FR2956116A1 - Complexes polysaccharide/bmp-7 solubles a ph physiologique - Google Patents

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Abstract

[0001] L'invention concerne un complexe polymère/BMP-7 soluble à pH physiologique, caractérisé en ce que le polymère est choisi dans le groupe des polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles dont un au moins est substitué par au moins un radical hydrophobe, noté Ah, ledit radical hydrophobe Ah étant un reste d'un composé hydrophobe choisi parmi les alcool, thioalcool, acide, O-thioacide ou amine hydrophobes comportant une chaine alkyle linéaire, ramifiée ou cyclique comportant au moins 6 atomes de carbone, résultant soit du couplage entre une de ses fonctions réactives et une fonction carboxyle du polysaccharide anionique soit du couplage entre une de ses fonctions réactives et une fonction réactive du précurseur du bras de liaison R' constitué d'une chaîne comprenant entre 4 et 50 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, éventuellement comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, éventuellement comprenant un ou plusieurs cycles ou hétérocycles saturés, insaturés ou aromatiques, greffé ou lié au polysaccharide anionique ledit polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles étant amphiphile à pH neutre, etla BMP-7 étant choisie dans le groupe consitué parmi les BMP-7 recombinantes humaines et leurs homologues. [0002] Elle concerne également l'utilisation de ce complexe pour la solubilisation de la BMP-7 et les formulations pharmceutiques obtenues.

Description

Complexes polysaccharide / BMP-7 solubles à pH physiologique [0001] La présente invention concerne le domaine de la formulation de la Bone Morphogenetic Protein-7, BMP-7. [0002] Les Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sont des facteurs de croissance impliqués dans les mécanismes de formation de l'os et du cartilage. Les BMPs appelées également Osteogenic Proteins (OPs) ont été initialement caractérisées par Urist en 1965 (Urist MR. Science 1965; 150, 893). Ces protéines isolées à partir d'os cortical ont la capacité d'induire la formation d'os chez un grand nombre d'animaux (Urist MR. Science 1965; 150, 893). [0003] Les BMPs sont exprimées sous forme de propeptides qui, après maturation post-traductionnelle, ont une longueur comprise entre 104 et 139 résidus. Elles possèdent une grande homologie de séquences entre elles et ont des structures tridimensionnelles similaires. En particulier, elles possèdent 6 résidus cystéine impliqués dans des ponts disulfure intramoléculaires formant un « cysteine knot » (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287, 103 ; Schlunegger MP,J. Mol. Biol. 1993; 231, 445). Certaines d'entre elles possèdent une 7e cystéine impliquée également dans un pont disulfure intermoléculaire à l'origine de la formation du dimère (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287:103.). [0004] Sous leur forme active, les BMPs s'assemblent en homodimères, voire en hétérodimères comme cela a été, décrit par Israel et al. (Israel DI, Growth Factors. 1996; 13(3-4), 291). Les BMPs dimériques interagissent avec les récepteurs transmembranaires de type BMPR (Mundy et al. Growth Factors, 2004, 22 (4), 233). Cette reconnaissance est à l'origine d'une cascade de signalisation intracellulaire impliquant notamment les protéines Smad aboutissant ainsi à l'activation ou à la répression des gènes cibles. [0005] La BMP-7,eptotermine alpha selon la dénomination commune internationale, joue un rôle direct et indirect sur la différenciation des cellules mésenchymateuses provoquant leur différenciation en ostéoblastes (Cheng H., J. Bone and Joint Surgery, 2003, 85A 1544-1552). Elle possèdent en outre des propriétés de chimiotactisme et induit la prolifération, la différentiation et l'angiogénèse. [0006] La rhBMP-7 a clairement montré une capacité à induire la formation d'os in vivo chez l'homme et a été approuvée pour certaines applications dans le domaine orthopédique. Ainsi, la BMP-7 recombinante humaine constitue la base de deux produits : OP-1 Implant pour les fractures ouvertes du tibia et OP-1 Putty pour la fusion des vertèbres lombaires. OP-1 Implant se compose d'une poudre contenant de la rhBMP-7 et du collagène à reprendre dans une solution saline à 0,9%. La pâte obtenue est ensuite appliquée au niveau de la fracture lors d'une intervention chirurgicale. OP-1 Putty se présente sous la forme de deux poudres l'une contenant la rhBMP-7 et du collagène, l'autre de la carboxyméthylcellulose (CMC). Au cours d'une intervention chirurgicale, la CMC est reconstituée avec une solution saline 0,9% et mélangée avec la rhBMP-7 et le collagène. La pâte ainsi obtenue est appliquée sur le site à traiter. Néanmoins, ces produits à base de BMP-7 n'ont fait l'objet que d'une approbation limitée de la part de la FDA puisqu'ils ont le statut de produit humanitaire. Les raisons majeures de cette approbation limitée sont une performance légèrement inférieure à l'autogreffe considérée comme le traitement de référence (Gold Standard) et une forte production d'anticorps dirigés contre la BMP-7. [0007] Outre le rôle de la BMP-7 dans la croissance osseuse, il a été démontré que la BMP-7 jouait un rôle important dans la croissance et la réparation du cartilage. Les études animales démontrent que l'OP-1 permet une réparation cartilagineuse parmi les différents modèles de lésions de ce cartilage, outre les lésions cartilagineuses, les lésions d'arthrose et les lésions de dégénérescence des disques intervertébraux.(Chubinskaya, S. et al., Int.Orthop. 2007, 31(6), 773-781.) [0008] Enfin, un autre rôle majeur avéré de la BMP-7 est relatif à la croissance rénale puisque la BMP-7 est un morphogène essentiel à la conversion des cellules mesenchymateuses en cellules épithéliales au cours du développement des reins. Cette propriété a trouvé une application thérapeutique potentielle pour la réparation des reins endommagés par la fibrose chronique du rein.(Zeisberg, M. et al., J Biot Chem 2005, 280 (9), 8094-8100.), (Zeisberg, M. et al., Am J Physiol Renal Physiol 2003, 285 (6), F1060-F1067.) [0009] Cependant, pour toutes ces applications, il est nécessaire de résoudre le problème de la faible solubilité de la BMP-7 à pH physiologique qui conduit à l'agrégation de cette protéine. La faible solubilité de la BMP-7 dans les conditions physiologiques et la formation d'agrégats rendent problématique son emploi pour les applications locales dans la mesure où la proportion de protéine réellement disponible pour exercer son rôle biologique est très faible. Cette faible solubilité de la BMP-7 dans les conditions physiologiques est encore plus problématique pour les applications systémiques de la BMP-7, que ce soit par voie intraveineuse ou sous-cutanée, puisque la précipitation massive de la BMP-7 au site d'injection peut conduire à des effets secondaires. De plus, il est connu que la formation d'agrégats de protéines conduit à une réaction immunologique impliquant la formation d'anticorps. [00010] De plus, il apparait nécessaire d'obtenir des formulations efficaces contenant une quantité minimale de BMP-7. Ceci afin d'éviter les effets secondaires générés par des concentrations importantes de cette protéine et également en raison du prix de cette protéine. [00011] Une des solutions pour répondre à la problématique de la faible solubilité de la BMP-7 à pH neutre développée par la société Centocor consiste à modifier la structure primaire de la BMP-7.(Swencki-Underwood, B. et al., Protein Expr.Purif. 2008, 57 (2), 312-319.) Cependant, cette solution n'est pas satisfaisante puisqu'elle conduit à une potentielle toxicité de la nouvelle protéine modifiée et qu'elle induit une modification des interactions entre la BMP-7 et ses récepteurs pouvant conduire à une modification de l'activité biologique. [00012] Une autre solution proposée à la faible solubilité de la BMP-7 à pH neutre décrite dans la demande de brevet US2007/0015701 consiste à greffer de manière covalente une ou plusieurs chaînes de polyethylèneglycol sur la BMP-7.(Zalipsky, Samuel et al., US2007/0015701 A1) Cette solution n'est pas non plus satisfaisante dans la mesure où la BMP-7 est modifiée chimiquement ce qui peut conduire à des modifications significatives de son activité biologique par rapport à la protéine naturelle. [00013] La demanderesse avait déjà décrit une solution dans la demande PCT/EP2008/059832 permettant de résoudre les problèmes similaires de solubilité à pH physiologique avec la BMP-2 sans avoir recours à des modifications chimiques de la BMP-2. Cette solution consistait à employer un polysaccharide amphiphile comprenant un groupe hydrophobe choisi dans le groupe constitué par les acides aminés hydrophobes d'origine naturelle, choisis dans le groupe constitué par le tryptophane, la tyrosine, la phénylalanine, la leucine ou l'isoleucine ou leurs dérivés alcools, esters, décarboxylés ou amides. [00014] De façon surprenante, la demanderesse a mis en évvidence que certains polymères outre le fait qu'ils forment des complexes ave la BMP-7, permettent de solubiliser ce facteur de croissance à pH physiologique à faibles concentrations de polymères. [00015] Ces complexes présentent l'avantage d'être stables dans les conditions physiologiques, mais également vis-à-vis d'une dilution importante dans du serum. [00016] Ces polymères possèdent en outre la propriété d'être lyoprotecteurs et permettent de maintenir l'intégrité de la BMP-7 en évitant les phénomènes d'agrégation lors des processus de lyophilisation. [00017] La présente invention concerne un complexe polymère/BMP-7 soluble à 5 pH physiologique, caractérisé en ce que le polymère est choisi dans le groupe des polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles dont un au moins est substitué par au moins un radical hydrophobe, noté Ah : ledit radical hydrophobe Ah étant un reste d'un composé hydrophobe choisi parmi les alcool, thioalcool, acide, O-thioacide ou amine 10 hydrophobes comportant une chaine alkyle linéaire, ramifiée ou cyclique comportant au moins 6 atomes de carbone, résultant soit du couplage entre une de ses fonctions réactives et une fonction carboxyle du polysaccharide anionique soit du couplage entre une de ses fonctions réactives et une fonction réactive du précurseur du bras de liaison R' 15 constitué d'une chaîne comprenant entre 4 et 50 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, éventuellement comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, éventuellement comprenant un ou plusieurs cycles ou hétérocycles saturés, insaturés ou aromatiques, greffé ou lié au polysaccharide anionique soit : 20 - par une fonction F' ladite fonction F' résultant du couplage entre une fonction réactive dudit composé hydrophobe et une fonction carboxyle du polysaccharide anionique, soit, - par un bras de liaison R, ledit bras de liaison R étant lié au polysaccharide par une liaison F résultant du couplage entre une fonction réactive du 25 précurseur du bras de liaison R' et une fonction carboxyle du polysaccharide anionique et ledit radical hydrophobe Ah étant lié au bras de liaison R par une fonction G résultant du couplage entre au moins une fonction réactive dudit composé hydrophobe et une fonction réactive du précurseur du bras de liaison R'. 30 - les fonctions carboxyles du polysaccharide anionique non substituées étant sous forme de carboxylate de cation, alcalin de préférence comme Na' ou Kt F étant soit une fonction amide, soit une fonction ester, soit une fonction thioester, soit une fonction anhydride, soit une fonction carbamate. - F' étant soit une fonction amide, soit une fonction ester, soit une fonction thioester, soit une fonction anhydride, G étant soit une fonction amide, ester, thioester, thionoester carbamate, carbonate ou anhydride, - R étant un radical au moins divalent constitué d'une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, éventuellement comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, éventuellement comprenant un ou plusieurs cycles ou hétérocycles saturés, insaturés ou aromatiques et résultant de la réaction d'un précurseur R' ayant au moins deux fonctions réactives, identiques ou différentes choisies dans le groupe constitué par les fonctions alcool, acide, amine, thiol et thioacide. ledit polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles étant amphiphile à pH neutre, la BMP-7 étant choisie dans le groupe consitué parmi les BMP-7 recombinantes humaines et leurs homologues.
[00018] Dans un mode de réalisation, les polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles sont des polysaccharides synthétiques obtenus à partir de polysaccharides neutres, sur lesquels au moins 15 groupes fonctionnels carboxyles pour 100 unités saccharidiques ont été greffés, de formule générale I. Polysaccharide I - les polysaccharides neutres étant choisis dans le groupe des polysaccharides constitués en majorité de monomères glycosidiques liés par des liaisons glycosidiques de type (1,6) et/ou (1,4). - L étant une liaison résultant du couplage entre le bras de liaison Q et une fonction ùOH du polysaccharide et étant soit une fonction ester, thionoester, carbonate, carbamate ou éther, - i représente la fraction molaire des substituants L-Q par unité 5 saccharidique du polysaccharide - Q étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et comportant au moins un groupe fonctionnel carboxyle, -CO2H. 10 [00019] Dans un mode de réalisation, i est compris entre 0,1 et 3. [00020] Dans un mode de réalisation, i est compris entre 0,2 et 1,5.
[00021] Dans un mode de réalisation le polysaccharide est constitué en majorité 15 de monomères glycosidiques liés par des liaisons glycosidiques de type (1,6). [00022] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de monomères glycosidiques liés par des liaisons glycosidiques de type (1,6) est le dextrane. [00023] Dans un mode de réalisation le polysaccharide est constitué en majorité 20 de monomères glycosidiques liés par des liaisons glycosidiques de type (1,4). [00024] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de monomères glycosidiques liés par des liaisons glycosidiques de type (1,4) est le pullulane. [00025] Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est 25 caractérisé en ce que le groupe Q est choisi dans les groupes suivants : L OH OH OH L 30 [00026] Dans un mode de réalisation le polysaccharide est choisi parmi les polysaccharides de formule II: II - Ah étant un reste d'un composé hydrophobe choisi parmi les alcool, thioalcool, acide, O-thioacide ou amine hydrophobes comportant une chaine alkyle linéaire, ramifiée ou cyclique comportant au moins 6 atomes de carbone, produit du couplage entre la fonction hydroxyle, thiol, acide 0-thiacide ou amine et au moins une fonction réactive portée par le précurseur du radical divalent R, F étant soit une fonction amide, soit une fonction ester, soit une fonction thioester, soit une fonction anhydride - G étant soit une fonction ester, soit une fonction thioester, soit une fonction carbonate, soit une fonction carbamate, soit une fonction amide, soit une fonction anhydride, - R étant un radical au moins divalent constitué d'une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, éventuellement comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et résultant de la réaction d'un précurseur R' ayant au moins deux fonctions réactives, identiques ou différentes choisies dans le groupe constitué par les fonctions amine, alcool, acide, thiol et 0-thioacide, n représentant la fraction molaire des fonctions carboxyles du polysaccharide substituées par F-R-G-Ah et est compris entre 0,01 et 0,7, et, - lorsque la fonction carboxyle du polysaccharide n'est pas substituée par F-R-G-Ah, alors le ou les groupes fonctionnels carboxyles du polysaccharide sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na+ ou K+. Polysaccharide + carboxyle [00027] Dans un mode de réalisation, F est une fonction amide, G est une fonction ester, R' est un acide aminé et Ah est un reste d'alcool hydrophobe. [00028] Dans un mode de réalisation, F est une fonction amide, G est une fonction thioester, R' est un acide aminé et Ah est un reste de thioalcool hydrophobe. [00029] Dans un mode de réalisation, F est une fonction amide, G est une fonction carbamate, R' est une diamine et Ah est un reste d'alcool hydrophobe. [00030] Dans un mode de réalisation, F est une fonction amide, G est une fonction carbonate, R' est un aminoalcool et Ah est un reste d'alcool hydrophobe. [00031] Dans un mode de réalisation, F est une fonction amide, G est une fonction thionoester, R' est un O-thioacideaminé et Ah est un reste d'alcool hydrophobe. [00032] Dans un mode de réalisation, F est une fonction ester, G est une fonction ester, R' est un acidealcool et Ah est un reste d'alcool hydrophobe. [00033] Dans un mode de réalisation, F est une fonction ester, G est une fonction thioester, R' est un acidealcool et Ah est un reste de thioalcool hydrophobe. [00034] Dans un mode de réalisation, F est une fonction ester, G est une fonction carbonate, R' est un dialcool et Ah est un reste d'alcool hydrophobe. [00035] Dans un mode de réalisation, F est une fonction ester, G est une fonction carbamate, R' est un alcoolamine et Ah est un reste d'alcool hydrophobe. [00036] Dans un mode de réalisation, F est une fonction thioester, G est une fonction ester, R' est un acide-thiol et Ah est un reste d'alcool hydrophobe. [00037] Dans un mode de réalisation, F est une fonction thioester, G est une fonction thioester, R' est un acide-thiol et Ah est un reste de thioalcool hydrophobe. [00038] Dans un mode de réalisation, F est une fonction thioester, G est une fonction carbonate, R' est un alcoolthiol et Ah est un reste d'alcool hydrophobe. [00039] Dans un mode de réalisation, F est une fonction thioester, G est une fonction carbamate, R' est un aminethiol et Ah est un reste d'alcool hydrophobe. [00040] Dans un mode de réalisation, F est une fonction anhydride, G est une fonction ester, R' est un diacide et Ah est un reste d'alcool hydrophobe. [00041] Dans un mode de réalisation, F est une fonction anhydride, G est une fonction thioester, R' est un diacide et Ah est un reste de thioalcool hydrophobe. [00042] Dans un mode de réalisation, F est une fonction anhydride, G est une fonction carbamate, R' est un aminoacide et Ah est un reste d'alcool hydrophobe. [00043] Dans un mode de réalisation, F est une fonction anhydride, G est une fonction carbonate, R' est un acidealcool et Ah est un reste d'alcool hydrophobe.
[00044] Dans un mode de réalisation, F est une fonction amide, G est une fonction anhydride, R' est un aminoacide et Ah est un reste d'acide hydrophobe. [00045] Dans un mode de réalisation, F est une fonction ester, G est une fonction amide, R' est un alcoolamine et Ah est un reste d'acide hydrophobe. [00046] Dans un mode de réalisation, F est une fonction ester, G est une fonction ester, R' est un dialcool et Ah est un reste d'acide hydrophobe. [00047] Dans un mode de réalisation, F est une fonction ester, G est une fonction thioester, R' est un alcoolthiol et Ah est un reste d'acide hydrophobe. [00048] Dans un mode de réalisation, F est une fonction ester, G est une fonction anhydride, R' est un alcool acide et Ah est un reste d'acide hydrophobe. [00049] Dans un mode de réalisation, F est une fonction thioester, G est une fonction amide, R' est un thiolamine et Ah est un reste d'acide hydrophobe. [00050] Dans un mode de réalisation, F est une fonction thioester, G est une fonction ester, R' est un alcoolthiol et Ah est un reste d'acide hydrophobe. [00051] Dans un mode de réalisation, F est une fonction thioester, G est une fonction thioester, R' est un dithioalcool et Ah est un reste d'acide hydrophobe. [00052] Dans un mode de réalisation, F est une fonction thioester, G est une fonction anhydride, R' est un acidethiol et Ah est un reste d'acide hydrophobe. [00053] Dans un mode de réalisation, F est une fonction anhydride, G est une fonction ester, R' èst un acidealcool et Ah est un reste d'acide hydrophobe. [00054] Dans un mode de réalisation, F est une fonction anhydride, G est une fonction thioester, R' est un acidethiol et Ah est un reste d'acide hydrophobe. [00055] Dans un mode de réalisation, F est une fonction anhydride, G est une fonction amide, R' est un aminoacide et Ah est un reste d'acide hydrophobe. [00056] Dans un mode de réalisation, F est une fonction anhydride, G est une fonction anhydride, R' est un diacide et Ah est un reste d'acide hydrophobe.
[00057] Dans un mode de réalisation, le précurseur du groupement R, R' est caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les acides aminés. [00058] Dans un mode de réalisation, les acides aminés sont choisis parmi les 35 alpha acides aminés. [00059] Dans un mode de réalisation, les alpha acides aminés sont choisis parmi les alpha acides aminés naturels. [00060] Dans un mode de réalisation, les alpha acides aminés naturels sont choisis parmi la leucine, l'alanine, l'isoleucine, la glycine, la phénylalanine, la valine, la proline, l'acide aspartique. [00061] Dans un mode de réalisation, le précurseur du groupement R, R' est caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les polyols. [00062] Dans un mode de réalisation les polyols sont choisis parmi les dialcools. [00063] Dans un mode de réalisation, les dialcools sont choisis dans le groupe 10 constitué par le diéthylèneglycol et le triéthylèneglycol. [00064] Dans un mode de réalisation, les dialcools sont choisis dans le groupe constitué par les polyéthylèneglycols sans restriction de masse. [00065] Dans un mode de réalisation, les polyols sont choisis dans le groupe constitué par le glycérol, le diglycérol et le triglycérol. 15 [00066] Dans un mode de réalisation, le polyol est la triéthanolamine.
[00067] Dans un mode de réalisation, le précurseur du groupement R, R' est caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les diamines. [00068] Dans un mode de réalisation, les diamines sont choisies dans le groupe 20 constitué par l'éthylène diamine et la lysine et ses dérivés.
[00069] Dans un mode de réalisation, le précurseur du groupement R, R' est caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les alcoolamines. [00070] Dans un mode de réalisation, les alcoolamines sont choisies dans le 25 groupe constitué par l'éthanolamine, l'amino-2-propanol, l'isopropanolamine, le 3-amino-1,2-propanediol, la diéthanolamine, la diisopropanolamine, la trométhamine (Tris) et le 2-(2-aminoéthoxy)éthanol. [00071] Dans un mode de réalisation, les alcoolamines sont choisies dans le groupe constitué par les acides aminés réduits. 30 [00072] Dans un mode de réalisation les acides aminés réduits sont choisis dans le groupe constitué par l'alaninol, le valinol, le leucinol, l'isoleucinol, le prolinol et le phénylalaninol. [00073] Dans un mode de réalisation, les alcoolamines sont choisies dans le groupe constitué par les acides aminés chargés. 35 [00074] Dans un mode de réalisation, les acides aminés chargés sont choisis dans le groupe constitué par la sérine et la thréonine. [00075] Dans un mode de réalisation, le précurseur du groupement R, R' est caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les diacides. [00076] Dans un mode de réalisation, le diacide est choisi dans le groupe 5 constitué par l'acide succinique, l'acide glutamique, l'acide maléique, l'acide oxalique, l'acide malonique, l'acide fumarique et l'acide glutaconique.
[00077] Dans un mode de réalisation, le précurseur du groupement R, R' est caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les acides alcools. 10 [00078] Dans un mode de réalisation, les acides alcools sont choisis dans le groupe constitué par l'acide mandélique, l'acide lactique et l'acide citrique.
[00079] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée, ramifiée ou non 15 ramifiée, comprenant de 6 à 18 carbones. [00080] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée, ramifiée ou non ramifiée, comprenant plus de18 carbones. [00081] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est l'octanol. 20 [00082] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est le dodécanol. [00083] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est le 2-éthylbutanol. [00084] Dans un mode de réalisation, l'alcool gras est choisi parmi le méristyl, le cétyl, le stéaryl, le cétéaryl, le butyl, l'oléyl, la lanoline. [00085] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les 25 dérivés du cholestérol. [00086] Dans un mode de réalisation, le dérivé du cholestérol est le cholestérol. [00087] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les dérivés du menthol. [00088] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est le menthol sous sa 30 forme racémique. [00089] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est l'isomère D du menthol. [00090] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est l'isomère L du menthol. 35 [00091] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les tocophérols. [00092] Dans un mode de réalisation, le tocophérol est l'alpha tocophérol. [00093] Dans un mode de réalisation, l'alpha tocophérol est le racémique de l'alpha tocophérol. [00094] Dans un mode de réalisation, le tocophérol est l'isomère D de l'alpha 5 tocophérol. [00095] Dans un mode de réalisation, le tocophérol est l'isomère L de l'alpha tocophérol. [00096] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools porteurs de groupe aryle. 10 [00097] Dans un mode de réalisation, l'alcool porteur de groupe aryle est choisi parmi l'alcool benzylique, l'alcool phenéthylique. [00098] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools gras insaturés dans le groupe constitué par le géraniol, le (3-citronellol et le farnesol. 15 [00099] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est le 3,7-diméthyl-1-octanol. [000100] Dans un mode de réalisation, l'amine hydrophobe est choisie parmi les amines constituées d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée, ramifiée ou linéaire, comprenant de 6 à 18 carbones. 20 [000101] Dans un mode de réalisation, l'amine hydrophobe est la dodécylamine. [000102] Dans un mode de réalisation, l'amine hydrophobe est choisi parmi le méristyl, le cétyl, le stéaryl, le cétéaryl, le butyl, l'oléyl, la lanoline. [000103] Dans un mode de réalisation, l'amine hydrophobe est choisie parmi les amines porteuses d'un groupe aryle. 25 [000104] Dans un mode de réalisation, l'amine porteuse d'un groupe aryle est choisie parmi la benzylamine, l'amine phenéthylique. [000105] Dans un mode de réalisation, l'acide hydrophobe est choisi parmi les acides gras. [000106] Dans un mode de réalisation, les acides gras sont choisis dans le groupe 30 constitué par les acides constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée, ramifiée ou non ramifiée, comprenant de 6 à 50 carbones. [000107] Dans un mode de réalisation, les acides gras sont choisis dans le groupe constitué par les acides gras linéaires. [000108] Dans un mode de réalisation, les acides gras linéaires sont choisis dans 35 le groupe constitué par l'acide caproïque, l'acide oenanthique, l'acide caprylique, l'acide caprique, l'acide nonanoïque, l'acide décanoïque, l'acide undécanoïque, l'acide dodécanoïque, l'acide palmitique, l'acide stéarique, l'acide arachidique, l'acide béhénique, l'acide tricosanoïque, l'acide lignocérique, l'acide heptacosanoïque, l'acide octacosanoïque et l'acide mélissique. [000109] Dans un mode de réalisation, les acides gras sont choisis dans le groupe 5 constitué par les acides gras insaturés. [000110] Dans un mode de réalisation, les acides gras insaturés sont choisis dans le groupe constitué par l'acide myristoléique, l'acide palmitoléique, l'acide oléique, l'acide élaidique, l'acide linoléique, l'acide alpha-linoléique, l'acide arachidonique, l'acide eicosapentaenoiiique, l'acide erucique et l'acide docosahexaenoïque. 10 [000111] Dans un mode de réalisation, les acides gras sont choisis dans le groupe constitué par les acides de la bile et leurs dérivés. [000112] Dans un mode de réalisation, les acides de la bile et leurs dérivés sont choisis dans le groupe constitué par l'acide cholique, l'acide déhydrocholique, l' acide désoxycholique et l'acide chénodésoxycholique. 15 [000113] Dans un mode de réalisation le polysaccharide est choisi parmi les polysaccharides de formule III : Polysaccharide + carboxyle F' Ah Formule III
20 • Ah étant un reste d'un composé hydrophobe choisi parmi les alcool, thioalcool, amine, acide ou O-thioacide hydrophobes comportant une chaine alkyle linéaire, ramifiée ou cyclique comportant au moins 6 atomes de carbone, produit du couplage entre la fonction hydroxyle, thiol, acide 0-thiacide ou amine et au moins une fonction carboxylate 25 du polysaccharide, • F' étant une fonction ester, thioester ou amide résultant du couplage entre la fonction carboxylate du polysaccharide anionique et une fonction alcool, thiol ou amine de Ah, n • n représentant la fraction molaire des fonctions carboxyles du polysaccharide substituées par -F'-Ah et est compris entre 0,01 et 0,7, et, lorsque la fonction carboxyle du polysaccharide n'est pas substituée par F'-Ah, alors le ou les groupes fonctionnels carboxyles du polysaccharide sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na+ ou K+.
[000114] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée, ramifiée ou non 10 ramifiée, comprenant de 6 à 18 carbones. [000115] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée, ramifiée ou non ramifiée, comprenant plus de 18 carbones. [000116] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est l'octanol. 15 [000117] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est le dodécanol. [000118] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est le 2-éthylbutanol ou isohexanol. [000119] Dans un mode de réalisation, l'alcool gras est choisi parmi le méristyl, le cétyl, le stéaryl, le cétéaryl, le butyl, l'oléyl, la lanoline. 20 [000120] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les dérivés du cholestérol. [000121] Dans un mode de réalisation, le dérivé du cholestérol est le cholestérol. [000122] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les dérivés du menthol. 25 [000123] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est le menthol sous sa forme racémique. [000124] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est l'isomère D du menthol. [000125] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est l'isomère L du 30 menthol. [000126] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les tocophérols. [000127] Dans un mode de réalisation, le tocophérol est l'alpha tocophérol. [000128] Dans un mode de réalisation, l'alpha tocophérol est le racémique de 35 l'alpha tocophérol. [000129] Dans un mode de réalisation, le tocophérol est l'isomère D de l'alpha tocophérol. [000130] Dans un mode de réalisation, le tocophérol est l'isomère L de l'alpha tocophérol. [000131] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools porteurs de groupe aryle. [000132] Dans un mode de réalisation, l'alcool porteur de groupe aryle est choisi parmi l'alcool benzylique, l'alcool phenéthylique. [000133] Dans un mode réalisation, l'alcool hydrophobe est choisi parmi les 10 alcools gras insaturés dans le groupe constitué par le géraniol, le (3-citronellol et le farnesol. [000134] Dans un mode de réalisation, l'alcool hydrophobe est le 3,7-diméthyl-1-octanol. [000135] Dans un mode de réalisation, l'amine hydrophobe est choisie parmi les 15 amines constituées d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée, ramifiée ou linéaire, comprenant de 6 à 18 carbones. [000136] Dans un mode de réalisation, l'amine hydrophobe est la dodécylamine. [000137] Dans un mode de réalisation, l'amine hydrophobe est choisi parmi le méristyl, le cétyl, le stéaryl, le cétéaryl, le butyl, l'oléyl, la lanoline. 20 [000138] Dans un mode de réalisation, l'amine hydrophobe est choisie parmi les amines porteuses d'un groupe aryle. [000139] Dans un mode de réalisation, l'amine porteuse d'un groupe aryle est choisie parmi la benzylamine, l'amine phenéthylique. [000140] Dans un mode de réalisation, l'acide hydrophobe est choisi parmi les 25 acides gras. [000141] Dans un mode de réalisation, les acides gras sont choisis dans le groupe constitué par les acides constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée, ramifiée ou non ramifiée, comprenant de 6 à 50 carbones. [000142] Dans un mode de réalisation, les acides gras sont choisis dans le groupe 30 constitué par les acides gras linéaires. [000143] Dans un mode de réalisation, les acides gras linéaires sont choisis dans le groupe constitué par l'acide caproïque, l'acide oenanthique, l'acide caprylique, l'acide caprique, l'acide nonanoïque, l'acide décanoïque, l'acide undécanoïque, l'acide dodécanoïque, l'acide palmitique, l'acide stéarique, l'acide arachidique, 35 l'acide béhénique, l'acide tricosanoïque, l'acide lignocérique, l'acide heptacosanoïque, l'acide octacosanoïque et l'acide mélissique. [000144] Dans un mode de réalisation, les acides gras sont choisis dans le groupe constitué par les acides gras insaturés. [000145] Dans un mode de réalisation, les acides gras insaturés sont choisis dans le groupe constitué par l'acide myristoléique, l'acide palmitoléique, l'acide oléique, l'acide élaidique, l'acide linoléique, l'acide alpha-linoléique, l'acide arachidonique, l'acide eicosapentaenoïique, l'acide erucique et l'acide docosahexaenoïque. [000146] Dans un mode de réalisation, les acides gras sont choisis dans le groupe constitué par les acides de la bile et leurs dérivés. [000147] Dans un mode de réalisation, les acides de la bile et leurs dérivés sont 10 choisis dans le groupe constitué par l'acide cholique, l'acide déhydrocholique, l' acide désoxycholique et l'acide chénodésoxycholique. [000148] L'invention concerne également l'utilisation des polysaccharides tels que ci-dessus décrits pour la formation d'un complexe B 15 [000149] L'invention concerne également une composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend un complexe polymère amphiphile-BMP-7 selon l'invention. [000150] On entend par composition thérapeutique une composition utilisable en médecine humaine ou vétérinaire. 20 [000151] La composition pharmaceutique selon l'invention est de préférence une composition à application locale pouvant se présenter sous la forme d'un soluté, d'un gel, d'une crème, d'un lyophilisat, d'une poudre ou d'une pâte. [000152] La nature des excipients susceptibles d'être formulés avec le complexe polymère amphiphile-BMP-7 selon l'invention est choisie en fonction de sa forme 25 de présentation selon les connaissances générales du galéniste. [000153] Ainsi, lorsque la composition selon l'invention est sous la forme d'une pâte, celle-ci est par exemple obtenue à partir de produits tels que les carboxyméthylcelluloses (CMC), le tricalcium phospate et le collagène. [000154] D'autres excipients peuvent être utilisés dans cette invention afin 30 d'ajuster les paramètres de la formulation comme un tampon pour ajuster le pH, un agent permettant d'ajuster l'isotonicité, des conservateurs comme le parahydroxybenzoate de méthyle, le parahydroxybenzoate de propyle, le m-crésol, ou le phénol ou encore un agent anti-oxydant comme le chlorhydrate de L-lysine. [000155] Selon l'invention, la composition thérapeutique est caractérisée en ce 35 qu'elle permet une administration d'environ 30 mg/ml de BMP-7. [000156] Selon l'invention, la composition thérapeutique est caractérisée en ce qu'elle permet une administration d'environ 20 mg/ml de BMP-7. [000157] Selon l'invention, la composition thérapeutique est caractérisée en ce qu'elle permet une administration d'environ 10 mg/ml de BMP-7. [000158] Selon l'invention, la composition thérapeutique est caractérisée en ce qu'elle permet une administration d'environ 5 mg/ml de BMP-7. [000159] Selon l'invention, la composition thérapeutique est caractérisée en ce qu'elle permet une administration d'environ 2 mg/ml de BMP-7. [000160] La présente invention concerne également l'utilisation d'un complexe 10 polymère amphiphile-BMP selon l'invention pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée à induire la formation d'os in-vivo. [000161] La présente invention concerne également l'utilisation d'un complexe polymère amphiphile-BMP selon l'invention pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée à induire la régénération du cartilage. 15 [000162] La présente invention concerne également l'utilisation d'un complexe polymère amphiphile-BMP selon l'invention pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée à induire la régénération du rein. [000163] Elle concerne également une méthode de traitement thérapeutique à usage humain ou vétérinaire caractérisée en ce qu'elle consiste à administrer au 20 site de traitement une composition thérapeutique comprenant le complexe polymère amphiphile-BMP selon l'invention. [000164] Elle concerne également une méthode de traitement thérapeutique à usage humain ou vétérinaire caractérisée en ce qu'elle consiste à administrer par voie intraveineuse une composition thérapeutique comprenant le complexe 25 polymère amphiphile-BMP selon l'invention. [000165] Elle concerne également une méthode de traitement thérapeutique à usage humain ou vétérinaire caractérisée en ce qu'elle consiste à administrer par voie sous-cutanée une composition thérapeutique comprenant le complexe polymère amphiphile-BMP selon l'invention. 30 [000166] Dans un mode de réalisation, elle concerne un complexe caractérisé en ce que le ratio massique polymère/BMP est inférieur ou égal à 100. [000167] Dans un mode de réalisation, elle concerne un complexe caractérisé en ce que le ratio massique polymère/BMP est inférieur ou égal à 50. [000168] Dans un mode de réalisation, elle concerne un complexe caractérisé en 35 ce que le ratio massique polymère/BMP est inférieur ou égal à 30. [000169] Dans un mode de réalisation, elle concerne un complexe caractérisé en ce que le ratio massique polymère/BMP est inférieur ou égal à 10. [000170] Dans un mode de réalisation, elle concerne un complexe caractérisé en ce que le ratio massique polymère/BMP est inférieur ou égal à 5. [000171] Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont soit sous forme liquide, en solution aqueuse, soit sous forme de poudre, d'implant ou de film. Elles comportent en outre les excipients pharmaceutiques classiques bien connus de l'homme de l'art. [000172] En fonction des pathologies et des modes d'administration les compositions pharmaceutiques pourront avantageusement comporter, en outre, des excipients permettant de les formuler sous forme de gel, d'éponge, de solution injectable, de solution buvable, de lyoc etc. [000173] L'invention concerne également une composition pharmaceutique selon l'invention telle que décrite précédemment, caractérisée en ce qu'elle est administrable sous forme de stent, de film ou « coating » de biomatériaux implantables, d'implant. Exemple 1 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate de sodium 20 modifié par le glycinate d'octanol Polymère 1 [000174] Le glycinate d'octanol, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818). [000175] 8 g (soit 148 mmol de fonctions hydroxyles) de dextrane de masse 25 molaire moyenne en poids d'environ 40 kg/mol (Fluka) sont solubilisés dans de l'eau à 42 g/L. A cette solution sont ajoutés 15 mL de NaOH 10 N (148 mmol NaOH). Le mélange est porté à 35°C puis 23 g (198 mmol) de chloroacétate de sodium sont ajoutés. La température du milieu réactionnel est portée à 60°C à 0,5°C/min puis maintenue à 60°C pendant 100 minutes. Le milieu réactionnel est 30 dilué avec 200 mL d'eau, neutralisé à l'acide acétique et purifié par ultrafiltration sur membrane PES de 5 kD contre 6 volumes d'eau. La solution finale est dosée par extrait sec pour déterminer la concentration en polymère ; puis dosée par dosage acide/base dans de l'eau/acétone 50 / 50 (V/V) pour déterminer le degré de substitution en méthylcarboxylates. 35 [000176] D'après l'extrait sec : [polymère] = 31,5 mg/g [000177] D'après le dosage acide/base : Le degré de substitution des fonctions hydroxyles par des fonctions méthylcarboxylates est de 1,04 par motif saccharidique. [000178] La solution de dextraneméthylcarboxylate de sodium est passée sur une 5 résine Purolite (anionique) pour obtenir le dextraneméthylcarboxylique acide qui est ensuite lyophilisé pendant 18 heures. [000179] 8 g de dextraneméthylcarboxylique acide (37 mmol fonctions méthylcarboxylique acide) sont solubilisés dans le DMF à 78 g/L puis refroidis à 0°C. 2,59 g de glycinate d'octanol, sel d'acide paratoluènesulfonique (7,2 mmol) 10 est mis en suspension dans du DMF à 100 g/L. 0,73 g de triéthylamine (7,2 mmol) est ensuite ajouté à cette suspension. Une fois la solution de polymère à 0°C, 4,16 g (41 mmol) de NMM et 4,47 g (41 mmol) de EtOCOCI sont ensuite ajoutés. Après 10 min de réaction, la solution de glycinate d'octanol est ajoutée et le milieu maintenu à 10°C durant 45 minutes. Le milieu est ensuite chauffé à 50°C. A 30°C, 15 une solution aqueuse d'imidazole à 600 g/L et 40 mL d'eau sont ajoutés. Après 1h30 d'agitation à 50°C, la solution obtenue est ultrafiltrée sur membrane PES 10 kD contre 6 volumes de solution NaCl 0,9%, 3 volumes de soude 0,O1N, 8 volumes de solution NaCI 0,9% puis 3 volumes d'eau. La concentration de la solution de polymère est déterminée par extrait sec. Une fraction de solution est 20 lyophilisée et analysée par RMN 1H dans D2O pour déterminer le taux de fonctions acides converties en amide de glycinate d'octanol. [000180] D'après l'extrait sec : [Polymère 1] = 30,2 mg/g [000181] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le glycinate d'octanol par unité saccharidique est de 0,21. 25 Exemple 2 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le glycinate d'octanol Polymère 2 [000182] Le glycinate d'octanol, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu 30 selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818). [000183] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1, un dextraneméthylcarboxylate de sodium de masse molaire moyenne en poids de 10 kDa modifié par le glycinate d'octanol est obtenu. [000184] D'après l'extrait sec : [Polymère 2] = 30,6 mg/g 35 [000185] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le glycinate d'octanol par unité saccharidique est de 0,16.
Exemple 3 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le glycinate de dodécanol Polymère 3 [000186] Le glycinate de dodécanol, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818). [000187] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1, un dextraneméthylcarboxylate de sodium de masse molaire moyenne en poids de 10 kDa modifié par le glycinate de dodécanol est obtenu. [000188] D'après l'extrait sec : [Polymère 3] = 23,6 mg/g [000189] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le glycinate de dodécanol par unité saccharidique est de 0,10. Exemple 4 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate de sodium 15 modifié par le leucinate d'isohexanol Polymère 4 [000190] Le leucinate d'isohexanol, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818). [000191] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1, un 20 dextraneméthylcarboxylate de sodium de masse molaire moyenne en poids de 10 kDa modifié par le leucinate d'isohexanol est obtenu. [000192] D'après l'extrait sec : [Polymère 4] = 12,3 mg/g [000193] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le leucinate d'isohexanol par unité saccharidique est de 0,18. 25 Exemple 5 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le phénylalaninate d'octanol Polymère 5 [000194] Le phénylalaninate d'octanol, sel d'acide paratoluènesulfonique est 30 obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818). [000195] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1, un dextraneméthylcarboxylate de sodium de masse molaire moyenne en poids de 40 kDa modifié par le phénylalaninate d'octanol est obtenu. [000196] D'après l'extrait sec : [Polymère 5] = 30,2 mg/g 35 [000197] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le phénylalaninate d'octanol par unité saccharidique est de 0,10.
Exemple 6 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'octanol Polymère 6 [000198] Le 1-octyle p-toluènesulfonate est obtenu selon le procédé décrit dans la publication (Morita, J.-I. et al., Green Chem. 2005, 7, 711). [000199] Le dextraneméthylcarboxylate de sodium est synthétisé selon le procédé décrit dans l' Exemple 1 en utilisant un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 10 kDa (Pharmacosmos). [000200] La solution de dextraneméthylcarboxylate de sodium est passée sur une résine Purolite (anionique) pour obtenir une solution aqueuse de dextraneméthylcarboxylique acide dont le pH est monté à 7,1 par ajout d'une solution aqueuse (40%) d'hydroxyde de tétrabutylammonium (Sigma) puis la solution est ensuite lyophilisée pendant 18 heures. [000201] 20 g de dextraneméthylcarboxylate de tétrabutylammonium (45 mmol fonctions méthylcarboxylates) sont solubilisés dans le DMF à 120 g/L puis chauffés à 40°C. Une solution de 2,37 g de 1-octyle p-toluènesulfonate (8,3 mmol) dans 14 mL de DMF est alors ajoutée à la solution de polymère. Le milieu est ensuite maintenu à 40°C pendant 5 heures. La solution est ultrafiltrée sur membrane PES 10 kD contre 15 volumes de solution NaCl 0,9% puis 5 volumes d'eau. La concentration de la solution de polymère est déterminée par extrait sec. Une fraction de solution est lyophilisée et analysée par RMN 1H dans D20 pour déterminer le taux de fonctions acides converties en ester de 1-octanol. [000202] D'après l'extrait sec : [Polymère 6] = 20,2 mg/g [000203] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le 1-octanol par unité saccharidique est de 0,17. Exemple 7 : Synthèse de dextranesuccinate de sodium modifié par le dodécanol [000204] Polymère 7 [000205] Le 1-dodécyle p-toluènesulfonate est obtenu selon le procédé décrit dans la publication (Morita, ].-I. et al., Green Chem. 2005, 7, 711). [000206] Le dextranesuccinate de sodium est obtenu à partir du dextrane 40 selon la méthode décrite dans l'article de Sanchez-Chaves et al. (Sanchez-Chaves, Manuel et al., Polymer 1998, 39 (13), 2751-2757.) Le taux de fonctions acides par unité glycosidique est de 0,90 d'après la RMN 1H dans D20/NaOD. [000207] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 6, un dextranesuccinate de sodium modifié par le 1-dodécanol est obtenu. [000208] D'après l'extrait sec : [.] = 37 mg/g [000209] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le 1-5 dodécanol par unité saccharidique est de 0,07. Exemple 8 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le valinate d'octanol Polymère 8 10 [000210] Le valinate d'octanol, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818). [000211] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1, un dextraneméthylcarboxylate de sodium de masse molaire moyenne en poids de 40 kDa modifié par le valinate d'octanol est obtenu. 15 [000212] D'après l'extrait sec : [Polymère 8] = 33,2 mg/g [000213] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par le valinate d'octanol par unité saccharidique est de 0,08. Exemple 9 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate de sodium 20 modifié par l'ester laurate d'éthanolamine Polymère 9 [000214] L'ester laurate d'éthanolamine, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818). [000215] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1, un 25 dextraneméthylcarboxylate de sodium de masse molaire moyenne en poids de 40 kDa modifié par l'ester laurate d'éthanolamine est obtenu. [000216] D'après l'extrait sec : [Polymère 9] = 21,2 mg/g [000217] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par l'ester laurate d'éthanolamine par unité saccharidique est de 0,09. 30 Exemple 10 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par Iaspartate de dihexanol Polymère 10 [000218] L'aspartate de dihexanol, sel d'acide paratoluènesulfonique est obtenu 35 selon le procédé décrit dans le brevet (Kenji, M et al., US4826818). [000219] Par un procédé similaire à celui décrit à l'Exemple 1, un dextraneméthylcarboxylate de sodium de masse molaire moyenne en poids de 40 kDa modifié par l'aspartate de dihexanol est obtenu. [000220] D'après l'extrait sec : [Polymère 10] = 31,1 mg/g [000221] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par l'aspartate de dihexanol par unité saccharidique est de 0,075. Exemple 11 : Synthèse de dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par la dodécylamine Polymère 11 [000222] Un dextraneméthylcarboxylique acide est préparé selon le procédé décrit dans la première partie de l' Exemple 1 en utilisant le dextrane 40 (Pharmacosmos). [000223] 13 g de dextraneméthylcarboxylique acide (62 mmol de fonctions méthylcarboxylique acides) sont solubilisés dans le DMF à 60 g/L puis refroidis à 0°C. Une fois la solution de polymère à 0°C, 1,75 g (17,4 mmol) de N-méthylmorpholine et 1,88 g (17,4 mmol) de chloroformiate d'éthyle sont ajoutés. Après 10 min de réaction, une solution de 1,07 g de dodécylamine (5,8 mmol) dans 11 mL de DMF est alors ajoutée à la solution de polymère. Le milieu est ensuite maintenu à 10°C durant 45 min puis chauffé à 30°C. A 20°C, une solution aqueuse d'imidazole à 340 g/L et 70 mL d'eau sont ajoutés. Après 30 min d'agitation à 30°C, 45 mL d'eau supplémentaires sont ajoutés et la solution est ultrafiltrée sur membrane PES 10 kD contre 15 volumes de solution NaCl 0,9% puis 5 volumes d'eau. La concentration de la solution de polymère est déterminée par extrait sec. Une fraction de solution est lyophilisée et analysée par RMN 1H dans D20 pour déterminer le taux de fonctions acides converties en dodécylamide. [000224] D'après l'extrait sec : [Polymère 11] = 41,2 mg/g [000225] D'après la RMN 1H : la fraction molaire des acides modifiés par la dodécylamine par unité saccharidique est de 0,085.
Exemple 12 Contre-exemple 1, synthèse de dextraneméthylcarboxylate non modifié par un groupement hydrophobe Polymère 12 [000226] Le dextraneméthylcarboxylate de sodium est obtenu comme décrit dans 35 la première partie de l'Exemple 1. La fraction molaire des acides modifiés par un groupement hydrophobe est nulle.
Exemple 13 : Affinité de la BMP-7 pour un Polymère par coélectrophorèse. Préparation du complexe BMP-7/Polymère [000227] 5 pI d'une solution de BMP-7 à 0,5 mg/mi sont ajoutés à 2,5 pI d'une solution de polymère (Pol) à 10 mg/ml et à 10 pl de tampon de migration 10X (Tris acetate pH 7). Cette solution est complétée à 100 pl par une solution de H2O. Cette solution a une concentration en BMP-7 de 25 pg/ml et un ratio BMP-7/Pol de 1/10.
Mise en évidence du complexe BMP-7/Polymère [000228] 2 pI de la solution de BMP-7 / Pol sont ensuite ajoutés à 8 pI d'eau et 2 pl de tampon de charge 5X (glycérol, tris-acétate et bleu de bromophénol dans de l'eau). Ces 12 pl contenant 50 ng de BMP-7 et 500 ng de Polymère sont déposés dans un puits d'un gel d'agarose 0,8%. La cuve d'électrophorèse est fermée et le générateur est réglé à 30V. La migration dure 1 heure. [000229] Après migration, le gel est transféré sur une membrane de PVDF placée dans un appareil de transfert par capillarité pendant 2h à température ambiante (Système Apelex). La membrane est saturée avec du PBST contenant 5% de BSA pendant 45 minutes à température ambiante puis incubée avec des anticorps primaires de la BMP-7 (une nuit à 4°C) et enfin incubée avec des anticorps secondaires, rabbit anti goat HRP (1 heure à température ambiante). La révélation se fait par réaction de l'HRP sur le Opti-4CN. La révélation est stoppée lorsque la coloration est suffisante puisque le produit de la réaction absorbe dans le visible. [000230] Lorsque la BMP-7 forme un complexe avec le Polymère, le complexe est détecté sous forme d'un spot unique à 0,7 cm du dépôt (migration vers l'anode). Lorsque la BMP-7 est seule ou ne forme pas de complexe avec le polymère, elle est détectée à l'endroit du dépôt et n'a donc pas migré.
Les résultats sont résumés dans le tableau suivant. Polymère Migration Aucun Non Polymère 1 Oui Polymère 2 Oui Polymère 3 Oui Polymère 4 Oui Polymère 5 Oui Polymère 6 Oui Polymère 7 Oui Polymère 8 Oui Polymère 10 Oui Polymère 11 Oui Polymère 12 Non Exemple 14 : Solubilisation de la BMP-7 à pH neutre [000230] Un essai de solubilisation de la Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP-7) a été développé afin de mettre en évidence le pouvoir solubilisant de différents polymères à pH physiologique. La BMP-7 est soluble à pH acide et possède une limite de solubilité très basse à pH physiologique de l'ordre de quelques microgrammes/mL. [000231] Les polymères décrits dans cette demande sont mis en oeuvre dans ce test. Le test consiste à utiliser une solution de BMP-7 à pH acide, par exemple un tampon lactate 1OmM à pH 3. La BMP-7 est à une concentration initiale de 2,47mg/ml. 2,02 mL de cette solution de BMP-7 sont mélangés à une solution de polymère à 54,5 mg/mL contenant 18mM de tampon phosphate à pH 7,4. Après mélange le pH final est ajusté à pH physiologique par ajout d'un mélange de soude 1N et d'eau pour obtenir un volume final de formulation de 5 mL. Les formulations sont analysées par observation visuelle, turbidité et diffusion dynamique de la lumière afin de détecter la présence d'agrégats.
Les résultats pour les différentes solutions sont rassemblés dans le tableau suivant. Polymère [polymère] [BMP-7] Aspect solubilité pH mg/ml mg/ml visuel Aucun 1 turbide Non 7,4 Polymère 2 30 1 limpide Oui 7,4 Polymère 3 30 1 limpide Oui 7,4 Polymère 4 30 1 limpide Oui 7,4 Polymère 5 30 1 limpide Oui 7,4 Polymère 6 30 1 limpide Oui 7,4 Polymère 7 30 1 limpide Oui 7,4 Polymère 8 30 1 limpide Oui 7,4 Polymère 9 30 1 limpide Oui 7,4 Polymère 10 30 1 limpide Oui 7,4 Polymère 11 30 1 limpide Oui 7,4 Polymère 12 30 1 turbide Non 7,4 [000232] Ce test permet de mettre en évidence l'amélioration de la solubilisation de la BMP-7 à pH physiologique par cette nouvelle famille de polymères. En revanche, le dextraneméthylcarboxylate de sodium non modifié même à une concentration de 30 mg/mL ne permet pas d'obtenir une solution limpide de BMP-7.
Exemple 15 : Effet lyoprotectant des polymères [000233] Afin de tester la capacité des polymères à maintenir l'intégrité de la BMP-7, un test de lyophilisation de ces formulations a été mené. La lyophilisation est un processus stressant pour les protéines qui conduit souvent à une agrégation de la protéine durant le procédé. A titre d'exemple, la formulation obtenue à l'exemple 14 avec le polymère 2 a été lyophilisée. Ce lyophilisat est ensuite reconstitué par de l'eau pour injection à la concentration initiale. Cette solution est alors analysée et comparée à la solution initiale par diffusion dynamique de la lumière. L'analyse montre que les deux solutions sont identiques et donc que la lyophilisation n'a pas induit d'agrégation de la protéine.
Exemple 16 : Solubilisation de la BMP-7 à pH physiologique et à une concentration supérieure à 1 mg/mi [000235] L'objectif de ce test est de solubiliser à pH physiologique la BMP-7 à une concentration supérieure à 1 mg/ml. [000236] Un volume de 5,5 mL d'une solution de BMP-7 à 2 mg/ml et pH acide est mélangé à 5,5 mL d'une solution du polymère 2 à une concentration de 6,9 mg/mL afin d'obtenir une solution de BMP-7 à 1 mg/mL et 3,45 mg/mL en polymère 1. Cette solution est ensuite lyophilisée par un procédé classique de lyophilisation. [000237] La solution est ensuite reconstituée par une solution de tampon phosphate 10mM et ajustée à pH physiologique par ajout d'une solution de soude 1N afin d'obtenir une formulation ou la concentration en BMP-7 est de 5mg/mL et la concentration en polymère est de 17,3 mg/mL. [000238] La solution ainsi obtenue est parfaitement limpide ne laissant pas présager la présence d'agrégats, ce que confirme l'analyse par diffusion dynamique de la lumière.
Exemple 17 : Stabilité de la formulation à la dilution. [000239] Ce test a pour but de simuler l'injection d'une formulation dans un milieu biologique comme par exemple dans le cas d'une administration à l'homme ou à un animal par un voie sous cutanée ou intraveineuse. En effet, après injection la formulation subit une dilution avec un fluide biologique ayant un pH de 7,4. [000240] Une formulation de BMP-7 en pH acide (pH 3) à 1 mg/ml est injectée dans un tampon PBS à pH 7,4 avec un facteur de dilution de 10. Lors de l'injection une turbidité de la solution est observée résultant de la précipitation de la protéine. Cette agrégation de la BMP-7 dans le PBS est confirmée par une mesure de diffusion dynamique de la lumière. [000241] Dans ce même test, si l'on utilise une formulation comme décrite dans l'exemple 14 avec un des polymères 1 à 11 à une concentration comparable de BMP-7 (i.e. 1 mg/ml) aucune turbidité n'est observée. La mesure par diffusion dynamique de la lumière démontre l'absence d'agrégats dans cet échantillon. [000242] La formulation BMP-7/polymère présente donc l'avantage d'être soluble et liquide à pH physiologique mais également d'être capable de résister à la dilution à pH physiologique en prévenant les phénomènes d'agrégation ce qui peut être particulièrement avantageux dans le cadre du développement d'un produit pharmaceutique pour injection.

Claims (34)

  1. Revendications1. Complexe polymère/BMP-7 soluble à pH physiologique, caractérisé en ce que le polymère est choisi dans le groupe des polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles dont un au moins est substitué par au moins un radical hydrophobe, noté Ah : - ledit radical hydrophobe Ah étant un reste d'un composé hydrophobe choisi parmi les alcool, thioalcool, acide, 0-thioacide ou amine hydrophobes comportant une chaine alkyle linéaire, ramifiée ou cyclique comportant au moins 6 atomes de carbone, résultant soit du couplage entre une de ses fonctions réactives et une fonction carboxyle du polysaccharide anionique soit du couplage entre une de ses fonctions réactives et une fonction réactive du précurseur du bras de liaison R' constitué d'une chaîne comprenant entre 4 et 50 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, éventuellement comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que 0, N ou/et S, éventuellement comprenant un ou plusieurs cycles ou hétérocycles saturés, insaturés ou aromatiques, greffé ou lié au polysaccharide anionique soit : - par une fonction F' ladite fonction F' résultant du couplage entre une fonction réactive dudit composé hydrophobe et une fonction carboxyle du polysaccharide anionique, soit, - par un bras de liaison R, ledit bras de liaison R étant lié au polysaccharide par une liaison F résultant du couplage entre une fonction réactive du précurseur du bras de liaison R' et une fonction carboxyle du polysaccharide anionique et ledit radical hydrophobe Ah étant lié au bras de liaison R par une fonction G résultant du couplage entre au moins une fonction réactive dudit composé hydrophobe et une fonction réactive du précurseur du bras de liaison R'. les fonctions carboxyles du polysaccharide anionique non substituées étant sous forme de carboxylate de cation, alcalin de préférence comme Na+ ou K+. - F étant soit une fonction amide, soit une fonction ester, soit une fonction thioester, soit une fonction anhydride, soit une fonction carbamate.F' étant soit une fonction amide, soit une fonction ester, soit une fonction thioester, soit une fonction anhydride, G étant soit une fonction amide, ester, thioester, thionoester carbamate, carbonate ou anhydride, - R étant un radical au moins divalent constitué d'une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, éventuellement comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, éventuellement comprenant un ou plusieurs cycles ou hétérocycles saturés, insaturés ou aromatiques et résultant de la réaction d'un précurseur R' ayant au moins deux fonctions réactives, identiques ou différentes choisies dans le groupe constitué par les fonctions alcool, acide, amine, thiol et thioacide. ledit polysaccharide comportant des groupes fonctionnels carboxyles étant amphiphile à pH neutre, la BMP-7 étant choisie dans le groupe consitué parmi les BMP-7 recombinantes humaines et leurs homologues.
  2. 2. Complexe selon la revendication 1, caractérisé en ce que les polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles sont des polysaccharides synthétiques obtenus à partir de polysaccharides neutres, sur lesquels au moins 15 groupes fonctionnels carboxyles pour 100 unités saccharidiques ont été greffés, de formule générale I. Polysaccharide [If Q I - les polysaccharides neutres étant choisis dans le groupe des polysaccharides constitués en majorité de monomères glycosidiques liés par des liaisons glycosidiques de type (1,6) et/ou (1,4).- L étant une liaison résultant du couplage entre le bras de liaison Q et une fonction -OH du polysaccharide et étant soit une fonction ester, thionoester, carbonate, carbamate ou éther, - i représente la fraction molaire des substituants L-Q par unité 5 saccharidique du polysaccharide - Q étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et comportant au moins un groupe fonctionnel carboxyle, -CO2H. 10
  3. 3. Complexe selon la revendication 2, caractérisé en ce que le polysaccharide est constitué en majorité de monomères glycosidiques liés par des liaisons glycosidiques de type (1,6). 15
  4. 4. Complexe selon la revendication 3, caractérisé en ce que le polysaccharide constitué en majorité de monomères glycosidiques liés par des liaisons glycosidiques de type (1,6) est le dextrane.
  5. 5. Complexe selon la revendication 2, caractérisé en ce que le polysaccharide 20 est constitué en majorité de monomères glycosidiques liés par des liaisons glycosidiques de type (1,4).
  6. 6. Complexe selon la revendication 5, caractérisé en ce que le polysaccharide constitué en majorité de monomères glycosidiques liés par des liaisons 25 glycosidiques de type (1,4) est le pullulane.
  7. 7. Complexe selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que le polysaccharide est caractérisé en ce que le groupe Q est choisi dans les groupes suivants : 30 L L L OH OH OH
  8. 8. Complexe selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polysaccharide est choisi parmi les polysaccharides de formule II: n II - Ah étant un reste d'un composé hydrophobe choisi parmi les alcool, thioalcool, acide, O-thioacide ou amine hydrophobes comportant une chaine alkyle linéaire, ramifiée ou cyclique comportant au moins 6 atomes de carbone, produit du couplage entre la fonction hydroxyle, thiol, acide 0-thiacide ou amine et au moins une fonction réactive portée par le précurseur du radical divalent R, - F étant soit une fonction amide, soit une fonction ester, soit une fonction thioester, soit une fonction anhydride - G étant soit une fonction ester, soit une fonction thioester, soit une fonction carbonate, soit une fonction carbamate, soit une fonction amide, soit une fonction anhydride, - R étant un radical au moins divalent constitué d'une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, éventuellement comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et résultant de la réaction d'un précurseur R' ayant au moins deux fonctions réactives, identiques ou différentes choisies dans le groupe constitué par les fonctions amine, alcool, acide, thiol et O-thioacide, - n représentant la fraction molaire des fonctions carboxyles du polysaccharide substituées par F-R-G-Ah et est compris entre 0,01 et 0,7, et, - lorsque la fonction carboxyle du polysaccharide n'est pas substituée par F-R-G-Ah, alors le ou les groupes fonctionnels carboxyles du Polysaccharide + carboxylepolysaccharide sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na+ ou K+.
  9. 9. Complexe selon la revendication 8, caractérisé en ce que F est une fonction amide, G est une fonction ester, R' est un acide aminé et Ah est un reste d'alcool 5 hydrophobe.
  10. 10. Complexe selon la revendication 8, caractérisé en ce que F est une fonction amide, G est une fonction anhydride, R' est un aminoacide et Ah est un reste d'acide hydrophobe.
  11. 11. Complexe selon la revendication 8, caractérisé en ce que F est une fonction amide, G est une fonction anhydride, R' est un aminoacide et Ah est un reste d'amine hydrophobe. 15
  12. 12. Complexe selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée, ramifiée ou non ramifiée, comprenant de 6 à 18 carbones.
  13. 13. Complexe selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'amine 20 hydrophobe est choisie parmi les amines constituées d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée, ramifiée ou linéaire, comprenant de 6 à 18 carbones.
  14. 14. Complexe selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'acide hydrophobe est choisi parmi les acides gras. 10 25
  15. 15. Complexe selon la revendication 14, caractérisé en ce que les acides gras sont choisis dans le groupe constitué par les acides constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée, ramifiée ou non ramifiée, comprenant de 6 à 50 carbones. 30
  16. 16. Complexe selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polysaccharide est choisi parmi les polysaccharides de formule IIIAh Polysaccharide + carboxyle n Formule III • Ah étant un reste d'un composé hydrophobe choisi parmi les alcool, thioalcool, amine, acide ou O-thioacide hydrophobes comportant une chaine alkyle linéaire, ramifiée ou cyclique comportant au moins 6 atomes de carbone, produit du couplage entre la fonction hydroxyle, thiol, acide 0-thiacide ou amine et au moins une fonction carboxylate du polysaccharide, • F' étant une fonction ester, thioester ou amide résultant du couplage 10 entre la fonction carboxylate du polysaccharide anionique et une fonction alcool, thiol ou amine de Ah, • n représentant la fraction molaire des fonctions carboxyles du polysaccharide substituées par -F'-Ah et est compris entre 0,01 et 0,7, et, 15 lorsque la fonction carboxyle du polysaccharide n'est pas substituée par F'-Ah, alors le ou les groupes fonctionnels carboxyles du polysaccharide sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na+ ou K+.
  17. 17. Complexe selon la revendication 16, caractérisé en ce que Ah est un alcool 20 hydrophobe.
  18. 18. Complexe selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée, ramifiée ou non ramifiée, comprenant de 6 à 18 carbones. 25
  19. 19. Complexe selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'alcool hydrophobe est choisi parmi les alcools constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée, ramifiée ou non ramifiée, comprenant plus de 18 carbones. 35
  20. 20. Complexe selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'alcool hydrophobe est l'octanol.
  21. 21. Complexe selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'alcool hydrophobe est le dodécanol.
  22. 22. Complexe selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'alcool hydrophobe est le 2-éthylbutanol ou isohexanol. 10
  23. 23. Complexe selon la revendication 16, caractérisé en ce que Ah est une amine hydrophobe.
  24. 24. Complexe selon la revendication 23, caractérisé en ce que l'amine hydrophobe est choisie parmi les amines constituées d'une chaîne alkyle insaturée 15 ou saturée, ramifiée ou linéaire, comprenant de 6 à 18 carbones.
  25. 25. Complexe selon la revendication 24, caractérisé en ce que l'amine hydrophobe est la dodécylamine. 20
  26. 26. Complexe selon la revendication 16, caractérisé en ce que Ah est un acide hydrophobe.
  27. 27. Complexe selon la revendication 26, caractérisé en ce que l'acide hydrophobe est choisi parmi les acides gras.
  28. 28. Complexe selon la revendication 27, caractérisé en ce que les acides gras sont choisis dans le groupe constitué par les acides constitués d'une chaîne alkyle insaturée ou saturée, ramifiée ou non ramifiée, comprenant de 6 à 50 carbones. 30
  29. 29. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le ratio massique polymère/BMP est inférieur ou égal à 100.
  30. 30. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 28, caractérisé en ce que le ratio massique polymère/BMP est inférieur ou égal à 50. 35
  31. 31. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 28, caractérisé en ce que le ratio massique polymère/BMP est inférieur ou égal à 30. 25
  32. 32. Composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend un complexe polymère amphiphile-BMP-7 selon l'une quelconque des revendications précédentes.
  33. 33. Composition thérapeutique selon la revendication 32, caractérisée en ce qu'elle permet une administration d'environ 1,5 mg/ml de BMP-7.
  34. 34. Utilisation d'un complexe polymère amphiphile-BMP-7 selon l'une quelconque des revendications 1 à 31 pour la préparation d'une composition thérapeutique 10 destinée à induire la formation d'os in-vivo.
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