1 알긴산의 임의의 카르복실기와, 제2 알긴산의 임의의 카르복실기가, 하기 식 (HA-III-L):
Figure pct00006
[식 (HA-III-L) 중, 양단의 -CONH- 및 -NHCO-는 알긴산의 임의의 카르복실기를 통한 아미드 결합을 나타내고;
-L1-는 상기 양태 [1-6] 중의 정의와 동일하고;
-L2-는 상기 양태 [1-6] 중의 정의와 동일하고;
X는 하기 부분 구조식:
Figure pct00007
의 군에서 선택되는 환상기이며(각 식 중, 양단의 파선 외측은 포함하지 않음), 별표는 키랄 중심을 나타냄]을 통해 결합된 가교 알긴산인, 상기 [1-6]에 기재된 이식용 디바이스.
[1-8] 상기 화학 가교가, 이하의 (A) 및 (B)에 기재된 알긴산 유도체의 조합에 의한 화학 가교인, 상기 [1-1] 내지 [1-5] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스
(A): 알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 아미드 결합 및 2가의 링커(-L1-)를 통해, 환상 알킨기(Akn)가 도입된, 하기 식 (HB-I):
Figure pct00008
[식 (HB-I) 중, (ALG)는 알긴산을 나타내고; -NHCO-는 알긴산의 임의의 카르복실기를 통한 아미드 결합을 나타내고; -L1-는 하기 표
[표 1-1]
Figure pct00009
[표 1-2]
Figure pct00010
에 기재된 부분 구조식[각 식 중, 양단의 파선 외측은 포함하지 않음]으로 이루어지는 군에서 선택되는 링커를 나타내고;
Akn은 하기 표:
[표 2]
Figure pct00011
에 기재된 부분 구조식[각 식 중, 파선 우측은 포함하지 않음]으로 이루어지는 군에서 선택되는 환상 알킨기를 나타냄]로 표시되는 알긴산 유도체;
(B): 알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 아미드 결합 및 2가의 링커(-L2-)를 통해, 아지드기가 도입된, 하기 식 (HB-II):
Figure pct00012
[식 (HB-II) 중, (ALG)는 알긴산을 나타내고; -NHCO-는 알긴산의 임의의 카르복실기를 통한 아미드 결합을 나타내고; -L2-는 하기 표:
[표 3-1]
Figure pct00013
[표 3-2]
Figure pct00014
에 기재된 부분 구조식[각 식 중, 양단의 파선 외측은 포함하지 않음]으로 이루어지는 군에서 선택되는 링커를 나타냄]로 표시되는 알긴산 유도체(단, 식 (HB-I)로 표시되는 알긴산 유도체에 있어서 -L1-가 (L1-1), (L1-2a), (L1-2b), (L1-11) 또는 (L1-12)의 군에서 선택되는 어느 하나의 링커인 유도체와, 식 (HB-II)로 표시되는 알긴산 유도체에 있어서 -L2-가 (L2-10)의 링커인 유도체의 조합에 의한 화학 가교는 제외함).
[1-9] 상기 화학 가교된 알긴산 유도체가, 제1 알긴산의 임의의 카르복실기와, 제2 알긴산의 임의의 카르복실기가, 하기 식 (HB-III-L):
Figure pct00015
[식 (HB-III-L) 중, 양단의 -CONH- 및 -NHCO-는 알긴산의 임의의 카르복실기를 통한 아미드 결합을 나타내고;
-L1-는 상기 [1-8] 중의 정의와 동일하고;
-L2-는 상기 [1-8] 중의 정의와 동일하고; X는 하기 표:
[표 4-1]
Figure pct00016
[표 4-2]
Figure pct00017
에 기재된 부분 구조식의 군에서 선택되는 환상기임(각 식 중, 양단의 파선 외측은 포함하지 않음)]을 통해 결합된 가교 알긴산인(단, 식 (HB-I)로 표시되는 알긴산 유도체에 있어서 -L1-가 (L1-1), (L1-2a), (L1-2b), (L1-11) 또는 (L1-12)의 군에서 선택되는 어느 하나의 링커인 유도체와, 식 (HB-II)로 표시되는 알긴산 유도체에 있어서 -L2-가 (L2-10)의 링커인 유도체의 조합에 의한 가교 알긴산은 제외함), 상기 [1-8]에 기재된 이식용 디바이스.
[1-10] 식 (HA-I)의 알긴산 유도체가 하기 식 (EX-1-(I)-A-2)이며,
Figure pct00018
식 (HA-II)의 알긴산 유도체가 하기 식 (EX-2-(II)-A-2)인,
Figure pct00019
상기 [1-6] 또는 [1-7]에 기재된 이식용 디바이스.
[1-11] 식 (HA-I)의 알긴산 유도체가 하기 식 (EX-3-(I)-A-2)이며,
Figure pct00020
식 (HA-II)의 알긴산 유도체가 하기 식 (EX-4-(II)-A-2)인,
Figure pct00021
상기 [1-6] 또는 [1-7]에 기재된 이식용 디바이스.
[1-12] 식 (HA-I)의 알긴산 유도체가 하기 식 (EX-1-(I)-A-2)이며,
Figure pct00022
식 (HA-II)의 알긴산 유도체가 하기 식 (EX-4-2-(II)-A-2)인,
Figure pct00023
상기 [1-6] 또는 [1-7]에 기재된 이식용 디바이스.
[1-13] 식 (HA-I)의 알긴산 유도체가 하기 식 (EX-3-(I)-A-2)이며,
Figure pct00024
식 (HA-II)의 알긴산 유도체가 하기 식 (EX-2-(II)-A-2)인,
Figure pct00025
상기 [1-6] 또는 [1-7]에 기재된 이식용 디바이스.
[1-14] 식 (HA-I)의 알긴산 유도체가 하기 식 (EX-3-(I)-A-2)이며,
Figure pct00026
식 (HA-II)의 알긴산 유도체가 하기 식 (EX-4-2-(II)-A-2)인,
Figure pct00027
상기 [1-6] 또는 [1-7]에 기재된 이식용 디바이스.
[1-15] 상기 췌도가 인간 췌도 또는 돼지 췌도인, 상기 [1-1] 내지 [1-14] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[1-16] 상기 췌도가 돼지의 성체의 췌도인, 상기 [1-15]에 기재된 이식용 디바이스.
[1-17] 상기 췌도가 태생기, 신생아기 또는 주산기의 돼지 췌도인, 상기 [1-15]에 기재된 이식용 디바이스.
[1-18] 상기 인슐린 분비 세포 또는 췌도가, 도너인 인간으로부터 얻어진 췌도, 췌도 세포 또는 β 세포이거나, 도너인 돼지로부터 얻어진 췌도, 췌도 세포 또는 β 세포이거나, 인간 유래의 줄기 세포로부터 분화시켜 얻어진 췌도, 췌도 세포 또는 β 세포인, 상기 [1-1] 내지 [1-14] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[1-19] 상기 인슐린 분비 세포 또는 췌도가, 도너인 인간으로부터 얻어진 췌도, 췌도 세포 또는 β 세포인, 상기 [1-18]에 기재된 이식용 디바이스.
[1-20] 상기 하이드로겔이 또한 반투막으로 피복된, 상기 [1-1] 내지 [1-19] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[1-21] 상기 반투막이 셀룰로오스 유도체로부터 형성된 투석막인, 상기 [1-20]에 기재된 이식용 디바이스.
[1-22] 상기 셀룰로오스 유도체가 아세트산셀룰로오스인, 상기 [1-21]에 기재된 이식용 디바이스.
[1-23] 상기 이식용 디바이스의 이식 부위가 피하 또는 복강 내인, 상기 [1-1] 내지 [1-22] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[1-24] 상기 이식용 디바이스의 두께가 0.1 내지 5mm인, 상기 [1-1] 내지 [1-23] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[1-25] 상기 이식용 디바이스의 두께가 100㎛ 이상 1000㎛ 미만인, 상기 [1-1] 내지 [1-23] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[1-26] 상기 하이드로겔의 두께가 0.1 내지 5mm인, 상기 [1-1] 내지 [1-23] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[1-27] 상기 하이드로겔의 두께가 100㎛ 이상 500㎛ 미만인, 상기 [1-1] 내지 [1-23] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[1-28] 상기 인슐린 분비 세포 또는 췌도를 포함하는 하이드로겔을 제작한 후, 반투막으로 피복한, 상기 [1-1] 내지 [1-27] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[1-29] 화학 가교에 의해 하이드로겔화되는 알긴산 유도체의 용액에, 인슐린 분비 세포 또는 췌도를 현탁시키고, 당해 인슐린 분비 세포 또는 췌도를 현탁시킨 용액을 반투막 내에 봉입한 후, 당해 반투막을 2가 금속 이온을 포함하는 용액과 접촉시킴으로써, 반투막 내의 알긴산 유도체를 겔화하여 얻어지는, 상기 [1-1] 내지 [1-28] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[1-30] 상기 2가 금속 이온을 포함하는 용액이, 칼슘 이온을 포함하는 용액인, 상기 [1-29]에 기재된 이식용 디바이스.
[1-31] 세로 10mm 및 가로 20mm로 한 상기 하이드로겔 3장을 37℃, 12mL의 생리 식염수 용액 중에서, 진폭 25mm, 진탕 속도 180rpm의 왕복 진탕의 조건에서 37℃를 유지한 채 96시간 진탕 교반했을 때, 하이드로겔이 붕괴되지 않는, [1-1] 내지 [1-30] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[1-32] 세로 10mm 및 가로 20mm로 한 상기 하이드로겔 3장을 37℃, 12mL의 생리 식염수 용액 중에서, 진폭 25mm, 진탕 속도 180rpm의 왕복 진탕의 조건에서 37℃를 유지한 채 96시간 진탕 교반했을 때, 하이드로겔의 붕괴율이 30％ 이하인, [1-1] 내지 [1-31] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[1-33] 세로 10mm 및 가로 20mm로 한 상기 하이드로겔 3장을 37℃, 12mL의 생리 식염수 용액 중에서, 진폭 25mm, 진탕 속도 180rpm의 왕복 진탕의 조건에서 37℃를 유지한 채 24시간 진탕 교반했을 때, 하이드로겔로부터 세포가 거의 탈락되지 않는, [1-1] 내지 [1-32] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[1-34] 세로 10mm 및 가로 20mm로 한 상기 하이드로겔 3장을 37℃, 12mL의 생리 식염수 용액 중에서, 진폭 25mm, 진탕 속도 180rpm의 왕복 진탕의 조건에서 37℃를 유지한 채 24시간 진탕 교반했을 때, 하이드로겔에 봉입한 세포수를 100％로 한 경우의 진탕 교반 후의 하이드로겔로부터의 세포의 탈락율이 30％ 이하인, [1-1] 내지 [1-33] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
본 발명의 제2 양태는 이하의 [2-1] 내지 [2-34]와 같을 수 있다.
[2-1] 인슐린 분비 세포 또는 췌도가 봉입된 하이드로겔을 포함하는 이식용 디바이스이며, 상기 하이드로겔이 알긴산 유도체를 화학 가교에 의해 겔화한 것이며,
상기 하이드로겔의 두께가 100㎛ 이상 500㎛ 미만인, 이식용 디바이스.
[2-2] 상기 하이드로겔의 두께가 150㎛ 이상 500㎛ 미만인, 상기 [2-1]에 기재된 이식용 디바이스.
[2-3] 상기 하이드로겔의 두께가 200㎛ 이상 300㎛ 미만인, 상기 [2-1] 또는 [2-2]에 기재된 이식용 디바이스.
[2-4] 상기 하이드로겔이, 가교로서 알긴산 유도체간에 형성되는 화학 가교를 포함하는, 상기 [2-1] 내지 [2-3] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[2-5] 상기 하이드로겔이, 가교로서 위스헨 반응에 의해 형성되는 트리아졸환에 의한 화학 가교를 포함하는, 상기 [2-1] 내지 [2-4] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[2-6] 상기 화학 가교가, 알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 도입된 환상 알킨기와, 알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 도입된 아지드기로부터 발생하는, 상기 [2-1] 내지 [2-5] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[2-7] 상기 화학 가교가, 제1 알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 도입된 환상 알킨기와, 제2 알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 도입된 아지드기로부터 발생하는, 상기 [2-6]에 기재된 이식용 디바이스.
[2-8] 상기 화학 가교가, 이하의 (A) 및 (B)에 기재된 알긴산 유도체의 조합에 의한 화학 가교인, 상기 [2-1] 내지 [2-7] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스
(A):
알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 아미드 결합 및 2가의 링커(-L1-)를 통해, 환상 알킨기(Akn)가 도입된, 하기 식 (HA-I):
Figure pct00028
[식 (HA-I) 중, (ALG)는 알긴산을 나타내고; -NHCO-는 알긴산의 임의의 카르복실기를 통한 아미드 결합을 나타내고; -L1-는 하기 부분 구조식[각 식 중, 양단의 파선 외측은 포함하지 않음]:
Figure pct00029
의 군에서 선택되는 2가의 링커를 나타내고; Akn은 하기 부분 구조식[각 식 중, 파선 우측은 포함하지 않음]:
Figure pct00030
의 군에서 선택되는 환상 알킨기를 나타내고, 별표는 키랄 중심을 나타냄]로 표시되는 알긴산 유도체;
(B):
알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 아미드 결합 및 2가의 링커(-L2-)를 통해, 아지드기가 도입된, 하기 식 (HA-II):
Figure pct00031
[식 (HA-II) 중, (ALG)는 알긴산을 나타내고; -NHCO-는 알긴산의 임의의 카르복실기를 통한 아미드 결합을 나타내고; -L2-는 하기 부분 구조식[각 식 중, 양단의 파선 외측은 포함하지 않음]:
Figure pct00032
의 군에서 선택되는 2가의 링커를 나타냄]로 표시되는 알긴산 유도체.
[2-9] 상기 화학 가교된 알긴산 유도체가, 제1 알긴산의 임의의 카르복실기와, 제2 알긴산의 임의의 카르복실기가, 하기 식 (HA-III-L):
Figure pct00033
[식 (HA-III-L) 중, 양단의 -CONH- 및 -NHCO-는 알긴산의 임의의 카르복실기를 통한 아미드 결합을 나타내고;
-L1-는 상기 양태 [2-8] 중의 정의와 동일하고;
-L2-는 상기 양태 [2-8] 중의 정의와 동일하고;
X는 하기 부분 구조식:
Figure pct00034
의 군에서 선택되는 환상기이며(각 식 중, 양단의 파선 외측은 포함하지 않음), 별표는 키랄 중심을 나타냄]을 통해 결합된 가교 알긴산인, 상기 [2-8]에 기재된 이식용 디바이스.
[2-10] 상기 화학 가교가, 이하의 (A) 및 (B)에 기재된 알긴산 유도체의 조합에 의한 화학 가교인, 상기 [2-1] 내지 [2-7] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스
(A): 알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 아미드 결합 및 2가의 링커(-L1-)를 통해, 환상 알킨기(Akn)가 도입된, 하기 식 (HB-I):
Figure pct00035
[식 (HB-I) 중, (ALG)는 알긴산을 나타내고; -NHCO-는 알긴산의 임의의 카르복실기를 통한 아미드 결합을 나타내고; -L1-는 하기 표:
[표 5-1]
Figure pct00036
[표 5-2]
Figure pct00037
에 기재된 부분 구조식[각 식 중, 양단의 파선 외측은 포함하지 않음]으로 이루어지는 군에서 선택되는 링커를 나타내고;
Akn은 하기 표:
[표 6]
Figure pct00038
에 기재된 부분 구조식[각 식 중, 파선 우측은 포함하지 않음]으로 이루어지는 군에서 선택되는 환상 알킨기를 나타냄]로 표시되는 알긴산 유도체;
(B): 알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 아미드 결합 및 2가의 링커(-L2-)를 통해, 아지드기가 도입된, 하기 식 (HB-II):
Figure pct00039
[식 (HB-II) 중, (ALG)는 알긴산을 나타내고; -NHCO-는 알긴산의 임의의 카르복실기를 통한 아미드 결합을 나타내고; -L2-는 하기 표:
[표 7-1]
Figure pct00040
[표 7-2]
Figure pct00041
에 기재된 부분 구조식[각 식 중, 양단의 파선 외측은 포함하지 않음]으로 이루어지는 군에서 선택되는 링커를 나타냄]로 표시되는 알긴산 유도체
(단, 식 (HB-I)로 표시되는 알긴산 유도체에 있어서 -L1-가 (L1-1), (L1-2a), (L1-2b), (L1-11) 또는 (L1-12)의 군에서 선택되는 어느 하나의 링커인 유도체와, 식 (HB-II)로 표시되는 알긴산 유도체에 있어서 -L2-가 (L2-10)의 링커인 유도체의 조합에 의한 화학 가교는 제외함).
[2-11] 상기 화학 가교된 알긴산 유도체가, 제1 알긴산의 임의의 카르복실기와, 제2 알긴산의 임의의 카르복실기가, 하기 식 (HB-III-L):
Figure pct00042
[식 (HB-III-L) 중, 양단의 -CONH- 및 -NHCO-는 알긴산의 임의의 카르복실기를 통한 아미드 결합을 나타내고;
-L1-는 상기 [2-10] 중의 정의와 동일하고;
-L2-는 상기 [2-10] 중의 정의와 동일하고; X는 하기 표:
[표 8-1]
Figure pct00043
[표 8-2]
Figure pct00044
에 기재된 부분 구조식의 군에서 선택되는 환상기임(각 식 중, 양단의 파선 외측은 포함하지 않음)]을 통해 결합된 가교 알긴산인(단, 식 (HB-I)로 표시되는 알긴산 유도체에 있어서 -L1-가 (L1-1), (L1-2a), (L1-2b), (L1-11) 또는 (L1-12)의 군에서 선택되는 어느 하나의 링커인 유도체와, 식 (HB-II)로 표시되는 알긴산 유도체에 있어서 -L2-가 (L2-10)의 링커인 유도체의 조합에 의한 가교 알긴산은 제외함), 상기 [2-10]에 기재된 이식용 디바이스.
[2-12] 식 (HA-I)의 알긴산 유도체가 하기 식 (EX-1-(I)-A-2)이며,
Figure pct00045
식 (HA-II)의 알긴산 유도체가 하기 식 (EX-2-(II)-A-2)인,
Figure pct00046
상기 [2-8] 또는 [2-9]에 기재된 이식용 디바이스.
[2-13] 식 (HA-I)의 알긴산 유도체가 하기 식 (EX-3-(I)-A-2)이며,
Figure pct00047
식 (HA-II)의 알긴산 유도체가 하기 식 (EX-4-(II)-A-2)인,
Figure pct00048
상기 [2-8] 또는 [2-9]에 기재된 이식용 디바이스.
[2-14] 식 (HA-I)의 알긴산 유도체가 하기 식 (EX-1-(I)-A-2)이며,
Figure pct00049
식 (HA-II)의 알긴산 유도체가 하기 식 (EX-4-2-(II)-A-2)인,
Figure pct00050
상기 [2-8] 또는 [2-9]에 기재된 이식용 디바이스.
[2-15] 식 (HA-I)의 알긴산 유도체가 하기 식 (EX-3-(I)-A-2)이며,
Figure pct00051
식 (HA-II)의 알긴산 유도체가 하기 식 (EX-2-(II)-A-2)인,
Figure pct00052
상기 [2-8] 또는 [2-9]에 기재된 이식용 디바이스.
[2-16] 식 (HA-I)의 알긴산 유도체가 하기 식 (EX-3-(I)-A-2)이며,
Figure pct00053
식 (HA-II)의 알긴산 유도체가 하기 식 (EX-4-2-(II)-A-2)인,
Figure pct00054
상기 [2-8] 또는 [2-9]에 기재된 이식용 디바이스.
[2-17] 상기 췌도가 인간 췌도 또는 돼지 췌도인, 상기 [2-1] 내지 [2-16] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[2-18] 상기 췌도가 돼지의 성체의 췌도인, 상기 [2-17]에 기재된 이식용 디바이스.
[2-19] 상기 췌도가 태생기, 신생아기 또는 주산기의 돼지 췌도인, 상기 [2-17]에 기재된 이식용 디바이스.
[2-20] 상기 인슐린 분비 세포 또는 췌도가, 도너인 인간으로부터 얻어진 췌도, 췌도 세포 또는 β 세포이거나, 도너인 돼지로부터 얻어진 췌도, 췌도 세포 또는 β 세포이거나, 인간 유래의 줄기 세포로부터 분화시켜 얻어진 췌도, 췌도 세포 또는 β 세포인, 상기 [2-1] 내지 [2-19] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[2-21] 상기 인슐린 분비 세포 또는 췌도가, 도너인 인간으로부터 얻어진 췌도, 췌도 세포 또는 β 세포인, 상기 [2-20]에 기재된 이식용 디바이스.
[2-22] 상기 하이드로겔이 또한 반투막으로 피복된, 상기 [2-1] 내지 [2-21] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[2-23] 상기 반투막이 셀룰로오스 유도체로부터 형성된 투석막인, 상기 [2-22]에 기재된 이식용 디바이스.
[2-24] 상기 셀룰로오스 유도체가 아세트산셀룰로오스인, 상기 [2-23]에 기재된 이식용 디바이스.
[2-25] 상기 이식용 디바이스의 이식 부위가 피하 또는 복강 내인, 상기 [2-1] 내지 [2-24] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[2-26] 상기 이식용 디바이스의 두께가 100㎛ 이상 1000㎛ 미만인, 상기 [2-1] 내지 [2-25] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[2-27] 상기 이식용 디바이스의 두께가 150㎛ 이상 500㎛ 미만인, 상기 [2-26]에 기재된 이식용 디바이스.
[2-28] 상기 인슐린 분비 세포 또는 췌도를 포함하는 하이드로겔을 제작한 후, 반투막으로 피복한, 상기 [2-1] 내지 [2-27] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[2-29] 화학 가교에 의해 하이드로겔화되는 알긴산 유도체의 용액에, 인슐린 분비 세포 또는 췌도를 현탁시키고, 당해 인슐린 분비 세포 또는 췌도를 현탁시킨 용액을 반투막 내에 봉입한 후, 당해 반투막을 2가 금속 이온을 포함하는 용액과 접촉시킴으로써, 반투막 내의 알긴산 유도체를 겔화하여 얻어지는, 상기 [2-1] 내지 [2-28] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[2-30] 상기 2가 금속 이온을 포함하는 용액이, 칼슘 이온을 포함하는 용액인, 상기 [2-29]에 기재된 이식용 디바이스.
[2-31] 세로 10mm 및 가로 20mm로 한 상기 하이드로겔 3장을 37℃, 12mL의 생리 식염수 용액 중에서, 진폭 25mm, 진탕 속도 180rpm의 왕복 진탕의 조건에서 37℃를 유지한 채 96시간 진탕 교반했을 때, 하이드로겔이 붕괴되지 않는, [2-1] 내지 [2-30] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[2-32] 세로 10mm 및 가로 20mm로 한 상기 하이드로겔 3장을 37℃, 12mL의 생리 식염수 용액 중에서, 진폭 25mm, 진탕 속도 180rpm의 왕복 진탕의 조건에서 37℃를 유지한 채 96시간 진탕 교반했을 때, 하이드로겔의 붕괴율이 30％ 이하인, [2-1] 내지 [2-31] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[2-33] 세로 10mm 및 가로 20mm로 한 상기 하이드로겔 3장을 37℃, 12mL의 생리 식염수 용액 중에서, 진폭 25mm, 진탕 속도 180rpm의 왕복 진탕의 조건에서 37℃를 유지한 채 24시간 진탕 교반했을 때, 하이드로겔로부터 세포가 거의 탈락되지 않는, [2-1] 내지 [2-32] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
[2-34] 세로 10mm 및 가로 20mm로 한 상기 하이드로겔 3장을 37℃, 12mL의 생리 식염수 용액 중에서, 진폭 25mm, 진탕 속도 180rpm의 왕복 진탕의 조건에서 37℃를 유지한 채 24시간 진탕 교반했을 때, 하이드로겔에 봉입한 세포수를 100％로 한 경우의 진탕 교반 후의 하이드로겔로부터의 세포의 탈락율이 30％ 이하인, [2-1] 내지 [2-33] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스.
본 발명의 제3 양태는 이하의 [3-1] 내지 [3-4]와 같을 수 있다.
[3-1] 이하의 공정 (a) 내지 (d)를 포함하는, 인슐린 분비 세포 또는 췌도가 봉입된 하이드로겔을 포함하는 이식용 디바이스의 제조 방법.
공정 (a): 임의 선택의 공정으로서, 생체로부터 췌장을 적출하고, 췌도를 분리하는 공정,
공정 (b): 화학 가교에 의해 하이드로겔화될 수 있는 알긴산 유도체의 용액에, 인슐린 분비 세포, 췌도, 배양되어 얻어진 췌도 세포, 및 줄기 세포로부터 분화시켜 얻어진 췌도 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 세포 또는 조직을 혼화하는 공정,
공정 (c): 공정 (b)에서 얻어진 알긴산 유도체의 용액을, 2가 금속 이온을 포함하는 용액과 접촉시켜, 두께 0.1 내지 5mm(100 내지 5000㎛)의 겔을 제작하는 공정,
공정 (d): 임의 선택의 공정으로서, 공정 (c)에서 얻어진 겔을 반투막으로 피복하는 공정.
[3-2] 이하의 공정 (a) 내지 (d)를 포함하는, 인슐린 분비 세포 또는 췌도가 봉입된 하이드로겔을 포함하는 이식용 디바이스의 제조 방법.
공정 (a): 임의 선택의 공정으로서, 생체로부터 췌장을 적출하고, 췌도를 분리하는 공정,
공정 (b): 화학 가교에 의해 하이드로겔화될 수 있는 알긴산 유도체의 용액에, 인슐린 분비 세포, 췌도, 배양되어 얻어진 췌도 세포, 및 줄기 세포로부터 분화시켜 얻어진 췌도 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 세포 또는 조직을 혼화하는 공정,
공정 (c): 공정 (b)에서 얻어진 알긴산 유도체의 용액을, 2가 금속 이온을 포함하는 용액과 접촉시켜, 두께 100㎛ 이상 500㎛ 미만의 겔을 제작하는 공정,
공정 (d): 임의 선택의 공정으로서, 공정 (c)에서 얻어진 겔을 반투막으로 피복하는 공정.
[3-3] 이하의 공정 (a) 내지 (d)를 포함하는, 인슐린 분비 세포 또는 췌도가 봉입된 하이드로겔을 포함하는 이식용 디바이스의 제조 방법.
공정 (a): 임의 선택의 공정으로서, 생체로부터 췌장을 적출하고, 췌도를 분리하는 공정,
공정 (b): 화학 가교에 의해 하이드로겔화될 수 있는 알긴산 유도체의 용액에, 인슐린 분비 세포, 췌도, 배양되어 얻어진 췌도 세포, 및 줄기 세포로부터 분화시켜 얻어진 췌도 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 세포 또는 조직을 혼화하는 공정,
공정 (c): 공정 (b)에서 얻어진 알긴산 유도체의 용액을 반투막에 봉입하는 공정,
공정 (d): 공정 (c)에서 얻어진 반투막을, 2가 금속 이온을 포함하는 용액과 접촉시켜, 반투막 내의 알긴산 유도체의 용액을 겔화하는 공정.
[3-4] 상기 2가 금속 이온을 포함하는 용액이, 칼슘 이온을 포함하는 용액인, 상기 [3-1] 내지 [3-3] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스의 제조 방법.
[3-5] 이하의 공정 (a) (b) (e) (d)를 포함하는, 인슐린 분비 세포 또는 췌도가 봉입된 하이드로겔을 포함하는 이식용 디바이스의 제조 방법.
공정 (a): 임의 선택의 공정으로서, 생체로부터 췌장을 적출하고, 췌도를 분리하는 공정,
공정 (b): 화학 가교에 의해 하이드로겔화될 수 있는 알긴산 유도체의 용액에, 인슐린 분비 세포, 췌도, 배양되어 얻어진 췌도 세포, 및 줄기 세포로부터 분화시켜 얻어진 췌도 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 세포 또는 조직을 혼화하는 공정,
공정 (e): 공정 (b)에서 얻어진 알긴산 유도체의 용액을 임의의 형상으로 하여 겔을 제작하는 공정,
공정 (d): 임의 선택의 공정으로서, 공정 (e)에서 얻어진 겔을 반투막으로 피복하는 공정.
[3-6] 이하의 공정 (a) (b) (e) (f)를 포함하는, 인슐린 분비 세포 또는 췌도가 봉입된 하이드로겔을 포함하는 이식용 디바이스의 제조 방법.
공정 (a): 임의 선택의 공정으로서, 생체로부터 췌장을 적출하고, 췌도를 분리하는 공정,
공정 (b): 화학 가교에 의해 하이드로겔화될 수 있는 알긴산 유도체의 용액에, 인슐린 분비 세포, 췌도, 배양되어 얻어진 췌도 세포, 및 줄기 세포로부터 분화시켜 얻어진 췌도 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 세포 또는 조직을 혼화하는 공정,
공정 (e): 공정 (b)에서 얻어진 알긴산 유도체의 용액을 임의의 용기에 넣거나, 또는 임의의 표면에 두는 공정,
공정 (f): 공정 (e)에서 얻어진 용기 중 또는 표면 상에서, 알긴산 유도체의 용액을 겔화하는 공정.
[3-7] 상기 임의의 용기가 반투막, 비이커 또는 샤알레인, 상기 [3-6]에 기재된 이식용 디바이스의 제조 방법.
[3-8] 상기 임의의 표면이 반투막 표면, 플라스틱 표면 또는 유리 표면인, 상기 [3-6]에 기재된 이식용 디바이스의 제조 방법.
[3-9] 상기 하이드로겔이 두께 0.1 내지 5mm(100 내지 5000㎛)인, 상기 [3-5] 내지 [3-8] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스의 제조 방법.
[3-10] 상기 알긴산 유도체의 용액 겔화에 2가 금속 이온 또는 그 용액과의 접촉하는 공정을 포함하지 않는, 상기 [3-5] 내지 [3-9] 중 어느 한 항에 기재된 이식용 디바이스의 제조 방법.
[3-11] 이하의 공정 (a) 내지 (c) (f)를 포함하는, 인슐린 분비 세포 또는 췌도가 봉입된 하이드로겔을 포함하는 이식용 디바이스의 제조 방법.
공정 (a): 임의 선택의 공정으로서, 생체로부터 췌장을 적출하고, 췌도를 분리하는 공정,
공정 (b): 화학 가교에 의해 하이드로겔화될 수 있는 알긴산 유도체의 용액에, 인슐린 분비 세포, 췌도, 배양되어 얻어진 췌도 세포, 및 줄기 세포로부터 분화시켜 얻어진 췌도 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 세포 또는 조직을 혼화하는 공정,
공정 (c): 공정 (b)에서 얻어진 알긴산 유도체의 용액을 반투막에 봉입하는 공정,
공정 (f): 공정 (c)에서 얻어진 반투막 내에서, 알긴산 유도체의 용액을 겔화하여, 두께 0.1 내지 5mm(100 내지 5000㎛)의 겔을 제작하는 공정.
본 발명에 의해, 새로운 이식용 디바이스가 제공된다. 바람직하게는, 이식용 디바이스는 적어도 하기 효과 중 하나 이상을 나타낸다.
(1) 생체 적합성이나 안정성이 우수하고, 세포 독성도 적고, 이식 부위에 있어서의 유착이나 염증도 거의 없다.
(2) 겔의 용해가 적어 형상이 장기간 유지된다.
(3) 장기간에 걸쳐 혈당 강하 작용을 지속시켜, 혈당을 조절하는 것이 가능해진다.
(4) 장기간 사용한 후, 반투막 내의 알긴산 겔은 용해되지 않고 형상을 유지 가능하고, 또한 췌도의 생존·기능 유지가 가능하여, 장기간 사용할 수 있다.
(5) 교환이 가능하고, 면역 격리 가능하고, 유착, 염증 등도 적어, 안전성이 높은 의료 재료가 된다.
(6) 디바이스의 내외에서의 물질 투과가 우수하다.
(7) 하이드로겔을 진탕한 경우에 있어서, 하이드로겔이 붕괴되지 않거나 또는 붕괴가 적다.
(8) 하이드로겔을 진탕한 경우에 있어서, 하이드로겔 중에 포함되는 췌도의 겔로부터의 탈락이 적은 것.
또한, 하이드로겔의 두께가 얇은(예를 들어 500㎛ 미만) 이식용 디바이스에 있어서는, 바람직하게는 적어도 상기 (1) 내지 (8)의 효과 중 하나 이상, 및/또는 하위의 효과 중 하나 이상을 나타낸다.
(9) 디바이스를 이식한 경우의 치유율이 두꺼운 하이드로겔의 경우와 비해 높다.
(10) 디바이스의 표면에 대한 중심부의 산소 농도의 비율이 높다.
보다 바람직한 양태의 이식용 디바이스는, 이식 성적이나 기능성이 우수하고, 소재에 대하여 신규이며, 당뇨병 환자(특히, I형 당뇨병 및 인슐린 고갈형 II형 당뇨병)에 이식함으로써, 장기간에 걸쳐 혈당 강하 작용을 지속시켜, 혈당을 조절하는 것이 가능해진다. 또한, 하이드로겔 내의 인슐린 분비 세포 또는 췌도의 기능이 저하된 경우에, 회수가 가능하다. 혹은, 정기적인 교환 혹은 추가 이식이 가능해진다. 또한, 이식용 디바이스의 하이드로겔에 봉입하는 인슐린 분비 세포 또는 췌도로서, 줄기 세포(iPS 등)로부터 분화시킨 인슐린 분비 세포, 또는 인간 췌도를 사용하는 것도 가능하다. 따라서, 보다 바람직한 양태의 디바이스는 유용하다.
도 1은 평판형 알긴산 겔의 사진이다. (a) 이식 전, (b) 이식 후.
도 2는 평판형 알긴산 겔의 사진이다. (a) 이식 전, (b) 이식 후.
도 3은 평판형 알긴산 겔의 사진이다. (a) 이식 전, (b) 이식 후.
도 4a는 제작한 이식용 디바이스의 사진이다.
도 4b는 제작한 이식용 디바이스의 사진이다.
도 5a는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 혈당값 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day75까지).
도 5b는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 혈당값 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day305까지).
도 5c는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 혈당값 변동을 나타내는 도면이다(릴레이 이식 후 day26까지).
도 6a는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 체중 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day75까지).
도 6b는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 체중 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day305까지).
도 6c는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 체중 변동을 나타내는 도면이다(릴레이 이식 후 day26까지).
도 7a는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 혈당값 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day305까지).
도 7b는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 혈당값 변동을 나타내는 도면이다(릴레이 이식 후 day26까지).
도 8a는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 체중 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day305까지).
도 8b는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 체중 변동을 나타내는 도면이다(릴레이 이식 후 day26까지).
도 9a는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 혈당값 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day305까지).
도 9b는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 혈당값 변동을 나타내는 도면이다(릴레이 이식 후 day26까지).
도 10a는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 체중 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day305까지).
도 10b는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 체중 변동을 나타내는 도면이다(릴레이 이식 후 day26까지).
도 11a는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 혈당값 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day178까지).
도 11b는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 혈당값 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day178까지).
도 11c는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 혈당값 변동을 나타내는 도면이다(릴레이 이식 후 day40까지).
도 11d는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 혈당값 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day178까지).
도 11e는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 혈당값 변동을 나타내는 도면이다(릴레이 이식 후 day40까지).
도 12a는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 체중 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day178까지).
도 12b는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 체중 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day178까지).
도 12c는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 체중 변동을 나타내는 도면이다(릴레이 이식 후 day40까지).
도 12d는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 체중 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day178까지).
도 12e는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 체중 변동을 나타내는 도면이다(릴레이 이식 후 day40까지).
도 13a는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 혈당값 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day17까지).
도 13b는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 혈당값 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day17까지).
도 13c는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 혈당값 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day17까지).
도 13d는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 혈당값 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day17까지).
도 13e는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 혈당값 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day17까지).
도 14a는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 체중 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day17까지).
도 14b는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 체중 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day17까지).
도 14c는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 체중 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day17까지).
도 14d는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 체중 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day17까지).
도 14e는 이식용 디바이스를 이식한 마우스의 체중 변동을 나타내는 도면이다(이식 후 day17까지).
도 15a는 하이드로겔의 산소 농도의 평가 부위를 나타내는 도면이다.
도 15b는 하이드로겔의 단면에 있어서의 산소 농도를 나타내는 도면이다.
도 15c는 하이드로겔의 단면에 있어서의 산소 농도를 나타내는 도면이다.
도 15d는 하이드로겔의 단면에 있어서의 산소 농도를 나타내는 도면이다.
도 16a는 이식용 디바이스로부터의 인간 인슐린의 투과율을 나타내는 도면이다.
도 16b는 이식용 디바이스로부터의 글루코오스의 투과율을 나타내는 도면이다.
도 17은 하이드로겔의 진탕 시의 붕괴율을 나타내는 도면이다.
도 18a는 시험 개시 24시간 후의 외액의 현미경 사진이다(바는 1000㎛를 의미함).
도 18b는 시험 개시 24시간 후의 외액의 현미경 사진이다(바는 1000㎛를 의미함).
여기에서는, 화학 가교에 의해 겔화되는 알긴산 유도체를 사용하여 조제된, 세포 등을 생체에 이식하기 위한 디바이스, 보다 구체적으로는, 예를 들어 인슐린 분비 세포 또는 췌도 등이 포매된 화학 가교 알긴산 겔과, 필요에 따라서 당해 겔을 피복하는 반투막을 포함하는 이식용 디바이스, 그의 제조 방법 등이 제공된다. 화학 가교에 의해 겔화되는 알긴산 유도체는, 예를 들어 알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에, 아미드 결합 및 2가의 링커를 통해 환상 알킨기 또는 아지드기가 도입된 식 (HA-I) 또는 식 (HA-II)의 알긴산 유도체이며, 식 (HA-I) 및 식 (HA-II)의 알긴산 유도체를 사용하여 위스헨 반응(1,3-쌍극자 부가 환화 반응)을 행함으로써 신규의 가교 알긴산이 얻어진다. 혹은, 화학 가교에 의해 겔화되는 알긴산 유도체는, 예를 들어 알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에, 아미드 결합 및 2가의 링커를 통해 환상 알킨기 또는 아지드기가 도입된 식 (HB-I) 또는 식 (HB-II)의 알긴산 유도체이며, 식 (HB-I) 및 식 (HB-II)의 알긴산 유도체를 사용하여 위스헨 반응(1,3-쌍극자 부가 환화 반응)을 행함으로써 신규의 가교 알긴산이 얻어진다.
「이식용 디바이스」란, 인슐린 분비 세포 또는 췌도가 봉입된 하이드로겔을 사용한 것이다. 당해 하이드로겔은 알긴산 유도체를 화학 가교에 의해 겔화한 것이다. 따라서, 알긴산 유도체로서는, 화학 가교에 의해 겔화하는 것이 가능한 것을 사용한다. 인슐린 분비 세포 또는 췌도가 봉입되어 있는 하이드로겔의 형상은, 예를 들어 평판형이다. 이식용 디바이스에 있어서, 하이드로겔이 또한 반투막으로 피복되어 있어도 되고, 이 경우, 인슐린 분비 세포 또는 췌도가 봉입된 하이드로겔이 반투막 내에 삽입된 상태로 된다.
이식용 디바이스로 사용하는 「인슐린 분비 세포」란, 인슐린을 분비하는 기능을 갖는 세포를 의미하고, 예를 들어 췌도를 구성하는 세포에 있어서는, 인슐린을 분비하는 β 세포를 의미한다. 또한, 「인슐린 분비 세포」는 분화, 성숙이나 개변 등에 의해 인슐린 분비 기능을 갖게 된 세포여도 되고, 예를 들어 iPS 세포, ES 세포, 또는 체성 줄기 세포(예를 들어, 간엽계 줄기 세포) 등의 줄기 세포를 분화시켜 얻어진 인슐린 분비 기능을 갖는 세포, 유약 세포나 전구 세포를 성숙시켜 얻어진 인슐린 분비 기능을 갖는 세포, 및 유전자 재조합에 의해 인슐린 분비 기능이 부여된 세포도 포함할 수 있다. 여기서, 당해 세포를 분화나 성숙시키는 것에는, 당해 세포를 배양시키는 것이 포함되고, 즉, 분화 또는 성숙시켜 얻어진 세포란, 배양되어 얻어진 세포를 포함할 수 있다.
「췌도」란, 별명 랑게르한스섬이라고도 불리는, 평균 약 2000개의 췌도 세포로 구성되는 세포괴이다. 췌도는, 글루카곤을 분비하는 α 세포, 인슐린을 분비하는 β 세포, 소마토스타틴을 분비하는 δ 세포, 그레인을 분비하는 ε 세포, 및 췌장 폴리펩티드를 분비하는 PP(pancreaticpolypeptide; 췌장 폴리펩티드) 세포의 5종의 세포로 구성된다.
「인슐린 분비 세포 또는 췌도」란, 생물학적 활성의 생성물의 분비 기능을 갖는 세포 또는 조직이라고도 표시된다.
본 명세서에 있어서 「췌도 세포」란, 상기 5종류의 세포 중 적어도 1종류의 세포를 포함하는 것이면 되지만, 적어도 β 세포를 포함하는 것이 바람직하다. 몇 가지의 양태에서는, 췌도 세포로서는, α 세포, β 세포, δ 세포, ε 세포 및 PP 세포의 모두를 포함하는 혼합물이어도 되고, 췌도에 포함된 상태의 것이어도 된다.
또한, 「췌도 세포」는 분화, 성숙이나 개변 등에 의해 췌도 세포가 된 것이어도 된다. 이 경우, 「췌도 세포」에는, 예를 들어 iPS 세포, ES 세포 및 체성 줄기 세포(예를 들어, 간엽계 줄기 세포) 등의 줄기 세포를 분화시켜 얻어진 췌도 세포, 및 유약 세포나 전구 세포를 성숙시켜 얻어진 췌도 세포도 포함할 수 있다.
「인슐린 분비 세포 또는 췌도(췌도 세포를 포함함)」로서는, 환자에 이식했을 때, 환자의 병적 상태를 회복할 수 있는 정도의 생존성과 기능을 갖는 것이 바람직하다. 인슐린 분비 세포, 췌도 또는 췌도 세포의 기능으로서는, 예를 들어 인슐린을 분비하는 것을 들 수 있고, 이식 후에 있어서도 글루코오스 응답성이 유지되고 있는 것이 바람직하다.
몇 가지 양태의 「이식용 디바이스」는 바이오 인공 췌도라고도 불리고, 바이오 인공 장기의 일례이다. 당해 바이오 인공 췌도가 구비하는 세포에는, 상기한 「인슐린 분비 세포」, 「췌도」 또는 「췌도 세포」가 포함되고, 예를 들어 인슐린 분비 세포가 포함된다. 인슐린 분비 세포는 인간 혹은 돼지 등으로부터 채취된 췌도에 포함되는 세포, 혹은 줄기 세포(예를 들어, ES 세포, iPS 세포 및 체성 줄기 세포(예를 들어, 간엽계 줄기 세포))로부터 분화된 췌도 중 어느 것이어도 된다.
본 발명의 이식용 디바이스에는, 「인슐린 분비 세포, 췌도 및 췌도 세포」 이외의 세포를 사용하는 경우가 있다.
「인슐린 분비 세포, 췌도 및 췌도 세포」 이외의 세포는, 세포 이식에 사용할 수 있는 것이면 임의의 세포를 사용할 수 있고, 그 종류는 특별히 한정되지 않는다. 또한, 사용하는 세포는 1종이어도 되고, 복수종의 세포를 조합하여 사용해도 된다. 사용하는 세포로서, 바람직하게는 동물 세포, 보다 바람직하게는 척추 동물 유래 세포, 특히 바람직하게는 인간 유래 세포를 들 수 있다. 척추 동물 유래 세포(특히, 인간 유래 세포)의 종류는, 줄기 세포(예를 들어, 만능 세포 또는 체성 줄기 세포), 전구 세포 또는 성숙 세포 중 어느 것이어도 된다. 만능 세포로서는, 예를 들어 배성간(ES) 세포, 생식 줄기(GS) 세포 또는 인공 다능성 줄기(iPS) 세포를 사용할 수 있다. 체성 줄기 세포로서는, 예를 들어 간엽계 줄기 세포(MSC), 조혈 줄기 세포, 양막 세포, 제대혈 세포, 골수 유래 세포, 심근 줄기 세포, 지방 유래 줄기 세포 또는 신경 줄기 세포를 사용할 수 있다.
전구 세포 및 성숙 세포로서는, 예를 들어 피부, 진피, 표피, 근육, 심근, 신경, 뼈, 연골, 내피, 뇌, 상피, 심장, 신장, 간장, 비장, 구강 내, 각막, 골수, 제대혈, 양막 또는 털에서 유래하는 세포를 사용할 수 있다. 인간 유래 세포로서는, 예를 들어 ES 세포, iPS 세포, MSC, 연골 세포, 골아 세포, 골아 전구 세포, 간충직 세포, 근아세포, 심근 세포, 심근아세포, 신경 세포, 간세포, 섬유아세포, 각막 내피 세포, 혈관 내피 세포, 각막 상피 세포, 양막 세포, 제대혈 세포, 골수 유래 세포 또는 조혈 줄기 세포를 사용할 수 있다. 또한, 세포의 유래는 자가 세포 또는 타가 세포 중 어느 것이라도 상관없다. 몇 가지의 양태에서는, 상기한 것 중에서도, 예를 들어 ES 세포, iPS 세포, 간엽계 줄기 세포(MSC)를 사용할 수 있다.
「인슐린 분비 세포 또는 췌도(췌도 세포를 포함함)」의 도너는, 동물, 바람직하게는 척추 동물이며, 구체적으로는 인간, 돼지, 원숭이, 래트 또는 마우스 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 인간 또는 돼지이다. 「인슐린 분비 세포, 췌도 또는 췌도 세포」의 도너는, 몇 가지의 양태에서는, 도너 부족 해소의 관점에서 돼지이다. 「인슐린 분비 세포 또는 췌도(췌도 세포를 포함함)」로서는, 도너인 동물로부터 얻어진 췌도, 혹은 도너 유래 세포로부터 얻어진 인슐린 분비 세포 또는 췌도 세포 중 어느 것이어도 되고, 예를 들어 인간 유래의 ES 세포 또는 iPS 세포로부터 분화된 인슐린 분비 세포 또는 췌도 세포여도 된다.
「인슐린 분비 세포 또는 췌도(췌도 세포를 포함함)」가 돼지 유래일 경우에는, 성체의 돼지 췌도, 또는 태생기, 신생아기 혹은 주산기의 돼지 췌도를 들 수 있다. 당해 췌도는 적절히 배양하고 나서 사용하도록 해도 되고, 태생기, 신생아기 혹은 주산기의 돼지 췌도를 성숙시킨 췌도를 사용해도 된다.
이식용 디바이스의 이식 방법으로서는, 절개와 유치, 주사, 내시경, 복강경과 같은 것이 사용 가능하다.
이식 부위는 특별히 한정되지 않고, 피하, 복강 내, 간장 내, 근육 내, 대망(大網) 내, 신장 피막 하 등을 들 수 있지만, 피하나 복강 내에 이식하는 것이 바람직하다.
여기서 「반투막(한토우막쿠, semipermeable membrane)」이란, 일정한 크기 이하의 분자 또는 이온만을 투과시키는 막이다. 반투막을 투과하지 않는 용질과 투과성을 나타내는 용매의 계에서, 반투막을 통해 2개의 농도의 용액을 접하면, 사이에 침투압이 발생하여 용매만이 투과하는 성질을 갖는다. 본 명세서에 기재된 이식용 디바이스는 반투막을 포함하고 있어도 되고, 혹은 반투막은 필수는 아니고, 즉 반투막을 포함하지 않아도 된다. 몇 가지 양태의 이식용 디바이스는 (예를 들어, 인슐린 분비 세포 또는 췌도가 봉입된) 하이드로겔 단체이며, 즉, 당해 하이드로겔이 반투막으로 피복되어 있지 않다. 하이드로겔이 반투막으로 피복되지 않은 이식용 디바이스는, 바람직하게는 생체 적합성이나 안정성이 우수하고, 세포 독성도 적고, 이식 부위에 있어서의 유착이나 염증도 거의 없고, 겔의 용해가 적어 형상이 장기간 유지되고, 보다 바람직하게는 장기간에 걸쳐 혈당 강하 작용을 지속시켜, 혈당을 조절하는 것이 가능한 것이다. 다른 몇 가지 양태의 이식용 디바이스는, 하이드로겔이 반투막으로 피복되어 있다. 반투막으로서는, 예를 들어 투석에 사용되는 막 혹은 튜브 등을 들 수 있고, 투석 튜브, 코튼 셀룰로오스 투석막, 재생 셀룰로오스 투석막, 셀룰로오스에스테르 투석막 등도 사용 가능하고, 상품명으로서는 Cellu-Sep T Tubular Membrane(Membrane Filtration Products사), 스펙트라 바이오텍 멤브란(REPLIGEN사(구SPECTRUM사)), 스펙트라/포어 CE 투석 튜브(REPLIGEN사(구SPECTRUM사)) 등을 들 수 있다.
「반투막」으로서는, 셀룰로오스에스테르로 제작된 반투막인 것이 바람직하다.
구체예로서는, 투석막인 스펙트라/포어 CE 투석 튜브(REPLIGEN사(구SPECTRUM사))를 들 수 있다. 당해 셀룰로오스에스테르는 아세트산셀룰로오스의 고분자인 것이 보다 바람직하다.
여기에서 사용하는 반투막은 수지를 함유한다. 반투막은, 예를 들어 적어도 1종류 이상의 수지를 용매에 용해시켜, 용해된 수지를 응고시킴으로써 제작할 수 있다. 이러한 수지는 특별히 한정되는 것은 아니다. 이러한 수지로서, 예를 들어 에틸렌-비닐알코올계 공중합체, 폴리술폰계 중합체, 폴리아크릴로니트릴계 중합체, 아세트산셀룰로오스 등의 셀룰로오스계 중합체, 폴리아미드계 중합체, 폴리카르보네이트계 중합체 등의 수지를 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 아세트산셀룰로오스 등의 셀룰로오스계 중합체이다.
여기에서 사용되는 반투막에는, 「분자량 컷오프」가 있다. 「분자량 컷오프」란, 실질적으로 차단되지 않는 최대 분자량의 크기를 의미한다. 해당 분자량 컷오프를 상회하는 분자량을 갖는 분자는, 해당 반투막을 출입하는 것이 실질적으로 방해된다. 여기에서 사용되는 반투막의 「분자량 컷오프」로서는, 100kDa(킬로달톤)인 것이 바람직하다. 예를 들어, 셀룰로오스에스테르 투석막인 스펙트라/포어 CE 투석 튜브((REPLIGEN사(구SPECTRUM사))이면, 당해 컷오프값을 「MWCO」로서, 100 내지 500Da(달톤), 0.5 내지 1kDa, 3.5 내지 5kDa, 8 내지 10kDa, 20kDa, 50kDa, 100kDa, 300kDa, 1000kDa 등의 규격으로 판매되고 있다. 예를 들어, 당해 컷오프값이 약 500000달톤보다 큰 분자량 컷오프를 갖는 경우, IgG나 보체와 같은 분자는 이들 반투막에 진입할 수 있지만, 면역 세포와 같은 숙주 세포는 당해 반투막 내로의 진입이 방해되며, 인슐린이나 세포의 영양소나 산소는 당해 반투막을 통과할 수 있게 된다. 단위 달톤 기호는 Da, 1000Da는 1kDa를 의미한다.
여기서, 이식용 디바이스의 두께의 정의는 후술하는 대로이다. 몇 가지의 양태에서는, 이식용 디바이스의 두께는 0.1 내지 5mm(100 내지 5000㎛)이며, 0.1 내지 3mm(100 내지 3000㎛)인 것이 바람직하다. 혹은, 0.5 내지 5mm(500 내지 5000㎛)인 것이 바람직하고, 1 내지 3mm(1000 내지 3000㎛)인 것이 보다 바람직하다. 이식용 디바이스의 두께는, 인슐린 분비 세포 또는 췌도가 봉입되어 있는 하이드로겔이 반투막으로 피복되어 있는 경우, 반투막의 두께로 0.15 내지 5mm(150 내지 5000㎛)이며, 0.2 내지 3mm(200 내지 3000㎛)인 것이 바람직하다. 혹은, 0.5 내지 5mm(500 내지 5000㎛)인 것이 바람직하고, 1 내지 3mm(1000 내지 3000㎛)인 것이 보다 바람직하다.
박형의 이식용 디바이스의 경우, 이식용 디바이스의 두께는 100㎛ 이상 1000㎛ 미만이고, 100㎛ 이상 500㎛ 미만인 것이 바람직하다. 혹은, 150㎛ 이상 1000㎛ 미만인 것이 바람직하고, 150㎛ 이상 500㎛인 것이 보다 바람직하다. 이식용 디바이스의 두께는, 인슐린 분비 세포 또는 췌도가 봉입되어 있는 하이드로겔이 반투막으로 피복되어 있는 경우, 반투막의 두께로 150㎛ 이상 1000㎛ 미만인 것이 바람직하고, 150㎛ 이상 500㎛ 미만인 것이 보다 바람직하다. 혹은, 200㎛ 이상 1000㎛ 미만인 것이 바람직하고, 200㎛ 이상 500㎛인 것이 보다 바람직하다.
또한, 하이드로겔의 두께의 정의도 후술하는 대로이다. 몇 가지의 양태에서는, 하이드로겔의 두께는 0.1 내지 5mm(100 내지 5000㎛)이며, 0.1 내지 3mm(100 내지 3000㎛)인 것이 바람직하고, 0.1 내지 1mm(100 내지 1000㎛)인 것이 보다 바람직하다. 혹은, 0.15 내지 5mm(150 내지 5000㎛)이며, 0.15 내지 3mm(150 내지 3000㎛)인 것이 바람직하고, 0.15 내지 1mm(150 내지 1000㎛)인 것이 보다 바람직하다. 혹은, 0.2 내지 5mm(200 내지 5000㎛)이며, 0.2 내지 3mm(200 내지 3000㎛)인 것이 바람직하고, 0.2 내지 1mm(200 내지 1000㎛)인 것이 보다 바람직하다. 혹은, 0.5 내지 5mm(500 내지 5000㎛)이며, 0.5 내지 3mm(500 내지 3000㎛)인 것이 바람직하고, 0.5 내지 1mm(500 내지 1000㎛)인 것이 보다 바람직하다.
이식용 디바이스가 반투막을 포함하는 경우, 반투막 내의 하이드로겔의 두께는 0.1 내지 3mm(100 내지 3000㎛)이며, 0.1 내지 2mm(100 내지 2000㎛)인 것이 바람직하고, 0.1 내지 1mm(100 내지 1000㎛)인 것이 보다 바람직하다. 혹은, 0.15 내지 3mm(150 내지 3000㎛)이며, 0.15 내지 2mm(150 내지 2000㎛)인 것이 바람직하고, 0.15 내지 1mm(150 내지 1000㎛)인 것이 보다 바람직하다. 혹은, 0.2 내지 3mm(200 내지 3000㎛)이며, 0.2 내지 2mm(200 내지 2000㎛)인 것이 바람직하고, 0.2 내지 1mm(200 내지 1000㎛)인 것이 보다 바람직하다. 혹은, 1 내지 3mm(1000 내지 3000㎛)인 것이 바람직하고, 1.5 내지 2mm(1500 내지 2000㎛)인 것이 보다 바람직하다.
이식용 디바이스가 반투막을 포함하지 않는 경우, 하이드로겔의 두께는 0.1 내지 5mm(100 내지 5000㎛)이며, 0.1 내지 3mm(100 내지 3000㎛)인 것이 바람직하고, 0.1 내지 1mm(100 내지 1000㎛)인 것이 보다 바람직하다. 혹은, 0.15 내지 5mm(150 내지 5000㎛)이며, 0.15 내지 3mm(150 내지 3000㎛)인 것이 바람직하고, 0.15 내지 1mm(150 내지 1000㎛)인 것이 보다 바람직하다. 혹은, 0.2 내지 5mm(200 내지 5000㎛)이며, 0.2 내지 3mm(200 내지 3000㎛)인 것이 바람직하고, 0.2 내지 1mm(200 내지 1000㎛)인 것이 보다 바람직하다. 혹은, 0.5 내지 5mm(500 내지 5000㎛)이며, 0.5 내지 3mm(500 내지 3000㎛)인 것이 바람직하고, 0.5 내지 1mm(500 내지 1000㎛)인 것이 보다 바람직하다.
박형의 하이드로겔일 경우, 하이드로겔의 두께는 100㎛ 이상 500㎛ 미만이고, 100㎛ 이상 400㎛ 미만인 것이 바람직하고, 100㎛ 이상 300㎛ 미만인 것이 보다 바람직하다. 혹은, 150㎛ 이상 500㎛ 미만이고, 150㎛ 이상 400㎛ 미만인 것이 바람직하고, 150㎛ 이상 300㎛ 미만인 것이 보다 바람직하고, 200㎛ 이상 300㎛ 미만인 것이 더욱 바람직하다. 이러한 두께는 이식용 디바이스가 반투막을 포함하는 경우와, 반투막을 포함하지 않는 경우에서 마찬가지이다.
이식용 디바이스의 형상은 평판상이면, 특별히 한정되지 않는다. 평판이란, 평평한 판을 의미하고, 두께가 거의 일정하여 넓은 면적을 갖는 판상을 나타낸다. 당해 판의 형상으로서, 예를 들어 삼각형, 사각형, 오각형과 같은 다각형이나 원형 등의 평평한 판상을 들 수 있다. 또한, 당해 이식용 디바이스는 상기한 두께이며, 또한 판상 전체에서 거의 일정한 두께인 것이 바람직하다. 판상의 이식 디바이스에 있어서 두께의 변동은, 바람직하게는 ±20％ 이내, 보다 바람직하게는 ±10％ 이내이다. 이식용 디바이스의 두께는 이식용 디바이스의 최대 두께 부분의 두께다. 예를 들어, 하이드로겔을 반투막인 투석 튜브 중에 봉입할 때에는, 투석 튜브의 양단을 시일함으로써, 이식용 디바이스의 형상이 언뜻 보면 럭비볼 형상과 같은, 양단이 약간 얇고, 양단에 비해 중앙이 두꺼워지는 형상이 되는 경우가 있다. 그러한 형상이 되는 경우에는, 이식용 디바이스의 두께는 그 최대 두께의 부분인 중앙 부근의 두께를 의미한다.
또한, 하이드로겔의 형상도 평판상이면, 특별히 한정되지 않는다. 평판이란, 평평한 판을 의미하고, 두께가 거의 일정하며 넓은 면적을 갖는 판상을 나타낸다. 당해 판의 형상으로서, 예를 들어 삼각형, 사각형, 오각형과 같은 다각형이나 원형 등의 평평한 판상을 들 수 있다. 또한, 하이드로겔은 상기한 두께이며, 또한 판상 전체에서 거의 일정한 두께인 것이 바람직하다. 하이드로겔에 있어서 두께의 변동은 바람직하게는 ±20％ 이내, 보다 바람직하게는 ±10％ 이내이다. 하이드로겔의 두께는 하이드로겔의 최대 두께 부분의 두께이다. 몇 가지의 양태에서는, 평판형의 하이드로겔은, 예를 들어 단직경이 12 내지 15mm, 장직경이 12 내지 18mm, 두께가 0.1 내지 5mm 정도의 크기인 가교 알긴산의 겔이며, 원형, 사각형, 육각형, 팔각형 등의 형상을 취하는 것도 가능하다. 평판형의 하이드로겔을 면적으로 표시하면, 예를 들어 144 내지 270mm2로도 나타낼 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「IEQ」란, Islet Equivalents의 약호이며, 췌도를 구형으로 보아 정하고, 직경이 150㎛인 췌도를 1IEQ로 정의하는, 췌도의 양을 나타내는 국제 단위이다.
일본 췌장·췌도 이식 연구회의 신선 췌도 이식의 기준(췌도 이식 실시 매뉴얼)에 의하면, 신선 췌도를 이식할 때의 조건 중 하나로, 「췌도량 5000IEQ/kg(환자 체중) 이상」이고, 여기에서도 참고로 한다. 이식용 디바이스는, 원하는 치료 효과가 발생하도록 산정된 췌도수로 적절히 설정할 수 있고, 환자의 체중, 증상의 정도 등에 의해 적절히 적절한 디바이스로 설정하는 것이 가능하다.
인슐린 분비 세포의 양에 대해서도, 췌도에 준하여 적절히 설정할 수 있다.
이식용 디바이스의 제조 방법에 대해서, 보다 상세하게 설명한다.
이식용 디바이스의 제조 방법에 있어서, 「공정 (a): 임의 선택의 공정으로서, 생체로부터 췌장을 적출하고, 췌도를 분리하는 공정」이란, 공정 (a)가 임의 선택인 것을 의미한다. 「생체」는, 예를 들어 인간 또는 비인간 포유 동물이며, 비인간 포유 동물로서는, 예를 들어 돼지를 들 수 있다. 공정 (a)를 행하는 경우에는, 예를 들어 돼지 췌도의 단리에서 말하면, 당기술의 공지된 수순, 혹은 시모다 등(Shimoda; Cell Transplantation, 제21권, 501-508 페이지, 2012년)에 기재된 방법, 혹은 에드몬톤 프로토콜을 사용한 표준의 리콜디 기술 등에 준하여, 무균 하에서 성체의 돼지로부터 무균의 생존 가능한 췌장을 얻고, 췌도 세포를 단리할 수 있다. 기타 비인간 포유 동물의 췌도, 혹은 인간의 췌도 단리도, 돼지 췌도의 단리에 준하여 행할 수 있다. 그 후, 단리한 췌도를 그대로 사용해도 되고, 혹은 배양하여 사용해도 된다. 췌도의 배양에 대해서는, 예를 들어 노구치(Noguchi) 등 (Transplantation Proceedings, 42, 2084-2086(2010))의 방법에 준하여, 배지 중 (Connaught Medical Research Laboratory(CMRL)-based Miami-definedmedia #1(MM1; Mediatech-Cellgro, Herndon, VA)-supplemented with 0.5％ human serum albumin.), 5％ CO2/95％ 공기의 습윤 분위기 중에 37℃에서 1일간 배양하는 것이 가능하다.
이어서, 「공정 (b): 화학 가교에 의해 하이드로겔화될 수 있는 알긴산 유도체의 용액에, 인슐린 분비 세포, 췌도, 배양되어 얻어진 췌도 세포, 및 줄기 세포로부터 분화시켜 얻어진 췌도 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 세포 또는 조직을 혼화하는 공정」에서는, 화학 가교에 의해 하이드로겔화될 수 있는 것으로서, 예를 들어 상술한 식 (I) 및 식 (II)로 표시되는 알긴산 유도체를 들 수 있다. 공정 (b)에서는, 예를 들어 상기 알긴산 유도체의 0.1 내지 5중량％의 수용액 혹은 생리 식염수 용액을 제작하고, 당해 용액에, 인슐린 분비 세포, 췌도, 배양되어 얻어진 췌도 세포, 및 줄기 세포로부터 분화시켜 얻어진 췌도 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 세포 또는 조직(예를 들어, 공정 (a)에서 얻은 췌도, 당해 췌도로부터 단리한 인슐린 분비 세포, 또는 당해 췌도로부터 단리한 췌도 세포를 배양하여 얻어지는 췌도 세포)을 적절히 필요량 현탁시킨다.
여기서, 「화학 가교에 의해 하이드로겔화될 수 있는 알긴산 유도체의 용액」은, 예를 들어 상술한 식 (HA-I)로 표시되는 알긴산 유도체의 용액과, 전술한 식 (HA-II)로 표시되는 알긴산 유도체의 용액의 2종의 용액이다. 혹은, 「화학 가교에 의해 하이드로겔화될 수 있는 알긴산 유도체의 용액」은, 예를 들어 상술한 식 (HB-I)로 표시되는 알긴산 유도체의 용액과, 전술한 식 (HB-II)로 표시되는 알긴산 유도체의 용액의 2종의 용액이다. 이 경우, 공정 (b)에서는, 이들 2종의 용액, 및 그들에 세포 또는 조직을 혼화한 용액은, 혼합하지 않고, 따로따로 제작된다. 이 때, 세포 또는 조직은 2종의 용액 중 한쪽에만 혼화해도 되고, 혹은 양쪽에 혼화해도 된다.
이어서, 「공정 (c): 공정 (b)에서 얻어진 알긴산 유도체의 용액에, 2가 금속 이온을 포함하는 용액과 접촉시켜, 두께 0.1 내지 5mm(100 내지 5000㎛) 또는 두께 100㎛ 이상 500㎛ 미만의 겔을 제작하는 공정」에서는, 세포 또는 조직(예를 들어, 췌도)이 현탁된, 공정 (b)에서 얻어진 알긴산 유도체의 용액을 겔화시킨다. 이 때, 우선, 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)의 알긴산 유도체의 용액과 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)로 표시되는 알긴산 유도체의 용액을, 각각의 화학 가교기의 도입률에 따라서, 적절히 각각의 용량을 혼합하도록 해도 된다. 이어서, 그 혼합 용액에, 2가 금속 이온을 포함하는 용액과 접촉시킴으로써, 이온 가교가 진행됨과 동시에 화학 가교도 진행되어, 겔을 제작할 수 있다. 겔은 보다 구체적으로는, 후술하는 실시예 5에 기재된 [평판형 알긴산 겔의 제조]<일반적인 조제 방법>과 마찬가지로 제작할 수 있다.
이어서, 「공정 (d): 임의 선택의 공정으로서, 공정 (c)에서 얻어진 겔을 반투막으로 피복하는 공정」이란, 공정 (d)가 임의 선택인 것을 의미한다. 공정 (d)를 행하는 경우에는, 공정 (c)에서 얻어진 겔을, 당해 분야에서 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법으로, 반투막으로 피복한다. 예를 들어, 겔을, 반투막(예를 들어, 일단부를 시일한 반투막의 튜브)에 삽입하여, 다른 일단부를 시일함으로써 피복한다.
혹은, 「공정 (c): 공정 (b)에서 얻어진 알긴산 유도체의 용액을 반투막에 봉입하는 공정」은, 세포 또는 조직(예를 들어, 췌도)이 현탁된, 공정 (b)에서 얻어진 알긴산 유도체의 용액을, 당해 분야에서 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법으로, 반투막으로 피복한다. 이 때, 우선 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)의 알긴산 유도체의 용액과 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)로 표시되는 알긴산 유도체의 용액을, 각각의 화학 가교기의 도입률에 따라서, 적절히 각각의 용량을 혼합하도록 해도 된다. 이어서, 그 세포 또는 조직(예를 들어, 췌도)이 현탁된 혼합 용액을, 반투막(예를 들어, 일단부를 시일한 반투막의 튜브)에 삽입하여, 다른 일단부를 시일함으로써 피복한다.
이어서, 「공정 (d): 공정 (c)에서 얻어진 반투막을, 2가 금속 이온을 포함하는 용액과 접촉시켜, 반투막 내의 알긴산 용액을 겔화하는 공정」에서는, 공정 (c)에서 얻어진 알긴산 용액을 봉입한 반투막을 2가 금속 이온을 포함하는 용액과 접촉시켜, 반투막 내의 알긴산 용액을 겔화한다.
공정 (d)에 의해 얻어진 디바이스는 생리 식염수 등의 용매로 세정해도 된다. 또한, 배지 중에서 소정 기간 배양해도 된다.
「공정 (e): 공정 (b)에서 얻어진 알긴산 유도체의 용액을 임의의 형상으로 하여 겔을 제작하는 공정」 또는 「공정 (e): 공정 (b)에서 얻어진 알긴산 유도체의 용액을 임의의 용기에 넣거나, 또는 임의의 표면에 두는 공정」은, 세포 또는 조직(예를 들어, 췌도)이 현탁된, 공정 (b)에서 얻어진 알긴산 유도체의 용액을, 당해 분야에서 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법으로, 임의의 용기나 표면 등을 이용하여 일정한 형으로 고정하여, 화학 가교의 진행에 의해 겔화시킨다. 이 때, 우선, 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)의 알긴산 유도체의 용액과 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)로 표시되는 알긴산 유도체의 용액을, 각각의 화학 가교기의 도입률에 따라서, 적절히 각각의 용량을 혼합하도록 해도 된다.
임의의 용기는 용액을 일정한 형상으로 유지할 수 있는 용기를 말하고, 예를 들어 반투막, 비이커 또는 샤알레를 들 수 있고, 반투막이 바람직하다.
임의의 표면은 용액을 일정한 형상으로서 올려놓을 수 있는 표면을 말하고, 예를 들어 반투막 표면, 플라스틱 표면 또는 유리 표면을 들 수 있고, 반투막 표면이 바람직하다.
「공정 (f): 공정 (e)에서 얻어진 용기 내 또는 표면 상에서, 알긴산 유도체의 용액을 겔화하는 공정」 또는 「공정 (f): 공정 (c)에서 얻어진 반투막 내에서, 알긴산 유도체의 용액을 겔화하여, 두께 0.1 내지 5mm(100 내지 5000㎛)의 겔을 제작하는 공정」은, 임의의 용기, 표면 혹은 반투막 내에서 유지된 용액을 화학 가교에 의해 겔화시키는 것을 의미한다. 이 때, 2가 금속 이온을 포함하는 용액과 접촉시킴으로써, 이온 가교와 화학 가교를 동시에 진행시켜 겔을 제작해도 되고, 2가 금속 이온이나 그 용액과 접촉시키지 않고 화학 가교만을 진행시켜, 겔을 제작해도 된다.
이식용 디바이스에 사용되는 「2가 금속 이온」을 포함하는 용액이란, 칼슘 이온, 바륨 이온, 스트론튬 이온 등을 포함하는 용액을 들 수 있다. 바람직하게는 칼슘 이온 또는 바륨 이온을 포함하는 용액이며, 칼슘 이온을 포함하는 용액인 것이 보다 바람직하다.
2가 금속 이온을 포함하는 용액은, 예를 들어 2가 금속 이온의 염을 용매에 용해시킴으로써 얻을 수 있다. 2가 금속 이온의 염으로서는, 염화칼슘, 염화바륨, 염화스트론튬 등을 들 수 있다. 용매로서는, 예를 들어 물, 생리 식염수 및 HEPES 완충액을 들 수 있다.
몇 가지의 양태에서는, 2가 금속 이온을 포함하는 용액은, 칼슘 이온을 포함하는 용액이며, 바람직하게는 염화칼슘을 포함하는 수용액이다.
2가 금속 이온을 포함하는 용액의 사용량은, 알긴산 유도체의 사용량이나 분자량 등에 따라서 적절히 조절하는 것이 바람직하다.
이식용 디바이스가 반투막을 갖는 경우, 디바이스 중의 하이드로겔은, 알긴산 유도체의 용액을 반투막에 봉입하고 나서, 2가 금속 이온 용액에 접촉시킴으로써 제작해도, 반투막에 봉입하기 전에 겔화시키고, 그 후 반투막 내에 봉입해도 어느 것이어도 된다.
여기서, 「접촉」이란, 알긴산 유도체의 용액을 봉입한 반투막을 2가 금속 이온 용액에 침지시키는 것, 알긴산 유도체의 용액을 봉입한 반투막에 2가 금속 이온 용액을 가하는 것 등을 들 수 있다.
이식용 디바이스에 사용되는 하이드로겔이란, 물에 불용인 삼차원의 그물눈 구조를 갖는 고분자 및 그 물에 의한 팽윤체를 가리키는 것으로 한다. 여기에서는, 하이드로겔을 간단히 겔이라고 하는 경우가 있다.
하이드로겔을 조제할 때에 사용하는, 고분자의 농도를 변화시킴으로써, 이 겔의 그물눈원 구조를 통과할 수 있는 분자의 분자량을 크게 자유롭게 변화시킬 수 있다. 즉, 겔의 그물눈 구조는 고분자의 농도가 진한 경우에는 메쉬가 작고, 고분자의 농도가 엷은 경우에는 메쉬가 커지는 것을 생각할 수 있다. 그물눈 구조의 메쉬가 너무 크면, 항체 등이 그물눈 구조 내에 침입한다. 이 경우, 겔 내의 인슐린 분비 세포 또는 췌도에 대하여 거절 반응이 일어나기 쉬워진다. 거절 반응은 인슐린 등의 필요 물질의 산생을 저해한다.
일반적으로, 하이드로겔의 재료는 이하와 같은 고분자를 포함한다. 예를 들어, 콜라겐, 히알루로난, 젤라틴, 피브로넥틴, 엘라스틴, 테나신, 라미닌, 비트로넥틴, 폴리펩티드, 헤파란황산, 콘드로이틴, 콘드로이틴황산, 케라탄, 케라탄황산, 데르마탄황산, 카라기난, 헤파린, 키틴, 키토산, 알긴산염, 알긴산 유도체, 아가로오스, 한천, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 글리코겐 및 이들의 유도체, 덧붙여 피브린, 피브리노겐, 트롬빈 및 폴리글루탐산, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 락트산-글리콜산 공중합체, 비닐알코올계 중합체, 젤란검, 크산탄검, 갈락토만난, 구아검, 로커스트빈검 및 타라검 등을 들 수 있다.
여기서, 하이드로겔의 재료로서는, 생체 적합성, 췌도의 장기 생착·기능 유지 등의 점에서, 알긴산 유도체가 바람직하다.
이하, 알긴산 유도체의 각 양태에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
1. 알긴산
본 명세서 중, 알긴산이라 기재하는 경우, 알긴산, 알긴산 에스테르 및 그들의 염(예를 들어, 알긴산나트륨)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 알긴산(「알긴산류」라고 하는 경우가 있음)을 의미한다. 사용되는 알긴산은 천연 유래여도 합성물이어도 되지만, 천연 유래인 것이 바람직하다. 바람직하게 사용되는 알긴산류는, 레소니아, 마크로키스티스, 라미나리아, 아스코필럼, 더빌리아, 감태, 대황, 다시마 등의 갈조류로부터 추출되는 생체 내 흡수성의 다당류이며, D-만누론산(M)과 L-글루론산(G)이라는 2종류의 우론산이 직쇄상으로 중합된 폴리머이다. 보다 구체적으로는, D-만누론산의 호모폴리머 분획(MM 분획), L-글루론산의 호모폴리머 분획(GG 분획), 및 D-만누론산과 L-글루론산이 랜덤하게 배열된 분획(M/G 분획)이 임의로 결합된 블록 공중합체이다.
본 명세서 중, 알긴산은 알긴산을 (ALG)로 하여, 알긴산의 임의의 카르복실기 중 하나를 -COOH로 하여, (ALG)-COOH라 표기하는 경우가 있다.
몇 가지의 양태에서는, 알긴산은 알긴산나트륨이다. 알긴산나트륨은 시판품의 알긴산나트륨을 사용할 수 있다. 여기서, 후술하는 실시예에서는, 알긴산나트륨은 하기 표에 기재한 A-1, A-2, A-3, B-1, B-2 및 B-3의 알긴산나트륨(발매원 모치다 세이야쿠 가부시키가이샤)을 사용하고 있다. 각 알긴산나트륨의 1w/w％의 수용액의 점도, 중량 평균 분자량 및 M/G비를 하기 표에 나타낸다.
[표 9]
Figure pct00055
상기 알긴산나트륨 A-1, A-2, A-3, B-1, B-2 및 B-3의 각 물성값은, 하기 각종 방법에 의해 측정하였다. 측정 방법은 당해 방법에 한정되는 것은 아니지만, 측정 방법에 의해 각 물성값이 상기한 것과 다른 경우가 있다.
[알긴산나트륨의 점도 측정]
일본 약전(제16판)의 점도 측정법에 따라서, 회전 점도계법(콘플레이트형 회전 점도계)을 사용하여 측정하였다. 구체적인 측정 조건은 이하와 같다. 시료 용액의 조제는 MilliQ수를 사용하여 행하였다. 측정 기기는 콘플레이트형 회전 점도계(점도 점탄성 측정 장치 레오스트레스 RS600(Thermo Haake GmbH) 센서: 35/1)를 사용하였다. 회전수는 1w/w％ 알긴산나트륨 용액 측정 시는 1rpm으로 하였다. 판독 시간은 2분간 측정하고, 개시 1분에서 2분까지의 평균값으로 하였다. 3회의 측정의 평균값을 측정값으로 하였다. 측정 온도는 20℃로 하였다.
[알긴산나트륨의 중량 평균 분자량 측정]
(1) 겔 침투 크로마토그래피(GPC)와, (2) GPC-MALS의 2종류의 측정법으로 측정하였다. 측정 조건은 이하와 같다.
[전처리 방법]
시료에 용리액을 첨가하여 용해 후, 0.45㎛ 멤브레인 필터 여과한 것을 측정 용액으로 하였다.
(1) 겔 침투 크로마토그래피(GPC) 측정
[측정 조건(상대 분자량 분포 측정)]
칼럼: TSKgel GMPW-XL×2+G2500PW-XL(7.8mmI.D.×300mm×3개)
용리액: 200mM 질산나트륨 수용액
유량: 1.0mL/min
농도: 0.05％
검출기: RI 검출기
칼럼 온도: 40℃
주입량: 200μL
분자량 표준: 표준 풀루란, 글루코오스
(2) GPC-MALS 측정
[굴절률 증분(dn/dc) 측정(측정 조건)]
시차 굴절률계: Optilab T-rEX
측정 파장: 658nm
측정 온도: 40℃
용매: 200mM 질산나트륨 수용액
시료 농도: 0.5 내지 2.5mg/mL(5 농도)
[측정 조건(절대 분자량 분포 측정)]
칼럼: TSKgel GMPW-XL×2+G2500PW-XL(7.8mmI.D.×300mm×3개)
용리액: 200mM 질산나트륨 수용액
유량: 1.0mL/min
농도: 0.05％
검출기: RI 검출기, 광 산란 검출기(MALS)
칼럼 온도: 40℃
주입량: 200μL
본 명세서 중, 알긴산, 알긴산 유도체, 가교 알긴산 및 가교 알긴산의 분자량에 있어서, 단위로서 Da(달톤)를 부기하는 경우가 있다.
알긴산류의 D-만누론산과 L-글루론산의 구성비(M/G비)는, 주로 해조 등의 유래가 되는 생물의 종류에 따라서 다르고, 또한 그 생물의 생육 장소나 계절에 의한 영향을 받고, M/G비가 약 0.2인 고G형으로부터 M/G비가 약 5인 고M형까지 고범위에 걸쳐 있다. 알긴산류의 겔화 능력 및 생성된 겔의 성질은, M/G비에 의해 영향을 받고, 일반적으로 G 비율이 높은 경우에는 겔 강도가 높아지는 것이 알려져 있다. M/G비는 그 밖에도, 겔의 경도, 취성, 흡수성, 유연성 등에도 영향을 준다. 사용하는 알긴산류 및/또는 그의 염의 M/G비는 통상 0.2 내지 4.0이며, 보다 바람직하게는 0.4 내지 3.0, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 3.0이다.
본 명세서 중, 「내지」를 사용하여 나타내진 수치 범위는, 「내지」의 전후에 기재되는 수치를 각각 최솟값 및 최대값으로서 포함하는 범위를 나타낸다.
본 명세서 중, 사용되는 「알긴산 에스테르」, 「알긴산염」이란, 특별히 한정되지 않지만, 가교제와 반응시키기 위해서, 가교 반응을 저해하는 관능기를 갖지 않는 것이 필요하다. 알긴산 에스테르로서는, 바람직하게는 알긴산프로필렌글리콜 등을 들 수 있다.
본 명세서 중, 알긴산염으로서는, 예를 들어 알긴산의 1가의 염, 알긴산의 2가의 염을 들 수 있다. 알긴산의 1가의 염으로서는, 바람직하게는 알긴산나트륨, 알긴산칼륨, 알긴산암모늄 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 알긴산나트륨 또는 알긴산칼륨이며, 특히 바람직하게는 알긴산나트륨이다. 알긴산의 2가의 염으로서는, 바람직하게는 알긴산칼슘, 알긴산마그네슘, 알긴산바륨, 알긴산스트론튬 등을 들 수 있다.
알긴산은 고분자 다당류이며, 분자량을 정확하게 정하는 것은 곤란하지만, 일반적으로 중량 평균 분자량으로 1000 내지 1000만, 바람직하게는 1만 내지 800만, 보다 바람직하게는 2만 내지 300만의 범위이다. 천연물 유래의 고분자 물질의 분자량 측정에서는, 측정 방법에 의해 값에 차이가 발생할 수 있는 것이 알려져 있다.
예를 들어, 겔 침투 크로마토그래피(GPC) 또는 겔 여과 크로마토그래피(이들을 모두 사이즈 배제 크로마토그래피라고도 함)에 의해 측정한 중량 평균 분자량은, 바람직하게는 10만 이상, 보다 바람직하게는 50만 이상이며, 또한 바람직하게는, 500만 이하, 보다 바람직하게는 300만 이하이다. 그의 바람직한 범위는 10만 내지 500만이며, 보다 바람직하게는 15만 내지 300만이다.
또한, 예를 들어 GPC-MALS법에 의하면, 절대 중량 평균 분자량을 측정할 수 있다. GPC-MALS법에 의해 측정한 중량 평균 분자량(절대 분자량)은, 바람직하게는 1만 이상, 보다 바람직하게는 5만 이상, 더욱 바람직하게는 6만 이상이며, 또한 바람직하게는 100만 이하, 보다 바람직하게는 80만 이하, 더욱 바람직하게는 70만 이하, 특히 바람직하게는 50만 이하이다. 그의 바람직한 범위는 1만 내지 100만이며, 보다 바람직하게는 5만 내지 80만이며, 더욱 바람직하게는 6만 내지 70만, 특히 바람직하게는 6만 내지 50만이다.
통상, 고분자 다당류의 분자량을 상기와 같은 방법으로 산출하는 경우, 10％ 내지 20％의 측정 오차를 발생할 수 있다. 예를 들어, 40만이라면 32만 내지 48만, 50만이라면 40만 내지 60만, 100만이라면 80만 내지 120만 정도의 범위에서 값의 변동이 발생할 수 있다.
알긴산류의 분자량의 측정은, 통상법에 따라서 측정할 수 있다.
분자량 측정에 겔 여과 크로마토그래피를 사용하는 경우의 대표적인 조건은, 후술하는 본 명세서의 실시예에 기재된 바와 같다. 칼럼은, 예를 들어 Superose6 Increase10/300 GL 칼럼(GE 헬스케어 사이언스사)을 사용할 수 있고, 전개 용매로서, 예를 들어 0.15mol/L NaCl을 포함하는 10mmol/L 인산 완충액(pH 7.4)을 사용할 수 있고, 분자량 표준으로서 블루 덱스트란, 티로글로불린, 페리틴, 알돌라아제, 콘알부민, 오브알부민, 리보뉴클레아제 A 및 아프로티닌을 사용할 수 있다.
본 명세서 중에서 사용되는 알긴산의 점도는, 특별히 한정되지 않지만, 1w/w％의 알긴산류의 수용액으로서 점도를 측정한 경우, 바람직하게는 10mPa·s 내지 1000mPa·s, 보다 바람직하게는 50mPa·s 내지 800mPa·s이다.
알긴산의 수용액의 점도의 측정은, 통상법에 따라서 측정할 수 있다. 예를 들어, 회전 점도계법의, 공축 이중 원통형 회전 점도계, 단일 원통형 회전 점도계(브룩필드형 점도계), 원추-평판형 회전 점도계(콘플레이트형 점도계) 등을 사용하여 측정할 수 있다. 바람직하게는, 일본 약전(제16판)의 점도 측정법을 따르는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 콘플레이트형 점도계를 사용한다.
알긴산류는, 갈조류로부터 추출된 당초에는 분자량이 크고, 점도가 높은 편이지만, 열에 의한 건조, 정제 등의 과정에서 분자량이 작아지고, 점도는 낮아진다. 제조 공정의 온도 등의 조건 관리, 원료로 하는 갈조류의 선택, 제조 공정에 있어서의 분자량의 분획 등의 방법에 의해 분자량이 다른 알긴산류를 제조할 수 있다. 또한, 다른 분자량 혹은 점도를 갖는 다른 로트의 알긴산류와 혼합함으로써, 목적으로 하는 분자량을 갖는 알긴산류로 하는 것도 가능하다.
본 명세서 중에서 사용되는 알긴산은, 몇 가지의 양태에 있어서는, 저엔도톡신 처리되지 않은 알긴산이며, 또는 다른 몇 가지의 양태에 있어서는, 저엔도톡신 처리된 알긴산이다. 저엔도톡신이란, 실질적으로 염증 또는 발열을 야기하지 않을 정도까지 엔도톡신 레벨이 낮은 것을 말한다. 보다 바람직하게는 저엔도톡신 처리된 알긴산류인 것이 바람직하다.
저엔도톡신 처리는 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들어, 히알루론산나트륨을 정제하는, 스가 등의 방법(예를 들어, 일본 특허 공개 평9-324001호 공보 등 참조), β1,3-글루칸을 정제하는, 요시다 등의 방법(예를 들어, 일본 특허 공개 평8-269102호 공보 등 참조), 알지네이트, 젤란검 등의 생체 고분자염을 정제하는, 윌리엄 등의 방법(예를 들어, 일본 특허 공표 제2002-530440호 공보 등 참조), 폴리사카라이드를 정제하는, 제임스 등의 방법(예를 들어, 국제 공개 제93/13136호 팸플릿 등 참조), 루이스 등의 방법(예를 들어, 미국 특허 제5589591호 명세서 등 참조), 알지네이트를 정제하는, 하맨 프랭크 등의 방법(예를 들어, Appl Microbiol Biotechnol(1994) 40: 638-643 등 참조) 등 또는 이들에 준하는 방법에 의해 실시할 수 있다. 저엔도톡신 처리는 그들에 한정되지 않고, 세정, 필터(엔도톡신 제거 필터나 대전한 필터 등)에 의한 여과, 한외 여과, 칼럼(엔도톡신 흡착 어피니티 칼럼, 겔 여과 칼럼, 이온 교환 수지에 의한 칼럼 등)을 사용한 정제, 소수성 물질, 수지 또는 활성탄 등에의 흡착, 유기 용매 처리(유기 용매에 의한 추출, 유기 용제 첨가에 의한 석출·침강 등), 계면 활성제 처리(예를 들어, 일본 특허 공개 제2005-036036호 공보 등 참조) 등 공지된 방법에 의해, 혹은 이들을 적절히 조합하여 실시할 수 있다. 이들 처리의 공정에, 원심 분리 등 공지된 방법을 적절히 조합해도 된다. 알긴산의 종류에 맞게 적절히 선택하는 것이 바람직하다.
엔도톡신 레벨은 공지된 방법으로 확인할 수 있고, 예를 들어 리물루스 시약(LAL)에 의한 방법, 엔도스페시(등록 상표) ES-24S 세트(세이카가쿠 고교 가부시키가이샤)를 사용하는 방법 등에 의해 측정할 수 있다.
사용되는 엔도톡신의 처리 방법은 특별히 한정되지 않지만, 그 결과로서, 알긴산류의 엔도톡신 함유량이, 리물루스 시약(LAL)에 의한 엔도톡신 측정을 행한 경우에, 500엔도톡신 단위(EU)/g 이하인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 100EU/g 이하, 특히 바람직하게는 50EU/g 이하, 특별히 바람직하게는 30EU/g 이하이다. 저엔도톡신 처리된 알긴산나트륨은, 예를 들어 Sea Matrix(등록 상표)(모치다 세이야쿠 가부시키가이샤), PRONOVATM UP LVG(FMCBioPolymer) 등 시판품에 의해 입수 가능하다.
2. 알긴산 유도체
본 명세서 중, 신규의 알긴산 유도체가 제공된다. 본 명세서 중, 알긴산 유도체로서는, 알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 아미드 결합 및 2가의 링커를 통해, 위스헨 반응에 있어서의 반응성기 또는 당해 반응성기의 상보적인 반응성기가 도입된 것이다.
보다 구체적으로는, 하기 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I):
Figure pct00056
[식 (HA-I) 또는 식 (HB-I) 중, (ALG), -L1-, Akn의 정의는 각각 전술한 제1 양태 중의 정의와 동일함]로 표시되는 알긴산 유도체, 및 하기 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II):
Figure pct00057
[식 (HA-II) 또는 식 (HB-II) 중, (ALG), -L2-의 정의는 각각 전술한 제1 양태 중의 정의와 동일함]로 표시되는 알긴산 유도체이다.
상기한 2가의 링커(-L1- 또는 -L2-)는 반응성기와 당해 반응성기와 상보적인 반응성기의 반응을 저해하지 않는 한, 임의의 직쇄상기의 사용이 가능하다. 구체적으로는, 직쇄의 알킬렌기(-(CH2)n-, n=1 내지 30)(당해 기 중의 -CH2-는, -C(=O)-, -CONH-, -O-, -NH-, -S-, 벤젠환, 복소환(피리딘환, 피페리딘환, 피페라진환 등의 5 내지 6원 방향족 복소환 또는 5 내지 6원 비방향족 복소환) 등의 기로 복수개(예를 들어, 1 내지 10개, 또는 1 내지 5개) 치환되어도 되고, 당해 -CH2-의 수소 원자는, 옥소기(=O), C1-6 알킬기(예를 들어, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, iso-프로필기 등의 기), 할로겐 원자(예를 들어, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자 등), 수산기(-OH) 등의 기에서 선택되는 기로 복수개(예를 들어, 1 내지 10개, 또는 1 내지 5개) 치환되어 있어도 됨)를 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 신규의 알긴산 유도체인 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I), 및 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)로 표시되는 알긴산 유도체는, 예를 들어 하기 식의 방법에 의해 제조하는 것이 가능하다.
Figure pct00058
본 명세서의 식 (HA-I), 식 (HA-II), 식 (HB-I) 또는 식 (HB-II)로 표시되는 알긴산 유도체의 중량 평균 분자량은, 10만Da 내지 300만Da이며, 바람직하게는 30만Da 내지 250만Da이며, 보다 바람직하게는 50만Da 내지 200만Da이다. 당해 양쪽 알긴산 유도체의 분자량은, 후술하는 방법에 의해 구할 수 있다.
본 명세서 중, 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)의 Akn-L1-NH-기는, 알긴산 구성 단위의 모든 카르복실기에 결합되어 있을 필요는 없고, 또한 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)의 N3-L2-NH-기는, 알긴산 구성 단위의 모든 카르복실기에 결합되어 있을 필요는 없다.
본 명세서 중, 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)의 Akn-L1-NH-기를 반응성기로 하는 경우, 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)의 N3-L2-NH-기가 상보적인 반응성기가 된다. 또한, 반대로 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)의 N3-L2-NH-기를 반응성기로 하는 경우, 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)의 Akn-L1-NH-기가 상보적인 반응성기가 된다.
본 명세서 중, 반응성기 또는 상보적인 반응성기의 도입률은 각각 0.1％ 내지 30％, 또는 1％ 내지 30％이며, 바람직하게는 2％ 내지 20％이며, 보다 바람직하게는 3％ 내지 10％이다.
상기 반응성기 또는 상보적인 반응성기의 도입률은, 알긴산류의 반복 단위인 우론산 단당 단위 중, 각 반응성기가 도입된 우론산 단당 단위의 수를 백분율로 나타낸 값이다. 본 명세서 중, 특별히 언급하지 않는 한, 알긴산 유도체(식 (HA-I), 식 (HA-II), 식 (HB-I) 또는 식 (HB-II))에 있어서의 반응성기 또는 상보적인 반응성기의 도입률에 사용되는 ％는, mol％를 의미한다. 각 반응성기 또는 상보적인 반응성기의 도입률은, 후술하는 실시예에 기재된 방법에 의해 구할 수 있다.
본 명세서 중, 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I) 중의 환상 알킨기(Akn) 및 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II) 중의 아지드기가, 위스헨 반응에 의해 트리아졸환을 형성하고, 이에 의해 가교가 형성된다.
3. 위스헨 반응
위스헨 반응(1,3-쌍극자 부가 환화 반응)은, 하기 식에 나타내지는 바와 같이 말단 아지드기 및 말단 알킨기를 갖는 화합물간의 축합 반응이다. 반응의 결과, 2 치환 1,2,3-트리아졸환이 양호한 수율로 얻어지고, 쓸데없는 부생성물이 발생하지 않는다는 특징을 갖고 있다. 당해 반응은 1,4- 또는 1,5-2 치환 트리아졸환이 생성될 수 있다고 생각할 수 있지만, 구리 촉매를 사용함으로써 위치 선택적으로 트리아졸환을 얻는 것이 가능하다.
Figure pct00059
또한, 구리 촉매를 사용하지 않는 위스헨 반응이 Wittig과 Krebs에 의해 보고가 이루어져 있다. 즉, 시클로옥틴과 페닐아지드를 혼합하는 것만으로 환화 부가체가 얻어지는 반응이다(하기 식 중, R3=페닐임). 본 반응은, 시클로옥틴의 삼중 결합이 크게 변형되어 있기 때문에, 페닐아지드와의 반응을 의한 변형의 해소가 구동력이 되어, 반응이 자발적으로 진행됨으로써, 촉매가 불필요해졌다.
Figure pct00060
이상과 같이, 위스헨 반응은, 치환된 1급 아지드, 2급 아지드, 3급 아지드, 방향족 아지드 등을 갖는 아지드 화합물, 및 아지드기의 상보적인 반응성기인 말단 또는 환상 알킨기를 갖는 화합물을 사용할 수 있다. 또한, 위스헨 반응에서는, 거의 아지드기 및 알킨기만이 반응하는 점에서, 반응 기질 중에 각종 관능기(예를 들어, 에스테르기, 카르복실기, 알케닐기, 수산기, 아미노기 등)를 치환시키는 것이 가능하다.
몇 가지의 양태에서는, 바람직하지 않은 부생성물을 발생시키지 않고, 구리 촉매에 의한 세포 독성을 회피시키기 위해 구리 촉매를 사용하지 않고, 단시간에 용이하게 또한 효율적으로 1,2,3-트리아졸환에 의한 가교를 알긴산 분자간에 형성시키기 위해서, 위스헨 반응의 알킨기로서는, 예를 들어 상술한 제1 양태에 기재한 환상 알킨기(시클로옥틸기)를 사용한다.
바람직한 양태의 알긴산 유도체의 가교 방법에 있어서는, 당해 반응(위스헨 반응)에서 바람직하지 않은 부생성물이 거의 형성되지 않는다. 이 경우, 알긴산을 사용한 신규 형태의 생체 적합성 재료의 제작, 및 알긴산히드로겔의 형성에 있어서, 각종 생물 활성 분자를 도입하는 것, 또한 재건 외과용 또는 유전자 요법용의 알긴산히드로겔로써, 세포 물질을 도입하는 것이 가능해진다.
4. 가교 알긴산
가교 알긴산은, (i) 2가의 금속 이온 결합을 통한 것과, (ii) 화학 결합을 통한 것과, 또는 (iii) 2가의 금속 이온 결합 및 화학 결합의 양쪽을 통한 것이 있다. 어느 가교 알긴산은, 겔상으로부터 반고체, 경우에 따라서는 스펀지와 같은 형태를 형성하는 특성을 갖고 있다.
2가의 금속 이온 결합을 통한 가교 알긴산은, 초고속으로 반응이 진행되고, 가역적인 것에 비해, 화학 결합을 통한 가교 알긴산은, 비교적 온화한 조건에서 천천히 반응이 진행되고, 비가역적이다. 가교 알긴산의 물성은, 예를 들어 사용하는 2가 금속 이온이 포함되는 수용액(예를 들어, 염화칼슘 수용액)의 농도, 혹은 알긴산에 도입된 반응성기의 도입률을 변화시키는 등의 방법으로, 조정이 가능하다.
상기한 가교 반응을 이용함으로써, 각종 알긴산 구조체를 제작하는 것이 가능해진다. 예를 들어, 이온 가교 반응에 의해, 알긴산 용액으로부터 순시에 특정한 구조체를 만들 수 있고, 당해 구조체의 구조 강화(예를 들어, 장기 안정성의 획득 등)를 위해, 화학 결합에 의한 가교 반응을 이용하는 것이 가능하다. 또한, 예를 들어 2가의 금속 이온 결합 및 화학 결합의 양쪽을 통한 가교 알긴산 구조체에 있어서, 이온 가교에 의해 도입된 2가 금속 이온은 가역적으로 방출되어, 화학 결합에 의한 가교만이 남은 구조체를 만드는 것도 가능하다.
또한, 바람직한 양태의 알긴산 유도체를 사용한 가교 알긴산 구조체는, 화학 결합에 의한 가교를 포함하기 때문에 안정성을 갖고, 알긴산나트륨을 사용한 이온 가교만의 가교 알긴산 구조체와 비교하여, 형상을 장기간 유지할 수 있어, 유리하다.
어떤 양태의 가교 알긴산은, 상기 식 (HA-I) 및 상기 식 (HA-II)의 알긴산 유도체를 혼합하여 위스헨 반응을 행함으로써, 얻을 수 있다. 또한, 어느 양태의 가교 알긴산은, 상기 식 (HB-I) 및 상기 식 (HB-II)의 알긴산 유도체를 혼합하여 위스헨 반응을 행함으로써, 얻을 수 있다.
어떤 양태의 가교 알긴산은, 화학 가교(알킨기 및 아지드기로부터 형성되는 트리아졸환에 의한 가교)를 통해 삼차원의 그물눈 구조를 형성한다. 바람직한 알긴산 유도체는, 가교 후의 가교 알긴산의 안정성이 개선된 것이다.
몇 가지 양태의 가교 알긴산은, 제1 알긴산의 임의의 카르복실기와 제2 알긴산의 임의의 카르복실기 사이가 하기 식 (HA-III-L) 또는 식 (HB-III-L):
Figure pct00061
[식 (HA-III-L) 또는 식 (HB-III-L) 중, 양단의 -CONH- 및 -NHCO-는 알긴산의 임의의 카르복실기를 통한 아미드 결합을 나타내고; -L1-, -L2- 및 X는 각각 상기 제1 양태 중의 정의와 동일함]을 통해 아미드 결합한 가교 알긴산이다.
몇 가지의 양태에서, 가교 알긴산을 제조할 때의, 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)의 알긴산 유도체와, 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)의 알긴산 유도체의 혼합비는, 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)의 유도체와 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)의 유도체의 중량비로, 예를 들어 1 내지 1.5:1, 바람직하게는 1.2 내지 1.5:1, 또는 1 내지 1.2:1, 보다 바람직하게는 1:1이다.
몇 가지의 양태에서, 가교 알긴산을 제조할 때의, 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)의 알긴산 유도체와, 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)의 알긴산 유도체의 혼합비는, 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)의 유도체와 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)의 유도체의 중량비로, 예를 들어 1 내지 4.0:1, 바람직하게는 1.5 내지 4.0:1, 또는 1.2 내지 1.5:1, 또는 1 내지 1.2:1, 보다 바람직하게는 1:1이다.
몇 가지의 양태에서, 가교 알긴산을 제조할 때의, 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)의 알긴산 유도체와, 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)의 알긴산 유도체의 혼합비는, 보다 바람직하게는 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)의 알긴산 유도체와 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)의 알긴산 유도체의 반응성기의 도입률(mol％)비로, 예를 들어 1 내지 1.5:1, 바람직하게는 1.2 내지 1.5:1, 또는 1 내지 1.2:1, 보다 바람직하게는 1:1이다.
몇 가지의 양태에서, 가교 알긴산을 제조할 때의, 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)의 알긴산 유도체와, 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)의 알긴산 유도체의 혼합비는, 보다 바람직하게는 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)의 알긴산 유도체와 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)의 알긴산 유도체의 반응성기의 도입률(mol％)비로, 예를 들어 1 내지 4.0:1, 바람직하게는 1.5 내지 4.0:1, 또는 1.2 내지 1.5:1, 또는 1 내지 1.2:1, 보다 바람직하게는 1:1이다.
또한, 상기 혼합비에 있어서, 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)의 알긴산 유도체를 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)의 알긴산 유도체로, 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)의 알긴산 유도체를 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)의 유도체에, 각각 치환하는 것도 가능하다.
가교 알긴산은, 알긴산의 구성 단위의 모든 카르복실기가 상기 식 (HA-III-L) 또는 식 (HB-III-L)의 가교를 갖고 있을 필요는 없다. 가교 알긴산에 있어서의, 상기 식 (HA-III-L) 또는 식 (HB-III-L)로 표시되는 가교의 도입률(가교율이라고도 함)은, 예를 들어 0.1 내지 80％, 0.3 내지 60％, 0.5 내지 30％, 또는 1.0 내지 10％의 범위이다.
가교 알긴산을 얻기 위한 위스헨 반응에 있어서의 식 (HA-I), 식 (HA-II), 식 (HB-I) 또는 식 (HB-II)의 알긴산 유도체의 농도는, 통상 1 내지 500mg/mL이며, 바람직하게는 5 내지 100mg/mL의 범위이다.
위스헨 반응의 반응 온도는, 통상 외온 4 내지 60℃이며, 바람직하게는 외온 15 내지 40℃의 범위이다.
가교 알긴산(히드로겔)을 형성시키는 위한 교반 시간은, 예를 들어 수초 내지 24시간, 수초 내지 12시간, 수초 내지 30분간, 또는 수초 내지 10분간이다.
위스헨 반응에 사용하는 반응 용매 또는 반응 용액은, 특별히 한정은 되지 않지만, 예를 들어 수돗물, 순수(예를 들어, 증류수, 이온 교환수, RO수, RO-EDI수 등), 초순수, 세포 배양용 배지, 인산 완충 생리 식염수(PBS), 생리 식염수 및 HEPES 완충액 등을 들 수 있고, 바람직하게는 초순수이다.
몇 가지 양태의 가교 알긴산은, 가교로서 위스헨 반응에 의해 형성되는 트리아졸환에 의한 화학 가교, 및 칼슘 이온에 의해 부분적으로 형성되는 이온 가교를 포함하는, 가교 알긴산이다.
5. 가교 알긴산 구조체
가교 알긴산 구조체는, 상기 알긴산 유도체에 가교 반응을 실시하는 것을 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 이하의 방법에 의해 조제하는 것이 가능하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
[혼화법]
식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)의 알긴산 유도체 및 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)의 알긴산 유도체를 혼화하여 얻어지는 알긴산 유도체의 혼합 용액을, 2가 금속 이온을 포함하는 용액 중에 적하함으로써, 화학 가교(위스헨 반응에 의해 알킨기 및 아지드기로부터 형성되는 트리아졸환에 의한 가교) 및 이온 가교(2가 금속 이온에 의해 부분적으로 형성되는 가교)가 형성된, 특정한 구조체인, 가교 알긴산 구조체를 얻을 수 있다.
[코팅법]
식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)의 알긴산 유도체를 포함하는 용액을, 2가 금속 이온을 포함하는 용액 중에 적하하거나 하여 부분적으로 가교된 특정한 구조체가 얻어진다. 상기에서 얻어진, 예를 들어 겔 등의 구조체를, 전술한 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)의 알긴산 유도체를 포함하는 용액에 첨가함으로써, 상기 구조체의 표면 등에 추가의 가교 반응(위스헨 반응)을 실시함으로써, 가교 알긴산 구조체를 얻을 수 있다. 또한, 이 방법은, 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)의 알긴산 유도체를 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)의 알긴산 유도체로, 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)의 알긴산 유도체를 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)의 알긴산 유도체로, 각각 치환하여 실시하는 것도 가능하다.
상기 방법에서 사용하는 2가 금속 이온으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 바륨 이온, 스트론튬 이온, 아연 이온 등을 들 수 있고, 바람직하게는 칼슘 이온이다.
상기 방법에서 사용하는 칼슘 이온을 포함하는 용액으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 염화칼슘 수용액, 탄산칼슘 수용액, 글루콘산칼슘 수용액 등의 수용액을 들 수 있고, 바람직하게는 염화칼슘 수용액이다.
상기 방법에서 사용하는 칼슘 이온을 포함하는 용액의 칼슘 이온 농도는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 1mM 내지 1M을 들 수 있고, 바람직하게는 5mM 내지 500mM이며, 보다 바람직하게는 10mM 내지 300mM이다.
상기 방법에서 사용하는 용매 또는 용액도 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 수돗물, 순수(예를 들어, 증류수, 이온 교환수, RO수, RO-EDI수 등), 초순수, 세포 배양용 배지, 인산 완충 생리 식염수(PBS), 생리 식염수 및 HEPES 완충액 등을 들 수 있고, 바람직하게는 초순수이다.
특정한 가교 알긴산 구조체로서는, 예를 들어 섬유상 구조체, 파이버, 비즈, 겔, 대략 구형의 겔 등을 들 수 있다. 바람직한 가교 알긴산 구조체는 안정성이 개선된 것이다. 또한, 가교 알긴산 구조체는 그 내부에 내용물을 유지하는 능력(내용물 유지성)을 갖고 있어도 된다.
알긴산 겔의 물성은, 경도, 탄성, 반발력, 단열력, 파단 시 응력 등의 물성값에 의해 조절하는 것이 가능하다.
6. 알긴산 유도체, 가교 알긴산 구조체의 생체 적합성
본 명세서에 있어서, 알긴산 유도체 또는 가교 알긴산 구조체는 생체 적합성을 갖는다. 본 명세서에 있어서, 생체 적합성이란, 생체용 재료(여기서는, 예를 들어 식 (HA-I) 및 식 (HA-II)로 표시되는 알긴산 유도체, 및 당해 양쪽 알긴산 유도체를 사용하여 제조된 가교 알긴산 구조체의 것을 의미함)와 생체간의 상호 작용, 상기 생체용 재료에 인접하는 조직의 국소적 반응, 또는 전신적 반응 등의 반응을 야기하지 않는 성질을, 생체 적합성(biocompatibility)을 갖는다고 한다.
본 명세서에 있어서, 알긴산 유도체 또는 가교 알긴산 구조체의 생체 적합성에 대해서는, 후술하는 생체 적합성에 관한 실시예에서 확인한다.
7. 가교 알긴산 구조체의 안정성
가교 알긴산 구조체의 안정성은, 예를 들어 겔 안정성을 측정하는 것, 투과성은 겔 투과율을 측정하거나 함으로써 확인할 수 있다.
[겔 안정성의 측정법]
용기에 넣은 가교 알긴산 구조체 겔에 인산 완충 생리 식염수(PBS)를 첨가하고, PBS 중에 누출된 알긴산의 농도(μg/mL)를 측정한다. 측정한 알긴산 농도를, 가교 알긴산 구조체 겔을 분해함으로써 얻은 전체 알긴산 농도로 나눈 값을 백분율로 나타낸 값을, 붕괴율로 한다. 겔 안정성은 구체적으로는, 후술하는 실시예에 기재된 방법에 의해 구할 수 있다.
본 명세서 중, 가교 알긴산 구조체의 겔 붕괴율은, 바람직하게는 0％ 내지 90％이며, 보다 바람직하게는 0％ 내지 70％이며, 더욱 바람직하게는 0％ 내지 50％이다. 가교 알긴산 구조체의 안정성은, 수용액 중에 누출되는 알긴산의 농도가 낮을수록, 즉 겔 붕괴율이 낮을수록, 안정성이 높은 것을 의미한다.
[겔 투과율의 측정법]
플루오레세인이소티오시아네이트-덱스트란을 내포한 가교 알긴산 구조체 겔을 제작하고, 용기에 넣은 상기 겔에 생리 식염수를 첨가하여, 생리 식염수 중에 누출된 덱스트란 농도를 측정한다. 측정한 덱스트란의 농도를, 플루오레세인이소티오시아네이트-덱스트란 내포 가교 알긴산 구조체 겔을 분해함으로써 얻은 전체 덱스트란 농도로 나눈 값을 백분율로 나타낸 값이 겔 투과율이다. 겔 투과율은 구체적으로는 후술하는 실시예에 기재된 방법에 의해 구할 수 있다.
가교 알긴산의 생리 식염수 첨가 24시간 후의 겔 투과율은, 예를 들어 분자량 200만의 덱스트란을 내포한 경우, 바람직하게는 0％ 내지 90％이며, 보다 바람직하게는 0％ 내지 70％이며, 더욱 바람직하게는 0％ 내지 50％이다. 또한, 분자량 15만의 덱스트란을 내포한 경우, 예를 들어 당해 가교 알긴산 구조체 겔의 사용 목적이 단백질이나 항체의 방출·산생이면, 바람직하게는 1％ 내지 100％이며, 보다 바람직하게는 10％ 내지 100％이며, 더욱 바람직하게는 30％ 내지 100％이다. 또한, 사용 목적이 면역 격벽이면, 바람직하게는 0％ 내지 90％이며, 보다 바람직하게는 0％ 내지 70％이며, 더욱 바람직하게는 0％ 내지 50％이다.
가교 알긴산 구조체의 투과성은, 투과율이 낮을수록, 내용물이나 겔외 물질의 투과성이 낮은 것을 의미하고, 투과율이 높을수록, 내용물이나 겔외 물질의 투과성이 높은 것을 의미한다.
겔의 투과율은, 사용하는 알긴산의 분자량, 농도, 알긴산에 도입하는 가교기의 종류나 도입률, 겔화에 사용하는 2가 금속 이온의 종류나 농도, 또는 이들의 조합에 의해 조정하는 것이 가능하다.
[내용물이 내포한 가교 알긴산 구조체 겔의 조제 방법]
예를 들어, 내용물로서 플루오레세인이소티오시아네이트-덱스트란을 내포한 가교 알긴산 구조체 겔은 이하의 방법으로 제조할 수 있다.
(1) 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)로 표시되는 알긴산 유도체의 용액과 플루오레세인이소티오시아네이트-덱스트란 용액을 혼화한다.
(2) (1)에서 얻어진 혼합 용액에, 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)로 표시되는 알긴산 유도체의 용액을 혼화한다.
((1)의 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)을 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)로 변경하는 경우, (2)의 식 (HA-II) 또는 식 (HB-II)은 식 (HA-I) 또는 식 (HB-I)로 변경하게 됨)
(3) (2)에서 얻어진 혼합 용액을, 칼슘 이온을 포함하는 용액 중에 적하하여 얻어진 겔이, 용액 중에서, 화학 가교 및 이온 가교를 형성함으로써, 플루오레세인이소티오시아네이트-덱스트란 내포의 가교 알긴산 구조체 겔이 얻어진다.
8. 알긴산 유도체의 합성 방법
식 (HA-I) 또는 식 (HA-II)로 표시되는 알긴산 유도체는, PCT/JP2019/023478(2019년 6월 13일 출원)을 참조함으로써 제조할 수 있다.
9. 알긴산 유도체, 가교 알긴산 구조체의 용도
알긴산 유도체는 전술한 바와 같이, 이식용 디바이스를 제작하는 데 사용할 수 있다. 이식용 디바이스 이외에도, 알긴산 유도체는 식품, 의료, 화장품, 섬유, 제지 등의 폭넓은 분야에서, 종래의 알긴산 대신에 사용할 수 있다. 알긴산 유도체 또는 가교 알긴산 구조체의 바람직한 용도로서는, 구체적으로는 창상 피복재, 수술 후 유착 방지재, 약제 서방용 기재, 세포 배양용 기재, 세포 이식용 기재 등의 의료용 재료를 들 수 있다.
의료용 재료로서 사용하는 경우의 가교 알긴산 구조체의 형상으로서, 튜브상, 섬유상, 파이버, 비즈, 겔, 대략 구형의 겔 등을 들 수 있고, 비즈, 겔 또는 대략 구형의 겔로 하는 것이 바람직하고, 대략 구형의 겔로 하는 것이 보다 바람직하다.
알긴산 유도체를 사용하는 특히 바람직한 양태의 이식용 디바이스는, 생체 적합성이나 안정성이 우수하고, 세포 독성도 적고, 이식 부위에 있어서의 유착이나 염증도 거의 없고, (반투막의 유무에 관계없이) 겔의 용해가 적어 형상이 장기간 유지되고, 장기간에 걸쳐 혈당 강하 작용을 지속시켜, 혈당을 조절하는 것이 가능해진다.
본 발명에 있어서의 치유율이란, 당뇨병 환자 또는 당뇨병 모델 동물에 대하여 인슐린 분비 세포 또는 췌도가 봉입된 하이드로겔, 또는 당해 하이드로겔을 포함하는 이식용 디바이스를 이식하고, 이식 후의 소정 기간 경과 시에 있어서, 이식예수에 대한 치료예수의 비율로 표시된다.
예를 들어, 실시예 7의 방법으로 얻은 복수의 당뇨병 모델 마우스에 대하여, 인슐린 분비 세포 또는 췌도가 봉입된 하이드로겔, 또는 당해 하이드로겔을 포함하는 이식용 디바이스를 이식하고, 이식 후의 소정 기간 중에 있어서, 혈당값이 300mg/dL 이하(단, 기간 중 3회까지는 300mg/dL를 초과하는 것을 허용함)일 경우를 치유 마우스로 하고, 당뇨병 모델 마우스에 대한 치유 마우스의 비율로 표시된다.
치유율은, 예를 들어 이식 후 2주일에 20％ 이상, 바람직하게는 35％ 이상, 보다 바람직하게는 50％ 이상이다. 또는 이식 후 1개월에 20％ 이상, 바람직하게는 35％ 이상, 보다 바람직하게는 50％ 이상이다.
본 발명에 있어서의 산소 투과율이란, 인슐린 분비 세포 또는 췌도가 봉입된 하이드로겔, 또는 당해 하이드로겔을 포함하는 이식용 디바이스의 표면 산소 농도를 100％로 한 경우의 중심부 산소 농도의 비율로 표시된다. 중심부란, 평판형 겔에 있어서는 세로 방향, 가로 방향 및 두께 방향의 모두가 대략 중앙부를 의미한다.
산소 투과율은 상기 하이드로겔 또는 디바이스를 측정함으로써 산출해도 되고, 계산에 의해 산출해도 된다. 측정에 의해 산출하는 경우에는, 예를 들어 PreSens사제 니들식 산소계(OXY-1 ST trace)를 사용하여, 표면 산소 농도와 중심부 산소 농도의 측정값으로부터 산출할 수 있다.
또한, 산소 투과율을 계산에 의해 산출하는 경우, 먼저, 하이드로겔을 공간 상의 직교 좌표계에 배치했을 때의 산소 농도의 반응 확산 방정식으로서 이하와 같이 된다.
Figure pct00062
그리고, QO2X=rO2(0차 반응)로 하고, 정상 상태((∂C/∂t)=0)에 있어서의 산소 농도 분포를 구하면, 이하의 식으로 표시된다.
Figure pct00063
그리고, x 방향을 x=iΔx, y 방향을 y=jΔy, z 방향을 z=kΔz로 등분할하고, 농도를 C(x, y, z)=Ci, j, k의 절점값으로 차분화함으로써, 다음 식을 얻고, 이러한 식에 의해 산출한다. 단, Δx=Δy=Δz=Δ로 한다.
Figure pct00064
산소 투과율은 0％가 아니면 되고, 예를 들어 1 내지 100％, 바람직하게는 10 내지 100％, 보다 바람직하게는 25 내지 100％, 더욱 바람직하게는 50 내지 100％, 특히 바람직하게는 75 내지 100％이다. 또한, 바람직하게는 25 내지 50％, 보다 바람직하게는 50 내지 75％, 특히 바람직하게는 75 내지 100％이다.
본 발명에 있어서의 물질 투과율이란, 인슐린 분비 세포 또는 췌도가 봉입된 하이드로겔, 또는 당해 하이드로겔을 포함하는 이식용 디바이스에 소정의 물질을 봉입하고, 교반한 용액 중에서 소정 시간 둔 후의 상기 하이드로겔 또는 이식용 디바이스로부터의 물질 투과율을 의미한다. 물질로서는, 글루코오스, 인슐린 등을 들 수 있다.
예를 들어, 인간 인슐린 500mg 또는 글루코오스 250mg을 하이드로겔 또는 이식용 디바이스에 봉입하고, 실온의 0.01 Tween20 함유 생리 식염수 40mL 중에서 24시간 교반한 경우의 인슐린 투과율 또는 글루코오스 투과율을 들 수 있다.
인슐린 투과율은 50％ 이상, 바람직하게는 70％ 이상, 보다 바람직하게는 80％ 이상이다. 또한, 글루코오스 투과율은 50％ 이상, 바람직하게는 70％ 이상, 보다 바람직하게는 80％ 이상이다.
본 발명의 하이드로겔은 소정 조건에서 진탕해도 파단, 분해 또는 용해가 없거나 적다. 예를 들어, 세로 10mm×가로 20mm×두께 0.1 내지 5mm 혹은 약 20 내지 1000mm3의 하이드로겔, 세로 10mm×가로 20mm×두께 100㎛ 이상 500㎛ 미만 혹은 약 20mm3 이상 내지 100mm3 미만의 하이드로겔, 또는 세로 10mm×가로 20mm×두께 250㎛ 혹은 약 50mm3의 하이드로겔을 3장 준비하고, 15mL 코니컬 튜브 중의 37℃의 생리 식염수 용액 12mL 중에 첨가하고, 진탕 배양기(예를 들어, 중형 항온 진탕 배양기(다이테크 가부시키가이샤, 바이오 셰이커(등록 상표) BR-43FL·MR))를 사용하여, 37℃로 유지한 채 왕복 진탕의 방식으로 진폭 25mm, 진탕 속도 180rpm의 조건에서 진탕했을 때에, 파단, 분해 또는 용해가 없거나 적다.
하이드로겔의 분해 또는 용해가 적다는 것은, 예를 들어 하이드로겔 중의 알긴산을 100％로 하고, 상기 조건에서 진탕했을 때에 용액 중에 용출된 알긴산의 비율을 붕괴율로 한 경우에, 붕괴율이 40％ 이하, 바람직하게는 20％ 이하, 보다 바람직하게는 10％ 이하인 경우를 말한다. 특히, 상기 조건에서 24시간 진탕했을 때에 용액 중에 용출된 알긴산의 비율을 붕괴율로 한 경우에, 붕괴율이 30％ 이하, 바람직하게는 20％ 이하, 보다 바람직하게는 10％ 이하인 경우를 말한다. 또한, 상기 조건에서 96시간 진탕했을 때에 용액 중에 용출된 알긴산의 비율을 붕괴율로 한 경우에, 붕괴율이 30％ 이하, 바람직하게는 20％ 이하, 보다 바람직하게는 10％ 이하인 경우를 말한다.
본 발명의 하이드로겔은 소정 조건에서 진탕해도 하이드로겔 중의 세포가 탈락되지 않거나 탈락이 적다. 예를 들어, 세로 10mm×가로 20mm×두께 0.1 내지 5mm 혹은 약 20 내지 1000mm3의 하이드로겔, 세로 10mm×가로 20mm×두께 100㎛ 이상 500㎛ 미만 혹은 약 20mm3 이상 내지 100mm3 미만의 하이드로겔, 또는 세로 10mm×가로 20mm×두께 250㎛ 혹은 약 50mm3의 하이드로겔(어느 경우도 세포가 봉입되어 있음)을 3장 준비하고, 15mL 코니컬 튜브 중의 37℃의 생리 식염수 용액 12mL 중에 첨가하고, 진탕 배양기(예를 들어, 중형 항온 진탕 배양기(다이테크 가부시키가이샤, 바이오 셰이커(등록 상표) BR-43FL·MR))를 사용하여, 37℃로 유지한 채 왕복 진탕의 방식으로 진폭 25mm, 진탕 속도 180rpm의 조건에서 진탕했을 때에, 세포의 하이드로겔로부터의 탈락이 없거나, 탈락이 적다.
세포의 하이드로겔로부터의 탈락이 적다는 것은, 예를 들어 시험 개시 시의 하이드로겔 중의 세포수를 100％로 하고, 상기 조건에서 진탕했을 때에 하이드로겔로부터 탈락되는 세포의 비율을 탈락율로 한 경우에, 탈락율이 30％ 이하, 바람직하게는 20％ 이하, 보다 바람직하게는 10％ 이하인 경우를 말한다. 특히, 상기 조건에서 24시간 진탕했을 때의 탈락율이 30％ 이하, 바람직하게는 20％ 이하, 보다 바람직하게는 10％ 이하인 경우를 말한다.
또한, 본 명세서에 기재한 모든 문헌 및 간행물은, 그 목적에 관계없이 참조에 의해 그 전체를 본 명세서에 원용하는 것으로 한다. 또한, 본 명세서는 일본 특허 출원 No.2019-122063(2019년 6월 28일 출원) 및 국제 특허 출원 No.PCT/JP2020/25324(2020년 6월 26일 출원)의 특허 청구 범위, 명세서 및 도면의 개시 내용을 참조하여 원용하는 것으로 한다.
또한, 본 발명의 목적, 특징, 이점 및 그 아이디어는, 본 명세서의 기재에 의해 당업자에게는 명확하고, 본 명세서의 기재로부터, 당업자라면 용이하게 본 발명을 실시할 수 있다. 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 구체적인 실시예 등은, 본 발명의 바람직한 실시 양태를 나타내는 것이며, 예시 또는 설명을 위해 나타내져 있는 것이며, 본 발명을 그들에 한정하는 것은 아니다. 본 명세서에서 개시되어 있는 본 발명의 의도 그리고 범위 내에서, 본 명세서의 기재에 기초하여, 다양하게 수식할 수 있는 것은, 당업자에 있어서 명확하다.
실시예
이어서, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위해 실시예, 시험예를 들지만, 이들 예는 단순한 실시예, 시험예이며, 본 발명을 한정하는 것은 아니고, 또한 본 발명의 범위를 일탈하지 않는 범위에서 변화시켜도 된다.
핵자기 공명 스펙트럼(NMR)의 측정에는, JEOL JNM-ECX400 FT-NMR(니혼 덴시)을 사용하였다. 액체 크로마토그래피-질량 분석 스펙트럼(LC-Mass)은 이하의 방법으로 측정하였다. [UPLC] Waters AQUITY UPLC 시스템 및 BEH C18 칼럼(2.1mm×50mm, 1.7㎛)(Waters)을 사용하고, 아세토니트릴:0.05％ 트리플루오로아세트산 수용액=5:95(0분) 내지 95:5(1.0분) 내지 95:5(1.6분) 내지 5:95(2.0분)의 이동상 및 구배 조건을 사용하였다.
1H-NMR 데이터 중, NMR 시그널의 패턴에서, s는 싱글렛, d는 더블렛, t는 트리플렛, q는 콰르텟, m은 멀티플렛, br은 브로드, J는 커플링 상수, Hz는 헤르츠, CDCl3은 중클로로포름, DMSO-D6은 중디메틸술폭시드, D2O는 중수를 의미한다. 1H-NMR 데이터 중, 수산기(OH), 아미노기(NH2), 카르복실기(COOH)의 프로톤 등, 브로드 밴드이기 때문에 확인을 할 수 없는 시그널에 대해서는, 데이터에 기재하고 있지 않다.
LC-Mass 데이터 중, M은 분자량, RT는 유지 시간, [M+H]+, [M+Na]+는 분자 이온 피크를 의미한다.
실시예 중의 「실온」은, 통상 약 0℃로부터 약 35℃의 온도를 나타내는 것으로 한다.
실시예 중의 반응성 치환기 도입률(몰％)은 1H-NMR(D2O)로부터 산출된 알긴산을 구성하는 단당(글루론산 및 만누론산) 단위의 몰수에 대한 도입된 반응성 치환기의 몰수 비율을 나타내는 것으로 한다.
실시예에 있어서, 반응성기 또는 상보적인 반응성기가 도입되기 전의 알긴산나트륨은, 상기 표 10에 기재되는 물성값을 나타내는 알긴산나트륨을 사용하였다.
표 12에는, (실시예 1) 내지 (실시예 4-2)에서 얻어진, 반응성기가 도입된 알긴산 유도체(실시예 1a, 실시예 2a)의 물성값(구체적으로는 반응성기 도입률(mol％), 분자량 및 중량 평균 분자량(만Da))을 나타낸다.
(실시예 1)
디벤조시클로옥틴-아미노기 도입 알긴산(실시예 1a, 실시예 1b, 실시예 1c, 실시예 1d 및 실시예 1e)의 합성:
Figure pct00065
(실시예 1a) 디벤조시클로옥틴-아미노기 도입 알긴산(EX1-(I)-A-2a)의 합성:
1중량％로 조제한 알긴산나트륨(모치다 세이야쿠 가부시키가이샤제: A-2) 수용액(43.6mL)에, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드(DMT-MM)(111.65mg), 1몰 농도-중조수(403.5μL)를 첨가하였다. 이 용액에, 시판되고 있는 디벤조시클로옥틴-아민[CAS: 1255942-06-3](EX1-SM, 83.62mg)의 에탄올 용액(2mL)을 적하하고, 실온에서 18시간 교반하였다. 염화나트륨(400mg)을 첨가한 후, 에탄올(87.2mL)을 첨가하여, 30분간 실온에서 교반하였다. 얻어진 침전을 여과 취출하고, 에탄올로 세정 후, 감압 건조시켜, 표기 화합물 EX1-(I)-A-2a(376mg)를 담황색 고체로서 얻었다.
반응성 치환기(디벤조시클로옥틴-아미노기)의 도입률은 6.9mol％(NMR 적분비)였다.
(실시예 1b) 디벤조시클로옥틴-아미노기 도입 알긴산(EX1-(I)-A-2b)의 합성:
1중량％로 조제한 알긴산나트륨(모치다 세이야쿠 가부시키가이샤제: A-2) 수용액(120mL)에, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드(DMT-MM)(330mg), 1몰 농도-중조수(300μL)를 첨가하였다. 이 용액에, 시판되고 있는 디벤조시클로옥틴-아민[CAS: 1255942-06-3](EX1-SM, 80mg)의 에탄올 용액(12mL)을 적하하고, 30℃에서 4시간 교반하였다. 염화나트륨(1.2g)을 첨가한 후, 에탄올(240mL)을 첨가하여, 30분간 실온에서 교반하였다. 얻어진 침전을 여과 취출하고, 에탄올로 세정 후, 감압 건조시켜, 표기 화합물 EX1-(I)-A-2b(1.19g)를 백색 고체로서 얻었다.
당해 백색 고체를 80mL의 물에 용해시키고, 동결 건조 후, 40℃에서 23시간 건조시켜, 표기 화합물 EX1-(I)-A-2b(1.2g)를 백색 비정질로서 얻었다.
반응성 치환기(디벤조시클로옥틴-아미노기)의 도입률은 5.0mol％(NMR 적분비)였다.
(실시예 1c) 디벤조시클로옥틴-아미노기 도입 알긴산(EX1-(I)-A-2c)의 합성:
1중량％로 조제한 알긴산나트륨(모치다 세이야쿠 가부시키가이샤제: A-2) 수용액(120mL)에, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드(DMT-MM)(167mg), 1몰 농도-중조수(151μL)를 첨가하였다. 이 용액에, 시판되고 있는 디벤조시클로옥틴-아민[CAS: 1255942-06-3](EX1-SM, 42mg)의 에탄올 용액(12mL)을 적하하고, 30℃에서 3.5시간 교반하였다. 염화나트륨(1.2g)을 첨가한 후, 에탄올(240mL)을 첨가하여, 30분간 실온에서 교반하였다. 얻어진 침전을 여과 취출하고, 에탄올로 세정 후, 감압 건조시켜, 표기 화합물 EX1-(I)-A-2c(1.2g)를 백색 고체로서 얻었다.
당해 백색 고체를 80mL의 물에 용해시키고, 동결 건조 후, 40℃에서 23시간 건조시켜, 표기 화합물 EX1-(I)-A-2c(1.15g)를 백색 비정질로서 얻었다.
반응성 치환기(디벤조시클로옥틴-아미노기)의 도입률은 2.3mol％(NMR 적분비)였다.
(실시예 1d) 디벤조시클로옥틴-아미노기 도입 알긴산(EX1-(I)-A-2d)의 합성:
1중량％로 조제한 알긴산나트륨(모치다 세이야쿠 가부시키가이샤제: A-2) 수용액(201mL)에, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드(DMT-MM)(281mg), 1몰 농도-중조수(253μL)를 첨가하였다. 이 용액에, 시판되고 있는 디벤조시클로옥틴-아민[CAS: 1255942-06-3](EX1-SM, 70mg)의 에탄올 용액(20mL)을 적하하고, 32℃에서 3시간 교반하였다. 염화나트륨(2.01g)을 첨가한 후, 에탄올(402mL)을 첨가하여, 30분간 실온에서 교반하였다. 얻어진 침전을 여과 취출하고, 에탄올로 세정 후, 감압 건조시켜, 표기 화합물 EX1-(I)-A-2d(1.94g)를 백색 고체로서 얻었다.
당해 백색 고체를 130mL의 물에 용해시키고, 동결 건조 후, 실온에서 2시간 건조시켜, 표기 화합물 EX1-(I)-A-2d(1.84g)를 백색 비정질로서 얻었다.
반응성 치환기(디벤조시클로옥틴-아미노기)의 도입률은 2.4mol％(NMR 적분비)였다.
(실시예 1e) 디벤조시클로옥틴-아미노기 도입 알긴산(EX1-(I)-A-2e)의 합성:
1중량％로 조제한 알긴산나트륨(모치다 세이야쿠 가부시키가이샤제: A-2) 수용액(250mL)에, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드(DMT-MM)(307mg), 1몰 농도-중조수(277μL)를 첨가하였다. 이 용액에, 시판되고 있는 디벤조시클로옥틴-아민[CAS: 1255942-06-3](EX1-SM, 77mg)의 에탄올 용액(25mL)을 첨가하고, 32℃에서 3시간 교반하였다. 반응액에, 염화나트륨(2.5g)을 첨가한 후, 에탄올(500mL)을 첨가하여, 30분간 실온에서 교반하였다. 얻어진 침전을 여과 취출하고, 에탄올로 세정 후, 감압 건조시켜, 표기 화합물 EX1-(I)-A-2e(2.42g)를 백색 고체로서 얻었다.
당해 백색 고체를 160mL의 물에 용해시키고, 동결 건조 후, 실온에서 2시간 건조시켜, 표기 화합물 EX1-(I)-A-2e(2.34g)를 백색 비정질로서 얻었다.
반응성 치환기(디벤조시클로옥틴-아미노기)의 도입률은 2.2mol％(NMR 적분비)였다.
(실시예 2)
4-(2-아미노에톡시)-N-(3-아지드프로필)벤즈아미드기 도입 알긴산(실시예 2a, 실시예 2b, 실시예 2c, 실시예 2d 및 실시예 2e)의 합성:
Figure pct00066
<공정 1> 메틸4-(2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)에톡시)벤조에이트(화합물 EX2-IM-1)의 합성:
Figure pct00067
트리페닐포스핀(0.96g)의 테트라히드로푸란(2.59mL) 용액에, 빙랭 교반 하에, 아조디카르복실산디에틸(40％ 톨루엔 용액, 1.92mL) 용액을 첨가하고, 실온에서 20분간 교반하였다. 이 용액에 대하여, 빙랭 교반 하에 시판되고 있는 4-히드록시벤조산메틸[CAS: 99-76-3](화합물 EX2-SM, 0.37g) 및 2-(tert-부톡시카르보닐)에탄올아민[CAS: 26690-80-2](0.39g)의 테트라히드로푸란(1.1mL) 용액을 첨가하고, 실온에서 17시간 교반하였다. 반응액을 감압 하 농축하고, 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(5％ 아세트산에틸/n-헵탄 내지 40％ 아세트산에틸/n-헵탄)에 의해 정제하여, 화합물 1과 화합물 2의 혼합물을 얻었다. 이 혼합물을 메틸tert-부틸에테르(20mL)에 용해시켜, 1 N-수산화나트륨 수용액(5mL)으로 2회, 포화 식염수(5mL)로 순차 세정하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후, 감압 하에서 용매를 증류 제거하여, 화합물 EX2-IM-1(0.45g)을 핑크색의 오일상 물질로서 얻었다.
NMR 데이터(CDCl3)(δ: ppm): 7.98(2H, d, J=8.8Hz), 6.90(2H, d, J=8.8Hz), 4.97(1H, brs), 4.07(2H, t, J=5.2Hz), 3.88(3H, s), 3.56(2H, q, J=5.2Hz), 1.45(9H, s)
<공정 2> 4-(2-아미노에톡시)-N-(3-아지드프로필)벤즈아미드염산염(화합물 EX2-IM-3)의 합성:
Figure pct00068
(실시예 2) <공정 1>에서 얻어진 화합물 EX2-IM-1(0.44g)의 메탄올(4.4mL) 용액에 수산화리튬1수화물(0.25g)을 첨가하고, 60℃에서 3시간 30분 교반하였다. 반응액에 1 N-염산(5mL)을 첨가하고, 아세트산에틸(10mL)로 3회 추출하였다. 유기층을 물(5mL), 포화 식염수(5mL)로 순차 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 잔류물을 아세토니트릴(4.4mL)에 용해시켜, 3-아지드프로판-1-아민[CAS: 88192-19-2](0.15g)과 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄헥사플루오로인산염(0.57g)을 첨가하였다. 계속해서, 빙랭 교반 하에, N,N-디이소프로필에틸아민(0.52mL)을 첨가하고, 실온에서 5시간 교반하였다. 반응액에 대하여 물(10mL)을 첨가하고, 아세트산에틸(15mL)로 3회 추출하고, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(16％ 아세트산에틸/n-헵탄 내지 100％ 아세트산에틸)에 의해 정제하여, 화합물 EX2-IM-2(0.71g)를 포함하는 분획을 얻었다.
화합물 EX2-IM-2를 포함하는 분획(0.71g)에 대하여, 4 N-염화수소/1,4-디옥산(4.9mL)을 첨가하고, 실온에서 20분간 교반하였다. 반응액에 디이소프로필에테르를 첨가한 후, 석출물을 여과함으로써, 표기 화합물 EX2-IM-3(0.49g)을 백색 고체로서 얻었다.
NMR 데이터(CDCl3)(δ: ppm): 7.60(2H, d, J=8.8Hz), 6.93(2H, d, J=8.8Hz), 4.19(2H, t, J=4.8Hz), 3.31-3.29(6H, m), 1.77-1.71(2H, m). LC-MS: M(자유 아민)=263, RT=0.54(분), [M+H]+=264
(실시예 2a) 4-(2-아미노에톡시)-N-(3-아지드프로필)벤즈아미드기 도입 알긴산(화합물 EX2-(II)-A-2a)의 합성:
Figure pct00069
1중량％로 조제한 알긴산나트륨(모치다 세이야쿠 가부시키가이샤제: A-2) 수용액(19.6mL)에, 빙랭 교반 하에, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드(DMT-MM)(50.19mg), (실시예 2) <공정 2>에서 얻어진 화합물 EX2-IM-3(54.37mg), 1몰 농도-중조수(181.4μL)를 첨가하고, 실온에서 5시간 교반하였다. 염화나트륨(200mg)을 첨가한 후, 에탄올(39.2mL)을 첨가하여, 30분간 실온에서 교반하였다. 얻어진 침전을 여과 취출하고, 에탄올로 세정 후, 감압 건조시켜, 표기 화합물 EX2-(II)-A-2a(198mg)를 백색 고체로서 얻었다.
반응성 치환기(4-(2-아미노에톡시)-N-(3-아지드프로필)벤즈아미드기)의 도입률은 6.1mol％(NMR 적분비)였다.
(실시예 2b) 4-(2-아미노에톡시)-N-(3-아지드프로필)벤즈아미드기 도입 알긴산(화합물 EX2-(II)-A-2b)의 합성:
Figure pct00070
1중량％로 조제한 알긴산나트륨(모치다 세이야쿠 가부시키가이샤제: A-2) 수용액(120mL)에, 빙랭 교반 하에, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드(DMT-MM)(330mg), (실시예 2) <공정 2>에서 얻어진 화합물 EX2-IM-3(90mg), 1몰 농도-중조수(450μL)를 첨가하고, 30℃에서 4시간 교반하였다. 염화나트륨(1.2g)을 첨가한 후, 에탄올(240mL)을 첨가하여, 30분간 실온에서 교반하였다. 얻어진 침전을 여과 취출하고, 에탄올로 세정 후, 감압 건조시켜, 표기 화합물 EX2-(II)-A-2b(1.22g)를 백색 고체로서 얻었다.
당해 백색 고체를 80mL의 물에 용해시키고, 동결 건조 후, 40℃에서 23시간 건조시켜, 표기 화합물 EX3-(II)-A-2b(1.19g)를 백색 비정질로서 얻었다.
반응성 치환기(4-(2-아미노에톡시)-N-(3-아지드프로필)벤즈아미드기)의 도입률은 4.9mol％(NMR 적분비)였다.
(실시예 2c) 4-(2-아미노에톡시)-N-(3-아지드프로필)벤즈아미드기 도입 알긴산(화합물 EX2-(II)-A-2c)의 합성:
Figure pct00071
1중량％로 조제한 알긴산나트륨(모치다 세이야쿠 가부시키가이샤제: A-2) 수용액(120mL)에, 빙랭 교반 하에, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드(DMT-MM)(167mg), (실시예 2) <공정 2>에서 얻어진 화합물 EX2-IM-3(45mg), 1몰 농도-중조수(227μL)를 첨가하고, 30℃에서 3.5시간 교반하였다. 염화나트륨(1.2g)을 첨가한 후, 에탄올(240mL)을 첨가하여, 30분간 실온에서 교반하였다. 얻어진 침전을 여과 취출하고, 에탄올로 세정 후, 감압 건조시켜, 표기 화합물 EX2-(II)-A-2c(1.22g)를 백색 고체로서 얻었다.
당해 백색 고체를 80mL의 물에 용해시키고, 동결 건조 후, 40℃에서 22시간 건조시켜, 표기 화합물 EX2-(II)-A-2c(1.15g)를 백색 비정질로서 얻었다.
반응성 치환기(4-(2-아미노에톡시)-N-(3-아지드프로필)벤즈아미드기)의 도입률은 2.3mol％(NMR 적분비)였다.
(실시예 2d) 4-(2-아미노에톡시)-N-(3-아지드프로필)벤즈아미드기 도입 알긴산(화합물 EX2-(II)-A-2d)의 합성:
Figure pct00072
1중량％로 조제한 알긴산나트륨(모치다 세이야쿠 가부시키가이샤제: A-2) 수용액(220mL)에, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드(DMT-MM)(307mg), (실시예 2) <공정 2>에서 얻어진 화합물 EX2-IM-3(83mg), 1몰 농도-중조수(416μL)를 첨가하고, 32℃에서 3시간 교반하였다. 염화나트륨(2.2g)을 첨가한 후, 에탄올(440mL)을 첨가하여, 30분간 실온에서 교반하였다. 얻어진 침전을 여과 취출하고, 에탄올로 세정 후, 감압 건조시켜, 표기 화합물 EX2-(II)-A-2d(2.13g)를 백색 고체로서 얻었다.
당해 백색 고체를 130mL의 물에 용해시키고, 동결 건조 후, 실온에서 2시간 건조시켜, 표기 화합물 EX2-(II)-A-2d(1.99g)를 백색 비정질로서 얻었다.
반응성 치환기(4-(2-아미노에톡시)-N-(3-아지드프로필)벤즈아미드기)의 도입률은 2.3mol％(NMR 적분비)였다.
(실시예 2e) 4-(2-아미노에톡시)-N-(3-아지드프로필)벤즈아미드기 도입 알긴산(화합물 EX2-(II)-A-2e)의 합성:
Figure pct00073
1중량％로 조제한 알긴산나트륨(모치다 세이야쿠 가부시키가이샤제: A-2) 수용액(270mL)에, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드(DMT-MM)(377mg), (실시예 2) <공정 2>에서 얻어진 화합물 EX2-IM-3(102mg), 1몰 농도-중조수(511μL)를 첨가하고, 32℃에서 3시간 교반하였다. 반응액에, 염화나트륨(2.7g)을 첨가한 후, 에탄올(540mL)을 첨가하여, 30분간 실온에서 교반하였다. 얻어진 침전을 여과 취출하고, 에탄올로 세정 후, 감압 건조시켜, 표기 화합물 EX2-(II)-A-2e(2.60g)를 백색 고체로서 얻었다.
당해 백색 고체를 160mL의 물에 용해시키고, 동결 건조 후, 실온에서 2시간 건조시켜, 표기 화합물 EX2-(II)-A-2e(2.56g)를 백색 비정질로서 얻었다.
반응성 치환기(4-(2-아미노에톡시)-N-(3-아지드프로필)벤즈아미드기)의 도입률은 2.4mol％(NMR 적분비)였다.
(실시예 3)
N-(4-(아미노에틸)벤질)-2-(시클로옥트-2-인-1-일옥시)아세트아미드기 도입 알긴산(실시예 3a, 실시예 3b 및 실시예 3c)의 합성:
Figure pct00074
<공정 1> tert-부틸(4-(4((2,2,2-트리플루오로아세트아미드)메틸)벤질)카르바메이트(화합물 EX3-IM-1)의 합성:
Figure pct00075
문헌 공지된 방법(Bioorganic & Medicinal Chemistry(2003) 11: 4189-4206)을 참고로, 1,4-비스(아미노메틸)벤젠[CAS: 539-48-0]으로부터 합성한 tert-부틸(4-(아미노에틸)벤질)카르바메이트[CAS: 108468-80-4](EX3-SM1, 0.67g), 트리에틸아민(0.39mL) 및 메탄올(6.67mL)의 혼합물에 대하여, 빙랭 교반 하에 트리플루오로아세트산에틸(0.44mL)을 적하하였다. 반응 혼합물을 실온으로 승온하고, 동온에서 5시간 교반하였다. 반응을 물(10mL)로 정지하고, 아세트산에틸(10mL)로 3회 추출하였다. 회수한 유기층을 포화 식염수(5mL)로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조시킨 유기층을 여과 후, 농축하여, 표기 조화합물 EX3-IM-1(0.671g)을 담황색 비정질로서 얻었다.
NMR 데이터(CDCl3)(δ: ppm): 7.29(2H, d, J=8.4Hz), 7.25(2H, d, J=7.6Hz), 6.51(1H, brs), 4.86(1H, brs), 4.51(2H, d, J=5.2Hz), 4.31(2H, d, J=6.0Hz), 1.46(9H, s). LC-MS: M=332, RT=0.97(분), [M+Na]+=355.
<공정 2> N-(4-(아미노에틸)벤질)-2,2,2-트리플루오로아세트아미드염산염(화합물 EX3-IM-2)의 합성:
Figure pct00076
(실시예 3) <공정 1>에서 얻어진 화합물 EX3-IM-1(0.5g)의 1,4-디옥산 용액(3.5mL)에 대하여 수랭 교반 하에, 4 N-염화수소/1,4-디옥산(3.5mL)을 첨가하고, 실온에서 3시간 교반하였다. 반응액에 디이소프로필에테르(40mL)를 첨가한 후, 석출물을 여과함으로써, 표기 화합물 EX3-IM-2(0.36g)를 백색 고체로서 얻었다.
NMR 데이터(D2O)(δ: ppm): 7.29(2H, d, J=8.0Hz), 7.25(2H, d, J=8.4Hz), 4.38(2H, s), 4.02(2H, s). LC-MS: M(자유 아민)=232, RT=0.53(분), [M+H]+=233.
<공정 3> N-(4-((2-(시클로옥트-2-인-1-일옥시)아세트아미드)메틸)벤질)-2,2,2-트리플루오로아세트아미드(화합물 EX3-IM-3)의 합성:
Figure pct00077
문헌 공지된 방법(Org. Process Res. Dev.(2018) 22: 108-110)에 따라서, 시클로헵텐[CAS: 628-92-2]으로부터 합성한 카르복실산[CAS: 917756-42-4](EX3-SM2, 0.17g) 및 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄헥사플루오로인산염(0.26g)의 아세토니트릴(1.7mL) 용액에 대하여, 빙랭 교반 하에, (실시예 3) <공정 2>에서 얻어진 EX3-IM-2(0.26g) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(0.51mL)을 적하하고, 실온에서 1시간 30분 교반하였다. 물(5mL)을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 아세트산에틸(5mL)로 3회 추출하였다. 유기층을 포화 식염수(3mL)로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 건조시킨 유기층을 여과 후, 감압 하에서 용매를 증류 제거하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(12％ 아세트산에틸/n-헵탄 내지 100％ 아세트산에틸)에 의해 정제하여, 표기 화합물 EX3-IM-3(0.189g)을 백색 비정질로서 얻었다.
NMR 데이터(CDCl3)(δ: ppm): 7.31(2H, d, J=8.4Hz), 7.26(2H, d, J=8.0Hz, 용매 피크와 오버랩됨), 6.84(1H, brs), 6.52(1H, brs), 4.52(2H, d, J=6.0Hz), 4.49(2H, d, J=6.4Hz), 4.26-4.23(1H, m), 4.11(1H, d, J=15.2Hz), 3.94(1H, d, J=15.2Hz), 2.26-2.09(3H, m), 2.00-1.58(6H, m), 1.48-1.44(1H, m). LC-MS: M=396, RT=0.99(분), [M+H]+=397.
<공정 4> N-(4-(아미노메틸)벤질)-2-(시클로옥트-2-인-1-일옥시)아세트아미드(화합물 EX3-IM-4)의 합성:
Figure pct00078
(실시예 3) <공정 3>에서 얻어진 화합물 EX3-IM-3(0.18g) 및 메탄올(1.8mL)의 혼합물에 대하여, 빙랭 교반 하에 탄산칼륨(0.126g) 수용액(0.9mL)을 적하하고, 실온에서 17시간 30분 교반하였다. 메탄올을 감압 하에서 증류 제거하고, 아세트산에틸(5mL)로 3회 추출하였다. 유기층을 포화 식염수(5mL)로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 유기층을 여과 후, 감압 하에서 용매를 증류 제거하여, 표기 조화합물 EX3-IM-4(0.13g)를 담황색 유상물로서 얻었다.
NMR 데이터(CDCl3)(δ: ppm): 7.28-7.28(4H, m), 6.80(1H, brs), 4.48(2H, d, J=6.0Hz), 4.26-4.21(1H, m), 4.11(1H, d, J=15.2Hz), 3.93(1H, d, J=15.2Hz), 3.86(2H, s), 2.28-2.07(3H, m), 1.99-1.40(7H, m, 용매 피크와 오버랩됨). LC-MS: M=300, RT=0.68(분), [M+H]+=301.
(실시예 3a) N-(4-(아미노메틸)벤질)-2-(시클로옥트-2-인-1-일옥시)아세트아미드기 도입 알긴산(EX3-(I)-A-2a)의 합성:
Figure pct00079
1중량％로 조정한 알긴산나트륨(모치다 세이야쿠 가부시키가이샤제, A-2) 수용액(60mL)에, 실온 교반 하에, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드(DMT-MM)(183mg)를 첨가하였다. 계속해서, (실시예 3) <공정 4>에서 얻어진 화합물 EX3-IM-4(41.2mg)의 에탄올(5mL) 용액을 동온에서 적하하고, 40℃에서 4시간 교반하였다. 실온에 냉각 후, 염화나트륨(600mg)을 첨가한 후, 에탄올(119mL)을 첨가하고, 30분간 교반하였다. 얻어진 침전을 여과 취출하고, 에탄올(5mL)로 3회 세정 후, 감압 하 건조시켜, 표기 화합물 EX3-(I)-A-2a를 백색 고체로서 얻었다. 당해 백색 고체를 40mL의 물에 용해시키고, 동결 건조 후, 40℃에서 22시간 건조시켜, 표기 화합물 EX3-(I)-A-2a(597mg)를 백색 면상물로서 얻었다.
반응성 치환기(N-(4-(아미노메틸)벤질)-2-(시클로옥트-2-인-1-일옥시)아세트아미드기)의 도입률은 3.7mol％(NMR 적분비)였다.
(실시예 3b) N-(4-(아미노메틸)벤질)-2-(시클로옥트-2-인-1-일옥시)아세트아미드기 도입 알긴산(EX3-(I)-A-2b)의 합성:
Figure pct00080
1중량％로 조정한 알긴산나트륨(모치다 세이야쿠 가부시키가이샤제, A-2) 수용액(290mL)에, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드(DMT-MM)(405mg), (실시예 3) <공정 4>에서 얻어진 화합물 EX3-IM-4(121mg)의 에탄올(29mL) 용액, 1몰 농도-중조수(366μL)를 첨가하고, 32℃에서 3시간 20분 교반하였다. 염화나트륨(2.9g)을 첨가한 후, 에탄올(580mL)을 첨가하여, 30분간 실온에서 교반하였다. 얻어진 침전을 여과 취출하고, 에탄올로 세정 후, 감압 건조시켜, 표기 화합물 EX3-(I)-A-2b(2.67g)를 백색 고체로서 얻었다.
당해 백색 고체를 180mL의 물에 용해시키고, 동결 건조 후, 40℃에서 6시간 건조 후, 한번 냉장 보존하였다. 다시 40℃에서 5시간 건조시켜, 표기 화합물 EX3-(I)-A-2b(2.77g)를 백색 비정질로서 얻었다.
반응성 치환기(N-(4-(아미노메틸)벤질)-2-(시클로옥트-2-인-1-일옥시)아세트아미드기)의 도입률은 2.1mol％(NMR 적분비)였다.
(실시예 3c) N-(4-(아미노메틸)벤질)-2-(시클로옥트-2-인-1-일옥시)아세트아미드기 도입 알긴산(EX3-(I)-A-2c)의 합성:
Figure pct00081
1중량％로 조정한 알긴산나트륨(모치다 세이야쿠 가부시키가이샤제, A-2) 수용액(260mL)에, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드(DMT-MM)(363mg), (실시예 3) <공정 4>에서 얻어진 화합물 EX3-IM-4(109mg)의 에탄올(26mL) 용액, 1몰 농도-중조수(328μL)를 첨가하고, 32℃에서 3시간 교반하였다. 반응액에, 염화나트륨(2.6g)을 첨가한 후, 에탄올(520mL)을 첨가하여, 30분간 실온에서 교반하였다. 얻어진 침전을 여과 취출하고, 에탄올로 세정 후, 감압 건조시켜, 표기 화합물 EX3-(I)-A-2c(2.69g)를 백색 고체로서 얻었다.
당해 백색 고체를 180mL의 물에 용해시키고, 동결 건조 후, 40℃에서 2.5시간 건조시켜, 표기 화합물 EX3-(I)-A-2c(2.42g)를 백색 비정질로서 얻었다.
반응성 치환기(N-(4-(아미노메틸)벤질)-2-(시클로옥트-2-인-1-일옥시)아세트아미드기)의 도입률은 2.0mol％(NMR 적분비)였다.
(실시예 4)
N-(2-아미노에틸)-4-아지도벤즈아미드기 도입 알긴산(실시예 4)의 합성:
Figure pct00082
<공정 1> tert-부틸(2-(4-아지도벤즈아미드)에틸)카르바메이트(화합물 EX4-IM-1)의 합성:
Figure pct00083
4-아지도벤조산(EX4-SM, [CAS: 6427-66-3] 700mg)에, 염화티오닐(783μL), N,N-디메틸포름아미드(3μL)를 첨가하고, 70℃에서 1시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔류물에 염화메틸렌(1mL)을 첨가하여 공비하고, 마찬가지의 조작을 다시 행하였다. 얻어진 담황색 고체의 염화메틸렌(3mL) 용액에 대하여, tert-부틸(2-아미노에틸)카르바메이트[CAS: 57260-73-8](825mg), 피리딘(1.04mL)의 염화메틸렌(7.0mL) 용액에 빙수랭 하에 첨가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 tert-부틸메틸에테르(30mL)로 희석하고, 물(10mL), 포화 중층수(5mL), 0.5 N-시트르산(5mL로 2회), 물(5mL), 포화 식염수(5mL)로 순차 세정하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 감압 농축하였다. 잔류물을 tert-부틸메틸에테르/헵탄으로 트리틸레이트하고, 고체를 여과한 후, tert-부틸메틸에테르/헵탄으로 세정하여, 표기 화합물 EX4-IM-1(1.1g)을 백색 고체로서 얻었다.
NMR 데이터(CDCl3)(δ: ppm): 7.83(2H, d, J=8Hz), 7.26(1H, brs), 7.05(2H, d, J=8Hz), 4.97(1H, brs), 3.55(2H, q, J=5Hz), 3.45-3.37(2H, m), 1.43(9H, s), LC-MS: M=305, RT=0.90(분), [M+H]+=306, [M+Na]+=328
<공정 2> N-(2-아미노에틸)-4-아지도벤즈아미드염산염(화합물 EX4-IM-2)의 합성:
Figure pct00084
(실시예 4) <공정 1>에서 얻어진 화합물(EX4-IM-1, 500mg)을 1,4-디옥산(1.5mL)에 현탁시켰다. 빙수랭 하에 4 N-염화수소/디옥산 용액(3.5mL)을 첨가하고, 실온에서 2.5시간 교반하였다. 반응액에 디이소프로필에테르(10.5mL)를 첨가하고, 실온에서 50분간 교반하였다. 고체를 여과하고, 디이소프로필에테르로 세정 후, 감압 건조시켜, 표기 화합물 EX4-IM-2(365mg)을 옅은 베이지색 고체로서 얻었다.
NMR 데이터(DMSO-d6)(δ: ppm): 8.68(1H, t, J=6Hz), 7.93(2H, d, J=9Hz), 7.82(1H, brs), 7.22(2H, d, J=9Hz), 3.49(2H, q, J=6Hz), 2.97(2H, t, J=6Hz), LC-MS: M(자유 아민)=205, RT=0.56(분), [M+H]+=206
<공정 3-1> N-(2-아미노에틸)-4-아지도벤즈아미드기 도입 알긴산(EX4-(II)-A2)의 합성:
Figure pct00085
1중량％로 조제한 알긴산나트륨(모치다 세이야쿠 가부시키가이샤제: A-2) 수용액(60mL)에, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드(DMT-MM)(167mg), (실시예 4) <공정 2>에서 얻어진 화합물 EX4-IM-2(37mg), 1몰 농도-중조수(227μL)를 첨가하고, 30℃에서 3.5시간 교반하였다. 염화나트륨(600mg)을 첨가한 후, 에탄올(120mL)을 첨가하여, 30분간 실온에서 교반하였다. 얻어진 침전을 여과 취출하고, 에탄올로 세정 후, 감압 건조시켜, 표기 화합물 EX4-(II)-A-2(615mg)를 백색 분말로서 얻었다.
당해 백색 고체를 40mL의 물에 용해시키고, 동결 건조 후, 40℃에서 22시간 건조시켜, 표기 화합물 EX4-(II)-A-2(583mg)를 백색 비정질로서 얻었다.
반응성기(N-(2-아미노에틸)-4-아지도벤즈아미드기)의 도입률은 5.3mol％(NMR 적분비)였다.
(실시예 4-2)
N-(2-(2-아미노에톡시)에틸)-4-아지도벤즈아미드기 도입 알긴산(실시예 4-2a 및 실시예 4-2b)의 합성:
Figure pct00086
<공정 1> tert-부틸(2-(2-(4-아지도벤즈아미드)에톡시)에틸)카르바메이트(화합물 EX4-2-IM-1)의 합성:
Figure pct00087
4-아지도벤조산[CAS: 6427-66-3](EX4-SM, 300mg), tert-부틸(2-(2-아미노에톡시)에틸)카르바메이트[CAS: 127828-22-2](376mg)를 아세토니트릴(6.0mL)에 용해시켰다. O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄헥사플루오로인산염(0.77g), 디이소프로필에틸아민(707μL)을 첨가하고, 실온에서 16시간 교반하였다. 반응액에 아세트산에틸(20mL), 물(10mL)을 첨가하고 분액하였다. 유기층을 물(10mL), 포화 식염수(5mL)로 순차 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조 후, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(20％ 아세트산에틸/n-헵탄 내지 70％ 아세트산에틸/n-헵탄)로 정제하여, 표기 화합물 EX4-2-IM-1(673mg)을 담황색 검상물로서 얻었다.
NMR 데이터(CDCl3)(δ: ppm): 7.83(2H, d, J=9Hz), 7.08(2H, d, J=9Hz), 6.61(1H, brs), 4.84(1H, brs), 3.68-3.64(4H, m), 3.56(2H, t, J=5Hz), 3.34(2H, q, J=5Hz), 1.44(9H, s)
<공정 2> N-(2-(2-아미노에톡시)에틸)-4-아지도벤즈아미드염산염(화합물 EX4-2-IM-2)의 합성:
Figure pct00088
(실시예 4-2) <공정 1>에서 얻어진 화합물(EX4-2-IM-1, 670mg)에, 빙수랭 하에 4 N-염화수소/1,4-디옥산(4.7mL)을 첨가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 반응액에 디이소프로필에테르(14mL)를 첨가하고, 30분간 교반하였다. 얻어진 고체를 여과 취출하고, 디이소프로필에테르로 세정 후, 감압 건조시켜, 표기 화합물 EX4-2-IM-2(604mg)를 옅은 베이지색 고체로서 얻었다.
NMR 데이터(DMSO-d6)(δ: ppm): 8.61(1H, t, J=6Hz), 7.95(3H, brs), 7.93(2H, d, J=9Hz), 7.20(2H, d, J=9Hz), 3.62(2H, t, J=5Hz), 3.57(2H, t, J=6Hz), 3.46(2H, q, J=6Hz), 3.02-2.93(2H, m), LC-MS(자유 아민): RT=0.57(분), [M+H]+=250
(실시예 4-2a) N-(2-(2-아미노에톡시)에틸)-4-아지도벤즈아미드기 도입 알긴산(EX4-2-(II)-A-2a)의 합성:
Figure pct00089
1중량％로 조제한 알긴산나트륨(모치다 세이야쿠 가부시키가이샤제: A-2) 수용액(118mL)에, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드(DMT-MM)(366.09mg), 1몰 농도-중조수(274.51μL)를 첨가하였다. 계속해서, (실시예 4-2) <공정 2>에서 얻어진 화합물 EX4-2-IM-2(78.44mg)의 물(1mL) 및 에탄올(1mL) 용액을 실온에서 첨가하고, 40℃에서 4시간 교반하였다. 염화나트륨(1.2g)을 실온에서 첨가한 후, 에탄올(237mL)을 첨가하여, 30분간 실온에서 교반하였다. 얻어진 침전을 여과 취출하고, 에탄올로 세정 후, 감압 건조시켜, 표기 화합물 EX4-2-(II)-A-2a(1.17g)를 백색 고체로서 얻었다.
당해 백색 고체를 80mL의 물에 용해시키고, 동결 건조시켜, 표기 화합물 EX4-2-(II)-A-2a(1.14g)를 백색 면상물로서 얻었다.
반응성기(N-(2-(2-아미노에톡시)에틸)-4-아지도벤즈아미드기)의 도입률은 2.72mol％(NMR 적분비)였다.
(실시예 4-2b) N-(2-(2-아미노에톡시)에틸)-4-아지도벤즈아미드기 도입 알긴산(EX4-2-(II)-A-2b)의 합성:
Figure pct00090
1중량％로 조제한 알긴산나트륨(모치다 세이야쿠 가부시키가이샤제: A-2) 수용액(200mL)에, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드(DMT-MM)(279mg), 1몰 농도-중조수(378μL)를 첨가하였다. 계속해서, (실시예 4-2) <공정 2>에서 얻어진 화합물 EX4-2-IM-2(77mg)를 실온에서 첨가하고, 32℃에서 3.25시간 교반하였다. 반응액에, 염화나트륨(2.0g)을 실온에서 첨가한 후, 에탄올(400mL)을 첨가하여, 30분간 실온에서 교반하였다. 얻어진 침전을 여과 취출하고, 에탄올로 세정 후, 감압 건조시켜, 표기 화합물 EX4-2-(II)-A-2b(1.93g)를 백색 고체로서 얻었다.
당해 백색 고체를 130mL의 물에 용해시키고, 동결 건조시켜, 표기 화합물 EX4-2-(II)-A-2b(1.85g)를 백색 비정질로서 얻었다.
반응성기(N-(2-(2-아미노에톡시)에틸)-4-아지도벤즈아미드기)의 도입률은 2.3mol％(NMR 적분비)였다.
[표 10]
Figure pct00091
[반응성기 또는 상보적인 반응성기의 도입률 측정]
반응성기 또는 상보적인 반응성기 도입률은, 알긴산의 반복 단위인 우론산 단당 단위당 도입된 반응성기 또는 상보적인 반응성기의 수를 백분율로 나타낸 값을 의미한다.
본 실시예에서는, 반응성기 또는 상보적인 반응성기 도입률(mol％)은 1H-NMR의 적분비에 의해 계산하였다. 또한, 도입률의 산출에 필요한 알긴산의 양은, 검량선을 이용한 카르바졸 황산법에 의해 측정하고, 반응성기 또는 상보적인 반응성기의 양은, 검량선을 이용한 흡광도 측정법에 의해 측정할 수도 있다.
[분자량의 측정]
실시예에서 얻어진 반응성기 또는 상보적인 반응성기가 도입된 알긴산 고체를 0.15mol/L의 NaCl을 포함하는 10mmol/L 인산 완충액(pH 7.4)에 용해시켜 0.1％ 용액을 조제하고, 구멍 직경 0.22㎛의 폴리에테르술폰제 여과 필터(Minisart High Flow Filter, Sartorius사)를 통과시켜 불용물을 제거한 후, 겔 여과용 샘플로 하였다. 각 샘플의 스펙트럼을 분광 광도계 DU-800(Beckman-Coulter사)에 의해 측정하고, 각 화합물의 겔 여과에 있어서의 측정 파장을 결정하였다. 특이적인 흡수 파장을 갖지 않는 화합물에 대해서는, 시차 굴절계를 사용하였다.
겔 여과용 샘플에 200μL를 Superose6 Increase10/300 GL 칼럼(GE 헬스케어 사이언스사)에 제공하였다. 겔 여과는, 크로마토그래프 장치로서 AKTA Explorer 10S를, 전개 용매로서 0.15mol/L NaCl을 포함하는 10mmol/L 인산 완충액(pH 7.4)을 사용하고, 실온에서 유속 0.8mL/mim의 조건으로 실시하였다. 샘플의 용출 프로파일은 각 화합물로 결정한 파장의 흡수를 모니터하여 제작하였다. 얻어진 크로마토그램은 Unicorn5.31 소프트웨어(GE 헬스케어 사이언스사)로 해석하여, 피크 범위를 결정하였다.
반응성기 또는 상보적인 반응성기가 도입된 알긴산의 분자량은, 블루 덱스트란(분자량 200만Da, SIGMA사), 티로글로불린(분자량 66.9만Da, GE 헬스케어 사이언스사) 페리틴(분자량 44만Da, GE 헬스케어 사이언스사) 알돌라아제(분자량 15.8만Da, GE 헬스케어 사이언스사), 콘알부민(분자량 7.5만Da, GE 헬스케어 사이언스사), 오브알부민(분자량 4.4만Da, GE 헬스케어 사이언스사), 리보뉴클레아제 A(분자량 1.37만Da, GE 헬스케어 사이언스사) 및 아프로티닌(분자량 6500Da, GE 헬스케어 사이언스사)을 표준품으로서 사용하고, 반응성기 또는 상보적인 반응성기가 도입된 알긴산과 동일 조건에서 겔 여과를 행하고, 각 성분의 용출액량을 Unicorn 소프트웨어로 결정하였다. 이 각 성분의 용출액량을 횡축에, 분자량의 대수값을 종축에 각각 플롯하고, 직선 회귀하여 검량선을 제작하였다. 검량선은 블루 덱스트란으로부터 페리틴까지, 페리틴으로부터 아프로티닌까지의 2종류를 제작하였다.
이 검량선을 사용하여, 앞서 얻어진 크로마토그램의 용출 시간 i에 있어서의 분자량(Mi)을 계산하였다. 이어서, 용출 시간 i에 있어서의 흡광도를 판독하여 Hi로 하였다. 이들 데이터로부터 중량 평균 분자량(Mw)을 이하의 식으로부터 구하였다.
Figure pct00092
(실시예 5)
평판형 알긴산 겔의 제조
[알긴산 용액의 조제]
각 실시예에서 얻어진 알긴산 유도체를 사용하여, 1.6중량％ 혹은 3.3중량％의 수용액을 조제하고, 미니사르트 하이플로(사토리우스, 0.2㎛, Cat. 16532GUK)를 사용하여 여과 멸균한다. 여과 멸균 후의 수용액의 염 농도를 조정하고, 1.5중량％ 또는 3.0중량％의 생리 식염수 용액으로 하였다.
실시예 1(a, b, c)의 알긴산: 1.5중량％ 생리 식염수 용액(실시예 5-1a, 실시 5-1b, 실시예 5-1c의 용액)
실시예 2(a, b, c)의 알긴산: 3.0중량％ 생리 식염수 용액(실시예 5-2a, 실시예 5-2b, 실시예 5-2c의 용액)
실시예 3(a)의 알긴산: 1.5중량％ 생리 식염수 용액(실시예 5-3a의 용액)
실시예 4의 알긴산: 3.0중량％ 생리 식염수 용액(실시예 5-4의 용액)
혹은, 각 실시예에서 얻어진 알긴산 유도체를 사용하여, 1.0중량％의 생리 식염수 용액을 조제하고, MILLEX GV 0.22㎛(Millipore, 0.22㎛, Cat. SLGV033RS)를 사용하여 여과 멸균한다.
실시예 1(d)의 알긴산: 1.0중량％ 생리 식염수 용액(실시예 5-1d의 용액)
실시예 2(d)의 알긴산: 1.0중량％ 생리 식염수 용액(실시예 5-2d의 용액)
실시예 3(b)의 알긴산: 1.0중량％ 생리 식염수 용액(실시예 5-3b의 용액)
실시예 4-2(a)의 알긴산: 1.0중량％ 생리 식염수 용액(실시예 5-5a의 용액)
실시예 1(e)의 알긴산: 0.5중량％ 생리 식염수 용액(실시예 5-1e의 용액)
실시예 2(e)의 알긴산: 0.5중량％ 생리 식염수 용액(실시예 5-2e의 용액)
실시예 3(c)의 알긴산: 0.5중량％ 생리 식염수 용액(실시예 5-3b의 용액)
실시예 4-2(b)의 알긴산: 0.5중량％ 생리 식염수 용액(실시예 5-5b의 용액)
이하의 실시예에서는, 이들 각 알긴산 생리 식염 용액을 적절히 농도 조정하여 시험에 사용하였다.
실시예 1(a, b, c) 또는 실시예 3(a)에서 조제한 알긴산과 실시예 2(a, b, c) 또는 실시예 4에서 조제한 알긴산을 조합하여, 화학 가교된 알긴산 겔을 제작한다.
보다 구체적으로는, 실시예 5-1(a, b, c)의 용액과 실시예 5-2(a, b, c)의 용액을 조합하고, 실시예 5-3a의 용액과 실시예 5-4의 용액을 조합한다.
또한, 실시예 1(d) 또는 실시예 3(b)에서 조제한 알긴산과 실시예 2(d) 또는 실시예 4-2 (a)에서 조제한 알긴산을 조합하여, 화학 가교된 알긴산 겔을 제작한다.
보다 구체적으로는, 실시예 5-1d의 용액과 실시예 5-2d의 용액을 조합하고, 실시예 5-1d의 용액과 실시예 5-5a의 용액을 조합하고, 실시예 5-3b의 용액과 실시예 5-2d의 용액을 조합하고, 실시예 5-3b의 용액과 실시예 5-5a의 용액을 조합한다.
또한, 실시예 1(e) 또는 실시예 3(c)에서 조제한 알긴산과 실시예 2(e) 또는 실시예 4-2(b)에서 조제한 알긴산을 조합하여, 화학 가교된 알긴산 겔을 제작한다.
보다 구체적으로는, 실시예 5-1e의 용액과 실시예 5-2e의 용액을 조합하고, 실시예 5-1e의 용액과 실시예 5-5b의 용액을 조합하고, 실시예 5-3c의 용액과 실시예 5-2e의 용액을 조합하고, 실시예 5-3c의 용액과 실시예 5-5b의 용액을 조합한다.
[평판형 알긴산 겔의 제조]
<일반적인 조제 방법>
3.5cm 배양 접시에 55mmol/L 염화칼슘(CaCl2) 수용액을 2mL 넣어, 400μL의 알긴산 용액을 P1000 피펫으로 적하하고, 10분간 정치한다. 그 동안, 5분 이상 경과하여 굳기 시작하면, 손으로 배양 접시를 진탕시켜 알긴산의 테두리를 굳힌다. 10분 후, 염화칼슘 용액을 4mL 추가로 첨가하고, 5분 정치한다. 생리 식염수로 3회 세정하여, 평판형의 알긴산 겔을 얻는다.
여기서, 평판형 겔이란, 예를 들어 단직경이 12 내지 15mm, 장직경이 12 내지 18mm, 두께가 0.5 내지 5mm 정도의 크기인 알긴산 겔이며, 원형, 사각형, 육각형, 팔각형 등을 취하는 것도 가능하고, 특별히 한정되지 않는다.
(실시예 6)
알긴산 겔의 생체 적합성 시험
[실시예 6-1: 이식용의 평판형 알긴산 겔의 제조]
실시예 5에 기재된 「평판형 알긴산 겔의 제조」에 준하여, 55mmol/L의 염화칼슘 수용액을 사용하여, 평판형 알긴산 겔을 제조하였다. 알긴산 용액은, 1중량％로 조제한 알긴산나트륨(모치다 세이야쿠 가부시키가이샤제: B-2) 수용액, 알긴산나트륨(모치다 세이야쿠 가부시키가이샤제: A-2) 수용액, 실시예 5-1b의 용액과 실시예 5-2b의 용액을 2:1(용량비)로 혼화하여 얻어지는 용액, 실시예 5-1d의 용액과 실시예 5-2d의 용액을 1:1(용량비)로 혼화하여 얻어지는 용액, 실시예 5-1d의 용액과 실시예 5-5의 용액을 1:1(용량비)로 혼화하여 얻어지는 용액, 실시예 5-3b의 용액과 실시예 5-2d의 용액을 1:1(용량비)로 혼화하여 얻어지는 용액, 실시예 5-3b의 용액과 실시예 5-5a의 용액을 1:1(용량비)로 혼화하여 얻어지는 용액을 사용하여, 하기 평판형 알긴산 겔을 조제하였다.
조제한 평판상 알긴산 겔을 D-MEM 배지에서 철야 배양하였다. 다음날, 무혈청 D-MEM 배지로 치환하고, 또한 생리 식염수 중으로 치환하고, 1시간 이상 정치하여, 동물에의 이식용의 알긴산 겔을 얻었다.
실시예 6-1a:
1중량％로 조제한 알긴산나트륨(모치다 세이야쿠 가부시키가이샤제: B-2) 수용액을 사용하여, 단직경(12mm)-장직경(15mm)-두께(5mm)의 평판상 알긴산 겔을 얻었다. 이 평판형 알긴산 겔의 사진을 도 1의 (a)로서 나타냈다.
실시예 6-1b:
실시예 5-1b의 용액과 실시예 5-2b의 용액을 2:1(용량비)로 혼합한 용액을 사용하여, 단직경(12mm)-장직경(12mm)-두께(4mm)의 평판상 알긴산 겔을 얻었다. 화학 가교기로서는 1％ 농도로 조제하였다. 이 평판형 알긴산 겔의 사진을 도 2의 (a)로서 나타냈다.
실시예 6-1c:
실시예 5-1b의 용액과 실시예 5-2b의 용액을 2:1(용량비)로 혼합한 용액을 사용하여, 단직경(12mm)-장직경(12mm)-두께(4mm)의 평판상 알긴산 겔을 얻었다. 화학 가교기로서는 2％ 농도로 조제하였다. 이 평판형 알긴산 겔의 사진을 도 3 (a)로서 나타냈다.
실시예 6-1d:
1중량％로 조제한 알긴산나트륨(모치다 세이야쿠 가부시키가이샤제: A-2) 수용액을 사용하여, 단직경(약 12mm)-장직경(약 12mm)-두께(약 4mm)의 평판상 알긴산 겔을 얻었다.
실시예 6-1e:
실시예 5-1d의 용액과 실시예 5-2d의 용액을 1:1(용량비)로 혼합한 용액을 사용하여, 단직경(약 12mm)-장직경(약 12mm)-두께(약 4mm)의 평판상 알긴산 겔을 얻었다. 화학 가교기로서는 1％ 농도로 조제하였다.
실시예 6-1f:
실시예 5-1d의 용액과 실시예 5-5a의 용액을 1:1(용량비)로 혼합한 용액을 사용하여, 단직경(약 12mm)-장직경(약 12mm)-두께(약 4mm)의 평판상 알긴산 겔을 얻었다. 화학 가교기로서는 1％ 농도로 조제하였다.
실시예 6-1g:
실시예 5-3b의 용액과 실시예 5-2d의 용액을 1:1(용량비)로 혼합한 용액을 사용하여, 단직경(약 12mm)-장직경(약 12mm)-두께(약 4mm)의 평판상 알긴산 겔을 얻었다. 화학 가교기로서는 1％ 농도로 조제하였다.
실시예 6-1h:
실시예 5-3b의 용액과 실시예 5-5a의 용액을 1:1(용량비)로 혼합한 용액을 사용하여, 단직경(약 12mm)-장직경(약 12mm)-두께(약 4mm)의 평판상 알긴산 겔을 얻었다. 화학 가교기로서는 1％ 농도로 조제하였다.
[실시예 6-2: 평판형 알긴산 겔의 동물에의 이식 시험]
실시예 6-1a 내지 c에서 조제한 각 알긴산 겔을 건강 마우스 C57BL/6NCr의 복강 내에 이식하였다. 5주일 후 개복하여 겔을 적출하고, 겔의 상태를 확인하였다. 또한 복강 내의 복강 내의 유착이나 염증도 확인하였다.
또한, 실시예 6-1d 내지 h에서 조제한 각 알긴산 겔을 건강 마우스 C57BL/6NCr의 복강 내에 이식하였다. 1, 2 또는 4주일 후 개복하여 겔을 적출하고, 겔의 상태를 확인하였다. 또한 복강 내의 복강 내의 유착이나 염증도 확인하였다.
실시예 6-1a의 알긴산 겔: 적출한 알긴산 겔은 원래의 형상을 유지하지 않았고, 뿔뿔이 흩어져서, 잔존하여 확인할 수 있는 겔의 회수량도 적은 상태였다. 그 상태의 사진을 도 1의 (b)로서 나타냈다.
실시예 6-1b의 알긴산 겔: 적출한 알긴산 겔은, 겔의 사이즈 변화는 없었다. 그 상태의 사진을 도 2의 (b)로서 나타냈다.
실시예 6-1c의 알긴산 겔: 적출한 알긴산 겔은, 균열되어 있지만, 원래의 형상은 거의 유지하고 있으며, 겔의 사이즈 변화는 없었다. 그 상태의 사진을 도 3의 (b)로서 나타냈다.
실시예 6-1d의 알긴산 겔: 1주일 후에 적출한 알긴산 겔은 원래의 형상을 유지하지 않았고, 뿔뿔이 흩어져서, 잔존하여 확인할 수 있는 겔의 회수량도 적은 상태였다.
실시예 6-1f의 알긴산 겔: 1주일 후, 2주일 후, 4주일 후에 적출한 알긴산 겔은, 모두 겔의 사이즈 변화는 없었다.
실시예 6-1g의 알긴산 겔: 1주일 후, 2주일 후에 적출한 알긴산 겔은, 모두 겔의 사이즈 변화는 없었다. 4주일 후에 적출한 알긴산 겔은, 균열되어 있지만, 원래의 형상은 거의 유지하고 있으며, 겔의 사이즈 변화는 없었다.
실시예 6-1h의 알긴산 겔: 1주일 후, 2주일 후에 적출한 알긴산 겔은, 모두 겔의 사이즈 변화는 없었다. 4주일 후에 적출한 알긴산 겔은, 균열되어 있지만, 원래의 형상은 거의 유지하고 있으며, 겔의 사이즈 변화는 없었다.
실시예 6-1a, 실시예 6-1b, 실시예 6-1c의 알긴산 겔에 대해서는, 이식하고, 5주일 후에 개복하여 확인한 바, 복강 내 장기 사이에 유착·염증은 없었다. 당해 겔이 매립되어 있던 대망이나 장관막도 유착·염증은 없었다. 뿔뿔이 흩어진 겔이 접착되어 있던 간장에 유착·염증은 없었다.
실시예 6-1d, 실시예 6-1f, 실시예 6-1g, 실시예 6-1h의 알긴산 겔에 대해서는, 이식하고, 1주일 후, 2주일 후 및 4주일 후에 개복하여 확인한 바, 복강 내 장기 사이에 유착·염증은 없었다. 당해 겔이 매립되어 있던 대망이나 장관막도 유착·염증은 없었다. 뿔뿔이 흩어진 겔이 접착되어 있던 간장에 유착·염증은 없었다.
[실시예 6-3: 평판형 알긴산 겔의 세포 생존 확인 시험]
췌장 랑게르한스섬 β 세포의 주화 세포인 MIN6 세포(5×106cells)를, 실시예 6-1a, 실시예 6-1b, 실시예 6-1c, 실시예 6-1d, 실시예 6-1e, 실시예 6-1f, 실시예 6-1g, 실시예 6-1h의 알긴산 겔의 조제에 사용한 각 알긴산 용액에 첨가한 후, 알긴산 겔을 제작하고, D-MEM 배지에서 3 내지 4주일 배양하여, MIN6 세포의 생존을 현미경으로 확인하였다.
실시예 6-1a, 실시예 6-1b, 실시예 6-1c, 실시예 6-1d, 실시예 6-1e, 실시예 6-1f, 실시예 6-1g, 실시예 6-1h의 알긴산 겔 중에 있어서의 세포 증식은 양호하고, 현미경 하에서 10분 세포가 생존하고 있는 것이 관찰되었다.
(실시예 7)
당뇨병 모델 마우스에의 복강 내 이식에 의한 이식용 디바이스의 평가
[돼지 췌도의 단리]
당기술이 공지된 수순, 혹은 시모다 등(Shimoda; Cell Transplantation, 제21권, 501-508 페이지, 2012년)에 기재된 방법, 혹은 에드몬톤 프로토콜을 사용한 표준의 리콜디 기술 등에 준하여, 무균 하에서 성체의 돼지로부터 무균의 생존 가능한 췌장을 얻어, 췌도 세포를 단리하였다.
[단리 췌도의 배양 방법]
이어서, 단리한 췌도를, 노구치(Noguchi) 등(Transplantation Proceedings, 42, 2084-2086(2010))의 방법에 준하여, 배지 중(Connaught Medical Research Laboratory(CMRL)-based Miami-defined media #1(MM1; Mediatech-Cellgro, Herndon, VA)-supplemented with 0.5％ human serum albumin.), 5％ CO2/95％ 공기의 습윤 분위기 중에 37℃에서 1일간 배양하였다. 배양한 췌도를 이식용 디바이스의 제작에 사용하였다.
[이식용 디바이스의 조제]
가교기의 도입률 5.0mol％의 실시예 1b와 도입률 4.9mol％의 실시예 2b를 사용하여, 각각 1.5중량％의 실시예 5-1b의 생리 식염수 용액 및 3.0중량％의 실시예 5-2b의 생리 식염수 용액을 조정한다.
실시예 5-1b의 용액과 실시예 5-2b의 용액을 2:1(용량비)로 혼합함으로써, 가교기의 도입률이 5mol％ 상당인 2중량％의 알긴산 용액을 조제할 수 있다.
실시예 5-1b와 실시 5-2b의 용액을 2배 및 4배로 희석한 용액을 조제하여, 각각 2:1(용량비)로 혼합하고, 용액을 조제한다.
2배 희석한 용액의 혼합 용액을 실시예 7-1의 용액, 4배 희석한 용액의 혼합 용액을 실시예 7-2의 용액으로 한다.
또한, 마찬가지의 방법으로, 실시예 5-1c의 용액과 실시예 5-2c의 용액을 2:1(용량비)로 혼합하고, 4배 희석한 용액의 혼합액을 실시예 7-3의 용액으로 한다.
실시예 7-1 및 실시예 7-2의 용액(100μL, 200μL), 그리고 실시예 7-3의 용액(100μL, 200μL)으로 각각 조제한 이식용 디바이스는 이하와 같다.
<이식용 디바이스>
실시예 7-1a: 실시예 7-1의 용액을 100μL 사용하여 조제한 이식용 디바이스
실시예 7-1b: 실시예 7-1의 용액을 200μL 사용하여 조제한 이식용 디바이스
실시예 7-2a: 실시예 7-2의 용액을 100μL 사용하여 조제한 이식용 디바이스
실시예 7-2b: 실시예 7-2의 용액을 200μL 사용하여 조제한 이식용 디바이스
실시예 7-3a: 실시예 7-3의 용액을 100μL 사용하여 조제한 이식용 디바이스
실시예 7-3b: 실시예 7-3의 용액을 200μL 사용하여 조제한 이식용 디바이스
100μL 또는 200μL의 돼지 췌도 함유 0.5중량％ 내지 1.0중량％ 알긴산 용액을 제작하기 위해서, 실시예 5-1b의 알긴산 용액 (B1)에 디바이스 1개분에 분주한 췌도 펠릿을 현탁 후, 실시예 5-2b의 알긴산 용액 (C1)과 혼합하여, 돼지 췌도를 현탁시킨 실시예 7-1a, 실시예 7-1b, 실시예 7-2a 및 실시예 7-2b의 용액으로 하였다. 1 디바이스당 돼지 췌도량 10000IEQ의 펠릿량(10 내지 30μL)에 따라서, 실시예 5-1b의 알긴산 용액 (B1) 및 실시예 5-2b의 알긴산 용액 (C1)은 생리 식염수로 농도 조제를 행하였다.
또한, 100μL 또는 200μL의 돼지 췌도 함유 0.5중량％ 내지 1.0중량％ 알긴산 용액을 제작하기 위해서, 실시예 5-1c의 알긴산 용액 (B1)에 디바이스 1개분에 분주한 췌도 펠릿을 현탁 후, 실시예 5-2c의 알긴산 용액 (C1)과 혼합하여, 돼지 췌도를 현탁시킨 실시예 7-3a 및 실시예 7-3b의 용액으로 하였다. 1 디바이스당 돼지 췌도량 10000IEQ의 펠릿량(10 내지 30μL)에 따라서, 실시예 5-1c의 알긴산 용액 (B1) 및 실시예 5-2c의 알긴산 용액 (C1)은 생리 식염수로 농도 조제를 행하였다.
실시예 7-1a, 실시예 7-2a, 실시예 7-2b 및 실시예 7-3b로서 조제한 돼지 췌도 함유 알긴산 용액은, 신속히 반투막(스펙트럼사제 투석 튜브 「스펙트라/포어 CE(분획 분자량 10만)」)에 봉입(반투막의 일단부를 히트 실링한 후, 알긴산 용액을 넣어, 티타늄 클립으로 봉입)하고, 55mmol/L CaCl2 용액 중에 10 내지 15분간 담그고, 디바이스 중의 알긴산 용액을 겔화하였다.
겔화 후, 당해 이식용 디바이스는 생리 식염수로 3분 세정하고, 이식용 배지(M199-니코틴아미드-FBS+P/S)에서 철야 배양하였다. 이어서, 이식용 무혈청 배지(M199+P/S)에 30분 침지시키고 나서, 이식 전 세정용의 생리 식염수 +P/S로 30분 침지하여 세정하고, 마우스에의 이식용 디바이스로 하였다. 제작한 이식용 디바이스의 사진을 도 4a에 나타냈다.
·이식용 디바이스의 크기: 세로 10mm×가로 26mm×두께 약 2mm
·배양 조건: M199+니코틴아미드+소태아 혈청+페니실린/스트렙토마이신(P/S), O/N
·세정 조건: 1) 이식용 무혈청 배지(M199+P/S), 30min, r.t.
2) 생리 식염수(saline+P/S), 30min, r.t.
[표 11]
Figure pct00093
[이식용 디바이스의 평가(이식 시험)]
사용 동물:
야생형 면역 정상 마우스(C57BL/6NCr)의 당뇨병 모델 마우스. 13 내지 17주령, 수컷, 25 내지 35g. 스트렙토조신 용액의 꼬리 정맥 주사, 110mg/kg, 단회 투여로 약 1주일간 당뇨병 모델을 제작하였다. 수시 혈당값이 300mg/dL 이상, 600mg/dL 이하인 개체를 당뇨병 모델로 하였다.
투여 방법·이식 방법:
3종 혼합 마취약(도미톨/미다졸람/베토르파아르)을 0.25 내지 0.3mL복강 내 투여로 마취하고, 마취 하에서 복부 면도, 소독 후, 복부를 약 2cm 정중 절개하고, 세정 후의 이식용 디바이스를 복강 내에 단순 유치, 고정없이 이식하였다. 이식 후, 폐복하여 메데토미딘 길향약(안티세단)을 0.25 내지 0.3mL 피하 주사하여 각성시켰다. 수술은 히트 패드 상에서 마우스를 보온하여 행하였다. 면역 제어제의 투여 없음. 보액·항생제·항염증제 등의 투여도 없음.
혈당값·체중 측정법:
이식 전 및 이식 후 day1로부터 수일 간격으로 일중 정시에 수시 혈당값을 측정하였다. 암컷에 의한 꼬리의 베인 상처로부터의 혈액 1방울로, 글루테스트 Neo 알파 및 글루테스트 Neo 센서를 사용하여 혈당값을 측정하였다. 체중은 수시 혈당값 측정 직전에 전자 천칭으로 측정하였다. 디바이스 이식 마우스의 수시 혈당값은 300mg/dL 미만인 것을 당뇨병이 치유된 개체로 하였다.
실시예 7-2a의 이식 디바이스를 사용했을 때의 이식 후 day75까지의 혈당값 변동을 도 5a, 체중의 변동을 도 6a에 나타냈다. 또한, 이식 후 day 305까지의 혈당값 변동을 도 5b, 체중의 변동을 도 6b에 나타냈다. 또한, 이식 후 day 305에 이식용 디바이스를 취출하여, 다른 당뇨병 모델 마우스에 이식하고(여기서, 당뇨병 모델 마우스에 디바이스를 이식하고, 이식한 디바이스를 소정 기간 경과 후에 취출하고, 취출한 디바이스를 다른 당뇨병 모델 마우스에 이식하는 것을 「릴레이 이식」이라고 칭함), 릴레이 이식 후 day 26까지의 혈당값 변동을 도 5c, 체중의 변동을 도 6c에 나타냈다. 도 5a 내지 c 및 도 6a 내지 c 중, ＃1 및 ＃2는 각각 이식한 마우스 고체를 식별하는 번호를 의미한다.
체중 변동에는 이상은 없고, 혈당값은 75일간 정상값으로 유지되었다. 또한, 이식 후 305일간 및 추가의 릴레이 이식 후 26일간, 체중 변동에는 이상은 없고, 혈당값은 정상적으로 유지되었다.
실시예 7-2b의 이식 디바이스를 사용했을 때의 혈당값 변동은, 실시예 7-2a와 마찬가지로, 체중 변동에는 이상은 없고, 혈당값은 75일간 정상값으로 유지되었다.
또한, 실시예 7-2b의 이식용 디바이스를 사용했을 때의 이식 후 day 305까지의 혈당값 변동을 도 7a, 체중의 변동을 도 8a에 나타냈다. 또한, 이식 후 day 305에 이식용 디바이스를 취출하여, 다른 당뇨병 모델 마우스에 이식하고, 릴레이 이식 후 day 26까지의 혈당값 변동을 도 7b, 체중의 변동을 도 8b에 나타냈다.
이식 후 305일간 및 추가의 릴레이 이식 후 26일간, 체중 변동에는 이상은 없고, 혈당값은 정상적으로 유지되었다.
실시예 7-3b의 이식 디바이스를 사용했을 때의 혈당값 변동은, 실시예 7-2a와 마찬가지로, 체중 변동에는 이상은 없고, 혈당값은 75일간 정상값으로 유지되었다.
또한, 실시예 7-3b의 이식용 디바이스를 사용했을 때의 이식 후 day 305까지의 혈당값 변동을 도 9a, 체중의 변동을 도 10a에 나타냈다. 또한, 이식 후 day 305에 이식용 디바이스를 취출하여, 다른 당뇨병 모델 마우스에 이식하고, 릴레이 이식 후 day 26까지의 혈당값 변동을 도 9b, 체중의 변동을 도 10b에 나타냈다. 또한, ＃2 및 ＃3은 도중에 디바이스를 적출하고, 시험을 종료하였다.
이식 후 305일간 및 추가의 릴레이 이식 후 26일간, 체중 변동에는 이상은 없고, 혈당값은 정상적으로 유지되었다.
상기 이식용 디바이스의 제작에 있어서, 알긴산 유도체를 사용하지 않고 췌도를 반투막에 봉입한 이식용 디바이스를 제작하였다. 상기한 [이식용 디바이스의 평가(이식 시험)]과 마찬가지의 방법으로 마우스에 이식한 바, 당뇨병 마우스의 혈당 억제 효과는 확인되지 않았다.
조직 반응성의 평가:
조직 반응성의 평가는 이하와 같이 행하였다.
이식 후 수주일 후 또는 수시 혈당값 상승 후, 디바이스 이식 마우스를 3종 혼합 마취약으로 마취하고, 마취 하에서 복부 소독, 복부를 약 4cm 정중 절개하고, 이식 디바이스를 복강 내 장기 사이에서 찾았다. 장기 사이에 디바이스의 일부가 보이면 섭자로 천천히 취출하고, 단체로 디바이스를 취출할 수 있는지 여부를 조사한다. 취출한 디바이스의 표면의 상황을 관찰한다.
<관찰 항목>
1. 디바이스 표면에, 혈관 신생되어 있는지 여부를 조사한다. 혈관 신생이 있다면, 모세혈관 레벨인지 굵은 혈관까지 생겼는지 관찰한다.
2. 이어서, 장기나 복막, 대망 등과 유착되어 있는지, 연결되어 있는지 관찰한다. 장기가 둔하게 박리가 가능한지, 예리하게 박리가 필요한지 조사한다.
3. 장기와 직접 유착되어 있는 경우에는, 어느 장기와 디바이스의 어느 부분(면 전체인지, 일부인지, 변인지, 디바이스 접음선 부분이나 실링 부분인지 등.)이 유착되어 있는지 확인한다.
4. 장기측에 염증 등이 있는지 여부를 확인한다.
※ 디바이스 적출 후, 폐복. 길향약을 피하 주사하여 각성시킨다. 수술은 히트 패드 상에서 마우스를 보온하여 행한다.
실시예 7-1a의 이식 디바이스를 사용했을 때의, 이식 10주 후 디바이스를 적출하고, 조직 반응성을 관찰한 결과, (1) 디바이스 표면에, 혈관 신생하지 않았고, (2) 디바이스가 장기나 복막, 대망 등과 유착하지 않았고, (3) 장기가 우둔적으로 박리가 가능하며, 장기와 직접 유착하지 않았고, (4) 장기측에 염증 등은 확인되지 않았다.
적출한 디바이스 내의 생존 췌도 세포의 모습을, 이하와 같은 염색, 즉, (a) 디티존에 의한 췌도 세포의 염색, (b) 디티존에 의한 췌도 세포의 염색, (c) FDA에 의한 생세포의 형광 염색, (d) PI에 의한 사세포의 형광 염색을 행한 후, 또한 염색되지 않고 알긴산 겔 중에 분산된 췌도 세포를 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 디바이스 중에 췌도 세포가 충분히 생존하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
이식 후 10주 후 적출한 디바이스를 개방하여, 디바이스 중의 알긴산 겔의 형상을 확인하였다. 그 결과, 생체 내에 장기간 놓인 이식용 디바이스 중의 알긴산 겔의 형상은 유지되고 있는 것이 명확해졌다.
(실시예 8)
당뇨병 모델 마우스에의 복강 내 이식에 의한 이식용 디바이스의 평가 2
[돼지 췌도의 단리 및 단리 췌도의 배양 방법]
이식용 디바이스의 제작에 사용하는 췌도는 실시예 7에 기재된 단리 방법 및 배양 방법에 의해 입수하였다.
[이식용 디바이스의 조제]
실시예 7과 마찬가지의 방법으로, 실시예 5-1c의 용액과 실시예 5-2c의 용액을 2:1(용량비)로 혼합하고, 4배 희석한 용액의 혼합액을 실시예 8의 용액으로 한다.
실시예 8의 용액(100μL, 75μL, 50μL)으로 각각 조제한 이식용 디바이스는 이하와 같다.
<이식용 디바이스>
실시예 8-1: 실시예 8의 용액을 100μL 사용하여 조제한 이식용 디바이스
실시예 8-2: 실시예 8의 용액을 75μL 사용하여 조제한 이식용 디바이스
실시예 8-3: 실시예 8의 용액을 50μL 사용하여 조제한 이식용 디바이스
100μL, 75μL 또는 50μL의 돼지 췌도 함유 0.5중량％ 알긴산 용액을 제작하기 위해서, 실시예 5-1c의 알긴산 용액 (B1)에 디바이스 1개분에 분주한 췌도 펠릿을 현탁 후, 실시예 5-2c의 알긴산 용액 (C1)과 혼합하여, 돼지 췌도를 현탁시킨 실시예 8의 용액으로 하였다. 1 디바이스당 돼지 췌도량 10000IEQ의 펠릿량(10 내지 30μL)에 따라서, 실시예 5-1b의 알긴산 용액 (B1) 및 실시예 5-2b의 알긴산 용액 (C1)은 생리 식염수로 농도 조제를 행하였다.
실시예 8로서 조제한 돼지 췌도 함유 알긴산 용액은, 신속히 반투막(스펙트럼사제 투석 튜브 「스펙트라/포어 CE(분획 분자량 10만)」)에 봉입(반투막의 일단부를 히트 실링한 후, 알긴산 용액을 넣어, 타단부를 히트 실링하여 봉입)하고, 55mmol/L CaCl2 용액 중에 10 내지 15분간 담그고, 디바이스 중의 알긴산 용액을 겔화하였다.
겔화 후, 당해 이식용 디바이스는 생리 식염수로 3분 세정하고, 이식용 배지(M199-니코틴아미드-FBS+P/S)에서 철야 배양하였다. 이어서, 이식용 무혈청 배지(M199+P/S)에 30분 침지시키고 나서, 이식 전 세정용의 생리 식염수 +P/S로 30분 침지하여 세정하고, 마우스에의 이식용 디바이스로 하였다. 제작한 이식용 디바이스의 사진을 도 4b에 나타냈다.
·이식용 디바이스의 크기: 세로 10mm×가로 26mm×두께 약 0.25 내지 0.8mm
·이식용 디바이스 중의 하이드로겔의 크기:
실시예 8-1: 세로 약 10mm×가로 약 20mm×두께 약 0.5mm(500㎛)
실시예 8-2: 세로 약 10mm×가로 약 20mm×두께 약 0.375mm(375㎛)
실시예 8-3: 세로 약 10mm×가로 약 20mm×두께 약 0.25mm(250㎛)
·배양 조건: M199+니코틴아미드+소태아 혈청+페니실린/스트렙토마이신 (P/S), O/N
·세정 조건: 1) 이식용 무혈청 배지(M199+P/S), 30min, r.t.
2) 생리 식염수(saline+P/S), 30min, r.t.
[이식용 디바이스의 평가(이식 시험)]
실시예 7에 준하여 실시하였다.
실시예 8-1의 이식 디바이스를 사용했을 때의 이식 후 day 178까지의 혈당값 변동을 도 11a, 체중의 변동을 도 12a에 나타냈다.
또한, 실시예 8-2의 이식 디바이스를 사용했을 때의 이식 후 day 178까지의 혈당값 변동을 도 11b, 체중의 변동을 도 12b에 나타냈다. 또한, 이식 후 day 178에 이식용 디바이스를 취출하고, 릴레이 이식 후 day 40까지의 혈당값 변동을 도 11c, 체중의 변동을 도 12c에 나타냈다.
또한, 실시예 8-3의 이식 디바이스를 사용했을 때의 이식 후 day 178까지의 혈당값 변동을 도 11d, 체중의 변동을 도 12d에 나타냈다. 또한, 이식 후 day 178에 이식용 디바이스를 취출하고, 릴레이 이식 후 day 40까지의 혈당값 변동을 도 11e, 체중의 변동을 도 12e에 나타냈다.
도 11a 내지 e 및 도 12a 내지 e 중, ＃ 및 숫자로 나타낸 표시는 각각 이식한 마우스 고체를 식별하는 번호를 의미한다.
체중 변동에는 이상은 없고, 혈당값은 178일간 정상값으로 유지되었다. 또한, 추가의 릴레이 이식 후 40일간, 체중 변동에는 이상은 없고, 혈당값은 정상적으로 유지되었다.
적출한 디바이스는 GsIs가 행해지고, 디바이스가 인슐린 분비능을 갖고 있는 것을 확인하였다.
(실시예 9)
당뇨병 모델 마우스에의 복강 내 이식에 의한 이식용 디바이스의 평가 3
실시예 7의 방법에 준하여, 이하의 디바이스를 조제하였다.
<이식용 디바이스>
실시예 9-1: 1중량％로 조제한 알긴산나트륨(모치다 세이야쿠 가부시키가이샤제: B-2) 수용액을 200μL 사용하여 조제한 이식용 디바이스
실시예 9-2: 실시예 7-1과 마찬가지의 방법으로 제조한 용액 200μL 사용하여 조제한 이식용 디바이스
실시예 9-3: 실시예 7-2와 마찬가지의 방법으로 제조한 용액 200μL 사용하여 조제한 이식용 디바이스
실시예 9-4: 실시예 7-2와 마찬가지의 방법으로 제조한 용액 100μL 사용하여 조제한 이식용 디바이스
실시예 9-5: 실시예 7-3과 마찬가지의 방법으로 제조한 용액 200μL 사용하여 조제한 이식용 디바이스
실시예 9-6: 실시예 7-3과 마찬가지의 방법으로 제조한 용액 100μL 사용하여 조제한 이식용 디바이스
실시예 9-7: 실시예 7-3과 마찬가지의 방법으로 제조한 용액 50μL 사용하여 조제한 이식용 디바이스
·이식용 디바이스의 크기: 세로 10mm×가로 26mm×두께 약 0.25 내지 1.3mm
·이식용 디바이스 중의 하이드로겔의 크기:
실시예 9-1, 실시예 9-2, 실시예 9-3 및 실시예 9-5: 세로 약 10mm×가로 약 20mm×두께 약 1mm(1000㎛)
실시예 9-4, 실시예 9-6: 세로 약 10mm×가로 약 20mm×두께 약 0.5mm(500㎛)
실시예 9-7: 세로 약 10mm×가로 약 20mm×두께 약 0.25mm(250㎛)
이식 시험은 실시예 7에 준하여 행해졌다. 실시예 9-1 내지 실시예 9-7의 디바이스를 각각 복수의 당뇨병 모델 마우스에 이식하였다. 이식으로부터 178일간, 혈당값이 300mg/dL 이하(단, 기간 중 3회까지는 300mg/dL를 초과하는 것을 허용함)였던 마우스를 치유 마우스라고 정의하고, 이식한 당뇨병 모델 마우스수에 대한 치유 마우스수를 치유율로서 산출한 바, 이하의 결과가 되었다.
[표 12]
Figure pct00094
당뇨병 모델 마우스의 치유율은, 천연의 알긴산으로 제조한 하이드로겔을 포함하는 이식용 디바이스보다도 본원 발명의 알긴산 유도체로 제조한 하이드로겔을 포함하는 이식용 디바이스쪽이 높은 것을 확인하였다. 또한, 하이드로겔의 두께가 얇을수록 치유율이 높고, 본 실시예에 있어서 500㎛ 이상의 두께에서 치유율이 약 40％에 비해, 250㎛가 됨으로써 치유율이 약 62％로 향상되는 것이 확인되었다. 또한, 실시예 9-2는 치유율 0.0％로 되어 있지만, N수가 적은 것에서 기인하고 있으며, N수가 증가함으로써 실시예 9-3에 기재된 정도의 치유율이 될 것으로 예상된다.
(실시예 10)
당뇨병 모델 마우스에의 복강 내 이식에 의한 이식용 디바이스의 평가 4
[이식용 디바이스의 조제]
췌도로서 췌장 랑게르한스섬 β 세포의 주화 세포인 MIN6 세포(2.5×106cells)를 사용하여, 실시예 7에 준한 방법으로 디바이스를 제조하였다.
2％의 A-2의 알긴산 용액을, 4배 희석한 용액을 실시예 10-1의 용액으로 하였다.
실시예 5-1e의 용액과 실시예 5-2e의 용액을 1:1(용량비)로 혼합한 용액을 실시예 10-2의 용액으로 하였다.
또한, 실시예 5-1e의 용액과 실시예 5-5b의 용액을 1:1(용량비)로 혼합한 용액을 실시예 10-3의 용액으로 하였다.
또한, 실시예 5-3c의 용액과 실시예 5-2e의 용액을 1:1(용량비)로 혼합한 용액을 실시예 10-4의 용액으로 하였다.
또한, 실시예 5-3c의 용액과 실시예 5-5b의 용액을 1:1(용량비)로 혼합한 용액을 실시예 10-5의 용액으로 하였다.
실시예 10-2 내지 10-5는 모두 화학 가교기로서는 0.5％ 농도이다.
실시예 10-1 내지 실시예 10-5의 용액(모두 50μL)으로 각각 조제한 이식용 디바이스는 이하와 같다.
<이식용 디바이스>
실시예 10-1: 실시예 10-1의 용액을 50μL 사용하여 조제한 이식용 디바이스
실시예 10-2: 실시예 10-2의 용액을 50μL 사용하여 조제한 이식용 디바이스
실시예 10-3: 실시예 10-3의 용액을 50μL 사용하여 조제한 이식용 디바이스
실시예 10-4: 실시예 10-4의 용액을 50μL 사용하여 조제한 이식용 디바이스
실시예 10-5: 실시예 10-5의 용액을 50μL 사용하여 조제한 이식용 디바이스
·이식용 디바이스의 크기: 세로 10mm×가로 26mm×두께 약 0.4mm
·이식용 디바이스 중의 하이드로겔의 크기: 세로 약 10mm×가로 약 20mm×두께 약 0.25mm(250㎛)
[이식용 디바이스의 평가(이식 시험)]
실시예 7에 준하여 실시하였다.
실시예 10-1의 이식 디바이스를 사용했을 때의 이식 후 day 17까지의 혈당값 변동을 도 13a, 체중의 변동을 도 14a에 나타냈다.
실시예 10-2의 이식 디바이스를 사용했을 때의 이식 후 day 17까지의 혈당값 변동을 도 13b, 체중의 변동을 도 14b에 나타냈다.
실시예 10-3의 이식 디바이스를 사용했을 때의 이식 후 day 17까지의 혈당값 변동을 도 13c, 체중의 변동을 도 14c에 나타냈다.
실시예 10-4의 이식 디바이스를 사용했을 때의 이식 후 day 17까지의 혈당값 변동을 도 13d, 체중의 변동을 도 14d에 나타냈다.
실시예 10-5의 이식 디바이스를 사용했을 때의 이식 후 day 17까지의 혈당값 변동을 도 13e, 체중의 변동을 도 14e에 나타냈다.
도 13a 내지 e 및 도 14a 내지 e 중, ＃ 및 숫자로 나타낸 표시는 각각 이식한 마우스 고체를 식별하는 번호를 의미한다.
체중 변동에는 이상은 없고, 혈당값은 12 내지 17일간 정상값으로 유지되었다.
조직 반응성의 평가:
조직 반응성의 평가는 실시예 7에 준하여 행하였다.
실시예 10-1 내지 5의 이식 디바이스를 사용했을 때의, 이식 2주일 후 디바이스를 적출하고, 조직 반응성을 관찰한 결과, (1) 디바이스 표면에, 혈관 신생하지 않았고, (2) 디바이스가 장기나 복막, 대망 등과 유착하지 않았고, (3) 장기가 우둔적으로 박리가 가능하며, 장기와 직접 유착하지 않았고, (4) 장기측에 염증 등은 확인되지 않았다.
이식 2주일 후 적출한 디바이스를 개방하여, 디바이스 중의 알긴산 겔의 형상을 확인하였다. 그 결과, 생체 내에 장기간 놓인 이식용 디바이스 중의 알긴산 겔의 형상은 유지되고 있는 것이 명확해졌다.
(실시예 11)
이식용 디바이스의 산소 투과성의 평가
[산소 투과성의 시뮬레이션]
세로 10mm×가로 20mm의 하이드로겔에 대해서, 실시예 11-1은 두께 1mm, 실시예 11-2는 0.5mm, 실시예 11-3은 0.25mm로 한 경우의, 산소 투과율에 대하여 이하의 조건에서 시뮬레이션을 행하였다.
또한, 시뮬레이션 시에, 하이드로겔 표면의 산소 농도는 균일하면서 항상 일정할 것, 세포의 비호흡 속도는 항상 일정할 것, 세포의 체적은 무시하고, 하이드로겔 내에서 균일하게 산소 소비할 것, 겔의 전체 표면부터 중심에 대하여 균등하게 산소 확산이 발생할 것을 전제로 하였다.
먼저, 하이드로겔을 공간 상의 직교 좌표계에 배치했을 때의 산소 농도의 반응 확산 방정식으로서 이하와 같이 하였다.
Figure pct00095
그리고, QO2X=rO2(0차 반응)로 하고, 정상 상태((∂C/∂t)=0)에 있어서의 산소 농도 분포를 구하고, 이하의 식으로 나타냈다. rO2는 표 13에 기재된 췌도의 비호흡 속도, 하이드로겔 중에 포함되는 췌도의 총 수 및 하이드로겔 형상을 사용하여 산출하였다.
Figure pct00096
그리고, x 방향을 x=iΔx, y 방향을 y=jΔy, z 방향을 z=kΔz로 등분할하고, 농도를 C(x, y, z)=Ci, j, k의 절점값으로 차분화함으로써, 다음 식을 얻고, 이러한 식에 의해 산출하였다. 단, Δx=Δy=Δz=Δ로 하였다.
Figure pct00097
상기 식으로부터 하이드로겔 표면과 중심부의 산소 농도 비율의 시뮬레이션을 실시하였다. 또한, 시뮬레이션에 사용한 계수는 하기와 같고, BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING/VOL96, ISSUE5, P990-998(2007) 및 THEORETICAL BIOLOGY AND MEDICAL MODELLING/6:5(2009)를 참조하였다.
[표 13]
Figure pct00098
도 15a는 하이드로겔을 나타내고, 검은 화살표로 나타내는 개소의 단면에 있어서의 산소 투과성을 나타낸 것이 도 15b 내지 15d이다. 또한, 범례를 도 15b에 나타내고, 표시 내용은 도 15c 내지 15d에 있어서도 마찬가지이다. 도 15b는 실시예 11-1의 두께 1mm의 하이드로겔이지만, 표면의 산소 투과성이 100 내지 75％인 것에 비해, 중심부의 산소 투과율이 25％ 이하였다. 또한, 실시예 11-2를 나타내는 도 15c에서는 두께 0.5mm로 함으로써, 중심부의 산소 투과율이 50 내지 25％로 향상되고, 실시예 11-3을 나타내는 도 15d에서는 두께 0.25mm로 함으로써, 중심부의 산소 투과율이 75 내지 50％로 표면의 산소 농도의 절반 이상이 되었다.
(실시예 12)
이식용 디바이스로부터의 물질 투과성의 평가
[이식용 디바이스의 조제]
가교기의 도입률 2.2mol％의 실시예 1e와 도입률 2.4mol％의 실시예 2e를 사용하여, 각각 2중량％의 실시예 12-1e의 수용액 및 2중량％의 실시예 12-2e의 수용액을 조제하였다. 또한, 수용액의 조제에는 생리 식염수를 사용하였다.
실시예 12-1e의 용액과 실시예 12-2e의 용액을 1:1(용량비)로 혼합함으로써, 2중량％의 알긴산 용액을 조제할 수 있다. 이 용액을 생리 식염수와 1:1(용량비)로 혼합한 용액 25μL와, 인간 인슐린 500ng 또는 글루코오스 250μg을 포함하는 0.01％ Tween20 함유 생리 식염 용액 25μL를 혼합하여 50μL로 하였다. 이 용액은, 신속히 반투막(스펙트럼사제 투석 튜브 「스펙트라/포어 CE(분획 분자량 10만)」)에 봉입(반투막의 일단부를 히트 실링한 후, 알긴산 용액을 넣어, 타단부를 히트 실링하여 봉입)하고, 55mmol/L CaCl2 용액 중에 10 내지 15분간 담그고, 디바이스 중의 알긴산 용액을 겔화하였다. 알긴산의 최종 농도는 0.5％였다. 이러한 용액에서 조제한 이식용 디바이스를 실시예 12-1(인슐린을 포함함) 및 실시예 12-2(글루코오스를 포함함)의 하이드로겔로 하였다.
·하이드로겔의 크기: 세로 10mm×가로 20mm×두께 약 0.25mm
[시험 방법]
실시예 12-1 또는 실시예 12-2의 하이드로겔을 실온의 0.01％ Tween20 함유 생리 식염수 용액 40mL 중에서 24시간 교반하고, 외액 중의 인슐린 농도 혹은 글루코오스 농도를 측정하고, 하이드로겔에 봉입한 인간 인슐린 또는 글루코오스가 생리 식염수 용액 중에 확산된 경우를 100％로 했을 때의 인간 인슐린 투과율 또는 글루코오스 투과율을 구하였다.
실시예 12의 이식용 디바이스를 사용했을 때의 시험 개시 후 24시간까지의 외액 중 인슐린 농도를 도 16a, 글루코오스 농도를 도 16b에 나타냈다. 인간 인슐린 및 글루코오스의 모두 빠르게 투과하고, 24시간 교반으로 100％가 투과한 것이 확인되어, 본 발명의 이식용 디바이스가, 인간 인슐린이나 글루코오스의 투과성이 우수한 것을 확인하였다.
(실시예 13)
하이드로겔의 붕괴성 평가
[이식용 디바이스의 조제]
먼저, 이하의 실시예 13-1 내지 13-5의 생리 식염수 용액을 조제하였다.
[표 14]
Figure pct00099
실시예 13-1 내지 실시예 13-5의 용액으로 각각 조제한 이식용 디바이스는 이하와 같다.
<이식용 디바이스>
실시예 13-1: 실시예 13-1의 용액을 50μL 사용하여 조제한 후에, 신속히 반투막(스펙트럼사제 투석 튜브 「스펙트라/포어 CE(분획 분자량 10만)」)에 봉입(반투막의 일단부를 히트 실링한 후, 알긴산 용액을 넣어, 반대측도 히트 실링을 실시하여 봉입)하고, 55mmol/L CaCl2 용액 중에 10 내지 15분간 담그고, 디바이스 중의 알긴산 용액을 겔화하였다. 그 후, 봉입막으로부터 알긴산 겔을 취출한 이식용 디바이스
실시예 13-2: 실시예 13-2의 용액을 200μL 사용하여 조제한 후에, 실시예 13-1과 마찬가지로 제작한 이식용 디바이스
실시예 13-3a: 실시예 13-3의 용액을 50μL 사용하여 조제한 후에, 실시예 13-1과 마찬가지로 제작한 이식용 디바이스
실시예 13-3b: 실시예 13-3의 용액을 100μL 사용하여 조제한 후에, 실시예 13-1과 마찬가지로 제작한 이식용 디바이스
실시예 13-3c: 실시예 13-3의 용액을 200μL 사용하여 조제한 후에, 실시예 13-1과 마찬가지로 제작한 이식용 디바이스
실시예 13-4: 실시예 13-4의 용액을 200μL 사용하여 조제한 후에, 실시예 13-1과 마찬가지로 제작한 이식용 디바이스
실시예 13-5a: 실시예 13-5의 용액을 50μL 사용하여 조제한 후에, 실시예 13-1과 마찬가지로 제작한 이식용 디바이스
실시예 13-5b: 실시예 13-5의 용액을 100μL 사용하여 조제한 후에, 실시예 13-1과 마찬가지로 제작한 이식용 디바이스
실시예 13-5c: 실시예 13-5의 용액을 200μL 사용하여 조제한 후에, 실시예 13-1과 마찬가지로 제작한 이식용 디바이스
[시험 방법]
실시예 13-1 내지 5c 중 어느 이식용 디바이스 3장을 15mL 코니컬 튜브 중의 37℃의 생리 식염수 용액 12mL 중에 첨가하고, 중형 항온 진탕 배양기(다이테크 가부시키가이샤, 바이오 셰이커(등록 상표) BR-43FL·MR)를 사용하여, 37℃로 유지한 채 왕복 진탕의 방식으로 진폭 25mm, 진탕 속도 180rpm의 조건에서 진탕하였다. 시험 개시 1.5시간 후, 6시간 후, 24시간 후, 96시간 후에 외액을 회수하고, 카르바졸 황산법으로 알긴산 농도를 정량하였다. 또한 시험 개시 96시간 후의 외액 회수 후에, 이식용 디바이스를 회수하여 리아제 처리함으로써 알긴산 겔을 용해시킨 후에, 잔존 겔 중의 알긴산 농도를 정량하였다.
시험 종료 시의 외액 중의 알긴산 농도 및 잔존 겔 중의 알긴산 농도로부터 디바이스 중의 알긴산 함량을 구하고, 이것을 100％로 한 경우의, 각 시험 개시 후의 외액으로부터 확인된 알긴산 농도로부터 계산되는 디바이스로부터의 누출 알긴산 함량을 붕괴율로서 산출하였다.
실시예 13의 이식용 디바이스를 사용했을 때의 시험 개시 후 96시간까지의 붕괴율을 도 17에 나타냈다. 또한, 시험 개시 24시간 후 및 96시간 후의 붕괴율을 표 15에 나타냈다.
[표 15]
Figure pct00100
실시예 13-1 및 13-2의 천연 알긴산을 사용한 이식용 디바이스는 하이드로겔 중의 알긴산이 빠르게 용해되어 하이드로겔이 붕괴되었지만, 실시예 13-3 내지 13-5의 본 발명의 이식용 디바이스는 알긴산 용출이 거의 확인되지 않고, 하이드로겔도 붕괴되지 않기 때문에, 안정성이 우수한 것을 확인하였다.
(실시예 14)
알긴산 겔로부터의 세포 탈락의 모델 시험
[이식용 디바이스의 조제]
조제한 이식용 디바이스는 이하와 같다.
<이식용 디바이스>
실시예 14-1: 실시예 13-1의 용액 45μL에 췌도 세포의 대신으로서 폴리스티렌 비즈(106-125㎛, 폴리 사이언스사, cat No. 19824)의 용액을 5μL 첨가하여 조제한 후에, 신속히 반투막(스펙트럼사제 투석 튜브 「스펙트라/포어 CE(분획 분자량 10만)」)에 봉입(반투막의 일단부를 히트 실링한 후, 알긴산 용액을 넣어, 반대측도 히트 실링을 실시하여 봉입)하고, 55mmol/L CaCl2 용액 중에 10 내지 15분간 담그고, 디바이스 중의 알긴산 용액을 겔화하였다. 그 후, 봉입막으로부터 알긴산 겔을 취출한 이식용 디바이스
실시예 14-2: 실시예 13-3a의 용액 45μL에 췌도 세포의 대신으로서 폴리스티렌 비즈를 5μL 첨가하여 사용하여 조제한 후에, 실시예 14-1과 마찬가지로 제작한 이식용 디바이스
[시험 방법]
실시예 14-1 내지 2 중 어느 이식용 디바이스 3장을 15mL 코니컬 튜브 중의 37℃의 생리 식염수 용액 12mL 중에 첨가하고, 중형 항온 진탕 배양기(다이테크 가부시키가이샤, 바이오 셰이커(등록 상표) BR-43FL·MR)를 사용하여, 37℃로 유지한 채 왕복 진탕의 방식으로 진폭 25mm, 진탕 속도 180rpm의 조건에서 진탕하였다. 시험 개시 24시간 후에 외액을 회수하고, 외액 중에 탈락된 폴리스티렌 비즈에 대하여 현미경으로 관찰하였다.
실시예 14-1의 이식용 디바이스를 사용했을 때의 시험 개시 24시간 후의 외액 관찰 사진을 도 18a에, 실시예 14-2의 이식용 디바이스를 사용했을 때의 시험 개시 후 24시간 후의 외액 관찰 사진을 도 18b에, 각각 나타냈다.
실시예 14-1의 천연 알긴산을 사용한 이식용 디바이스의 경우, 외액 중에 다수의 비즈가 관찰되고, 시험 개시 24시간 후에 대부분의 마이크로비드가 탈락되어 있는 것이 확인되었다. 한편, 실시예 14-2의 본 발명의 이식용 디바이스의 경우, 마이크로비드의 탈락이 거의 확인되지 않고(탈락율 10％ 이하로 생각됨), 봉입한 세포가 장기에 걸쳐 탈락되지 않는다고 생각되어, 안정성이 우수한 것을 확인하였다.
이상으로부터, 바람직한 양태의 이식용 디바이스는 적어도 하기 효과 중 하나 이상을 나타내는 것이 명확해졌다.
(1) 생체 적합성이나 안정성이 우수하고, 세포 독성도 적고, 이식 부위에 있어서의 유착이나 염증도 거의 없다.
(2) 겔의 용해가 적어 형상이 장기간 유지된다.
(3) 장기간에 걸쳐 혈당 강하 작용을 지속시켜, 혈당을 조절하는 것이 가능해진다.
(4) 장기간 사용한 후, 반투막 내의 알긴산 겔은 용해되지 않고 형상을 유지 가능하고, 또한 췌도의 생존·기능 유지가 가능하여, 장기간 사용할 수 있다.
(5) 교환이 가능하고, 면역 격리 가능하고, 유착, 염증 등도 적어, 안전성이 높은 의료 재료가 된다.
(6) 디바이스 내외로의 물질 투과성이 우수하다.
(7) 하이드로겔의 두께가 500㎛ 미만인 박형의 디바이스인 경우에, 500㎛ 이상인 경우와 비교하여, 디바이스를 이식한 동물의 치유율이 높다.
(8) 하이드로겔의 두께가 500㎛ 미만인 박형의 디바이스인 경우에, 500㎛ 이상인 경우와 비교하여, 디바이스의 표면에 대한 중심부의 산소 농도의 비율이 높다.
(9) 하이드로겔을 진탕한 경우에 있어서, 하이드로겔이 붕괴되지 않거나 또는 되기 어렵다.
(10) 하이드로겔을 진탕한 경우에 있어서, 하이드로겔 중에 포함되는 췌도의 겔로부터의 탈락이 적다.
보다 바람직한 양태의 이식용 디바이스는, 이식 성적이나 기능성이 우수하고, 소재에 대하여 신규이며, 당뇨병 환자(특히, I형 당뇨병 및 인슐린 고갈형 II형 당뇨병)에 이식함으로써, 장기간에 걸쳐 혈당 강하 작용을 지속시켜, 혈당을 조절하는 것이 가능해진다. 또한, 하이드로겔 내의 인슐린 분비 세포 또는 췌도의 기능이 저하된 경우에, 회수가 가능하다. 혹은, 정기적인 교환 혹은 추가 이식이 가능해진다. 또한, 이식용 디바이스의 하이드로겔에 봉입하는 인슐린 분비 세포 또는 췌도로서, 줄기 세포(iPS 등)로부터 분화시킨 인슐린 분비 세포, 또는 인간 췌도를 사용하는 것도 가능하다. 따라서, 보다 바람직한 양태의 이식용 디바이스는 유용하다.

Claims (15)

  1. 인슐린 분비 세포 또는 췌도가 봉입된 하이드로겔을 포함하는 이식용 디바이스이며, 상기 하이드로겔이 알긴산 유도체를 화학 가교에 의해 겔화한 것이며,
    상기 하이드로겔의 두께가 100㎛ 이상 500㎛ 미만인, 이식용 디바이스.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하이드로겔이, 가교로서 알긴산 유도체간에 형성되는 화학 가교를 포함하는, 이식용 디바이스.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하이드로겔이, 가교로서 위스헨 반응에 의해 형성되는 트리아졸환에 의한 화학 가교를 포함하는, 이식용 디바이스.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학 가교가, 알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 도입된 환상 알킨기와, 알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 도입된 아지드기로부터 발생하는, 이식용 디바이스.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학 가교가, 이하의 (A) 및 (B)에 기재된 알긴산 유도체의 조합에 의한 화학 가교인, 이식용 디바이스
    (A):
    알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 아미드 결합 및 2가의 링커(-L1-)를 통해, 환상 알킨기(Akn)가 도입된, 하기 식 (HA-I):
    Figure pct00101

    [식 (HA-I) 중, (ALG)는 알긴산을 나타내고; -NHCO-는 알긴산의 임의의 카르복실기를 통한 아미드 결합을 나타내고; -L1-는 하기 부분 구조식[각 식 중, 양단의 파선 외측은 포함하지 않음]:
    Figure pct00102

    의 군에서 선택되는 2가의 링커를 나타내고; Akn은 하기 부분 구조식[각 식 중, 파선 우측은 포함하지 않음]:
    Figure pct00103

    의 군에서 선택되는 환상 알킨기를 나타내고, 별표는 키랄 중심을 나타냄]로 표시되는 알긴산 유도체;
    (B):
    알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 아미드 결합 및 2가의 링커(-L2-)를 통해, 아지드기가 도입된, 하기 식 (HA-II):
    Figure pct00104

    [식 (HA-II) 중, (ALG)는 알긴산을 나타내고; -NHCO-는 알긴산의 임의의 카르복실기를 통한 아미드 결합을 나타내고; -L2-는 하기 부분 구조식[각 식 중, 양단의 파선 외측은 포함하지 않음]:
    Figure pct00105

    의 군에서 선택되는 2가의 링커를 나타냄]로 표시되는 알긴산 유도체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 화학 가교된 알긴산 유도체가, 제1 알긴산의 임의의 카르복실기와, 제2 알긴산의 임의의 카르복실기가, 하기 식 (HA-III-L):
    Figure pct00106

    [식 (HA-III-L) 중, 양단의 -CONH- 및 -NHCO-는 알긴산의 임의의 카르복실기를 통한 아미드 결합을 나타내고;
    -L1-는 상기 제5항 중의 정의와 동일하고;
    -L2-는 상기 제5항 중의 정의와 동일하고;
    X는 하기 부분 구조식:
    Figure pct00107

    의 군에서 선택되는 환상기이며(각 식 중, 양단의 파선 외측은 포함하지 않음), 별표는 키랄 중심을 나타냄]을 통해 결합된 가교 알긴산인, 이식용 디바이스.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학 가교가, 이하의 (A) 및 (B)에 기재된 알긴산 유도체의 조합에 의한 화학 가교인, 이식용 디바이스.
    (A): 알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 아미드 결합 및 2가의 링커(-L1-)를 통해, 환상 알킨기(Akn)가 도입된, 하기 식 (HB-I):
    Figure pct00108

    [식 (HB-I) 중, (ALG)는 알긴산을 나타내고; -NHCO-는 알긴산의 임의의 카르복실기를 통한 아미드 결합을 나타내고; -L1-는 하기 표:
    [표 16-1]
    Figure pct00109

    [표 16-2]
    Figure pct00110

    에 기재된 부분 구조식[각 식 중, 양단의 파선 외측은 포함하지 않음]으로 이루어지는 군에서 선택되는 링커를 나타내고;
    Akn은 하기 표:
    [표 17]
    Figure pct00111

    에 기재된 부분 구조식[각 식 중, 파선 우측은 포함하지 않음]으로 이루어지는 군에서 선택되는 환상 알킨기를 나타냄]로 표시되는 알긴산 유도체;
    (B): 알긴산의 임의의 1개 이상의 카르복실기에 아미드 결합 및 2가의 링커(-L2-)를 통해, 아지드기가 도입된, 하기 식 (HB-II):
    Figure pct00112

    [식 (HB-II) 중, (ALG)는 알긴산을 나타내고; -NHCO-는 알긴산의 임의의 카르복실기를 통한 아미드 결합을 나타내고; -L2-는 하기 표:
    [표 18-1]
    Figure pct00113

    [표 18-2]
    Figure pct00114

    에 기재된 부분 구조식[각 식 중, 양단의 파선 외측은 포함하지 않음]으로 이루어지는 군에서 선택되는 링커를 나타냄]로 표시되는 알긴산 유도체(단, 식 (HB-I)로 표시되는 알긴산 유도체에 있어서 -L1-가 (L1-1), (L1-2a), (L1-2b), (L1-11) 또는 (L1-12)의 군에서 선택되는 어느 하나의 링커인 유도체와, 식 (HB-II)로 표시되는 알긴산 유도체에 있어서 -L2-가 (L2-10)의 링커인 유도체의 조합에 의한 화학 가교는 제외함).
  8. 제7항에 있어서, 상기 화학 가교된 알긴산 유도체가, 제1 알긴산의 임의의 카르복실기와, 제2 알긴산의 임의의 카르복실기가, 하기 식 (HB-III-L):
    Figure pct00115

    [식 (HB-III-L) 중, 양단의 -CONH- 및 -NHCO-는 알긴산의 임의의 카르복실기를 통한 아미드 결합을 나타내고;
    -L1-는 상기 제7항 중의 정의와 동일하고;
    -L2-는 상기 제7항 중의 정의와 동일하고; X는 하기 표:
    [표 19-1]
    Figure pct00116

    [표 19-2]
    Figure pct00117

    에 기재된 부분 구조식의 군에서 선택되는 환상기임(각 식 중, 양단의 파선 외측은 포함하지 않음)]을 통해 결합된 가교 알긴산인(단, 식 (HB-I)로 표시되는 알긴산 유도체에 있어서 -L1-가 (L1-1), (L1-2a), (L1-2b), (L1-11) 또는 (L1-12)의 군에서 선택되는 어느 하나의 링커인 유도체와, 식 (HB-II)로 표시되는 알긴산 유도체에 있어서 -L2-가 (L2-10)의 링커인 유도체의 조합에 의한 가교 알긴산은 제외함), 이식용 디바이스.
  9. 제5항 또는 제6항에 있어서, 식 (HA-I)의 알긴산 유도체가 하기 식 (EX-1-(I)-A-2)이며,

    식 (HA-II)의 알긴산 유도체가 하기 식 (EX-2-(II)-A-2)인,
    Figure pct00119

    이식용 디바이스.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 췌도가 인간 췌도 또는 돼지 췌도인, 이식용 디바이스.
  11. 제10항에 있어서, 상기 췌도가 돼지의 성체의 췌도인, 이식용 디바이스.
  12. 제10항에 있어서, 상기 췌도가 태생기, 신생아기 또는 주산기의 돼지 췌도인, 이식용 디바이스.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔이 또한 반투막으로 피복된, 이식용 디바이스.
  14. 제13항에 있어서, 상기 반투막이 셀룰로오스 유도체로부터 형성된 투석막인, 이식용 디바이스.
  15. 제14항에 있어서, 상기 셀룰로오스 유도체가 아세트산셀룰로오스인, 이식용 디바이스.
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