JP2010534708A - 両親媒性ポリマーとbmpファミリーに属する骨形成タンパク質との複合体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、物理的及び化学的に安定であり且つ水溶性である両親媒性ポリマー−BMP複合体であって、前記両親媒性ポリマーは、疎水性置換基及び親水基により官能化された親水性多糖類骨格を含有し;前記BMPは、治療上有効なBMP(骨形成タンパク質)の群より選択され;前記ポリマー/BMP質量比は700以下であることを特徴とする複合体に関する。本発明はまた、水性溶媒中にてタンパク質を変性し得るいかなる有機溶媒も存在しない両親媒性ポリマー−BMP複合体の製造方法にも関する。本発明はさらに、本発明の両親媒性ポリマー−BMP複合体の治療用組成物に関する。
【選択図】なし
Description
・生物学的活性種の数の減少、
・生物活性又は吸収速度の変化、
・前記凝集物に対する潜在的な免疫学的応答、
・製品のオパール色による望ましくない外観、
・濾過装置及び注射器の閉塞
をもたらす可能性がある。
・生体外及び生体内における生理的pHでのその疎水性により生じるBMPの凝集を防止すること、
・37℃にて細胞の存在下でBMPを安定化させること、
を可能にする。
前記両親媒性ポリマーは、下記の一般式:
R、R1は、同一又は異なっていてもよく、結合部又は1ないし18個の炭素原子を含有する連鎖を表し、前記連鎖は、場合によっては、枝分れし及び/又は不飽和であっても、且つ、1個以上のヘテロ原子、例えばO、N又は/及びSを含有していてもよく、
F、F’は、同一又は異なっていてもよく、エステル、チオエステル、アミド、炭酸塩、カルバミン酸塩、エーテル、チオエーテル又はアミンを表し、
Xは、カルボキシレート、スルフェート、スルホネート、ホスフェート及びホスホネートからなる群より選択された親水基を表し、
Yは、スルフェート、スルホネート、ホスフェート及びホスホネートからなる群より選択された親水基を表し、
Hyは、下記の群:
・不飽和であってもよく、及び/又は1個以上のヘテロ原子、例えばO、N又はSを含有していてもよい直鎖状の又は枝分れ状の炭素原子数8ないし30のアルキル基、
・不飽和であってもよく、及び/又は1個以上のヘテロ原子、例えばO、N又はSを含有していてもよい直鎖状の又は枝分れ状の炭素原子数8ないし18のアルキルアリール基、或いは直鎖状の又は枝分れ状の炭素原子数8ないし18のアリールアルキル基、及び
・不飽和であってもよく、及び/又は1個以上のヘテロ原子、例えばO、N又はSを含有していてもよい炭素原子数8ないし30の多環式基
からなる群より選択される疎水基を表すが、但し、Hyはベンジルアミンを表すものではなく、
n及びoは1ないし3の数であり、
hは、モノマー単位に関する疎水性パターンのモル分率を表すものであって、0.01ないし0.5であり、
xは、モノマー単位に関する親水基のモル分率を表すものであって、0ないし2.0であり、
yは、モノマー単位に関する親水基のモル分率を表すものであって、0ないし0.5である。]
で表される疎水性置換基と親水基により官能化された親水性多糖類骨格により形成されており、
前記BMPは、治療上有効なBMP(骨形成タンパク質)の群より選択され、
前記ポリマー/BMP質量比は700以下であることを特徴とする、複合体に関する。
ランダムコポリマー
★−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−★
| | |
疎水基 疎水基 疎水基
ブロックコポリマー
★−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−★
| | |
疎水基 疎水基 疎水基
交互コポリマー
★−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−モノマー−★
| | |
疎水基 疎水基 疎水基
・ゲル電気泳動を用いた両親媒性ポリマー−BMP複合体を明らかにするための試験
・37℃及び中性pHにて行われる両親媒性ポリマー−BMP複合体中の細胞の存在下でのBMPの熱安定性の試験
・生理的pHでの前記複合体中のBMPの物理的安定性についての試験
を行うことにより証明され得る。
・円偏光二色性により決定されるBMPの三次元構造を維持するための試験。
・ストレス下、生理的pHでの本発明に従う両親媒性ポリマー−BMP複合体中のBMPの安定性の試験。ストレスは、塩等の存在下での特定の攪拌法であり得る。
・サーモリシンのようなタンパク質分解酵素に対する耐性の試験。
・細胞培地中で生成されたアルカリホスファターゼの活性のアッセイ、
・アルカリホスファターゼを生成する細胞の染色、
・細胞培地中に生成されたオステオカルシンのRNAのRT−PCR
を用いて測定され得る。
実施例1:トリプトファンエチルエステルにより修飾されたカルボキシメチルデキストラン(AP−1)
この両親媒性ポリマーを、糖単位当りのカルボキシメチル置換度が1.0、及び60kg/モルの平均モル質量を有するカルボキシメチルデキストランから合成した。クロロギ酸エチル及びN−メチルモルホリンを用いた有機溶媒中での慣用のカップリング法に従い、トリプトファンエチルエステルをポリマーの酸にグラフトした。反応媒体を水中に希釈し、そして1NのNaOHを添加してpHを7に調節した後、ポリマーを限外濾過により精製した。最終ポリマーは、
・D2O/NaODにおけるRMN1Hにより決定された、糖単位当りのTrpOEt置換度が0.45、
・電位差測定解析により決定された、糖単位当りのカルボキシレート(メチルカルボキシレート)置換度が0.55
を特徴としていた。
AP−1の塩基性加水分解により両親媒性ポリマーを得た。両親媒性ポリマー1の水溶液(31mg/mLで64mL)に水酸化ナトリウム1N(3.79mL)を添加して、pH12.7とした。得られた溶液を周囲温度にて一晩攪拌した。水(NaCl 0.9%及びH2O)に対する透析により、ポリマーを精製した。最終ポリマーは、
・D2O/NaODにおけるRMN1Hにより決定された、糖単位当りのTrpONa置換度が0.45、
・電位差測定解析により決定された、糖単位当りのカルボキシレート(メチルカルボキシレート、トリプトファンカルボキシレート)置換度が1
を特徴としていた。
この両親媒性ポリマーを、実施例1に従い、糖単位当りのカルボキシメチル置換度が1.0及び60kg/モルの平均モル質量を有するカルボキシメチルデキストランから合成した。最終ポリマーは、
・D2O/NaODにおけるRMN1Hにより決定された、糖単位当りのPheOEt置換度が0.45、
・電位差測定解析により決定された、糖単位当りのカルボキシレート(メチルカルボキシレート)置換度が0.55、
を特徴としていた。
この両親媒性ポリマーを、実施例1に従い、糖単位当りのカルボキシメチル置換度が1.0及び60kg/モルの平均モル質量を有するカルボキシメチルデキストランから合成した。最終ポリマーは、
・D2O/NaODにおけるRMN1Hにより決定された、糖単位当りのTyrOMe置換度が0.45、
・電位差測定解析により決定された、糖単位当りのカルボキシレート(メチルカルボキシレート)置換度が0.55、
を特徴としていた。
この両親媒性ポリマーを、文献(Sanchez−Chaves,Manuel他,polymer 1998,39(13),2751−2757)に従い得られた、糖単位当りのコハク酸置換度が1.0及び70kg/モルの平均モル質量を有するデキストランコハク酸から合成した。クロロギ酸エチル及びN−メチルモルホリンを用いた有機溶媒中での慣用のカップリング法に従い、トリプトファンエチルエステルをポリマーの酸にグラフトした。反応媒体を水中に希釈し、そして1NのNaOHを添加してpHを7に調節した後、ポリマーを限外濾過により精製した。最終ポリマーは、
・D2O/NaODにおけるRMN1Hにより決定された、糖単位当りのTrpOEt置換度が0.45、
・電位差測定解析により決定された、糖単位当りのカルボキシレート(コハク酸カルボキシレート)置換度が0.55、
を特徴としていた。
この両親媒性ポリマーを、実施例1に従い、糖単位当りのカルボキシメチル置換度が1.0及び60kg/モルの平均モル質量を有するカルボキシメチルデキストランから合成した。最終ポリマーは、
・D2O/NaODにおけるRMN1Hにより決定された、糖単位当りのドデシルアミン置換度が0.10、
・電位差測定解析により決定された、糖単位当りのカルボキシレート(メチルカルボキシレート)置換度が0.90
を特徴としていた。
この両親媒性ポリマーは、特許文献7に記載されており、
・糖単位当りのベンジルアミン置換度が0.45、
・糖単位当りのカルボキシレート(メチルカルボキシレート)置換度が0.55、
を特徴としていた。
BMP−2/両親媒性ポリマー複合体の製造
H2O/AcN/TFA(64.9/35/0.1%)緩衝液中の0.28mg/mLBMP−2溶液の5μLを、pH7.4によって緩衝化された100mg/mLのAP溶液の7μLに添加した。この溶液を0.9%NaCl溶液を用いて14μLとした。この溶液は、0.1mg/mLのBMP−2濃度、及び1:500のBMP−2/AP比を有していた。この溶液を、周囲温度にて30分間素早く攪拌した。
BMP−2/AP溶液を泳動用緩衝液(pH7を有するトリスアセテート溶液)で20倍に希釈した。希釈溶液の2μLをその後、水8μL及びローディング用緩衝液7μL(水中のグリセロール、トリスアセテート及びブロモフェノールブルー)に添加した。このBMP−2を10ng及びAPを5μL含有する17μLを、0.8%アガロースゲルのウェルに沈積した。電気泳動チャンバを閉じ、そしてジェネレータを30Vに設定した。泳動を1時間継続した。
BMP−2/両親媒性ポリマー複合体の製造
H2O/AcN/TFA(64.9/35/0.1%)緩衝液中の0.28mg/mLのBMP−2溶液から出発して、種々の溶液を製造した。
1.水中に希釈することにより得られた0.084mg/mLBMP−2溶液
2.14mg/mLのAP溶液を用いてBMP−2を希釈することにより得られた、0.084/9.8mg/mLのBMP−2/両親媒性ポリマー溶液。
各々の溶液をその後、pH7.4及び300mOsmを有するPBS10mM溶液を用いて1:10に希釈し、そしてその後、マイクロコン細胞遠心分離(Microcon cell centrifugation)を用いて再濃縮した(YM10,10kD,500μL)。この操作を2回繰り返した。3回の洗浄後、各々の溶液を遠心分離し、そして上澄み中のBMP−2の濃度を、ELISA法により決定した。
0日目に、C2C12細胞(マウスの筋肉細胞)を、10%FVS及び1%TBAを含有するDMEMを含有する96ウェルの培養プレートに播種し(ウェル当り7000細胞)、そしてその後、オーブン中に24時間置いた。1日目に、細胞の付着後に、培地を、2%FVS及び1%TBAを含有するDMEMで24時間置き換えた。2日目に、培地を、BMP−2のみの溶液(0.3μg/mL)又はBMP−2/AP1複合体の溶液(0.3/150μg/mL,1:500の比)を補った2%FVS及び1%TBAを含有するDMEMで置き換えた。複合体を、2%FVS及び1%TBAを含有するDMEM中にBMP−2及びAPを別々に希釈することにより製造した。沈積させる前に、タンパク質/AP1混合物を1時間静置させた。7日目に、即ち沈積して5日後に、残存するBMP−2をELISAによりアッセイするために上澄みを採取した。
BMP−2活性は、細胞分化のゆっくりとした進行によって明らかであり、BMP−2複合体は、BMP−2単独よりも生体外においてより高い活性であった。
BMP−2/ポリマー複合体の製造
TFAアセトニトリル緩衝液中の0.315mg/mL BMP−2溶液の19μLを、66mg/mLポリマー(PA2)溶液の4.6μLに、7.5のpHを有するトリス50mMの50μLに、25μg/mLサーモリシンの60μLに、そしてH2O366.4μLに添加した。いずれのポリマーも含有しない同様の溶液を対照として製造した。これら2種の溶液において、サーモリシンはタンパク質の25%である(質量/質量)。
サーモリシンを含有するBMP−2単独の溶液及び複合体の溶液を60℃にて6時間インキュベートした。T=0.20分、1時間、2時間及び6時間にて20μLの試料を採取した。各々の試料を採取したとき、酵素反応を阻害するために250mM EDTAの5μLを直ちに添加し、即ち、50mMの最終濃度であった。その後、試料を−20℃にて凍結させた。
15%SDS−Pageゲルから形成したウエスタンブロットを使用して、現像を行った。各々の試料の7μL(BMP−2の65ngを含有する)を、SDSを含有するLaemmliローディング用緩衝液の7μLと混合した。その後、試料を95℃にて10分間変性し、その後、15%SDS−Pageゲルに沈積した。対照として、等量のBMP−2(65ng)及びサーモリシン(16.25ng)をもゲルに沈積した。電気泳動チャンバを閉じ、そしてジェネレータを125Vに設定した。泳動を1時間15分間継続した。
ポリマーがサーモリシンの作用を阻害していないことをチェックした後には、得られた結果が、ポリマーPA2が酵素分解に対してBMP−2を有効に保護していることを示すものと結論され得る。
生理的pHでのBMP−2の溶解度
BMP−2は8.5の等電点を有しており、このことは生理的pHにおいて、BMP−2がその低い溶解度と関連していることを意味している。このことは、BMP−2を用いた酸溶液を中和するための実験によって示され得る。
清澄な1.5mg/mL BMP−2溶液を、酸性緩衝液(インフーズ緩衝液,pH4.5)中で製造した。75mg/mLの濃度のPA2を得るために、凍結乾燥したPA2を前記溶液に添加した。このBMP−2/PA2複合溶液をその後、ホスフェート緩衝液を添加することによって中和して、7.4のpHを得た(1.2mg/mLの最終BMP−2濃度及び60mg/mLの最終PA2濃度)。pH7.4にてBMP−2は完全に溶解し、凝集体は見られなかった。BMP−2/PA2複合体の形態における、生理的pHでのBMP−2の溶解度は、それ故大きく高められた。
Claims (20)
- 物理的及び化学的に安定であり且つ水溶性である両親媒性ポリマー−BMP複合体であって、前記両親媒性ポリマーは、下記の一般式:
R、R1は、同一又は異なっていてもよく、結合部又は1ないし18個の炭素原子を含有する連鎖を表し、前記連鎖は、場合によっては、枝分れし及び/又は不飽和であっても、且つ、1個以上のヘテロ原子、例えばO、N又は/及びSを含有していてもよく、
F、F’は、同一又は異なっていてもよく、エステル、チオエステル、アミド、炭酸塩、カルバミン酸塩、エーテル、チオエーテル又はアミンを表し、
Xは、カルボキシレート、スルフェート、スルホネート、ホスフェート及びホスホネートからなる群より選択された親水基を表し、
Yは、スルフェート、スルホネート、ホスフェート及びホスホネートからなる群より選択された親水基を表し、
Hyは、下記の群:
・不飽和であってもよく、及び/又は1個以上のヘテロ原子、例えばO、N又はSを含有していてもよい直鎖状の又は枝分れ状の炭素原子数8ないし30のアルキル基、
・不飽和であってもよく、及び/又は1個以上のヘテロ原子、例えばO、N又はSを含有していてもよい直鎖状の又は枝分れ状の炭素原子数8ないし18のアルキルアリール基、或いは直鎖状の又は枝分れ状の炭素原子数8ないし18のアリールアルキル基、及び
・不飽和であってもよく、及び/又は1個以上のヘテロ原子、例えばO、N又はSを含有していてもよい炭素原子数8ないし30の多環式基
からなる群より選択される疎水基を表すが、但し、Hyはベンジルアミンを表すものではなく、
n及びoは1ないし3の数であり、
hは、モノマー単位に関する疎水性パターンのモル分率を表すものであって、0.01ないし0.5であり、
xは、モノマー単位に関する親水基のモル分率を表すものであって、0ないし2.0であり、
yは、モノマー単位に関する親水基のモル分率を表すものであって、0ないし0.5である。]
で表される疎水性置換基と親水基により官能化された親水性多糖類骨格により形成されており、
前記BMPは、治療上有効なBMP(骨形成タンパク質)の群より選択され、
前記ポリマー/BMP質量比は700以下であることを特徴とする、複合体。 - 前記多糖類は、式中、y=0である一般式Iで表される多糖類より選択されることを特徴とする、請求項1に記載の複合体。
- 前記多糖類は、式中、Xがカルボキシレートを表す一般式Iで表される多糖類より選択されることを特徴とする、請求項1又は2に記載の複合体。
- 前記ポリマー/BMP質量比は、600以下であることを特徴とする、請求項1ないし3のうちいずれか1項に記載の複合体。
- 前記ポリマー/BMP質量比は、500以下であることを特徴とする、請求項1ないし3のうちいずれか1項に記載の複合体。
- 前記BMPは、BMP−2(ジボテルミンα(dibotermin−alfa))、BMP−4、BMP−7(エプトテルミンα(eptotermin−alfa))、BMP−14及びGDF−5からなる群より選択されることを特徴とする、請求項1ないし5のうちいずれか1項に記載の複合体。
- 前記ポリマーは、置換基が任意の手法で分布したポリマーより選択されることを特徴とする、請求項1ないし6のうちいずれか1項に記載の複合体。
- 前記多糖類は、ヒアルロン酸(hyaluronanes)、アルギン酸、キトサン、ガラクツロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン及びセルロースからなる群より選択されることを特徴とする、請求項1ないし7のうちいずれか1項に記載の複合体。
- 前記セルロースの群は、酸により官能化されたセルロース、例えばカルボキシメチルセルロースからなることを特徴とする、請求項1ないし8のうちいずれか1項に記載の複合体。
- 前記デキストランの群は、酸により官能化されたデキストラン、例えばカルボキシメチルデキストランからなることを特徴とする、請求項1ないし6のうちいずれか1項に記載の複合体。
- 前記多糖類は、ヒアルロン酸、アルギン酸及びキトサンからなる群より選択されることを特徴とする、請求項1ないし6のうちいずれか1項に記載の複合体。
- 前記疎水基Hyは、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ロイシン及びイソロイシンからなる群より選択される疎水性の天然アミノ酸、或いはそれらのアルコール誘導体、脱カルボン酸誘導体、エステル誘導体又はアミド誘導体であることを特徴とする、請求項1ないし11のうちいずれか1項に記載の複合体。
- 前記疎水基Hyは、トリプトファン或いはトリプトファンのエステル誘導体又はアミド誘導体であることを特徴とする、請求項1ないし12のうちいずれか1項に記載の複合体。
- 前記両親媒性ポリマー−BMP複合体の形成は、可逆的であることを特徴とする、請求項1ないし13のうちいずれか1項に記載の複合体。
- 前記BMPは、生理的pHにて安定であることを特徴とする、請求項1ないし14のうちいずれか1項に記載の複合体。
- 前記BMPは、37℃及び中性pHにて生物学的活性を示すことを特徴とする、請求項1ないし15のうちいずれか1項に記載の複合体。
- 前記ポリマー/BMP複合体は、水性溶媒中にて且つタンパク質を変性し得る有機溶媒なしに製造されることを特徴とする、請求項1ないし16のうちいずれか1項に記載の両親媒性ポリマー−BMP複合体の製造方法。
- 請求項1ないし16のうちいずれか1項に記載の両親媒性ポリマー−BMP複合体を含有することを特徴とする、治療用組成物。
- およそ1.5mg/mLのBMP投与を可能とすることを特徴とする、請求項18に記載の治療用組成物。
- 生体内で骨形成を誘発する治療用組成物の製造のための、請求項1ないし16のうちいずれか1項に記載の両親媒性ポリマー−BMP複合体の使用。
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