CN101835493A - 两亲性聚合物和属于bmp家族的成骨蛋白之间的复合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在物理和化学上稳定的、可溶于水的两亲性聚合物-BMP复合物,其特征在于:所述两亲性聚合物由通过疏水取代基和亲水基团进行官能化的亲水性多糖骨架构成;所述BMP选自在治疗上有活性的BMP(骨形态发生蛋白);聚合物/BMP的质量比小于或等于700。本发明还涉及在水性介质中和在不存在能够使该蛋白质变性的有机溶剂的情况下制备所述两亲性聚合物-BMP复合物的方法。本发明还包括根据本发明的两亲性聚合物-BMP复合物的治疗组合物。
Description
本发明涉及两亲性聚合物和属于骨形态发生蛋白(BMP)家族的成骨蛋白之间的水溶性原始复合物的形成,所述复合物是在物理和化学上稳定的并因此改善了在体外和在体内BMP的物理和化学稳定性。
骨形态发生蛋白(BMP)是参与骨诱导机制的生长因子。也称为成骨蛋白(OP)的BMP最初于1965年由Urist进行了表征(Urist MR.Science 1965;150,893)。这些从骨密质分离出的蛋白质具有在许多动物中诱导骨形成的能力(Urist MR.Science 1965;150,893)。
BMP以前肽的形式进行表达,后者在翻译后成熟之后,具有104至139个残基的长度。它们彼此之间具有很大的序列同源性并且具有类似的三维结构。特别地,它们具有6个在形成“半胱氨酸结(cysteineknot)”的分子内二硫键中所牵涉的半胱氨酸残基(Scheufler C.2004J.Mol.Biol.1999;287,103;Schlunegger MP,J.Mol.Biol.1993;231,445)。它们中的某些具有还在导致二聚体形成的分子间二硫键中所牵涉的第7个半胱氨酸(Scheufler C.2004J.Mol.Biol.1999;287:103)。
在其活性形式下,BMP装配成同二聚体,甚至异二聚体,如Israel等人所描述的那样(Israel DI,Growth Factors.1996;13(3-4),291)。二聚体BMP与BMPR类型的跨膜受体相互作用(Mundy等人,Growth Factors,2004,22(4),233)。该识别引发尤其牵涉Smad蛋白的细胞内信号传导级联,如此导致靶基因的激活或抑制。
BMP(除了BMP 1和3外)对于间充质细胞的分化起着直接或间接的作用,导致它们分化为成骨细胞(Cheng H.,J.Bone and JointSurgery,2003,85A 1544-1552)。此外,它们还具有趋化性并且诱导增殖、分化和血管发生。
某些重组人BMP,尤其是rhBMP-2和rhBMP-7,清楚地显示出在人中于体内诱导骨形成的能力并且已被批准用于某些医学应用。因此,将重组人BMP-2(根据国际通用命名为代勃特明-α)配制在以的名称(在美国)和以的名称(在欧洲)进行销售的产品中。该产品被指定用于腰椎的融合和胫骨的骨再生(对于称为骨不连合的骨折)。在用于腰椎融合的的情况下,外科手术首先在于用rhBMP-2的溶液浸透胶原海绵,然后将海绵放置入预先植入到椎骨之间的空心支架(LT支架)中。
重组人BMP-7(根据国际通用命名为依托特明-α)具有与BMP-2相同的治疗适应症并且构成了两种产品的基础:用于胫骨的开放性骨折的OP-1 Implant和用于腰椎融合的OP-1 Put ty。OP-1 Implant由待接纳在0.9%盐水溶液中的包含rhBMP-7和胶原的粉末组成。然后,将所获得的糊状物在外科手术期间应用在骨折处。OP-1 Putty以两种粉末的形式存在:一种包含rhBMP-7和胶原,另一种包含羧甲基纤维素(CMC)。在外科手术过程中,CMC用0.9%盐水溶液进行重构并与rhBMP-7和胶原相混合。将如此获得的糊状物应用在待处理的部位上。
在目前已商业化的所有蛋白质中,BMP由于其强烈的疏水性和其聚集的能力(这导致在生理pH下非常低的溶解度)而显得突出。在BMP-2的情况下,这些性质已在为了其临床开发而进行的研究的范围内被证明。它们在生理条件下溶解性差并且具有聚集的倾向(Schmoekel,2004J.Orthop.Res.2004;22(2),376;Friess,W.,Drug Delivery Systems Based on Collagen,Shaker Verlag,ThesisAachen Germany 1999;Schwartz DH,Thesis München Germany 2005)。因此,Abbatiello和Porter(Protein Sci.1997,6,Suppl 2 99)已显示,在低离子强度的缓冲液中,当pH增加至4.5以上时,BMP-2变得越来越不溶。对于高于6.5的pH,观察到蛋白质发生沉淀,但在氯离子和/或硫酸根离子存在下在稍低的pH下(pH5.8,50mM NaCl;和pH5.5,5mM Na2SO4)也观察到沉淀,正如由Friess(Friess,W.,Drug Delivery Systems Based on Collagen,Shaker Verlag,ThesisAachen Germany 1999)所显示的。因此,在生理条件下BMP-2的配制完全是一个问题。
BMP的物理不稳定性这个问题的另一个例子由B iopharm在专利US2004132653中用BMP-14类的蛋白质GDF-5(生长和分化因子(Growth and Differentiation Factor),也称为MP-52)进行了揭示。GDF-5的性质与BMP-2非常相似,并且已观察到冻干物的不稳定性,所述冻干物具有在溶液重构过程中凝缩和不能完全再溶解的倾向。这两个现象与蛋白质的不可逆聚集有关。为了解决这个问题,在冻干之前添加甘露醇,从而使得能够在固体状态下防止这些问题。然而,甘露醇仅提供了体外的低的稳定化而不能防止体内的物理不稳定性。
然而,基于治疗性蛋白质的药物的制造商极度地受到所述蛋白质的物理稳定性问题的困扰。这是因为,BMP聚集体的形成可以导致:
●生物学活性种类的数量的减少,
●生物活性或吸收速度的改变,
●针对这些聚集体的可能的免疫应答,
●由于产品的乳光而引起的不希望的外观,
●过滤设备和注射装置的阻塞。
为了获得的所希望的治疗效果,必需采用非常大的、高于生理剂量10000倍的BMP的治疗剂量。这种情况特别是在用产品例如进行椎骨融合的治疗时,因为施用几毫克的rhBMP-2。这种待施用的BMP的巨大数量意味着必须在大约1.5mg/ml的BMP溶液的高浓度下进行工作。在这样的浓度,BMP非常容易聚集,因而不是在物理上稳定的。所提供的溶液采用酸性缓冲液和表面活性剂。然而,从治疗应用的角度看,采用酸性且包含表面活性剂的溶液是有问题的。
已开发了几种方法以解决物理和化学稳定性的这些问题。
首先,公知肝素和硫酸乙酰肝素用于使生长因子(包括BMP)稳定,因为这些多糖是内源的稳定分子(Ruppert等人,Eur.J.Biochem.1996,237,295)。然而,肝素和硫酸乙酰肝素具有非常强的抗凝和抗补体活性,因而不能用于药物组合物。
Hubbell描述了蛋白质的嫁接方法,其在于在蛋白质和载体之间形成化学键以便在纤维蛋白类型的基质中稳定所述蛋白质。所述键借助于可被酶切割的融合蛋白来建立。在出版物Biotechno.Bioeng.2005,89,3,253中所报道的这种方法使得能够通过阻止聚集而有效地在物理上稳定该蛋白质。然而,该方法导致采用了BMP-2的类似物,其迄今还未显示出其治疗效力和其无害性。
在专利US20050209145中,Stupp等人描述了用于生长因子(特别是BMP-2)的载体化的两亲性肽。这些两亲性肽由末端烷基链、亲水性肽序列和允许BMP-2的粘附的表位构成。这些肽在溶液中进行组织排列,从而形成小棍类型的大分子结构,其中疏水基团重集聚在中心。周围的氨基酸使得能够提供与水的相容性和蛋白质的粘附。然而,这些肽由于其复杂的一级结构而具有免疫风险。
在专利US6258382中,Takaoka等人所感兴趣的是BMP的载体化以用于骨再生的应用。这些作者开发出了基于乳酸和/或乙醇酸、对-二氧杂环己酮、聚乙二醇的新型聚合物,其允许控制这些蛋白质的释放。然而,这些作者没有解决任何在物理或化学稳定性方面的与该生长因子有关的问题。此外,这些聚合物在水中是不溶的,但吸附水从而形成凝胶。相反地,这些聚合物在有机介质中是可溶的,并且溶于丙酮。因此,聚合物-BMP-2制剂的制备需要采用有机溶剂,这意味着蛋白质变性的风险(Nature Biotechnology,2001,19,332)。
在专利US2005/0287135中,Wyeth描述了通过疏水基团(苄醇)进行修饰的乙酰透明质酸,用于BMP的载体化。在这些聚合物中,疏水基团的比率为50至100%,以致该聚合物在水中不溶但是可以吸附水。在这种情况下,这些吸湿的聚合物不能与该蛋白质形成水溶性复合物,以便使得能够解决BMP的稳定性问题。在Fidia et GeneticsInstitute的EP1454640中,也描述了相同类型的制剂,然而,所描述的制剂不形成复合物,所例示的多糖不溶于水并且包含多于50%的疏水性酯基团。
在专利NZ530701中,Brodbeck等人采用PLAGA来用于BMP的载体化。这些聚合物在水中不溶,因此不能与该蛋白质形成水溶性复合物。与申请人相反,所述作者的目标是使在由PLAGA构成的固体中的BMP不溶于水性介质,这仍需要采用有机溶剂,这意味着蛋白质变性的风险。
作为例子,可以提及以题目“Effects of heparin-like polymersassociated with growth factors on osteoblast proliferation andphenotype expression”,1998,J.Biomed.Mater.Res.,第44卷,第63-72页发表的Blanquaert等人和Barritault等人的工作,其描述了用被认为与各种生长因子相互作用的苄胺进行修饰的葡聚糖的用途。所述聚合物被描述为本身具有治疗活性。这些作者还声称,这些葡聚糖中的某些,更特别是用羧甲基(CM)、苄基酰胺(B)和磺酸(S)基团取代的葡聚糖,(化合物CMDBS),使得能够在不添加生长因子的情况下刺激骨重建(1995,Bone,17,6,499-506)。
根据类似的方法,在专利FR2794649中,Blanchat等人描述了用苄胺进行修饰的葡聚糖和通过借助于磷酸三甲酯使聚合物链交联而变得不溶的硫酸酯。这些在水性介质中的海绵充当BMP的储库,因为它们能够保留住该蛋白质。在交联之前,两亲性聚合物与BMP-2形成复合物,如在通过凝胶电泳进行的相互作用分析中所显示的那样。然而,所用的聚合物/BMP的质量比非常高,大于5000。采用这样的高比例是由于非常弱的聚合物/蛋白质相互作用,其导致复合物在溶液中解离。此外,没有证明BMP的化学或物理稳定性。此种比例对于开发药物产品来说是主要障碍。
还已知苄胺可能具有一定的毒性和可能损害在前面提及的两篇专利中所描述的聚合物的生物相容性。
用于骨重建的此类蛋白质的盖仑氏制剂应当必须满足赋形剂的无害性要求,并且为了到达这些要求,必需使用生物相容性化合物但还要限制其相对于活性成分的量。
因此,开发出允许使成骨蛋白例如BMP增溶和稳定的可注射制剂这一问题没有得到满意解决,所述BMP选自BMP-2(代勃特明-α)、BMP-4、BMP-7(依托特明-α)、BMP-14和GDF-5。
本发明使得能够在成骨蛋白和生物相容性两亲性聚合物之间以低于700的聚合物/BMP质量比形成稳定的水溶性复合物。该复合物使得能够:
●避免在体外和在体内在生理pH下由于其疏水性而发生的BMP聚集,
●在37℃下在细胞存在下稳定BMP。
该水溶性复合物在完全水性的介质中形成,而无需凭借于使用有机溶剂。
因此,本发明涉及在物理和化学上稳定的、可溶于水的两亲性聚合物-BMP复合物,其特征在于:
■所述两亲性聚合物由通过疏水取代基和亲水基团进行官能化的亲水性多糖骨架构成,根据下述通式I:
DP=m个单体单元
●R,R′,相同或不同,并且表示键或包含1至18个碳的链,所述链任选地是支化的和/或不饱和的,且包含一个或多个杂原子例如O、N或/和S,
●F,F′,相同或不同,并且表示酯、硫酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、醚、硫醚或胺,
●X表示亲水基团,其选自羧酸根、硫酸根、磺酸根、磷酸根、膦酸根,
●Y表示亲水基团,其选自硫酸根、磺酸根、磷酸根、膦酸根,
●Hy表示疏水基团,其选自下列:
○线性或支化的C8-C30烷基,其任选地是不饱和的和/或包含一个或多个杂原子例如O、N或S,
○线性或支化的C8-C18烷基芳基或芳基烷基,其任选地是不饱和的和/或任选地包含一个或多个杂原子例如O、N或S,
○C8-C30多环,其任选地是不饱和的和/或任选地包含一个或多个杂原子例如O、N或S,
○苄胺除外,
●n和o为1至3,
●h表示疏水基序相对于糖单元而言的摩尔份数,其为0.01至0.5,
●x表示亲水基团相对于糖单元而言的摩尔份数,其为0至2.0,
●y表示亲水基团相对于糖单元而言的摩尔份数,其为0至0.5,
■所述BMP选自在治疗上有活性的BMP(骨形态发生蛋白),
■聚合物/BMP的质量比小于或等于700。
在一个实施方案中,在根据本发明的复合物中,所述多糖选自如前面所定义的通式I的多糖,其中y=0。
在一个实施方案中,在根据本发明的复合物中,所述多糖选自如前面所定义的通式I的多糖,其中X表示羧酸根。
在一个实施方案中,在根据本发明的复合物中,根据本发明的多糖的特征在于基团R选自下列基团:
在一个实施方案中,本发明涉及复合物,其特征在于,聚合物/BMP的质量比小于或等于600。
在一个实施方案中,本发明涉及复合物,其特征在于,聚合物/BMP的质量比小于或等于500。
治疗用途的BMP的浓度为在溶液中大约1.5mg/ml。当所述比例大于700时,获得包含1.0g/ml的两亲性聚合物的组合物。基于这样的聚合物浓度,制剂具有不再适合于药学应用的物理化学行为,例如在粘度方面。
本发明涉及复合物,其特征在于,所述BMP选自BMP-2(代勃特明-α)、BMP-4、BMP-7(依托特明-α)、BMP-14和GDF-5。
所述两亲性聚合物的取代基以受控方式或随机方式分布。在具有取代基的受控分布的聚合物中,可以提及例如嵌段共聚物和交替共聚物。
无规共聚物
嵌段共聚物
交替共聚物
因此,在一个实施方案中,本发明还涉及两亲性聚合物-BMP复合物,其特征在于,所述聚合物选自其取代基以随机方式分布的聚合物。
在一个实施方案中,所述多糖选自乙酰透明质酸、藻酸盐、壳聚糖、聚半乳糖醛酸、硫酸软骨素、葡聚糖、纤维素。
纤维素的组由通过酸进行官能化的纤维素例如羧甲基纤维素构成。
葡聚糖的组由通过酸进行官能化的葡聚糖例如羧甲基葡聚糖构成。
在一个实施方案中,所述多糖选自乙酰透明质酸、藻酸盐、壳聚糖。
这些不同的多糖可以如下来表示:
聚半乳糖醛酸
乙酰透明质酸
R=H,葡聚糖
R=CH2COOH或H,羧甲基葡聚糖
壳聚糖
藻酸盐。
所述多糖可以具有10至10000的平均聚合度。
在一个实施方案中,所述多糖具有10至1000的平均聚合度。
在另一个实施方案中,所述多糖具有10至500的平均聚合度。
在一个实施方案中,本发明还涉及两亲性聚合物-BMP复合物,其特征在于,所述疏水基团Hy选自天然来源的疏水氨基酸或者其醇、酯、脱羧基或酰胺衍生物,所述天然来源的疏水氨基酸选自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。
在一个实施方案中,本发明还涉及两亲性聚合物-BMP复合物,其特征在于,所述疏水基团Hy是色氨酸或者色氨酸的酯或酰胺衍生物。
在色氨酸的衍生物中,可提及色氨醇(tryptophanol)、色氨酰胺(tryptophanamide)、2-吲哚乙胺。
在一个实施方案中,根据本发明的两亲性聚合物-BMP复合物是可逆的。
所使用的聚合物按照本领域技术人员已知的技术来合成,或者从制造商例如Sigma-Aidr ich、NOF Corp.或CarboMer Inc.购买。
所述BMP选自重组人BMP,其按照本领域技术人员已知的技术获得,或者从制造商例如Research Diagnostic Inc.(USA)公司购买。
BMP是非常疏水的生长因子。在生理pH下,该蛋白质的疏水性导致聚集,然后导致沉淀。根据本发明的两亲性聚合物-BMP复合物使得能够在物理上稳定在处于生理pH的溶液中的该蛋白质。
“物理或化学降解”是指任何物理范畴的事件,例如聚集,或者化学范畴的事件,例如蛋白水解,其导致该蛋白质的生物学活性降低。
平行地,“蛋白质的物理或化学稳定化”是指保持该蛋白质的生物学活性的动作。
复合物的稳定性通过测量BMP的稳定性来进行监测。
因此,可以尤其是通过进行下列测试来证明通过两亲性聚合物的该蛋白质的稳定化:
●通过凝胶混合电泳来揭示两亲性聚合物-BMP复合物的测试,
●在37℃和中性pH下进行的在两亲性聚合物-BMP复合物中在细胞存在下BMP的热稳定性的测试,
●在生理pH下在所述复合物中BMP的物理稳定化的测试。
通过凝胶混合电泳来揭示两亲性聚合物-BMP复合物的测试基于在电场的影响下离子的移动。阴离子复合物向阳极迁移,而阳离子复合物向阴极移动。在迁移后,通过毛细管作用将蛋白质转移到PVDF膜上,并且通过该蛋白质的特异性抗体(其被与过氧化物酶相偶联的二抗所识别)来揭示。单独的蛋白质不迁移;与两亲性聚合物相复合的蛋白质依照该复合物的总电荷而向阳极或阴极迁移。
在细胞存在下BMP的热稳定性的测试在37℃和中性pH下进行,并且在于将BMP的溶液放置入包含成肌细胞C2C12的培养基中。在放置后(J2)和在5天的培养结束时(J7)通过ELISA测定法来测定BMP溶液的浓度。通过测定在成肌细胞分化为成骨细胞的过程中在J2和J7之间所产生的碱性磷酸酶的活性来评价BMP的生物学活性。
生理pH下BMP的物理稳定化的测试基于通过将蛋白质的初始缓冲液(通常在酸性pH下)与pH7.4的PBS溶液进行交换来将蛋白质溶液带至生理pH。进行三次交换,同时保持BMP在交换结束时处于恒定的浓度。在该过程结束时,通过在离心后进行ELISA测定法来测定溶液中BMP的浓度。该测试还可以通过用固定在pH7.4的缓冲液稀释浓缩的BMP-2溶液来进行。
通过在不存在任何能够使该蛋白质变性的有机溶剂的情况下,在生理pH下将BMP和两亲性聚合物制成水溶液来形成根据本发明的两亲性聚合物-BMP复合物。两亲性聚合物-BMP复合物的形成是自发的,并且不牵涉BMP和两亲性聚合物之间的共价键。这种缔合通过弱键来进行,所述弱键主要是疏水相互作用和离子相互作用。复合物的这种形成不需要任何有机溶剂。
任选地,可以布置其他测试以完善根据本发明的两亲性聚合物-BMP复合物的证明。
●BMP的三级结构的维持的测试,通过圆二色性来测定。
●在生理pH和胁迫下,在根据本发明的两亲性聚合物-BMP复合物中BMP的稳定性的测试。所述胁迫可以是特定的搅拌方式、盐的存在,等等。
●对于蛋白水解酶例如嗜热菌蛋白酶的抗性的测试。
通过本发明解决的问题之一是增加了蛋白质的稳定化,并因此在体外和在体内保持了生物学活性。该生物学活性可以通过能够显示BMP使成肌细胞分化为成骨细胞的能力的各种测试来进行评价。所述分化可以通过下列方式来测量:
●测定在细胞培养物中所产生的碱性磷酸酶的活性,
●产生碱性磷酸酶的细胞的着色,
●在细胞培养物中所产生的骨钙蛋白的RNA的RT-PCR。
本发明还涉及治疗组合物,其特征在于,所述治疗组合物包含根据本发明的两亲性聚合物-BMP复合物。
“治疗组合物”是指在人类医学或兽医学中可用的组合物。
优选地,根据本发明的药物组合物是局部应用的组合物,其可以以溶液、凝胶、霜剂、冻干物、粉剂或糊剂的形式存在。
能够与根据本发明的两亲性聚合物-BMP复合物一起进行配制的赋形剂的种类根据盖仑氏医学学者(galéniste)的常识依照该复合物的呈现形式来进行选择。
因此,当根据本发明的组合物以糊剂的形式存在时,该糊剂可以例如从诸如羧甲基纤维素(CMC)、磷酸三钙和胶原的产品来获得。
为了调节该制剂的参数,在本发明中可以使用其他赋形剂,例如用于调节pH的缓冲液,使得能够调节等渗性的试剂,防腐剂例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、间甲酚或苯酚,或者抗氧化剂例如盐酸L-赖氨酸。
根据本发明,所述治疗组合物的特征在于,所述治疗组合物使得能够施用大约1.5mg/ml的BMP。
本发明还涉及根据本发明的两亲性聚合物-BMP复合物在制备用于在体内诱导骨形成的治疗组合物中的用途。
本发明还涉及用于人或兽医学使用的治疗性治疗方法,其特征在于,所述方法在于在治疗部位处施用包含根据本发明的两亲性聚合物-BMP复合物的治疗组合物。
两亲性聚合物的合成
实施例1:通过色氨酸乙酯进行修饰的羧甲基葡聚糖(PA 1)
从具有1.0的以“羧甲基/糖单元”表示的取代度和60kg/mol的平均摩尔质量的羧甲基葡聚糖开始来合成该两亲性聚合物。根据采用氯甲酸乙酯和N-甲基吗啉的在有机溶剂中的常规偶联方法,将色氨酸乙酯嫁接到该聚合物的酸上。在将反应介质在水中进行稀释并通过添加1N NaOH将pH调节至7后,通过超滤来纯化该聚合物。最终的聚合物的特征为:
×0.45的以“TrpOEt/糖单元”表示的取代度,其是在D2O/NaOD中通过1H NMR而测定的,
×0.55的以“羧酸根(甲基羧酸根)/糖单元”表示的取代度,其是通过电势分析法而测定的。
实施例2:通过色氨酸(钠盐)进行修饰的羧甲基葡聚糖(PA 2)
通过PA 1的碱性水解来获得该两亲性聚合物。向两亲性聚合物1的水溶液(64ml,31mg/ml)中添加1N氢氧化钠(3.79ml)以达到pH12.7。将所获得的溶液在环境温度下搅拌过夜。通过逆水(0.9%NaCl和H2O)进行透析来纯化该聚合物。最终的聚合物的特征为:
×0.45的以“TrpONa/糖单元”表示的取代度,其是在D2O/NaOD中通过1H NMR而测定的,
×1.0的以“羧酸根(甲基羧酸根,色氨酸的羧酸根)/糖单元”表示的取代度,其是通过电势分析法而测定的。
实施例3:通过苯丙氨酸乙酯进行修饰的羧甲基葡聚糖(PA 3)
根据实施例1,从具有1.0的以“羧甲基/糖单元”表示的取代度和60kg/mol的平均摩尔质量的羧甲基葡聚糖开始来合成该两亲性聚合物。最终的聚合物的特征为:
×0.45的以“PheOEt/糖单元”表示的取代度,其是在D2O/NaOD中通过1H NMR而测定的,
×0.55的以“羧酸根(甲基羧酸根)/糖单元”表示的取代度,其是通过电势分析法而测定的。
实施例4:通过酪氨酸甲酯进行修饰的羧甲基葡聚糖(PA 4)
根据实施例1,从具有1.0的以“羧甲基/糖单元”表示的取代度和60kg/mol的平均摩尔质量的羧甲基葡聚糖开始来合成该两亲性聚合物。最终的聚合物的特征为:
×0.45的以“TyrOMe/糖单元”表示的取代度,其是在D2O/NaOD中通过1H NMR而测定的,
×0.55的以“羧酸根(甲基羧酸根)/糖单元”表示的取代度,其是通过电势分析法而测定的。
实施例5:通过色氨酸乙酯进行修饰的葡聚糖琥珀酸(PA 5)
从根据(Sanchez-Chaves,Manuel等人,Polymer 1998,39(13),2751-2757)的文章获得的具有1.0的以“琥珀酸/糖单元”表示的取代度和70kg/mol的平均摩尔质量的葡聚糖琥珀酸开始来合成该两亲性聚合物。根据采用氯甲酸乙酯和N-甲基吗啉的在有机溶剂中的常规偶联方法,将色氨酸乙酯嫁接到该聚合物的酸上。在将反应介质在水中进行稀释并通过添加1N NaOH将pH调节至7后,通过超滤来纯化该聚合物。最终的聚合物的特征为:
×0.45的以“TrpOEt/糖单元”表示的取代度,其是在D2O/NaOD中通过1H NMR而测定的,
×0.55的以“羧酸根(琥珀酸的羧酸根)/糖单元”表示的取代度,其是通过电势分析法而测定的。
相反实施例1:通过十二烷胺进行修饰的羧甲基葡聚糖(PA 6)
根据实施例1,从具有1.0的以“羧甲基/糖单元”表示的取代度和60kg/mo l的平均摩尔质量的羧甲基葡聚糖开始来合成该两亲性聚合物。最终的聚合物的特征为:
×0.10的以“十二烷胺/糖单元”表示的取代度,其是在D2O/NaOD中通过1H NMR而测定的,
×0.90的以“羧酸根(甲基羧酸根)/糖单元”表示的取代度,其是通过电势分析法而测定的。
相反实施例2:通过苄胺进行修饰的羧甲基葡聚糖(PA 7)
该两亲性聚合物在专利FR2794649A中作了描述,它的特征为:
×0.45的以“苄胺/糖单元”表示的取代度,
×0.55的以“羧酸根(甲基羧酸根)/糖单元”表示的取代度。通过共电泳的BMP-2对两亲性聚合物的亲和力
BMP-2/两亲性聚合物复合物的制备
向7μl的缓冲至pH7.4的100mg/ml PA溶液中添加5μl在缓冲液H2O/AcN/TFA(64.9/35/0.1%)中的0.28mg/ml BMP-2溶液。用0.9%NaCl溶液将该溶液补足至14μl。该溶液具有0.1mg/ml的BMP-2的浓度和1/500的BMP-2/PA比例。将该溶液在环境温度下温和地搅拌30分钟。
BMP-2/两亲性聚合物复合物的证明
将BMP-2/PA溶液在迁移缓冲液(pH7的tris-乙酸盐溶液)中稀释20倍。然后,向8μl水和7μl上样缓冲液(水中的甘油、tris-乙酸盐和溴酚蓝)中添加2μl经稀释的溶液。将包含10ng BMP-2和5μg PA的这17μl置于0.8%琼脂糖凝胶的孔中。合上电泳槽,并将电发生器调至30V。迁移持续1小时。
在迁移后,在电场下将凝胶转移至置于阳极处的PVDF膜上(20分钟,15V,Bio-Rad的Trans-Blot SD)。在环境温度下用脱脂乳使该膜饱和1小时,接着与BMP-2的一抗一起进行温育(于4℃下过夜),并最后与二抗即兔抗山羊-HRP一起进行温育(在环境温度下1小时)。通过HRP对于Opti-4CN的反应来进行揭示。当着色足够时终止揭示,因为反应产物吸收可见光。
当BMP-2与PA形成复合物时,在离上样处0.7cm处以单个点的形式检测到该复合物(向阳极迁移)。当BMP-2是单独的或者不与PA形成复合物时,它在上样的地方被检测到,因此没有迁移。
关于所述5种聚合物的结果概括在下表中。
两亲性聚合物 | 迁移 |
无 | 没有 |
PA 1 | 有 |
PA 2 | 有 |
PA 3 | 有 |
PA 4 | 有 |
PA 5 | 有 |
PA 6 | 没有 |
PA 7 | 没有 |
生理pH下在两亲性聚合物存在下BMP-2的稳定性
BMP-2/两亲性聚合物复合物的制备
从在缓冲液H2O/AcN/TFA(64.9/35/0.1%)中的0.28mg/ml BMP-2溶液开始,制备下列各种溶液:
1.通过在水中进行稀释而获得的0.084mg/ml的BMP-2溶液,
2.通过用14mg/ml的PA溶液稀释BMP-2而获得的0.084/9.8mg/ml的BMP-2/两亲性聚合物溶液。
然后,将每种溶液用pH7.4和300mO sm的10mM PBS溶液稀释至1/10,随后通过在Microcon组件(cellule)(YM10,10kD,500μl)上进行离心而再浓缩。该操作重复两次。在这三次洗涤后,离心每种溶液,并通过ELISA测定法来测定上清液中的BMP-2的浓度。
一部分的0.084mg/ml的BMP-2溶液不经历任何洗涤以便作为对照。另一部分的0.084mg/ml的BMP-2溶液经历三个循环的用1mM HCl溶液(pH3)进行的洗涤。已知该缓冲液稳定BMP-2,但是与药学应用是不相容的。
没有经历任何洗涤的BMP-2溶液的ELISA测定给出83.4μg/ml的BMP-2的浓度。该值相应于100%的BMP-2。将通过在三次用PBS进行的洗涤结束时其他溶液的ELISA所测定的浓度与未洗涤的BMP-2的该值相联系。将所测得的BMP-2的百分比集中在下表中。
溶液 | %存在的BMP-2 |
BMP-2 | 2 |
BMP-2/PA 1 | 68 |
BMP-2/PA 2 | 90 |
BMP-2/PA 3 | 68 |
BMP-2/PA 4 | 51 |
BMP-2/PA 6 | 0 |
能够与BMP-2形成复合物的PA致使BMP-2在生理pH下稳定。在不存在PA时,在生理pH下BMP-2不再存在于溶液中。同样地,在不与BMP-2形成复合物的PA存在下,该蛋白质不再存在于溶液中。
在37℃和生理pH下,在培养基中,在两亲性聚合物存在下BMP-2的稳定性和生物学活性
在J 0,将C2C12细胞(小鼠的肌细胞)接种于包含具有10%FCS和1%TBA的DMEM的96孔培养板中(7000个细胞/孔),然后置于培养箱中24小时。在J1,在细胞粘着后,将该培养基替换成具有2%FCS和1%TBA的DMEM,持续24小时。在J2,将该培养基替换成补充有单独BMP-2溶液(0.3μg/ml)或BMP-2/PA 1复合物溶液(0.3/150μg/ml,1/500的比例)的具有2%FCS和1%TBA的DMEM。通过在具有2%FCS和1%TBA的DMEM中分开地稀释BMP-2和PA来制备该复合物。在放置之前,让蛋白质/PA 1混合物静置1小时。
在J7,即放置后5天,抽取上清液以便通过ELISA来测定残留的BMP-2的量。
与细胞接触5天后,留下少于5%的单独BMP-2,而当它与PA 1复合时,留下多于40%的BMP-2。
在J7,在相同的实验中,将细胞用PBS洗涤2次,随后用50μl裂解缓冲液进行裂解并经历3个循环的冷冻(-80℃)/解冻(37℃)。在底物即磷酸对硝基苯酯(其在405nm处吸收)上,在裂解物中测量碱性磷酸酶的酶活性。将该活性归并为通过microBCA测量的蛋白质的量,并因此表示为nmol pnP/分钟.μg蛋白质。
在存活条件下BMP-2通过复合物而被稳定5天以上,而在这样的持续时间内它在单独时则是不稳定的。
BMP-2的活性通过细胞分化的缓慢过程来显现,BMP-2的复合物在体外比单独BMP-2更具活性。
聚合物保护了BMP-2免于酶促降解
BMP-2/聚合物复合物的制备
将19μl在TFA乙腈缓冲液中的0.315mg/ml BMP-2溶液混合入4.6μl的66mg/ml聚合物(PA 2)溶液、50μl的50mM Tris(pH7.5)、60μl的25μg/ml嗜热菌蛋白酶和366.4μl H2O中。制备相似但不含有聚合物的溶液作为对照。在这两种溶液中,嗜热菌蛋白酶为所述蛋白质的25%(质量/质量)。
消化的动力学:
将包含嗜热菌蛋白酶的单独BMP-2溶液和复合物溶液在60℃下温育6小时。在T=0、20分钟、40分钟、1小时、2小时和6小时处抽取20μl样品。向每个样品中立即添加5μl的250mM(即50mM的终浓度)EDTA以抑制酶促反应。然后,将样品于-20℃进行冷冻。
揭示:
借助于使用15%SDS-Page凝胶的Western印迹来进行所述揭示。将7μl的每个样品(含有65ng的BMP-2)混合入7μl的含有SDS的Laemli上样缓冲液中。然后,将所述样品在95℃下变性10分钟,随后置于15%SDS-Page凝胶上。作为对照,将相等量的BMP-2(65ng)和嗜热菌蛋白酶(16.25ng)也置于凝胶上。合上电泳槽,并将电发生器调至125V。迁移持续1小时15分钟。
在迁移后,在100伏特下,在1小时期间,通过BioRad转移系统将凝胶转移至PVDF膜上。然后,在环境温度下用脱脂乳使该膜饱和1小时,接着与抗-BMP-2一抗一起进行温育(在4℃下过夜),并最后与偶联至HRP的二抗一起进行温育(在环境温度下1小时)。通过HRP对于Opti-4CN的反应来进行揭示。当着色足够时终止揭示,因为反应产物吸收可见光。
当BMP-2是单独的时,从20分钟开始观察到出现了较低分子量的条带,这说明了嗜热菌蛋白酶对于该蛋白质的降解。在聚合物存在下,不存在该条带,这表明该聚合物保护该蛋白质免于降解。
在已验证了该聚合物不抑制嗜热菌蛋白酶的作用之后,可以得出结论:所获得的结果因此证明,聚合物PA 2很好地保护BMP-2免于酶促降解。
生理pH下在水中以复合物形式的BMP-2的增溶
生理pH下BMP-2的溶解度
BMP-2具有8.5的等电点,这意味着,在7.4的生理pH下,BMP-2接近其最小溶解度。这可以通过BMP-2的酸性溶液的中和实验而得到证明。
在酸性缓冲液(Infuse缓冲液,pH4.5)中制备1.5mg/mL的BMP-2的澄清溶液。通过添加磷酸盐缓冲液来中和该溶液,以达到7.4的pH(1.2mg/mL的BMP-2的终浓度)。在pH7.4下,BMP-2沉淀出来并且所形成的聚集体是可见的。该中和导致获得悬浮液。
生理pH下BMP-2/PA 2的溶解度
在酸性缓冲液(Infuse缓冲液,pH4.5)中制备1.5mg/mL的BMP-2的澄清溶液。向该溶液中添加冻干的PA2以达到75mg/mL的PA2浓度。然后,通过添加磷酸盐缓冲液来中和该BMP-2/PA2复合物溶液,以达到7.4的pH(1.2mg/mL BMP-2和60mg/mL PA2的终浓度)。在pH7.4下,BMP-2是完全溶解的,并且没有见到任何聚集体。因此,大大地提高了在生理pH下以BMP-2/PA2复合物形式的BMP-2的溶解度。
Claims (20)
1.在物理和化学上稳定的、可溶于水的两亲性聚合物-BMP复合物,其特征在于:
■所述两亲性聚合物由通过疏水取代基和亲水基团进行官能化的亲水性多糖骨架构成,根据下述通式I:
●R,R′,相同或不同,并且表示键或包含1至18个碳的链,所述链任选地是支化的和/或不饱和的,且包含一个或多个杂原子例如0、N或/和S,
●F,F′,相同或不同,并且表示酯、硫酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、醚、硫醚或胺,
●X表示亲水基团,其选自羧酸根、硫酸根、磺酸根、磷酸根、膦酸根,
●Y表示亲水基团,其选自硫酸根、磺酸根、磷酸根、膦酸根,
●Hy表示疏水基团,其选自下列:
○线性或支化的C8-C30烷基,其任选地是不饱和的和/或包含一个或多个杂原子例如O、N或S,
○线性或支化的C8-C18烷基芳基或芳基烷基,其任选地是不饱和的和/或任选地包含一个或多个杂原子例如O、N或S,
○C8-C30多环,其任选地是不饱和的和/或任选地包含一个或多个杂原子例如O、N或S,
○苄胺除外,
●n和o为1至3,
●h表示疏水基序相对于糖单元而言的摩尔份数,其为0.01至0.5,
●x表示亲水基团相对于糖单元而言的摩尔份数,其为0至2.0,
●y表示亲水基团相对于糖单元而言的摩尔份数,其为0至0.5,
■所述BMP选自在治疗上有活性的BMP(骨形态发生蛋白),
■聚合物/BMP的质量比小于或等于700。
2.根据权利要求1的复合物,其特征在于,所述多糖选自通式I的多糖,其中y=0。
3.根据前述权利要求中任一项的复合物,其特征在于,所述多糖选自通式I的多糖,其中X表示羧酸根。
4.根据前述权利要求中任一项的复合物,其特征在于,聚合物/BMP的质量比小于或等于600。
5.根据权利要求1至3中任一项的复合物,其特征在于,聚合物/BMP的质量比小于或等于500。
6.根据前述权利要求中任一项的复合物,其特征在于,所述BMP选自BMP-2(代勃特明-α)、BMP-4、BMP-7(依托特明-α)、BMP-14和GDF-5。
7.根据前述权利要求中任一项的复合物,其特征在于,所述聚合物选自其取代基以随机方式分布的聚合物。
8.根据前述权利要求中任一项的复合物,其特征在于,所述多糖选自乙酰透明质酸、藻酸盐、壳聚糖、聚半乳糖醛酸、硫酸软骨素、葡聚糖、纤维素。
9.根据前述权利要求中任一项的复合物,其特征在于,纤维素的组由通过酸进行官能化的纤维素例如羧甲基纤维素构成。
10.根据权利要求1至8中任一项的复合物,其特征在于,葡聚糖的组由通过酸进行官能化的葡聚糖例如羧甲基葡聚糖构成。
11.根据权利要求1至8中任一项的复合物,其特征在于,所述多糖选自乙酰透明质酸、藻酸盐、壳聚糖。
12.根据前述权利要求中任一项的复合物,其特征在于,所述疏水基团Hy选自天然来源的疏水氨基酸或者其醇、酯、脱羧基或酰胺衍生物,所述天然来源的疏水氨基酸选自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。
13.根据前述权利要求中任一项的复合物,其特征在于,所述疏水基团Hy是色氨酸或者色氨酸的酯或酰胺衍生物。
14.根据前述权利要求中任一项的复合物,其特征在于,所述两亲性聚合物-BMP复合物的形成是可逆的。
15.根据前述权利要求中任一项的复合物,其特征在于,所述BMP在生理pH下是稳定的。
16.根据前述权利要求中任一项的复合物,其特征在于,所述BMP在37℃和中性pH下具有生物学活性。
17.制备根据前述权利要求中任一项的两亲性聚合物-BMP复合物的方法,其特征在于,在水性介质中和在不存在能够使该蛋白质变性的有机溶剂的情况下制备所述聚合物/BMP复合物。
18.治疗组合物,其特征在于,所述治疗组合物包含根据权利要求1至16中任一项的两亲性聚合物-BMP复合物。
19.根据权利要求18的治疗组合物,其特征在于,所述治疗组合物使得能够施用大约1.5mg/ml的BMP。
20.根据权利要求1至16中任一项的两亲性聚合物-BMP复合物在制备用于在体内诱导骨形成的治疗组合物中的用途。
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Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104903341A (zh) * | 2012-11-13 | 2015-09-09 | 阿道恰公司 | 由离散数个糖单元组成的骨架组成的经取代阴离子化合物 |
CN105218685A (zh) * | 2010-02-09 | 2016-01-06 | 阿道恰公司 | 通过至少两个由至少三价的间隔物所携带的疏水基团进行官能化的阴离子多糖 |
CN105820270A (zh) * | 2016-03-30 | 2016-08-03 | 中国药科大学 | 硫酸化透明质酰脂肪烃胺 |
US9700599B2 (en) | 2012-11-13 | 2017-07-11 | Adocia | Rapid-acting insulin formulation comprising a substituted anionic compound |
US9795678B2 (en) | 2014-05-14 | 2017-10-24 | Adocia | Fast-acting insulin composition comprising a substituted anionic compound and a polyanionic compound |
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US10792335B2 (en) | 2015-11-16 | 2020-10-06 | Adocia | Rapid-acting insulin composition comprising a substituted citrate |
Families Citing this family (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2914305B1 (fr) * | 2007-03-29 | 2009-07-03 | Proteins & Peptides Man | Dextran fonctionnalise par des amino-acides hydrophobes. |
US20120041079A1 (en) * | 2006-09-26 | 2012-02-16 | Adocia | Dextran functionalized by hydrophobic amino acids |
AU2007234612B2 (en) | 2006-12-14 | 2013-06-27 | Johnson & Johnson Regenerative Therapeutics, Llc | Protein stabilization formulations |
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EP2187932B1 (en) | 2007-08-07 | 2015-01-28 | DePuy Synthes Products, LLC | Protein formulations comprising gdf-5 in aqueous acidic solution |
WO2009127939A1 (fr) * | 2008-04-14 | 2009-10-22 | Adocia | Composition osteogenique comprenant un facteur de croissance un sel soluble de cation et un support organique |
WO2009127940A1 (fr) * | 2008-04-14 | 2009-10-22 | Adocia | Composition osteogenique comprenant un complexe facteur de croissance/polymere amphiphile un sel soluble de cation e un support organique |
WO2009129101A1 (en) * | 2008-04-14 | 2009-10-22 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Liquid buffered gdf-5 formulations |
FR2934999B1 (fr) * | 2008-08-13 | 2011-07-29 | Adocia | Polysaccharides fonctionnalises par des derives du tryptophane |
CN102196822A (zh) * | 2008-09-26 | 2011-09-21 | 阿道恰公司 | 由多糖和hbp构成的复合物 |
FR2948573B1 (fr) * | 2009-07-31 | 2011-11-18 | Adocia | Nouvelle forme d'administration de complexes de proteines osteogeniques |
US8529933B2 (en) | 2009-07-27 | 2013-09-10 | Warsaw Orthopedic, Inc. | Biphasic calcium phosphate cement for drug delivery |
JP2011030455A (ja) * | 2009-07-30 | 2011-02-17 | Uha Mikakuto Co Ltd | トリプトファン−ヒアルロン酸食品素材及びトリプトファン高含有ペプチド−ヒアルロン酸食品素材並びにそれらの製造方法 |
FR2952375A1 (fr) * | 2009-11-10 | 2011-05-13 | Adocia | Polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles substitues par esterification par un derive d'alcool hydrophobe |
FR2956116A1 (fr) * | 2010-02-09 | 2011-08-12 | Adocia | Complexes polysaccharide/bmp-7 solubles a ph physiologique |
WO2011097342A1 (en) * | 2010-02-04 | 2011-08-11 | University Of Utah Research Foundation | Hydrophobically-modified hyaluronan and methods of making and using thereof |
FR2958647B1 (fr) * | 2010-04-08 | 2013-08-23 | Adocia | Polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles substitues par un derive hydrophobe porte par un spacer au moins trivalent. |
CA2806143A1 (en) * | 2010-07-30 | 2012-02-02 | Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mb H | Drug delivery devices and growth factor formulations for accelerated wound healing |
CN101942101A (zh) * | 2010-09-02 | 2011-01-12 | 四川大学 | 含疏水烷基侧链的两亲性聚电解质接枝物制备方法 |
JP2012082180A (ja) * | 2010-10-14 | 2012-04-26 | Nagoya Univ | 骨再生用自己組織化ペプチドハイドロゲル |
JP5950477B2 (ja) * | 2011-08-10 | 2016-07-13 | アドシア | 少なくとも1種の基礎インスリンの注射溶液 |
CN113730555A (zh) | 2012-01-09 | 2021-12-03 | 阿道恰公司 | Ph为7且至少含pi为5.8至8.5之基础胰岛素和取代共聚(氨基酸)的可注射溶液 |
US9815912B2 (en) * | 2012-03-19 | 2017-11-14 | University Of Massachusetts | Hydrophilic modification of water insoluble polysaccharide as surface-active agents |
US20150314003A2 (en) | 2012-08-09 | 2015-11-05 | Adocia | Injectable solution at ph 7 comprising at least one basal insulin the isoelectric point of which is between 5.8 and 8.5 and a hydrophobized anionic polymer |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2808405A (en) | 1955-03-11 | 1957-10-01 | Ohio Commw Eng Co | Acylated amino acid esters of dextran products and method of making same |
DE4136324A1 (de) | 1991-11-05 | 1993-05-13 | Hoechst Ag | Dextranderivate als adsorptionsmittel fuer gallensaeuren, mit gallensaeuren beladene dextranderivate und verfahren zu deren herstellung sowie deren anwendung als arzneimittel |
US6573251B2 (en) | 1994-03-30 | 2003-06-03 | Denis Barritault | Drug and pharmaceutical composition for the treatment of lesions of the nervous system and fractions enriched in heparan sulfate |
DE4433101A1 (de) | 1994-09-16 | 1996-03-21 | Bauer Kurt Heinz Prof Dr | Wasserlösliche Dextranfettsäureester und ihre Verwendung als Solubilisatoren |
CA2192725C (en) | 1995-12-28 | 2004-04-20 | Kenji Tsujihara | Camptothecin derivatives |
US20040132653A1 (en) | 1997-01-30 | 2004-07-08 | Biopharm Gmbh | Lyophilized composition of bone morphogenetic factor human MP52 |
US5977076A (en) | 1997-04-14 | 1999-11-02 | Anderson; Byron E. | Method and material for inhibiting complement |
KR20010030891A (ko) * | 1997-10-03 | 2001-04-16 | 마크로메드 인코퍼레이션 | 가역적 열 겔화 성질을 갖는 생분해성 저분자량 트리블럭폴리(락티드-코-글리콜리드) 폴리에틸렌 글리콜 공중합체 |
FR2772382B1 (fr) | 1997-12-11 | 2000-03-03 | Solutions | Derives de dextrane, leur procede de preparation et leurs applications comme medicaments a action biologique specifique |
US6423345B2 (en) * | 1998-04-30 | 2002-07-23 | Acusphere, Inc. | Matrices formed of polymer and hydrophobic compounds for use in drug delivery |
FR2781485B1 (fr) * | 1998-07-21 | 2003-08-08 | Denis Barritault | Polymeres biocompatibles leur procede de preparation et les compositions les contenant |
JP4548623B2 (ja) | 1999-02-24 | 2010-09-22 | 多木化学株式会社 | 生体材料 |
CA2372994C (en) | 1999-06-04 | 2010-03-23 | Alza Corporation | Implantable gel compositions and method of manufacture |
FR2794649B1 (fr) * | 1999-06-11 | 2003-04-11 | Solutions | Biomateriau a base d'un derive de dextrane insolubilise et d'un facteur de croissance, son procede de preparation et ses applications |
ES2225241T3 (es) * | 1999-10-15 | 2005-03-16 | Genetics Institute, Llc | Formulaciones de acido hialuronico para suministrar proteinas osteogenicas. |
EP1454640A3 (en) * | 1999-10-15 | 2004-09-22 | Genetics Institute, LLC | Formulations of hyaluronic acid for delivery of osteogenic proteins |
EP1355965B1 (en) * | 2000-10-19 | 2012-09-19 | Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) | Method of synthesizing block copolymers for multifunctional self-assembled systems |
JP2005501831A (ja) * | 2001-08-01 | 2005-01-20 | スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション | プロドラッグおよび薬剤デリバリービヒクル |
BR0310087A (pt) * | 2002-05-17 | 2005-08-16 | Wyeth Corp | Veìculos sólidos injetáveis para ácido hialurÈnico para aplicação de proteìnas osteogênicas |
ATE541580T1 (de) | 2003-12-05 | 2012-02-15 | Univ Northwestern | Selbst anordnende peptid-amphiphile und relevante verfahren für die abgabe von wachstumsfaktor |
FR2891149B1 (fr) * | 2005-09-26 | 2007-11-30 | Biodex Sarl | Composition pharmaceutique a action cicatrisante comprenant un derive de dextrane soluble et un facteur de croissance derive des plaquettes. |
FR2914305B1 (fr) | 2007-03-29 | 2009-07-03 | Proteins & Peptides Man | Dextran fonctionnalise par des amino-acides hydrophobes. |
CA2648395A1 (fr) * | 2006-04-07 | 2007-10-18 | Adocia | Polysaccharides bifonctionnalises |
US20080102128A1 (en) * | 2006-07-28 | 2008-05-01 | Flamel Technologies, Inc. | Modified-release microparticles based on amphiphilic copolymer and on active principles(s) and pharmaceutical formulations comprising them |
-
2007
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-
2010
- 2010-02-17 ZA ZA201001163A patent/ZA201001163B/xx unknown
Cited By (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105218685B (zh) * | 2010-02-09 | 2018-12-25 | 阿道恰公司 | 通过至少两个由至少三价的间隔物所携带的疏水基团进行官能化的阴离子多糖 |
CN105218685A (zh) * | 2010-02-09 | 2016-01-06 | 阿道恰公司 | 通过至少两个由至少三价的间隔物所携带的疏水基团进行官能化的阴离子多糖 |
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