CN103889442B

CN103889442B - 至少一种基础胰岛素的可注射溶液

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Publication number: CN103889442B
Application number: CN201280038926.9A
Authority: CN
Inventors: 奥利维耶·索拉; 格拉尔德·索拉; 杰夫·托纳尔; 亚历山大·盖斯勒
Original assignee: Adocia SAS
Current assignee: Adocia SAS
Priority date: 2011-08-10
Filing date: 2012-08-09
Publication date: 2016-12-28
Anticipated expiration: 2032-08-09
Also published as: RU2578460C2; EP2741765A1; JP2014521716A; US9089476B2; EP2741765B1; IL230611A0; KR101810055B1; US20180311316A1; US20170182131A9; MX2014001190A; WO2013021143A1; CA2843586A1; BR112014002986A2; US20130065826A1; EP2741765B9; EP3053590A1; US20150250858A1; JP5950477B2; RU2014108829A; AU2012293463B2

Abstract

本发明涉及pH为7的包含至少一种pI为5.8至8.5之基础胰岛素的可注射溶液。本发明涉及pH为6.0至8.0的可注射水溶液形式的组合物，其至少包含：a)一种基础胰岛素，所述基础胰岛素的等电点(pI)为5.8至8.5；和b)式I或II的被带有羧酸荷载的基团和疏水基团取代的葡聚糖，其中，R是‑OH或选自基团o‑(f‑[A]‑COOH)、o‑(g‑[B]‑k‑[D])_m，D包含至少一个含至少8个碳原子的烷基链，其中R是‑OH或基团‑(f‑[A]‑COOH)_n，并且R’选自基团o‑CH2NH‑[E](‑o‑[F])_t和o‑C(O)NH‑[E](‑o‑[F])_t。

Description

至少一种基础胰岛素的可注射溶液

本发明涉及通过注射胰岛素来治疗糖尿病的治疗。

近年来，尤其是借助提供对患者血糖之纠正的新胰岛素(其能够较好地模拟胰的生理活动)的开发，胰岛素治疗或通过注射胰岛素的糖尿病治疗取得了显著的进步。

为了满足每日胰岛素需求，目前糖尿病患者具有可用的、按计划的两种具有互补作用的胰岛素：餐时胰岛素(insulines prandiales)(或快速作用胰岛素)和基础胰岛素(insulines basales)(或慢速作用胰岛素)。

餐时胰岛素允许迅速控制(代谢和/或储存)由膳食和零食提供的葡萄糖。患者在每次食物摄取之前必须注射餐时胰岛素，即，每天注射约2至3次。最常用的餐时胰岛素是：重组人胰岛素、(来自诺和诺德(NOVO NORDISK)的门冬胰岛素(insulineaspart))、(来自礼来(ELI LILLY)的赖脯胰岛素(insuline lispro))和(来自赛诺菲-安万特(SANOFI-AVENTIS)的赖谷胰岛素(insulineglulisine))。

基础胰岛素在食物摄取时期以外维持患者的血糖稳态。其基本通过阻断葡萄糖(肝葡萄糖)的内源性产生来发挥作用。基础胰岛素的日剂量一般相当于每日胰岛素需求总量的40-50％。根据所使用的基础胰岛素，通过在全天中均匀分布的1或2次注射来分配该剂量。最常用的基础胰岛素是(来自诺和诺德的地特胰岛素(insulinedetemir))和(来自赛诺菲-安万特的甘精胰岛素(insuline glargine))。

应注意的是，为了完整性，NPH(NPH胰岛素，Neutral Protamine Hagedorn(中性鱼精蛋白锌胰岛素)；Humuline)是最古老的基础胰岛素。该制剂是利用阳离子蛋白质鱼精蛋白沉淀人胰岛素(在中性pH下为阴离子)的结果。这些微晶体分散在水性悬液中，并且在皮下注射后缓慢地溶解。这种缓慢的溶解确保了胰岛素的持续释放。但是，这种释放无法确保胰岛素随着时间的恒定浓度。释放曲线为钟形并且仅持续12至16小时。因此每天注射两次。这种NPH基础胰岛素比现代的基础胰岛素和效力差得多。NPH是中速作用的基础胰岛素。

随着快速胰岛素类似物的出现，改变了NPH的原理以产生“预混合’’产品，其提供快速作用和中速作用二者。NovoLog(诺和诺德)和Humalog(礼来)是包含部分地与鱼精蛋白复合的快速胰岛素类似物和的制剂。因此这些制剂包含被认为作用中速的胰岛素的微晶和一定比例的保持可溶的、作用迅速的胰岛素。这些制剂实际上确实提供了快速胰岛素的优点，但是其也具有NPH的缺点，即作用的持续时间限于12至16小时以及钟形的胰岛素释放。但是，这些产品使得能够对患者单次注射中速作用的基础胰岛素和快速作用的餐时胰岛素。事实上，许多患者希望降低他们的注射次数。

可以根据用于获得持续作用的技术方案对目前销售和目前处于临床开发之下的基础胰岛素进行分类，并且目前使用两种方式。

第一种，地特胰岛素的方式，是在体内与白蛋白结合。它是在pH7可溶的类似物，其包含连接在B29位的脂肪酸(十四烷酰基)侧链，这使得能够这种胰岛素在体内与白蛋白组合。其持续作用主要是由于皮下注射后与白蛋白的这种亲和力。

但是，其药物代谢动力学曲线不能使其覆盖全天，这意味着通常需要每天注射两次。

其他在pH7可溶的基础胰岛素(例如)目前正在开发中。也包含与胰岛素连接的脂肪酸侧链(十六烷二酰基-γ-L-Glu)。

第二种，甘精胰岛素的方式，是在生理pH下沉淀。这是通过用两个精氨酸残基延长人胰岛素的B链的羧基端部分并用甘氨酸残基替换天冬酰胺残基A21获得的人胰岛素类似物(US5656722)。构想添加两个精氨酸残基来调整甘精胰岛素在生理pH下的pI(等电点)，从而使得这种胰岛素类似物在生理介质中不溶。

构想了A21的替换以使得甘精胰岛素在酸性pH下稳定，从而能够将其配制成在酸性pH下可注射溶液的形式。在皮下注射的过程中，甘精胰岛素从酸性pH(pH4-4.5)到生理pH(中性pH)的过程使得其沉淀在皮肤下。甘精胰岛素微粒的缓慢再溶解确保了缓慢且持续的作用。

甘精胰岛素的降血糖作用在24小时的时期中基本上恒定，这允许大部分患者使他们自身限制为每天注射一次。

甘精胰岛素目前被认为是已上市的最好的基础胰岛素。

但是，甘精胰岛素类型的基础胰岛素(其等电点为5.8至8.5)制剂的酸性pH阻碍了与其他蛋白质特别是餐时胰岛素的任何药学组合，因为后者在酸性pH下不稳定。

然而，迄今还没有人设法在中性pH下溶解这些甘精胰岛素类型的基础胰岛素(其等电点为5.8至8.5)，同时保持在体外介质(包含这些胰岛素)和体内介质(皮肤下)之间不依赖于pH的溶解度差异。

特别地，上文概述的甘精胰岛素类型的基础胰岛素的工作原理(即，其在酸性pH下可溶，在生理pH下沉淀)劝阻了本领域技术人员远离了pH6-8的可溶解甘精胰岛素类型的胰岛素同时保持甘精胰岛素类型的胰岛素在皮下介质中沉淀的基本性质的任何溶液。

此外，不能在酸性pH下配制餐时胰岛素，这是因为在这些条件下餐时胰岛素在A21位进行脱酰胺副反应，使得其不能满足美国药典(US Pharmacopeia)的要求，即在30℃下4周后低于5％的副产物。

此外，甘精胰岛素类型的基础胰岛素制剂(其等电点为5.8至8.5)的这种酸性pH甚至阻碍在中性pH下与餐时胰岛素的任何临时组合。

在2009年6月5-9日美国路易斯安那州新奥尔良召开的第69届美国糖尿病协会科学会议上提出的最新临床研究已证实了使用甘精胰岛素的这种限制。在临注射前将一剂甘精胰岛素和一剂餐时胰岛素(在这一情况下，赖脯胰岛素)混合在一起(E.Cengiz et al.，2010，Diabetes Care，33(5)，1009-12)。该实验能够证实餐时胰岛素的药物代谢动力学曲线和药物效应动力学曲线显著延迟，其可引起餐后高血糖和夜间低血糖。该研究确实证实了甘精胰岛素与目前上市的快速作用胰岛素的不相容性。

另外，来自赛诺菲-安万特公司的基于甘精胰岛素的商业化产品的使用说明书明确向使用者指出不应当将该胰岛素与餐时胰岛素的溶液混合，这可能是由于改变甘精胰岛素和/或混合的餐时胰岛素的药物代谢动力学和药物效应动力学的严重风险。

但是，从治疗的观点来看，在2010年的第70届年度美国糖尿病协会(AmericanDiabètes Association，ADA)科学会议期间披露的临床研究(摘要2163-PO和摘要编号0001-LB，特别是由赛诺菲-安万特进行的那些研究)表明组合了甘精胰岛素和餐时胰岛素的治疗比基于Novolog或Humalog型的“预混合”产品的治疗高效得多。

对于甘精胰岛素和快速胰岛素的组合，Biodel公司在专利申请US7718609中特别地描述了在螯合剂和多元酸存在下pH3.0至4.2的包含基础胰岛素和餐时胰岛素的组合物。该专利教导了如何在甘精胰岛素类型的胰岛素的存在下使餐时胰岛素在酸性pH下相容。其未教导如何制备甘精胰岛素型胰岛素和中性pH的餐时胰岛素的组合。

从对文献和专利中描述的组合物的分析中，可以看出甘精胰岛素类型的基础胰岛素在pH7的不溶性是其具有慢速作用的先决条件。因此，用于将其与其他产品(例如餐时胰岛素)组合的所有提议溶液基于对酸性pH下餐时胰岛素之溶解或稳定性的测试，见例如WO2007／121256和WO2009／021955。

出人意料地，根据本发明的组合物使得能够在pH7溶解等电点为5.8至8.5的基础胰岛素。

出人意料地，根据本发明的组合物允许保持等电点为5.8至8.5的基础胰岛素的降血糖活性的持续时间，尽管其在注射之前在pH7下溶解。这种值得注意的性质是由于以下事实，本发明组合物中在pH7下溶解的甘精胰岛素型胰岛素借助于介质组成的改变在皮下介质中沉淀。引起甘精胰岛素型胰岛素沉淀的因素不再是pH的改变，而是在药物组合物进入生理介质的过程中环境组成的改变。

通过解决了这种在pH7下溶解度的问题，本发明使得能够：

-提出在治疗糖尿病的可注射组合物，其包含：pH7的均匀溶液形式的等电点为5.8至8.5的基础胰岛素，同时保持其生物活性和作用曲线；

-提出以下制剂形式的组合物，所述制剂包含等电点为5.8至8.5的基础胰岛素与餐时胰岛素的组合，并且不改变在pH6-8下可溶而在酸性pH下不稳定的餐时胰岛素的作用曲线，同时保持基础胰岛素固有的基础作用曲线；

-提出在治疗糖尿病的可注射组合物，其还包含等电点为5.8至8.5的基础胰岛素与胃肠激素的衍生物或类似物(例如GLP-1或“胰高血糖素样肽-1”)的组合；

-对于患者来说，降低他们的注射次数；

-对于所述组合物来说，满足美国药典和欧洲药典的要求。

出人意料地，在作为本发明主题的甘精胰岛素型胰岛素与餐时胰岛素的胰岛素组合中，尽管甘精胰岛素型胰岛素在皮下介质中沉淀，但是保持了餐时胰岛素的快速作用。

本发明涉及pH6.0至8.0的可注射水溶液形式的组合物，所述组合物至少包含：

a)基础胰岛素，所述基础胰岛素的等电点pI为5.8至8.5；

b)式I或式II的被带有羧酸荷载(charge)的基团和疏水基团取代的葡聚糖：

其中：

●R是-OH或选自以下基团：

○-(f-[A]-COOH)_n；

○-(g-[B]-k-[D])_m，D包含至少一个含至少8个碳原子的烷基链；

●n表示-f-[A]-COOH对葡糖苷单元的取代度，并且0.1≤n≤2；

●m表示-g-[B]-k-[D]对葡糖苷单元的取代度，并且0<m≤0.5；

●q表示葡糖苷单元的聚合度，换言之是每个多糖链中葡糖苷单元的平均数，并且3≤q≤50；

●-(f-[A]-COOH)_n：

○-A-是包含1至4个碳原子的直链或支链基团；所述-A-基团：

○通过官能团f与葡糖苷单元键合，所述官能团f选自醚、酯和氨基甲酸酯官能团；

●-(g-[B]-k-[D])_m：

○-B-是包含1至4个碳原子的直链或支链的至少二价的基团；所述-B-基团：

○通过官能团g与葡糖苷单元键合，所述官能团g选自醚、酯和氨基甲酸酯官能团；

○通过官能团k与-D基团键合；k选自酯、酰胺和氨基甲酸酯官能团；所述-D基团：

●是-X(-l-Y)_p基团，X是包含选自C、N和O原子的1至12个原子的至少二价基团，任选地带有羧基或胺官能团和l或来自于氨基酸、二醇、二胺或者单或聚乙二醇单胺或二胺；Y是8至30个碳原子的直链烷基或环烷基、烷基芳基或芳基烷基，任选地被一个或更多个C₁至C₃烷基取代；p≥1，并且l是选自酯、酰胺和氨基甲酸酯官能团的官能团；

●f、g和k相同或不同；

●游离酸官能团为选自Na⁺和K⁺的碱金属阳离子的盐的形式；

●并且，当p＝1时，如果Y是C₈至C₁₄烷基，那么q*m≥2，如果Y是C₁₅烷基，那么q*m≥2；并且如果Y是C₁₆至C₂₀烷基，那么q*m≥1；

●并且，当p≥2时，如果Y是C₈至C₉烷基，那么q*m≥2，如果Y是C₁₀至C₁₆烷基，那么q*m≥0.2；

其中：

●R是一OH或-（f-[A]-COOH)_n基团：

○-A-是包含1至4个碳原子的直链或支链基团；所述基团-A-：

○n表示-f-[A]-COOH对葡糖苷单元的取代度，并且0.1≤n≤2；

●R’选自以下基团：

○-C(O)NH-[E]-(0-[F])_t；

○-CH₂N(L)_z-[E]-(0-[F])_t；

其中：

○z是等于1或2的正整数，

○L选自：

■-H，并且z等于1，和/或

■一[A]-COOH，并且z等于1或2，如果f是醚官能团，

■-CO-[A]-COOH，并且z等于1，如果f是酯官能团，以及

■-CO-NH-[A]-COOH，并且z等于1，如果f是氨基甲酸酯官能团；

○-[E]-(0-[F])_t：

■-E-是直链或支链的至少二价基团，其包含1至8个碳原子并且任选地包含杂原子如O、N或S；

■-F-是12至30个碳原子的直链烷基或环烷基、烷基芳基或芳基烷基，任选地被一个或更多个C₁至C₃烷基取代；

■0是选自醚、酯、酰胺或氨基甲酸酯官能团的官能团；

■t是的等于1或2的正整数；

●当z＝2时，氮原子为季铵的形式。

在一个实施方案中，当p＝1时，如果Y是C₂₁至C₃₀基团，那么q*m≥1。在一个实施方案中，当p＝1时，如果Y是C₂₁至C₃₀基团，那么q*m≥0.1。在一个实施方案中，-(f-[A]-COOH)_n基团是这样的：

●-A-是包含1个碳原子的基团，所述-A-基团通过醚官能团f与葡糖苷单元键合。

在一个实施方案中，-(g-[B]-k-[D])_m基团是这样的：

●-B-是包含1个碳原子的基团，所述-B-基团通过醚官能团g与葡糖苷单元键合，并且

●X是来自于氨基酸的基团。

在一个实施方案中，-(f-[A]-COOH)_n基团是这样的：

●-A-是包含1个碳原子的基团，所述-A-基团通过醚官能团f与葡糖苷单元键合，并且

●-(g-[B]-k-[D])_m基团是这样的：

●X是来自于氨基酸的基团，

●k是酰胺官能团。

在一个实施方案中，被带有羧酸荷载的基团和疏水基团取代的葡聚糖是式III的葡聚糖：

其中：

●R是-OH或选自以下基团：

○-(f-[A]-COOH)_n；

○-(g-[B]-k-[D])_m，D包含至少一个含至少8个碳原子的烷基链；

●n表示-f-[A]-COOH对葡糖苷单元的取代度，并且0.1≤n≤2；

●m表示-g-[B]-k-[D]对葡糖苷单元的取代度，并且0<m≤0.5；

●-(f-[A]-COOH)_n：

○-A-是包含1至4个碳原子的直链或支链基团；所述-A-基团：

●-(g-[B]-k-[D])_m：

○通过官能团k与-D基团键合，k选自酯、酰胺和氨基甲酸酯官能团；所述-D基团：

●是-X(-l-Y)_p基团，X是包含选自C、N和O原子的1至12个原子的至少二价基团，任选地带有羧基或胺官能团和l或来自于氨基酸、二醇、二胺或者单或聚乙二醇单胺或二胺；Y是8至20个碳原子的直链烷基或环烷基、烷基芳基或芳基烷基，任选地被一个或更多个C₁至C₃烷基取代；p≥1，并且l是选自酯、酰胺和氨基甲酸酯官能团的官能团；

●f、g和k相同或不同；

●并且当p≥2时，如果Y是C₈至C₁₁烷基，那么q*m≥2，如果Y是C₁₂至C₁₆烷基，那么q*m≥0.3。

在一个实施方案中，被带有羧酸荷载的基团和疏水基团取代的葡聚糖是式IV的葡聚糖：

其中：

●R是-OH或选自以下基团：

○-(f-[A]-COOH)_n；

○-(g-[B]-k-[D])_m，D包含至少一个含至少8个碳原子的烷基链；

●n表示每个葡糖苷单元中-f-[A]-COOH对羟基-OH官能团的取代度，并且0.1≤n≤2；

●m表示每个葡糖苷单元中-g-[B]-k-[D]对羟基-OH官能团的取代度，并且0<m≤0.5；

●q表示葡糖苷单元的聚合度，换言之是每个多糖链中葡糖苷单元的平

均数，并且3≤q≤50；

●-(f-[A]-COOH)_n：

○-A-是包含1至4个碳原子的直链或支链基团；所述-A-基团：

●-(g-[B]-k-[D])_m：

●是-X(-l-Y)p基团，X是包含选自C、N和O原子的1至12个原子的至少二价基团，任选地带有羧基或胺官能团和l或来自于氨基酸、二醇、二胺或者单或聚乙二醇单胺或二胺；Y是8至30个碳原子的直链烷基或环烷基、烷基芳基或芳基烷基，任选地被一个或更多个C₁至C₃烷基取代；p≥1，并且l是选自酯、酰胺和氨基甲酸酯官能团的官能团；

●f、g和k相同或不同；

●并且，当p＝1时，如果Y是C₈至C₁₄烷基，那么q*m≥2，如果Y是C₁₅烷基，那么q*m≥2；并且如果Y是C₁₆至C₃₀烷基，那么q*m≥1；●并且当p≥2时，如果Y是C₈至C₉烷基，那么q*m≥2，如果Y是C₁₀至C₁₆烷基，那么q*m≥0.2。

结构图符合于通常用于表示葡聚糖(其主要由葡糖苷单元之间的(1，6)连接构成的多糖)的图示，这是所采用的图示。葡聚糖通常还包含约5％的(1，3)连接，其有意地未示出，但是其当然也包括在本发明的范围内。

术语等电点为5.8至8.5的“基础胰岛素”应理解为是指在pH7下不溶并且在糖尿病标准模型中具有8至24小时或更长的作用持续时间的胰岛素。

这些等电点为5.8至8.5的基础胰岛素是重组胰岛素，其一级结构主要通过引入碱性氨基酸(例如精氨酸或赖氨酸)进行修饰。其描述在例如以下专利、专利申请或出版物中：WO2003／053339、WO2004／096854、US5656722和US6100376。

在一个实施方案中，等电点为5.8至8.5的基础胰岛素是甘精胰岛素。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含100IU／ml(即，约3.6mg／ml)等电点为5.8至8.5的基础胰岛素。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含40IU／ml等电点为5.8至8.5的基础胰岛素。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含200IU／ml等电点为5.8至8.5的基础胰岛素。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含300IU／ml等电点为5.8至8.5的基础胰岛素。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含400IU／ml等电点为5.8至8.5的基础胰岛素。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含500IU／ml等电点为5.8至8.5的基础胰岛素。

在一个实施方案中，等电点为5.8至8.5的基础胰岛素与经取代葡聚糖的重量比(即，经取代葡聚糖/基础胰岛素)为0.2至5。

在一个实施方案中，等电点为5.8至8.5的基础胰岛素与经取代葡聚糖的重量比(即，经取代葡聚糖/基础胰岛素)为0.2至4。

在一个实施方案中，等电点为5.8至8.5的基础胰岛素与经取代葡聚糖的重量比(即，经取代葡聚糖/基础胰岛素)为0.2至3。

在一个实施方案中，等电点为5.8至8.5的基础胰岛素与经取代葡聚糖的重量比(即，经取代葡聚糖/基础胰岛素)为0.5至3。

在一个实施方案中，等电点为5.8至8.5的基础胰岛素与经取代葡聚糖的重量比(即，经取代葡聚糖/基础胰岛素)为0.8至3。

在一个实施方案中，等电点为5.8至8.5的基础胰岛素与经取代葡聚糖的重量比(即，经取代葡聚糖/基础胰岛素)为1至3。

在一个实施方案中，经取代葡聚糖的浓度为1至100mg／ml。

在一个实施方案中，经取代葡聚糖的浓度为1至80mg／ml。

在一个实施方案中，经取代葡聚糖的浓度为1至60mg／ml。

在一个实施方案中，经取代葡聚糖的浓度为1至50mg／ml。

在一个实施方案中，经取代葡聚糖的浓度为1至30mg／ml。

在一个实施方案中，经取代葡聚糖的浓度为1至20mg／ml。

在一个实施方案中，经取代葡聚糖的浓度为1至10mg／ml。

在一个实施方案中，多糖的浓度为5至20mg／ml。

在一个实施方案中，多糖的浓度为5至10mg／ml。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物还包含餐时胰岛素。餐时胰岛素在pH7下可溶。

术语“餐时胰岛素”应理解为是指“快速”胰岛素或“普通”胰岛素。

“快速’’餐时胰岛素是必须满足在进餐时由于摄取蛋白质和糖所引起的需求的胰岛素，其必须在小于30分钟内起作用。

在一个实施方案中，“普通”餐时胰岛素选自(人胰岛素)和(人胰岛素)。

“快速作用’’餐时胰岛素是通过重组获得的胰岛素，并且其被修饰以减少其作用时间。

在一个实施方案中，“快速作用”餐时胰岛素选自赖脯胰岛素赖谷胰岛素和门冬胰岛素

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含总共100IU／ml(即，约3.6mg／ml)由餐时胰岛素与等电点为5.8至8.5的基础胰岛素组合的胰岛素。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含总共40IU／ml由餐时胰岛素与等电点为5.8至8.5的基础胰岛素组合的胰岛素。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含总共200IU／ml由餐时胰岛素与等电点为5.8至8.5的基础胰岛素组合的胰岛素。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含总共300IU／ml由餐时胰岛素与等电点为5.8至8.5的基础胰岛素组合的胰岛素。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含总共400IU／ml由餐时胰岛素与等电点为5.8至8.5的基础胰岛素组合的胰岛素。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含总共500IU／ml由餐时胰岛素与等电点为5.8至8.5的基础胰岛素组合的胰岛素。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含总共600IU／ml由餐时胰岛素与等电点为5.8至8.5的基础胰岛素组合的胰岛素。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含总共700IU／ml由餐时胰岛素与等电点为5.8至8.5的基础胰岛素组合的胰岛素。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含总共800IU／ml由餐时胰岛素与等电点为5.8至8.5的基础胰岛素组合的胰岛素。

对于上述40至800IU／ml的制剂，等电点为5.8至8.5的基础胰岛素与餐时胰岛素的比例(表示为相对于胰岛素总量的百分比)为例如25／75、30／70、40／60、50／50、60／40、70／30、80／20和90／10。但是，也可产生任何其他比例。

对于包含100IU／ml总胰岛素的制剂，等电点为5.8至8.5的基础胰岛素与餐时胰岛素的比例以IU／ml计为例如25／75、30／70、40／60、50／50、60／40、70／30、80／20或90／10。但是，也可产生任何其他比例。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物还包含GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1衍生物。

在一个实施方案中，GLP-1类似物或衍生物选自：由礼来公司和艾米林制药公司(Amylin Pharmaceuticals)开发的艾塞那肽(exenatide)或，由诺和诺德开发的利拉鲁肽(liraglutide)或，或者由赛诺菲开发的利西拉来(lixisenatide)或，它们的类似物或衍生物以及它们的可药用盐。

在一个实施方案中，GLP-1类似物或衍生物是艾塞那肽或，其类似物或衍生物以及它们的可药用盐。

在一个实施方案中，GLP-1类似物或衍生物是利拉鲁肽或，其类似物或衍生物以及它们的可药用盐。

在一个实施方案中，GLP-1类似物或衍生物是利西拉来或，其类似物或衍生物以及它们的可药用盐。

术语“类似物”当被用于指肽或蛋白质时，应理解为是指这样的肽或蛋白质，其中一个或更多个组成氨基酸残基被其他氨基酸残基替换和/或所述肽或蛋白质中的一个或更多个组成氨基酸残基缺失和／或已向所述肽或蛋白质中添加了一个或更多个组成氨基酸残基。对于类似物的该定义，接受的同一性百分比是50％。

术语“衍生物”当被用于指肽或蛋白质时，应理解为是指通过不存在于所指的肽或蛋白质或类似物中的取代基化学修饰的肽或蛋白质或类似物，也就是说，通过产生共价键以引入取代基来修饰的肽或蛋白质。

在一个实施方案中，GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1衍生物的浓度为0.01至10mg／ml。

在一个实施方案中，艾塞那肽、其类似物或衍生物以及它们的可药用盐的浓度为0.05至0.5mg／ml。

在一个实施方案中，利拉鲁肽、其类似物或衍生物以及它们的可药用盐的浓度为1至10mg／ml。

在一个实施方案中，利西拉来、其类似物或衍生物以及它们的可药用盐的浓度为0.01至1mg／ml。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物通过以10／90至90／10的体积比混合等电点为5.8至8.5的基础胰岛素的商业化溶液和GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1衍生物的商业化溶液来产生。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含日剂量的基础胰岛素和日剂量的GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1衍生物。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含500IU／ml等电点为5.8至8.5的基础胰岛素和0.05至0.5mg／ml艾塞那肽。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含500IU／ml等电点为5.8至8.5的基础胰岛素和1至10mg／ml利拉鲁肽。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含500IU／ml等电点为5.8至8.5的基础胰岛素和0.05至0.5mg／ml利西拉来。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含100IU／ml等电点为5.8至8.5的基础胰岛素和0.05至0.5mg／ml艾塞那肽。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含100IU／ml等电点为5.8至8.5的基础胰岛素和1至10mg／ml利拉鲁肽。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含100IU／ml等电点为5.8至8.5的基础胰岛素和0.05至0.5mg／ml利西拉来。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含40IU／ml等电点为5.8至8.5的基础胰岛素和0.05至0.5mg／ml艾塞那肽。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含40IU／ml等电点为5.8至8.5的基础胰岛素和1至10mg／ml利拉鲁肽。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含40IU／ml等电点为5.8至8.5的基础胰岛素和0.05至0.5mg／ml利西拉来。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含200IU／ml等电点为5.8至8.5的基础胰岛素和0.05至0.5mg／ml艾塞那肽。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含200IU／ml等电点为5.8至8.5的基础胰岛素和1至10mg／ml利拉鲁肽。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含200IU／ml等电点为5.8至8.5的基础胰岛素和0.05至0.5mg／ml利西拉来。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物还包含浓度为0至5000μM的锌盐。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物还包含浓度为50至4000μM的锌盐。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物还包含浓度为200至3000μM的锌盐。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物还包含浓度为0至1000μM的锌盐。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物还包含浓度为20至600μM的锌盐。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物还包含浓度为50至500μM的锌盐。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含浓度为0至100mM、优选0至50mM或15至50mM的缓冲剂，所述缓冲剂选自Tris、柠檬酸盐和磷酸盐。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物还包含防腐剂。

在一个实施方案中，防腐剂选自单独或作为混合物的间甲酚和苯酚。

在一个实施方案中，防腐剂的浓度为10至50mM。

在一个实施方案中，防腐剂的浓度为10至40mM。

根据本发明的组合物还可包含添加剂，例如张度剂(agents de )，例如甘油、NaCl、甘露醇和甘氨酸。

根据本发明的组合物还可包含根据药典的添加剂，例如表面活性剂，例如聚山梨醇酯。

根据本发明的组合物还可包含与以使用浓度使用的胰岛素相容的所有根据药典的赋形剂。

在一个实施方案中，0.3≤n≤1.7。

在一个实施方案中，0.7≤n≤1.5。

在一个实施方案中，0.9≤n≤1.2。

在一个实施方案中，0.01≤m≤0.5。

在一个实施方案中，0.02≤m≤0.4。

在一个实施方案中，0.03≤m≤0.3。

在一个实施方案中，0.05≤m≤0.2。

在一个实施方案中，3≤q≤50。

在一个实施方案中，3≤q≤40。

在一个实施方案中，3≤q≤30。

在一个实施方案中，3≤q≤20。

在一个实施方案中，3≤q≤10。

在一个实施方案中，-(f-[A]-COOH)_n基团选自以下序列(enchainement)，f具有以上给出的含义：

在一个实施方案中，-(g-[B]-k-[D])_m基团选自以下序列，g、k和D具有以上给出的含义：

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团是来自于氨基酸的至少二价基团。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团是来自于氨基酸的至少二价基团，所述氨基酸选自甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。

所述来自于氨基酸的基团可以是左旋的或右旋的。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团是来自于单或聚乙二醇的至少二价基团。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团是来自于乙二醇的至少二价基团。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团是来自于聚乙二醇的至少二价基团，所述聚乙二醇选自二甘醇(dieèthylène glycol)和三甘醇(thiéthylène glycol)。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团是来自于单或聚乙二醇胺的至少二价基团。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团是来自于单或聚乙二醇胺的至少二价基团，所述单或聚乙二醇胺选自乙醇胺、二甘醇胺(diéthylène glycol aminé)和三甘醇胺(triéthylène glycol aminé)。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团是来自于单或聚乙二醇二胺的至少二价基团。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团是来自于乙二胺的至少二价基团。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团是来自于单或聚乙二醇二胺的至少二价基团，所述单或聚乙二醇二胺选自二甘醇二胺(diéthylène glycol diamine)和三甘醇二胺(thiéthylène glycol diamine)。

在一个实施方案中，D是这样的，其中Y基团是来自于疏水醇的烷基。

在一个实施方案中，D是这样的，其中Y基团是来自于疏水醇的烷基，所述疏水醇选自辛醇(辛基醇)、3,7-二甲基辛-1-醇、癸醇(癸基醇)、十二烷醇(月桂醇)、十四烷醇(肉豆蔻醇)和十六烷醇(鲸蜡醇)。

在一个实施方案中，D是这样的，其中Y基团是来自于疏水酸的烷基。

在一个实施方案中，D是这样的，其中Y基团是来自于疏水酸的烷基，所述疏水酸选自癸酸、十二烷酸、十四烷酸和十六烷酸。

在一个实施方案中，D是这样的，其中Y基团是来自于甾醇的基团。

在一个实施方案中，D是这样的，其中Y基团是来自于甾醇的基团，所述甾醇选自胆固醇及其衍生物。

在一个实施方案中，D是这样的，其中Y基团是来自于生育酚的基团。

在一个实施方案中，D是这样的，其中Y基团是来自于生育酚衍生物的基团，所述生育酚衍生物选自α-生育酚的外消旋体、L异构体或D异构体。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团来自于甘氨酸，p＝1，Y基团来自于辛醇，并且官能团l是酯官能团。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团来自于甘氨酸，p＝1，Y基团来自于十二烷醇，并且官能团l是酯官能团。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团来自于甘氨酸，p＝1，Y基团来自于十六烷醇，并且官能团l是酯官能团。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团来自于苯丙氨酸，p＝1，Y基团来自于辛醇，并且官能团l是酯官能团。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团来自于苯丙氨酸，p＝1，Y基团来自于3，7-二甲基辛-1-醇，并且官能团l是酯官能团。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团来自于天冬氨酸，p＝2，Y基团来自于辛醇，并且官能团l是酯官能团。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团来自于天冬氨酸，p＝2，Y基团来自于癸醇，并且官能团l是酯官能团。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团来自于天冬氨酸，p＝2，Y基团来自于十二烷醇，并且官能团l是酯官能团。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团来自于乙二胺，Y基团来自于十二烷酸，并且官能团l是酰胺官能团。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团来自于二甘醇胺，p＝1，Y基团来自于十二烷酸，并且官能团l是酯官能团。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团来自于三甘醇二胺，p＝1，Y基团来自于十二烷酸，并且官能团l是酰胺官能团。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团来自于三甘醇二胺，p＝1，Y基团来自于十六烷酸，并且官能团l是酰胺官能团。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团来自于亮氨酸，p＝1，Y基团来自于胆固醇，并且官能团l是酯官能团。

在一个实施方案中，D是这样的，其中X基团来自于乙二胺，p＝1，Y基团来自于胆固醇，并且官能团l是氨基甲酸酯官能团。

在一个实施方案中，E基团是来自于氨基酸的至少二价基团，所述氨基酸选自甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。

所述来自于氨基酸的基团可以是左旋的或右旋的。

在一个实施方案中，E基团是来自于单或聚乙二醇胺的至少二价基团。

在一个实施方案中，E基团是来自于单或聚乙二醇胺的至少二价基团，所述单或聚乙二醇胺选自乙醇胺、二甘醇胺和三甘醇胺。

在一个实施方案中，E基团是来自于单或聚乙二醇二胺的至少二价基团。

在一个实施方案中，E基团是来自于乙二胺的至少二价基团。

在一个实施方案中，E基团是来自于单或聚乙二醇二胺的至少二价基团，所述单或聚乙二醇二胺选自二甘醇二胺和三甘醇二胺。

在一个实施方案中，F基团是来自于疏水醇的烷基。

在一个实施方案中，F基团是来自于疏水醇的基团，所述疏水醇选自十二烷醇(月桂醇)、十四烷醇(肉豆蔻醇)和十六烷醇(鲸蜡醇)。

在一个实施方案中，F基团是来自于疏水酸的基团。

在一个实施方案中，F基团是来自于疏水酸的基团，所述疏水酸选自十二烷酸、十四烷酸和十六烷酸。

在一个实施方案中，F基团是来自于甾醇的基团。

在一个实施方案中，F基团是来自于甾醇的基团，所述甾醇选自胆固醇及其衍生物。

在一个实施方案中，F基团是来自于生育酚的基团。

在一个实施方案中，F基团是来自于生育酚衍生物的基团，所述生育酚衍生物选自α-生育酚的外消旋体、L异构体或D异构体。

在一个实施方案中，E基团来自于乙二胺，t＝1，o是氨基甲酸酯官能团，并且F基团来自于胆固醇。

在一个实施方案中：

○-(f-[A]-COOH)_n是这样的，其中A是-CH₂-基团，并且f是醚官能团；

○-(g-[B]-k-[D])_m是这样的，其中g是醚官能团，B是-CH₂-基团，k是酰胺官能团，并且D是这样的，其中X来自于甘氨酸，l是酯官能团，并且Y来自于辛醇；

○q＝38，n＝0.9，并且m＝0.2。

在一个实施方案中：

○-(g-[B]-k-[D])_m是这样的，其中g是醚官能团，B是-CH₂-基团，k是酰胺官能团，并且D是这样的，其中X来自于甘氨酸，p＝1，l是酯官能团，并且Y来自于十六烷醇；

○q＝19，n＝1.0，并且m＝0.1。

在一个实施方案中：

○-(g-[B]-k-[D])_m是这样的，其中g是醚官能团，B是-CH₂-基团，k是酰胺官能团，并且D是这样的，其中X来自于苯丙氨酸，p＝1，l是酯官能团，并且Y来自于辛醇；

○q＝38，n＝1.0，并且m＝0.1。

在一个实施方案中：

○q＝19，n＝1.0，并且m＝0.2。

在一个实施方案中：

○-(g-[B]-k-[D])_m是这样的，其中g是醚官能团，B是-CH₂-基团，k是酰胺官能团，并且D是这样的，其中X来自于苯丙氨酸，p＝1，l是酯官能团，并且Y来自于3,7-二甲基辛-1-醇；

○q＝38，n＝1.0，并且m＝0.1。

在一个实施方案中：

○-(g-[B]-k-[D])_m是这样的，其中g是醚官能团，B是-CH₂-基团，k是酰胺官能团，并且D是这样的，其中X来自于天冬氨酸，p＝2，l是酯官能团，并且Y来自于辛醇；

○q＝38，n＝1.05，并且m＝0.05。

在一个实施方案中：

○-(g-[B]-k-[D])_m是这样的，其中g是醚官能团，B是-CH₂-基团，k是酰胺官能团，并且D是这样的，其中X来自于天冬氨酸，p＝2，l是酯官能团，并且Y来自于癸醇；

○q＝38，n＝1.05，并且m＝0.05。

在一个实施方案中：

○-(g-[B]-k-[D])_m是这样的，其中g是醚官能团，B是-CH₂-基团，k是酰胺官能团，并且D是这样的，其中X来自于天冬氨酸，p＝2，l是酯官能团，并且Y来自于十二烷醇；

○q＝19，n＝1.05，并且m＝0.05。

在一个实施方案中：

○-(g-[B]-k-[D])_m是这样的，其中g是醚官能团，B是-CH₂-基团，k是酰胺官能团，并且D是这样的，其中X来自于乙二胺，p＝1，l是酰胺官能团，并且Y来自于十二烷酸；

○q＝38，n＝1.0，并且m＝0.1。

在一个实施方案中：

○-(f-[A]-COOH)_n是这样的，其中A是-CH₂-CH₂-基团，并且f是酯官能团；

○-(g-[B]-k-[D])_m是这样的，其中g是酯官能团，B是-CH₂-CH₂-基团，k是酰胺官能团，并且D是这样的，其中X来自于甘氨酸，p＝1，l是酯官能团，并且Y来自于十二烷醇；

○q＝38，n＝1.3，并且m＝0.1。

在一个实施方案中：

○-(f-[A]-COOH)_n是这样的，其中A是-CH₂-基团，并且f是氨基甲酸酯官能团；

○-(g-[B]-k-[D])_m是这样的，其中g是氨基甲酸酯官能团，B是-CH₂-基团，k是酰胺官能团，并且D是这样的，其中X来自于天冬氨酸，p＝2，l是酯官能团，并且Y来自于辛醇；

○q＝38，n＝1.3，并且m＝0.1。

在一个实施方案中：

○q＝4，n＝0.96，并且m＝0.07。

在一个实施方案中：

○-(g-[B]-k-[D])_m是这样的，其中g是醚官能团，B是-CH₂-基团，k是酰胺官能团，并且D是这样的，其中X来自于二甘醇胺，p＝1，l是酯官能团，并且Y来自于十二烷酸；

○q＝38，n＝1.0，并且m＝0.1。

在一个实施方案中：

○-(g-[B]-k-[D])_m是这样的，其中g是醚官能团，B是-CH₂-基团，k是酰胺官能团，并且D是这样的，其中X来自于三甘醇二胺，p＝1，l是酰胺官能团，并且Y来自于十二烷酸；

○q＝38，n＝1.0，并且m＝0.1。

在一个实施方案中：

○o-(g-[B]-k-[D])_m是这样的，其中g是醚官能团，B是-CH₂-基团，k是酰胺官能团，并且D是这样的，其中X来自于三甘醇二胺，p＝1，l是酰胺官能团，并且Y来自于十六烷酸；

○q＝38，n＝1.05，并且m＝0.05。

在一个实施方案中：

○-(g-[B]-k-[D])_m是这样的，其中g是醚官能团，是-CH₂-基团，k是酰胺官能团，并且D是这样的，其中X来自于甘氨酸，p＝1，l是酯官能团，并且Y来自于十六烷醇；

○q＝19，n＝1.05，并且m＝0.05。

在一个实施方案中：

○q＝38，n＝0.37，并且m＝0.05。

在一个实施方案中：

○-(g-[B]-k-[D])_m是这样的，其中g是醚官能团，B是-CH₂-基团，k是酰胺官能团，并且D是这样的，其中X来自于亮氨酸，p＝1，l是酯官能团，并且Y来自于胆固醇；

○q＝19，n＝1.61，并且m＝0.04。

在一个实施方案中：

○q＝19，n＝1.06，并且m＝0.04。

在一个实施方案中：

○q＝19，n＝0.66，并且m＝0.04。

在一个实施方案中：

○q＝19，n＝0.46，并且m＝0.04。

在一个实施方案中：

○q＝4，n＝1.61，并且m＝0.05。

在一个实施方案中：

○-(g-[B]-k-[D])_m是这样的，其中g是醚官能团，B是-CH₂-基团，k是酰胺官能团，并且D是这样的，其中X来自于乙二胺，p＝1，l是氨基甲酸酯官能团，并且Y来自于胆固醇；

○q＝19，n＝1.61，并且m＝0.04。

在一个实施方案中：

○-(g-[B]-k-[D])_m是这样的，其中g氨基甲酸酯官能团，B是-CH₂-基团，k是酰胺官能团，并且D是这样的，其中X来自于亮氨酸，p＝1，l是酯官能团，并且Y来自于胆固醇；

○q＝19，n＝1.96，并且m＝0.04。

在一个实施方案中：

○-[E]-(o-[F])_t是这样的，其中E来自于乙二胺，o是氨基甲酸酯官能团，并且F来自于胆固醇；

○q＝19，并且n＝1.65。

在一个实施方案中：

○q＝38，n＝0.99，并且m＝0.05。

在一个实施方案中：

○q＝4，n＝1.41，并且m＝0.16。

在一个实施方案中：

○q＝4，n＝1.50，并且m＝0.07。

在一个实施方案中：

○q＝4，n＝1.05，并且m＝0.05。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含葡聚糖，其选自式I、III或IV的以下葡聚糖：

-经甘氨酸辛酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠(Dextraneméthylcarboxylate desodium)，

-经甘氨酸鲸蜡酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经苯丙氨酸辛酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经苯丙氨酸3,7-二甲基-1-辛酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经天冬氨酸二辛酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经天冬氨酸二癸酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经天冬氨酸二月桂酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经N-(2-氨基乙基)十二烷酰胺修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经甘氨酸月桂酯修饰的葡聚糖琥珀酸钠(Dextranesuccinate de sodium)，

-经天冬氨酸二辛酯修饰的N-(甲基羧酸钠)葡聚糖氨基甲酸酯，

-经天冬氨酸二月桂酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经十二烷酸2-(2-氨基乙氧基)乙酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经2-(2-{2-[十二烷酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙胺修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经2-(2-{2-[十六烷酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙胺修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经亮氨酸胆固醇酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经1-乙二胺羧酸胆固醇酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经亮氨酸胆固醇酯修饰的N-(甲基羧酸钠)葡聚糖氨基甲酸酯。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含葡聚糖，所述葡聚糖选自以下式II的葡聚糖：

-经通过对还原性链末端的还原胺化接枝的1-乙二胺羧酸胆固醇酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠。

本发明还涉及包含等电点为5.8至8.5的基础胰岛素和餐时胰岛素的pH为6.6至7.8的单剂量制剂。

本发明还涉及包含等电点为5.8至8.5的基础胰岛素和餐时胰岛素的pH为7至7.8的单剂量制剂。

在一个实施方案中，所述等电点为5.8至8.5的基础胰岛素是甘精胰岛素。

在一个实施方案中，所述餐时胰岛素选自：(人胰岛素)和(人胰岛素)。

在一个实施方案中，所述餐时胰岛素选自：赖脯胰岛素赖谷胰岛素和门冬胰岛素

借助于溶液外观的改变，可以利用肉眼以简单的方式观察和控制式I、II、III或IV的多糖使等电点为5.8至8.5的基础胰岛素在pH6.6至7.8下的溶解。

借助于溶液外观的改变，可以利用肉眼以简单的方式观察和控制式I、II、III或IV的多糖使等电点为5.8至8.5的基础胰岛素在pH7至7.8下的溶解。

此外，并且同样重要地，本申请公司能够证实在式I、II、III或IV的多糖的存在下溶解的等电点为5.8至8.5的基础胰岛素未失去其慢速胰岛素作用。

根据本发明的组合物的制备表现出具有能够通过简单地混合等电点为5.8至8.5的基础胰岛素的水溶液、餐时胰岛素的溶液和水溶液或冻干形式的式I、II、III或IV的多糖来进行的优点。如果必要的话，将制备的pH调整至pH7。

根据本发明的组合物的制备表现出具有能够通过简单地混合等电点为5.8至8.5的基础胰岛素的水溶液、水溶液或冻干形式的式I、II、III或IV的多糖和水溶液或冻干形式的餐时胰岛素来进行。

在一个实施方案中，通过超滤使基础胰岛素和多糖的混合物浓缩，之后与水溶液或冻干形式的餐时胰岛素混合。

如果必要的话，通过向混合物中添加赋形剂如甘油、间甲酚、氯化锌和吐温的浓溶液，在这些赋形剂中调整混合物的组成。如果必要的话，将制备的pH调整至7。

附图说明

图1至6示出了获得的葡萄糖的药物效应动力学曲线形式的结果。坐标轴的轴表示作为注射后时间(以分钟表示)的函数的D葡萄糖(以mM表示)。

图1：与根据本发明的组合物多糖(75／25)(■)相比，依次施用和(□)的平均值+平均值之标准偏差的曲线。

图2：独立曲线(在6只猪中测试)。

图3：多糖独立曲线(在6只猪中测试)。

图4：与根据本发明的组合物多糖(■)相比，依次施用和(□)的平均值+平均值之标准偏差的曲线。

图5：独立曲线(在6只猪中测试)。

图6：多糖独立曲线(在5只猪中测试)。

图7至12示出了得到的葡萄糖的药物效应动力学曲线形式的结果。坐标轴的轴表示作为注射后时间(以小时表示)的函数的D葡萄糖(以mM表示)。

图7：与实施例B28中描述的根据本发明的组合物(0.53IU／kg)相比，依次施用(100IU／ml，0.13IU／kg)和(100IU／ml，0.4IU／kg)的平均值+平均值之标准偏差的曲线。

图8：与实施例B27中描述的根据本发明的组合物(0.47IU／kg)相比，依次施用(100IU／ml，0.13IU／kg)和(100IU／ml，0.4IU／kg)的平均值+平均值之标准偏差的曲线。

图9：与实施例B29中描述的根据本发明的组合物(0.53IU／kg)相比，依次施用(100IU／ml，0.13IU／kg)和(100IU／ml，0.4IU／kg)的平均值+平均值之标准偏差的曲线。

图10：与实施例B31中描述的根据本发明的组合物(0.48IU／kg)相比，依次施用(100IU／ml，0.13IU／kg)和(100IU／ml，0.4IU／kg)的平均值+平均值之标准偏差的曲线。

图11：与实施例B30中描述的根据本发明的组合物(0.64IU／kg)相比，依次施用(100IU／ml，0.24U／kg)和(100IU／ml，0.4IU／kg)的平均值+平均值之标准偏差的曲线。

图12：与实施例B32中描述的根据本发明的组合物(0.53IU／kg)相比，依次施用(100IU／ml，0.13IU／kg)和(100IU／ml，0.4IU／kg)的平均值+平均值之标准偏差的曲线。

实施例

A部分：多糖

下表1以非限制性方式给出了可以在根据本发明的组合物中使用的多糖的实例。

表1

实施例A1：多糖1的制备

将重均分子量为约10kg／mol(q＝38，PHARMACOSMOS)的16g(即，296mmol羟基)葡聚糖以420g/l溶解在水中。向溶液中添加30ml的10N NaOH(296mmol)。将混合物升温至35℃，然后添加46g(396mmol)氯乙酸钠。以0.5℃／分钟将反应混合物的温度升高至60℃，然后在60℃保持100分钟。将反应介质用200ml水稀释，用乙酸中和，并利用6体积的水通过5kDaPES膜超滤纯化。将最终溶液通过干提取(extrait sec)进行测定，以确定多糖的浓度，然后通过在50／50(V／V)水／丙酮中的酸/碱滴定进行测定，以确定每个葡糖苷单元中甲基羧酸盐单元的平均数。

根据干提取：[多糖]＝31.5mg／g。

根据酸/碱滴定：每个葡糖苷单元中甲基羧酸盐单元的平均数为1.1。

使葡聚糖甲基羧酸钠溶液通过Purolite树脂(阴离子性)以得到葡聚糖甲基羧酸，随后将其冻干18小时。

根据专利US4826818中描述的方法获得甘氨酸辛酯对甲基苯磺酸盐。

将10g葡聚糖甲基羧酸(44.86mmol甲基羧酸)以60g/l溶解在DMF中，然后冷却至0℃。将3.23g甘氨酸辛酯对甲基苯磺酸盐(8.97mmol)以100g/l混悬在DMF中。随后向悬液中添加0.91g三乙胺(8.97mmol)。一旦多糖溶液处于0℃，随后添加NMM(5.24g，51.8mmol)的DMF溶液(530g/l)和5.62g(51.8mmol)EtOCOCl。在反应10分钟之后，添加甘氨酸辛酯悬液。随后使介质在10℃下保持45分钟。随后将介质加热至30℃。向反应介质中添加咪唑溶液(10.38g，在17ml水中)和52ml水。将多糖溶液利用15体积的0.9％NaCl溶液和5体积的水通过10kDa PES膜超滤。通过干提取确定多糖溶液的浓度。将一部分溶液冻干并在D₂O中通过¹HNMR进行分析，以确定每个葡糖苷单元中甘氨酸辛酯对甲基羧酸盐的取代度。

根据干提取：[多糖1]＝36.4mg/g

根据酸/碱滴定：n＝0.9

根据¹H NMR：m＝0.2。

实施例A2：多糖2的制备

根据专利US4826818中描述的方法获得甘氨酸鲸蜡酯对甲基苯磺酸盐。

通过与实施例A1中的描述类似的方法获得经甘氨酸鲸蜡酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，所述葡聚糖甲基羧酸钠使用重均分子量为约5kg／mol(q＝19，PHARMACOSMOS)的葡聚糖根据实施例A1中描述的方法合成。

根据干提取：[多糖2]＝15.1mg/g

根据酸/碱滴定：n＝1.05

根据¹H NMR：m＝0.05。

实施例A3：多糖3的制备

根据专利US4826818中描述的方法获得苯丙氨酸辛酯对甲基苯磺酸盐。

通过与实施例A1中的描述类似的方法获得经苯丙氨酸辛酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，所述葡聚糖甲基羧酸钠使用重均分子量为约10kg／mol(q＝38，PHARMACOSMOS)的葡聚糖根据实施例A1中描述的方法合成。

根据干提取：[多糖3]＝27.4mg/g

根据酸/碱滴定：n＝1.0

根据¹H NMR：m＝0.1。

实施例A4：多糖4的制备

通过与实施例A3中的描述类似的方法获得经苯丙氨酸辛酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，所述葡聚糖甲基羧酸钠使用重均分子量为约5kg／mol(q＝19，PHARMACOSMOS)的葡聚糖根据实施例A1中描述的方法合成。

根据干提取：[多糖4]＝21.8mg/g

根据酸/碱滴定：n＝1.0

根据¹H NMR：m＝0.2。

实施例A5：多糖5的制备

根据专利US4826818中描述的方法获得苯丙氨酸3,7-二甲基-1-辛酯对甲基苯磺酸盐。

通过与实施例A1中的描述类似的方法获得经苯丙氨酸3,7-二甲基-1-辛酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，所述葡聚糖甲基羧酸钠使用重均分子量为约10kg／mol(q＝38，PHARMACOSMOS)的葡聚糖根据实施例A1中描述的方法合成。

根据干提取：[多糖5]＝24.3mg/g

根据酸/碱滴定：n＝1.0

根据¹H NMR：m＝0.1。

实施例A6：多糖6的制备

根据专利US4826818中描述的方法获得天冬氨酸二辛酯对甲基苯磺酸盐。

通过与实施例A1中的描述类似的方法获得经天冬氨酸二辛酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，所述葡聚糖甲基羧酸钠使用重均分子量为约10kg／mol(q＝38，PHARMACOSMOS)的葡聚糖根据实施例A1中描述的方法合成。

根据干提取：[多糖6]＝22.2mg/g

根据酸/碱滴定：n＝1.05

根据¹H NMR：m＝0.05。

实施例A7：多糖7的制备

根据专利US4826818中描述的方法获得天冬氨酸二癸酯对甲基苯磺酸盐。

通过与实施例A1中的描述类似的方法获得经天冬氨酸二癸酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，所述葡聚糖甲基羧酸钠使用重均分子量为约10kg／mol(q＝38，PHARMACOSMOS)的葡聚糖根据实施例A1中描述的方法合成。

根据干提取：[多糖7]＝19.8mg/g

根据酸/碱滴定：n＝1.05

根据¹H NMR：m＝0.05。

实施例A8：多糖8的制备

根据专利US4826818中描述的方法获得天冬氨酸二月桂酯对甲基苯磺酸盐。

通过与实施例A1中的描述类似的方法获得经天冬氨酸二月桂酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，所述葡聚糖甲基羧酸钠使用重均分子量为约5kg／mol(q＝19，PHARMACOSMOS)的葡聚糖根据实施例A1中描述的方法合成。

根据干提取：[多糖8]＝22.8mg/g

根据酸/碱滴定：n＝1.05

根据¹H NMR：m＝0.05。

实施例A9：多糖9的制备

根据专利US2387201中描述的方法由十二烷酸甲酯(SIGMA)和乙二胺(ROTH)获得N-(2-氨基乙基)十二烷酰胺。

通过与实施例A1中的描述类似的方法获得经N-(2-氨基乙基)十二烷酰胺修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，所述葡聚糖甲基羧酸钠使用重均分子量为约10kg／mol(q＝38，PHARMACOSMOS)的葡聚糖根据实施例A1中描述的方法合成。

根据干提取：[多糖9]＝23.8mg/g

根据酸/碱滴定：n＝1.0

根据¹H NMR：m＝0.1。

实施例A10：多糖10的制备

根据Sanchez-Chaves等1998论文(Manuel等，polymer,1998，39(13)，2751-2757)中描述的方法由重均分子量为约10kg／mol(q＝38，PHARMACOSMOS)的葡聚糖获得葡聚糖琥珀酸钠。根据D₂O／NaOD中的¹H NMR，每个葡糖苷单元中琥珀酸盐基团的平均数为1.4。

根据专利US4826818中描述的方法获甘氨酸月桂酯对甲基苯磺酸盐。

通过与实施例A1中的描述类似的方法获得经甘氨酸月桂酯修饰的葡聚糖琥珀酸钠。

根据干提取：[多糖10]＝16.1mg/g

根据酸/碱滴定：n＝1.3

根据¹H NMR：m＝0.1。

实施例A11：多糖11的制备

将重均分子量为约10kg／mol(q＝38，PHARMACOSMOS)的12g(即，0.22mol羟基)葡聚糖溶解在DMF／DMSO混合物中。将混合物在搅拌中升温至80℃。逐渐引入3.32g(0.03mol)1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷，然后引入14.35g(0.11mol)异氰酰乙酸乙酯。在反应5小时之后，将介质在水中稀释，利用0.1N NaOH、0.9％NaCl和水通过5kDa PES膜超滤纯化。将最终溶液通过干提取进行测定，以确定多糖的浓度；然后通过在50／50(V／V)水／丙酮中的酸/碱滴定进行测定，以确定每个葡糖苷单元中N-甲基羧酸盐氨基甲酸酯单元的平均数。

根据干提取：[多糖]＝30.5mg/g

根据酸/碱滴定：每个葡糖苷单元中N-甲基羧酸盐氨基甲酸酯单元的平均数为1.4。

通过与实施例A1中的描述类似的方法获得经天冬氨酸二辛酯修饰的N-(甲基羧酸钠)葡聚糖氨基甲酸酯。

根据干提取：[多糖11]＝17.8mg／g

根据酸/碱滴定：n＝1.3

根据¹H NMR：m＝0.1。

实施例A12：多糖12的制备

通过与实施例A1中的描述类似的方法获得经天冬氨酸二月桂酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，所述葡聚糖甲基羧酸钠使用重均分子量为约1kg／mol(q＝4，PHARMACOSMOS)的葡聚糖根据实施例A1中描述的方法合成。

根据干提取：[多糖12]＝12.3mg/g

根据酸/碱滴定：n＝0.96

根据¹H NMR：m＝0.07。

实施例A13：多糖13的制备

根据专利US4826818中描述的方法获得十二烷酸2-(2-氨基乙氧基)乙酯对甲基苯磺酸盐。

通过与实施例A1中的描述类似的方法获得经十二烷酸2-(2-氨基乙氧基)乙酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，所述葡聚糖甲基羧酸钠使用重均分子量为约10kg／mol(q＝38，PHARMACOSMOS)的葡聚糖根据实施例A1中描述的方法合成。

根据干提取：[多糖13]＝25.6mg/g

根据酸/碱滴定：n＝1.0

根据¹H NMR：m＝0.1。

实施例A14：多糖14的制备

根据专利US2387201中描述的方法由十二烷酸甲酯(SIGMA)和三甘醇二胺(HUNSTMAN)获得2-(2-{2-[十二烷酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙胺。

通过与实施例A1中的描述类似的方法获得经2-(2-{2-[十二烷酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙胺修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，所述葡聚糖甲基羧酸钠使用重均分子量为约10kg／mol(q＝38，PHARMACOSMOS)的葡聚糖根据实施例A1中描述的方法合成。

根据干提取：[多糖14]＝24.9mg/g

根据酸/碱滴定：n＝1.0

根据¹H NMR：m＝0.1。

实施例A15：多糖15的制备

根据专利US2387201中描述的方法由棕榈酸甲酯(SIGMA)和三甘醇二胺(HUNSTMAN)获得2-(2-{2-[十六烷酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙胺。

通过与实施例A1中的描述类似的方法获得经2-(2-{2-[十六烷酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙胺修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，所述葡聚糖甲基羧酸钠使用重均分子量为约10kg／mol(q＝38，PHARMACOSMOS)的葡聚糖根据实施例A1中描述的方法合成。

根据干提取：[多糖15]＝22.2mg/g

根据酸/碱滴定：n＝1.05

根据¹H NMR：m＝0.05。

实施例A16：多糖16的制备

根据干提取：[多糖16]＝23mg/g

根据酸/碱滴定：n＝1.05

根据¹H NMR：m＝0.05。

实施例A17：多糖17的制备

将重均分子量为约10kg／mol(q＝38，PHARMACOSMOS)的10g(即，185mmol羟基)葡聚糖以420g／l溶解在水中。向所述溶液中添加19ml的10N NaOH(185mmol)。将混合物升温至35℃，然后添加8.6g(74mmol)氯乙酸钠。以0.5℃/分钟将反应混合物的温度升高至60℃，然后在60℃保持100分钟。将反应介质用200ml水稀释，用乙酸中和，并利用6体积的水通过5klDaPES膜超滤纯化。将最终溶液通过干提取进行测定，以确定多糖的浓度，然后通过在50／50(V／V)水／丙酮中的酸/碱滴定进行测定，以确定每个葡糖苷单元中甲基羧酸盐单元的平均数。

根据干提取：[多糖]＝35.1mg/g

根据酸/碱滴定：每个葡糖苷单元中甲基羧酸盐单元的平均数为0.42。

通过与实施例A1中的描述类似的方法获得经甘氨酸鲸蜡酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠

根据干提取：[多糖17]＝18mg／g

根据酸/碱滴定：n＝0.37

根据¹H NMR：m＝0.05。

实施例A18：多糖18的制备

根据与多糖1的描述类似的方法由重均分子量为5kg／mol(q＝19，PHARMACOSMOS)的葡聚糖合成10g以每个葡糖苷单元中甲基羧酸的取代度是1.10为特征的葡聚糖甲基羧酸钠，然后冻干。

将8g(即，64mmol羟基)以每个葡糖苷单元中甲基羧酸的取代度是1.05为特征的葡聚糖甲基羧酸钠以1000g/l溶解在水中。添加6ml10N NaOH(64mmol)。将混合物加热至35℃并添加7.6g氯乙酸钠(65mmol)。将混合物逐渐升温至60℃，并且在该温度下另外保持100分钟。将混合物用水稀释，用乙酸中和，并利用水通过5kDa PES膜超滤纯化。将最终溶液通过干提取进行测定，以确定多糖的浓度，然后通过在50／50(V／V)水／丙酮中的酸/碱滴定进行测定，以确定每个葡糖苷单元中甲基羧酸盐单元的平均数。

根据干提取：[多糖]＝45.8mg/g

根据酸/碱滴定：每个葡糖苷单元中甲基羧酸盐单元的平均数为1.65。

根据专利US4826818中描述的方法获得亮氨酸胆固醇酯对甲基苯磺酸盐。

通过与实施例A1中的描述类似的方法获得经亮氨酸胆固醇酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠。

根据干提取：[多糖18]＝21mg/g

根据酸/碱滴定：n＝1.61

根据¹H NMR：m＝0.04。

实施例A19：多糖19的制备

通过与实施例A1中的描述类似的方法获得经亮氨酸胆固醇酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，所述葡聚糖甲基羧酸钠使用重均分子量为约5kg／mol(q＝19，PHARMACOSMOS)的葡聚糖根据实施例A1中描述的方法合成。

根据干提取：[多糖19]＝19.4mg/g

根据酸/碱滴定：n＝1.06

根据¹H NMR：m＝0.04。

实施例A20：多糖20的制备

将重均分子量为约5kg／mol(q＝19，PHARMACOSMOS)的16g(即，296mmol羟基)葡聚糖以420g/l溶解在水中。向该溶液中添加30ml的10N NaOH(296mmol)。将混合物升温至35℃，然后添加26g(222mmol)氯乙酸钠。将反应混合物的温度逐渐升高至60℃并在60℃保持100分钟。将反应介质用水稀释，用乙酸中和，并利用水通过5kDa PES膜超滤纯化。将最终溶液通过干提取进行测定，以确定多糖的浓度，然后通过在50／50(V／V)水／丙酮中的酸/碱滴定进行测定，以确定每个葡糖苷单元中甲基羧酸盐单元的平均数。

根据干提取：[多糖]＝33.1mg/g

根据酸/碱滴定：每个葡糖苷单元中甲基羧酸盐单元的平均数为0.70。

根据干提取：[多糖20]＝18.9mg/g

根据酸/碱滴定：n＝0.66

根据¹H NMR：m＝0.04。

实施例A21：多糖21的制备

将重均分子量为约5kg／mol(q＝19，PHARMACOSMOS)的16g(即，296mmol羟基)葡聚糖以420g/l溶解在水中。向该溶液中添加30ml的10N NaOH(296mmol)。将混合物升温至35℃，然后添加18g(158mmol)氯乙酸钠。将反应介质的温度逐渐升高至60℃，然后在60℃保持100分钟。将反应介质用水稀释，用乙酸中和，并利用水通过1kDa PES膜超滤纯化。将最终溶液通过干提取进行测定，以确定多糖的浓度，然后通过在50／50(V／V)水／丙酮中的酸/碱滴定进行测定，以确定每个葡糖苷单元中甲基羧酸盐单元的平均数。

根据干提取：[多糖]＝52.6mg/g

根据酸/碱滴定：每个葡糖苷单元中甲基羧酸盐单元的平均数为0.50。

根据干提取：[多糖21]＝18.9mg/g

根据酸/碱滴定：n＝0.46

根据¹H NMR：m＝0.04。

实施例A22：多糖22的制备

通过与实施例A18中的描述类似的方法获得经亮氨酸胆固醇酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，所述葡聚糖甲基羧酸钠使用重均分子量为约1kg／mol(q＝4，PHARMACOSMOS)的葡聚糖根据实施例A18中描述的方法合成。

根据干提取：[多糖22]＝20.2mg/g

根据酸/碱滴定：n＝1.61

根据1H NMR：m＝0.04。

实施例A23：多糖23的制备

根据专利(Akiyoshi，K等，WO2010／053140)中描述的方法获得1-乙二胺羧酸胆固醇酯盐酸盐。

通过与实施例A18中的描述类似的方法获得1-乙二胺羧酸胆固醇酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，所述葡聚糖甲基羧酸钠使用重均分子量为约5kg／mol(q＝19，PHARMACOSMOS)的葡聚糖根据实施例A18中描述的方法合成。

根据干提取：[多糖23]＝20.1mg/g

根据酸/碱滴定：n＝1.61

根据¹H NMR：m＝0.04。

实施例A24：多糖24的制备

将重均分子量为约5kg／mol(q＝19，PHARMACOSMOS)的12g(即，0.22mol羟基)葡聚糖溶解在DMF／DMSO混合物中。将混合物搅拌着升温至80℃。逐渐引入3.32g(0.03mol)1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷，然后引入26.8g(0.21mol)异氰酰乙酸乙酯。在反应5小时之后，将介质在水中稀释，利用0.1N NaOH、0.9％NaCl和水通过5kDa PES膜超滤纯化。将最终溶液通过干提取进行测定，以确定多糖的浓度；然后通过在50／50(V／V)水／丙酮中的酸／碱滴定进行测定，以确定每个葡糖苷单元中N-甲基羧酸盐氨基甲酸酯单元的平均数。

根据干提取：[多糖]＝30.1mg/g

根据酸/碱滴定：每个葡糖苷单元中N-甲基羧酸盐氨基甲酸酯单元的平均数为2.0。

通过与实施例A1中的描述类似的方法获得经亮氨酸胆固醇酯修饰的N-(甲基羧酸钠)葡聚糖氨基甲酸酯。

根据干提取：[多糖24]＝17.9mg/g

根据酸/碱滴定：n＝1.96

根据¹H NMR：m＝0.04。

实施例A25：多糖25的制备

将重均分子量为约5kg／mol(q＝19，PHARMACOSMOS，3.2mmol的链末端)的10g葡聚糖溶解在80℃的DMSO中。向反应介质中添加4.8g1-乙二胺羧酸胆固醇酯盐酸盐(9.5mmol)、0.96g三乙胺(9.5mmol)和2.0g氰基硼氢化钠(32mmol)，将反应介质在80℃下搅拌24小时。在冷却之后，将混合物从二氯甲烷中沉淀，然后从丙酮中沉淀，并在真空下干燥。根据¹HNMR，获得被1-乙二胺羧酸胆固醇酯在链末端修饰的葡聚糖。通过与实施例A18中的描述类似的方法使用被1-乙二胺羧酸胆固醇酯在链末端修饰的葡聚糖合成以每个葡糖苷单元的甲基羧酸盐取代度为1.65并且被1-乙二胺羧酸胆固醇酯在链末端修饰为特征的葡聚糖甲基羧酸钠。

根据干提取：[多糖25]＝13.7mg/g

根据酸/碱滴定：n＝1.65

根据¹H NMR：每个多肽链带有接枝在还原性链末端的1-乙二胺羧酸胆固醇酯基团。

实施例A26：多糖26的制备

根据专利US4826818中描述的方法获得亮氨酸胆固醇对甲基苯磺酸盐。

通过与实施例A1中的描述类似的方法获得经亮氨酸胆固醇酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，所述葡聚糖甲基羧酸钠使用重均分子量为约10kg／mol(q＝38，PHARMACOSMOS)的葡聚糖根据实施例A1中描述的方法合成。

根据干提取：[多糖26]＝26.6mg/g

根据酸/碱滴定：n＝0.99

根据¹H NMR：m＝0.05。

实施例A27：多糖27的制备

通过与实施例A1中的描述类似的方法获得天冬氨酸二月桂酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，所述葡聚糖甲基羧酸钠使用重均分子量为约1kg／mol(q＝4，PHARMACOSMOS)的葡聚糖根据实施例A18中描述的方法合成。

根据干提取：[多糖27]＝16.7mg/g

根据酸/碱滴定：n＝1.41

根据¹H NMR：m＝0.16。

实施例A28：多糖28的制备

根据干提取：[多糖28]＝25mg/g

根据酸/碱滴定：n＝1.50

根据¹H NMR：m＝0.07。

实施例A29：多糖29的制备

通过与实施例A1中的描述类似的方法获得经天冬氨酸二癸酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，所述葡聚糖甲基羧酸钠使用重均分子量为约1kg／mol(q＝4，PHARMACOSMOS)的葡聚糖根据实施例A1中描述的方法合成。

根据干提取：[多糖29]＝15mg/g

根据酸/碱滴定：n＝1.05

根据¹H NMR：m＝0.05。

实施例

B部分：证明根据本发明的组合物的特性

实施例B1：100IU／ml快速作用胰岛素类似物的溶液

该溶液是门冬胰岛素的商业化溶液，由诺和诺德公司在美国以名称出售，在欧洲以名称出售。该产品是快速作用胰岛素类似物。

实施例B2：100IU／ml快速作用胰岛素类似物的溶液

该溶液是赖脯胰岛素的商业化溶液，由礼来公司以名称出售。该产品是快速作用胰岛素类似物。

实施例B3：100IU／ml快速作用胰岛素类似物的溶液

该溶液是赖谷胰岛素的商业化溶液，由赛诺菲-安万特公司以名称出售。该产品是快速作用胰岛素类似物。

实施例B4：100IU／ml慢速作用胰岛素类似物的溶液

该溶液是甘精胰岛素的商业化溶液，由赛诺菲-安万特公司以名称出售。该产品是慢速作用胰岛素类似物。

实施例B5：100IU／ml人胰岛素的溶液

该溶液是由诺和诺德以名称出售的商业化溶液。该产品是人胰岛素。

实施例B6：使用经取代葡聚糖以pH7和100IU／ml溶解

准确称出20mg在实施例A4中描述的多糖4。将该冻干物放置在2ml商业化制剂的中。出现短暂的沉淀，但是在约30分钟后溶液变澄清。该溶液的pH为6.3。用0.1N氢氧化钠溶液将pH调整至7。将该澄清溶液通过0.22μm滤器过滤，然后放置在+4℃下。

实施例B7：pH7的经取代葡聚糖75／25组合物的制备

将0.25ml(为其商业化制剂)添加到在实施例B6中制备的0.75ml多糖溶液中，以形成1ml pH7的组合物。该组合物是澄清的，证明和在这些制剂条件下良好的溶解度。将该澄清溶液通过0.22μm滤器过滤，然后放置在+4℃下。

实施例B8：pH7的经取代葡聚糖75／25组合物的制备

实施例B9：pH7的经取代葡聚糖75／25组合物的制备

将0.25ml(为其商业化制剂)添加到在实施例B6中制备的0.75ml多糖容液中，以形成1ml pH7的组合物。该组合物是澄清的，证明和在这些制剂条件下良好的溶解度。将该澄清溶液通过0.22μm滤器过滤，然后放置在+4℃下。

实施例B10：pH7的经取代葡聚糖75／25组合物的制备

实施例B11：pH7的经取代葡聚糖60／40组合物的制备

将0.4ml(为其商业化制剂)添加到在实施例B6中制备的0.6ml多糖溶液中，以形成1ml pH7的组合物。该组合物是澄清的，证明和在这些制剂条件下良好的溶解度。将该澄清溶液通过0.22μm滤器过滤，然后放置在+4℃下。

实施例B12：pH7的经取代葡聚糖40／60组合物的制备

将0.6ml(为其商业化制剂)添加到在实施例B6中制备的0.4ml多糖溶液中，以形成1ml pH7的组合物。该组合物是澄清的，证明和在这些制剂条件下良好的溶解度。将该澄清溶液通过0.22μm滤器过滤，然后放置在+4℃下。

实施例B13：的沉淀

将1ml添加到包含20mg／ml BSA(牛血清白蛋白)的2ml PBS溶液中。PBS／BSA混合物模拟皮下介质的组成。出现了沉淀，这很好地符合了的作用机制(在注射后由于pH的提高而沉淀)。

在4000转/分钟下进行离心以使沉淀与上清液分离。随后，测定上清液中的。该结果为，发现86％的为沉淀形式。

实施例B14：经取代葡聚糖组合物的制备

将在实施例实施例B6中制备的1ml多糖溶液添加到包含20mg／ml BSA(牛血清白蛋白)的2ml PBS溶液中。PBS／BSA混合物模拟皮下介质的组成。出现了沉淀。

在4000转/分钟下进行离心以使沉淀与上清液分离。随后，测定上清液中的。该结果为，发现85％的为沉淀形式。的这一沉淀百分比与在实施例B13中描述的对照中得到的结果相同。

在每100IU／ml为10mg／ml多糖的相同浓度对其他经取代葡聚糖进行与在实施例B6和B14中描述相同的溶解和沉淀测试。准确称出20mg冻干形式的多糖。将该冻干物放置在2ml商业化制剂的中。出现了短暂的沉淀，但是在约30分钟至几小时(取决于多糖的性质)之后溶液变澄清。该溶液的pH为6.3。用0.1N氢氧化钠溶液将pH调整至7。将该澄清溶液通过0.22μm滤器过滤，然后放置在+4℃下。结果整理在表2中。

表2

实施例B15：pH7的经取代葡聚糖75／25组合物的沉淀

将在实施例B7中制备的1ml经取代葡聚糖75／25组合物(包含7.5mg／ml多糖、75IU／ml和25IU／ml)添加到包含20mg／ml BSA(牛血清白蛋白)的2ml PBS溶液中。PBS／BSA混合物模拟皮下介质的组成。出现了沉淀。

在4000转/分钟下离心以使沉淀与上清液分离。随后，测定上清液中的的沉淀百分比与在实施例B13中描述的对照中得到的结果类似。

实施例B16：经取代葡聚糖的性质不同的多种组合物的沉淀

在其他经取代葡聚糖的存在下，在与实施例B15中的条件相同的条件下进行其他测试。

结果合并在下表3中，并且观察到保持了的溶解和沉淀。

表3

实施例B17：餐时胰岛素的性质不同的多种组合物的沉淀

通过将在实施例B6中制备的0.75ml多糖溶液与0.25ml餐时胰岛素混合来制备组合物，以形成1ml经取代葡聚糖／餐时胰岛素组合物(包含7.5mg／ml多糖、75IU／ml和25IU／ml餐时胰岛素)。

将该组合物添加到包含20mg／ml BSA(牛血清白蛋白)的2ml PBS溶液中。PBS／BSA混合物模拟皮下介质的组成。出现了沉淀。

在4000转/分钟下离心以分离使沉淀与上清液。随后，测定上清液中的。在所测试的四种餐时胰岛素存在下，沉淀为约90％。的这一沉淀百分比与在实施例B13中描述的对照中得到的结果类似；结果合并在表4中。

表4

实施例B18：慢速作用胰岛素类似物(甘精胰岛素)的浓溶液的制备。

将由赛诺菲-安万特公司以名称出售的甘精胰岛素的商业化溶液通过由再生纤维素制备的3kDa膜(由密理博(Millipore)公司出售的Ultra-15)超滤进行浓缩。在该超滤阶段结束时，通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)测定保留物中甘精胰岛素的浓度。随后通过添加商业化的100IU／ml甘精胰岛素溶液调整甘精胰岛素的终浓度，以取得期望的终浓度。该过程使得能够获得大于100IU／ml的不同浓度的甘精胰岛素浓溶液，用C_{甘精胰岛素}表示，例如C_{甘精胰岛素}＝200、250、300和333IU／ml。将所述浓溶液通过0.22μm滤器过滤，然后储存在+4℃。

实施例B19：快速作用胰岛素类似物(赖脯胰岛素)的商品化溶液的透析

将由礼来公司以名称出售的赖脯胰岛素的商业化溶液通过由再生纤维素(由密理博公司出售的Ultra-l5)制备的3kDa膜的超滤进行透析。在l mMpH7的磷酸盐缓冲液中进行透析。在该超滤阶段结束时，通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)测定保留物中赖脯胰岛素的浓度C_{经透析Humalo}g。将透析溶液储存在-80℃的冰箱中。

实施例B20：商业化形式的快速作用胰岛素类似物(赖脯胰岛素)溶液的冻干

将体积为V_Humalog浓度为100IU／ml的商业化形式的快速作用赖脯胰岛素的溶液放置在预先在高压锅中的灭菌的中。将在-80℃的冰箱中放置约1小时，之后在20℃的温度和0.31毫巴(mbar)的压力下冻干过夜。

将如此得到的无菌冻干物储存在环境温度下。

实施例B21：快速作用胰岛素类似物(赖脯胰岛素)的经透析商业化溶液的冻干

将体积为V_{经透析Humalog}、浓度为C_{经透析Humalog}的根据实施例B19获得的快速作用胰岛素的溶液放置在预先在高压锅中的灭菌的中。将在-80℃的冰箱中放置约1小时，之后在20℃的温度和0.31毫巴的压力下冻干过夜。

将如此得到的无菌冻干物储存在环境温度下。

实施例B22：根据使用液体形式(溶液中)的甘精胰岛素和固体形式(冻干)的多糖的方法，使用经取代葡聚糖制备pH7的经取代葡聚糖／甘精胰岛素组合物

准确称出重量为W_多糖的多糖18。将该冻干物放置在体积为V_{甘精胰岛素}的根据实施例B18制备的甘精胰岛素浓溶液中，得到表现出多糖的浓度C_多糖(mg／ml)＝W_多糖／V_{甘精胰岛素}、甘精胰岛素的浓度为C_{甘精胰岛素}(IU／ml)的组合物。该溶液为乳白色。该溶液的pH为约6.3。通过添加浓NaOH将pH调整至7，然后将该溶液在37℃的烘箱中在静态条件下放置约1小时。将体积V_{多糖/甘精胰岛素}的这种外表澄清的溶液放置在+4℃。

实施例B23：根据使用液体形式(溶液)的甘精胰岛素和液体形式(溶液)的多糖的方法，使用经取代葡聚糖制备pH7的经取代葡聚糖／甘精胰岛素组合物

将间甲酚、甘油和吐温20的浓溶液添加到表现出浓度C_多糖母液的pH7的多糖20的母液中，从而得到在含量等于在10ml瓶的商业化溶液中描述的含量的这些赋形剂存在下，具有浓度C_{多糖母液/赋形剂}(mg／ml)的多糖溶液。

将体积V_Lantus、浓度100IU／ml的以名称出售的慢速作用甘精胰岛素的商业化溶液添加到无菌烧瓶中体积V_{多糖母液/赋形剂}、浓度C_{多糖母液/赋形剂}(mg／ml)的多糖溶液中。出现了浑浊。通过添加1M NaOH将pH调整至pH7，然后将该溶液在37℃的烘箱中在静态条件下放置约1小时。将这种外表澄清的溶液放置在+4℃。

实施例B24：根据用于浓缩稀组合物的方法，使用经取代葡聚糖制备pH＝7的浓多糖／甘精胰岛素组合物

通过由再生纤维素制备的3kDa膜(由密理博公司出售的Ultra-15)超滤，将实施例B23中描述的pH7的稀多糖20／甘精胰岛素组合物进行浓缩。在该超滤阶段结束时，清洁保留物并通过反相色谱(RP-HPLC)测定组合物中甘精胰岛素的浓度。如果必要的话，随后通过在间甲酚／甘油／吐温20赋形剂的溶液中稀释将甘精胰岛素的浓度调整至期望值，所述赋形剂表现出每一种实体的浓度等于在商业化溶液(10ml瓶)中描述的浓度。将这种外观上澄清、表现出甘精胰岛素浓度C_{甘精胰岛素}(IU／ml)和多糖C_多糖(mg／ml)浓度的pH7的溶液放置在+4℃。

实施例B25：由商业化形式的快速作用赖脯胰岛素制备pH7的经取代葡聚糖／甘精胰岛素／赖脯胰岛素组合物

将体积V_{多糖/甘精胰岛素}的根据实施例B22制备的表现出甘精胰岛素浓度C_{甘精胰岛素}(IU／ml)和多糖18浓度C_多糖(mg／ml)的pH7的多糖／甘精胰岛素溶液添加到通过体积V_{赖脯胰岛素}的冻干获得的赖脯胰岛素冻干物(其制备描述在实施例B19中)中，从而使比率V_{多糖/甘精胰岛素}／V_{赖脯胰岛素}＝100／C_{赖脯胰岛素}，其中C_{赖脯胰岛素}是组合物中目标赖脯胰岛素浓度(IU／ml)。该溶液是澄清的。通过添加浓氯化锌溶液将制剂的锌含量调整至期望浓度C_锌(μM)。通过添加浓NaOH或HCl将最终pH调整至7。

该溶液是澄清的，证明了在这些制剂条件下甘精胰岛素和赖脯胰岛素良好的溶解度。将溶液通过0.22μm滤器过滤并放置在+4℃。

实施例B26：由通过商业化溶液的透析获得的快速作用赖脯胰岛素开始，制备pH7的经取代葡聚糖／甘精胰岛素／赖脯胰岛素组合物

将V_{多糖/甘精胰}岛素体积的根据实施例B24制备的表现出甘精胰岛素浓度C_{甘精胰岛素}(IU／ml)和多糖20浓度C_多糖(mg／ml)的pH7的多糖／甘精胰岛素溶液添加到通过体积V_{经透析Humalog}的冻干获得的赖脯胰岛素冻干物(其制备描述于实施例B21)中，从而使比例V_多糖/_{甘精胰岛素}／V_{经透析Humalo}＝C_{经透析Humalo}／C_{赖脯胰岛素}，其中C_{经透析Humalo}是在商业化溶液透析结束时(该阶段描述于实施例B19)获得的赖脯胰岛素浓度(IU／ml)，C_{赖脯胰岛素}是组合物中目标赖脯胰岛素的浓度(IU／ml)。该溶液是澄清的。通过添加浓氯化锌溶液将制剂的锌含量调整至期望浓度C_锌(μM)。通过添加浓NaOH或HCl将最终pH调整至7。

该制剂是澄清的，证明了在这些制剂条件下甘精胰岛素和赖脯胰岛素良好的溶解度。将溶液通过0.22μm滤器过滤并放置在+4℃。

实施例B27：表现出200IU／ml的甘精胰岛素浓度和33IU／ml的赖脯胰岛素浓度(作为胰岛素百分比的比例：甘精胰岛素／赖脯胰岛素为85／15)的pH7的经取代葡聚糖／甘精胰岛素／赖脯胰岛素组合物的制备

根据实施例B18制备浓的200IU／ml甘精胰岛素溶液。根据实施例B22中描述的制备方法由多糖18制备pH7的多糖18(13mg／ml)／甘精胰岛素300IU／ml组合物。将该多糖18／甘精胰岛素200IU／ml组合物添加到根据实施例B25中描述的制备方法由商业化形式的快速作用类似物的溶液冻干得到的赖脯胰岛素冻干物中。该溶液是澄清的。通过添加浓氯化锌溶液将制剂的锌含量调整至浓度C_锌(μM)＝750μM。通过添加浓NaOH或HCl将最终pH调整至7。

该组合物描述在表5中。

实施例B28：表现出200IU／ml的甘精胰岛素浓度和66IU／ml的赖脯胰岛素浓度(作为胰岛素百分比的比例：甘精胰岛素／赖脯胰岛素为75／25)的pH7的经取代葡聚糖／甘精胰岛素／赖脯胰岛素组合物的制备

根据实施例B18制备浓的200IU／ml甘精胰岛素溶液。根据实施例B22中描述的制备方法由多糖18制备pH7的多糖18(13mg／ml)／甘精胰岛素300IU／ml组合物。将该多糖18／甘精胰岛素200IU／ml组合物添加到根据实施例B25中描述的制备方法由商业化形式的快速作用类似物的溶液冻干得到的赖脯胰岛素冻干物中。该溶液是澄清的。通过添加浓氯化锌溶液将制剂的锌含量调整至浓度C_锌(μM)＝1500μM。通过添加浓NaOH或HCl将最终pH调整至7。

该组合物描述在表5中。

实施例B29：表现出300IU／ml的甘精胰岛素浓度和100IU／ml的赖脯胰岛素浓度(作为胰岛素百分比的比例：甘精胰岛素／赖脯胰岛素为75／25)的pH7的经取代葡聚糖／甘精胰岛素／赖脯胰岛素组合物的制备

根据实施例B18制备浓的300IU／ml甘精胰岛素溶液。根据实施例B22中描述的制备方法由多糖18制备pH7的多糖18(23mg／ml)／甘精胰岛素300IU／ml组合物。将该多糖18／甘精胰岛素300IU／ml组合物添加到根据实施例B25中描述的制备方法由商业化形式的快速作用类似物的溶液冻干得到的赖脯胰岛素冻干物中。该溶液是澄清的。通过添加浓氯化锌溶液将制剂的锌含量调整至浓度C_锌(μM)＝2000μM。通过添加浓NaOH或HCl将最终pH调整至7。

该组合物描述在表5中。

实施例B30：表现出250IU／ml的甘精胰岛素浓度和150IU／ml的赖脯胰岛素浓度(作为胰岛素的百分比的比例：甘精胰岛素／赖脯胰岛素为63／37)的pH7的经取代葡聚糖／甘精胰岛素/赖脯胰岛素组合物的制备

根据实施例B18制备浓的300IU／ml甘精胰岛素溶液。根据实施例B22中描述的制备方法由多糖18制备pH7的多糖18(19mg／m1)／甘精胰岛素300IU／ml组合物。将该多糖18/甘精胰岛素250IU／ml组合物添加到根据实施例B25中描述的制备方法由商业化形式的快速作用类似物的溶液冻干得到的赖脯胰岛素冻干物中。该溶液是澄清的。通过添加浓氯化锌溶液将制剂的锌含量调整至浓度C_锌(μM)＝1500μM。通过添加浓NaOH或HCl将最终pH调整至7。

该组合物描述在表5中。

实施例B31：表现出333IU／ml的甘精胰岛素浓度和67IU／ml的赖脯胰岛素浓度(作为胰岛素百分比的比例：甘精胰岛素／赖脯胰岛素为83／17)的pH7的经取代葡聚糖／甘精胰岛素／赖脯胰岛素组合物的制备

根据实施例B18制备浓的333IU／ml甘精胰岛素溶液。根据实施例B22中描述的制备方法由多糖18制备pH7的多糖18(20mg／ml)／甘精胰岛素300IU／ml组合物。将该多糖18／甘精胰岛素333IU／ml组合物添加到根据实施例B25中描述的制备方法由商业化形式的快速作用类似物的溶液冻干得到的赖脯胰岛素冻干物中。该溶液是澄清的。通过添加浓氯化锌溶液将制剂的锌含量调整至浓度C_锌(μM)＝2000μM。通过添加浓NaOH或HCl将最终pH调整至7。

该组合物描述在表5中。

实施例B32：表现出300IU／ml的甘精胰岛素浓度和100IU／ml的赖脯胰岛素浓度(作为胰岛素百分比的比例：甘精胰岛素／赖脯胰岛素为75／25)的pH7的经取代葡聚糖／甘精胰岛素／赖脯胰岛素组合物的制备

根据实施例B18制备浓的300IU／ml甘精胰岛素溶液。根据实施例B22中描述的制备方法由多糖19制备pH7的多糖18(23mg／ml)／甘精胰岛素300IU／ml组合物。将该多糖19／甘精胰岛素300IU／ml组合物添加到根据实施例B26中描述的制备方法由商业化形式的快速作用类似物的溶液冻干得到的赖脯胰岛素冻干物中。该溶液是澄清的。通过添加浓氯化锌溶液将制剂的锌含量调整至浓度C_锌(μM)＝3000μM。通过添加浓NaOH或HCl将最终pH调整至7。

该组合物描述在表5中。

实施例B33：表现出300IU／ml的甘精胰岛素浓度和100IU／ml的赖脯胰岛素浓度(作为胰岛素百分比的比例：甘精胰岛素／赖脯胰岛素为75／25)的pH7的经取代葡聚糖／甘精胰岛素／赖脯胰岛素组合物的制备

根据实施例B23中描述的制备方法由多糖20制备pH7的多糖20(23mg／ml)／甘精胰岛素300IU／ml组合物。将该多糖20／甘精胰岛素300IU／ml组合物添加到根据实施例B26中描述的制备方法由商业化溶液透析得到之快速作用类似物的溶液冻干得到的赖脯胰岛素冻干物中。该溶液是澄清的。通过添加浓氯化锌溶液将制剂的锌含量调整至浓度C_锌(μM)＝1500μM。通过添加浓NaOH或HCl将最终pH调整至7。

该组合物描述在表5中。

表5：pH7的经取代葡聚糖／甘精胰岛素／赖脯胰岛素组合物

实施例B34：表现出不同的甘精胰岛素浓度和赖脯胰岛素浓度以及两种胰岛素不同的相对比例的pH7的多种经取代葡聚糖／甘精胰岛素／赖脯胰岛素组合物的制备

将在实施例B27至B33中制备的1ml经取代葡聚糖组合物添加到包含20mg／ml BSA(牛血清白蛋白)的2ml PBS溶液中。PBS／BSA混合物模拟皮下介质的组成。出现了沉淀。

在4000转/分钟下进行离心以使沉淀与上清液分离。随后，测定上清液中的沉淀的百分比与在实施例B13中描述的对照类似。结果总结在表6中。

实施例B35：组合物的化学稳定性

将在实施例B7、B27、B28和B29中描述的经取代葡聚糖/餐时胰岛素组合物以及相应对照在30℃下放置4周。法规要求在30℃下4周后95％的天然(未降解)胰岛素。

4周后，所研究的制剂满足法规所限定的规范。结果合并在表7中。

表7

因此，无论研究什么制剂，都获得了大于95％的天然胰岛素的百分比，这符合法规的要求。

实施例B36：溶液的注射能力

可以利用注射胰岛素的标准系统注射所制备的全部组合物。实施例B7至B12中描述的溶液和实施例B27至B33中描述的组合物利用配备有31号针的胰岛素注射器和配备有31号针的由诺和诺德以名称出售的胰岛素笔二者毫无困难地注射。

实施例B37：用于测量胰岛素溶液的药物效应动力学的方案

在猪上进行临床研究以评估根据本发明的两种组合物：

实施例B7中与多糖4(6mg／ml)一起配制的(75／25)，以及

实施例B8中描述的与多糖4(6mg／ml)一起配制的(75／25)。

相对于在同一时间注射但是将(pH4)和然后的餐时胰岛素或分开注射的情况来比较这些组合物的降血糖作用。

将6只预先在颈静脉中插管的重约50kg的家养猪禁食2至3小时，之后开始实验。在注射胰岛素之前的一小时中，采集三个血样以确定基础胰岛素水平。

使用配备有31号针的咦岛素笔在动物的耳朵下通过皮下注射将0.4IU／kg剂量的胰岛素注射进颈部。

随后在4、8、12、16、20、30、40、50、60、90、120、240、360、480、600、660和720分钟之后采集血样。每份样品采集后，用稀肝素溶液冲洗插管。

取一滴血以使用血糖仪确定血糖。随后绘制葡萄糖的药物效应动力学曲线。

以图1至6中表示的葡萄糖的药物效应动力学曲线形式示出了获得的结果。

与多糖4(6mg／ml)一起配制的(75／25)。

图1：与根据本发明的组合物多糖(75／25)相比，依次施用和的平均值+平均值之标准偏差的曲线。

图2：独立曲线。

图3：多糖独立曲线。

图1显示了每一种制剂的所测试猪血糖降低的平均曲线和平均值的标准偏差。两种制剂在最初30分钟中血糖的降低类似，表明多糖的存在不干扰的快速作用性质。

另一方面，在90分钟至10小时(600分钟)之间，依次施用和使得血糖不等同地降低，对于三只猪中具有相同的平台期响应，对于另三只猪具有不同响应(图2)。相比之下，利用多糖制剂测试的6只猪具有相同响应(图3)。这反映在60分钟至10小时之间变异系数(CV)的分析，该系数对于对照平均为54％(21％至113％)，对于多糖为12％(5％至25％)。

与多糖4(6mg／ml)一起配制的(75／25)。

图4：与施用根据本发明的组合物多糖相比，依次施用和的平均值+平均值之标准偏差的曲线。

图5：独立曲线。

图6：多糖独立曲线。

图4显示了对于每一种制剂的所测试猪血糖降低的平均曲线和平均值的标准偏差。两种制剂在最初30分钟血糖的降低类似，表明多糖的存在不干扰的快速作用性质。另一方面，在60分钟至8小时(480分钟)之间，依次施用和使得血糖不等同地降低，对于四只猪中具有相同的平台期响应，对于另两只猪具有不同响应(图5)。相比之下，利用多糖4/制剂测试的5只猪具有相同响应(图6)。这反映在对60分钟至8小时之间血糖降低数据之变异系数(CV)的分析，该系数对于对照平均为54％(31％至72％)，对于多糖4／为15％(6％至28％)。因此，多糖4的存在极大降低了针对血糖降低的变异性。

实施例B38：测量胰岛素溶液的药物效应动力学的方案。在犬中进行临床

前研究以评价根据本发明的六种组合物：

针对同时但分开注射100IU／ml(pH4)并且然后注射餐时胰岛素100IU／ml来比较这些组合物的降血糖作用。

将10只重约12kg的家养犬(比格犬(Beagle))禁食18小时，之后开始实验。在注射胰岛素前一小时，采集三个血样以确定基础葡萄糖水平。

使用配备有31号针的咦岛素笔通过皮下注射将0.53IU／kg(除非在以下实施例中另外提及)剂量的胰岛素皮下注射进动物的颈部。

随后在10、20、30、40、50、60、90、120、180、240、300、360、420、480、540、600、660、720、780、840、900和960分钟之后采集血样。第一份样品利用插管采集(直到180分钟)，然后直接从颈静脉采集。在每份样品采集后，用稀肝素溶液冲洗插管。

取一滴血以借助血糖仪确定血糖。随后绘制葡萄糖的药物效应动力学曲线。

获得的结果呈现图7至12中所示的葡萄糖的药物效应动力学曲线的形式。

实施例B28的溶液

图7显示了对于每一种制剂的所测试犬血糖降低的平均曲线和平均值的标准偏差。两个曲线一直到12小时都类似，使得血糖快速降低，表明多糖不影响的快速作用效果，峰之间的显著回升是由于，平台期是由于甘精胰岛素，然后甘精胰岛素的平台期一直到12小时，表明良好地保持了甘精胰岛素的基础作用。

实施例B27的溶液

图8显示了对于每一种制剂的所测试犬血糖降低的平均曲线和平均值的标准偏差。在该比较中，组合物的基础胰岛素的剂量与对照相同，而的剂量是对照的一半。与对照相比，在制剂B27的情况葡萄糖的降低较大，而该对照包含的2倍。另一方面，相对于对照，在组合的情况下平台期的持续时间更短。这表明，在这种组合物中，在注射后一部分未沉淀并且与一起作用。

实施例B29的溶液

图9显示了对于每一种制剂的所测试犬血糖降低的平均曲线和平均值的标准偏差。两条曲线类似，使得血糖快速降低，表明多糖不影响的快速作用效果，峰之间的显著回升是由于平台期是由于然后的平台期一直到13小时，表明良好地保持了甘精胰岛素的基础作用。

实施例B31的溶液

图10显示了对于每一种制剂的所测试犬血糖降低的平均曲线和平均值的标准偏差。在该比较中，组合物的基础胰岛素的剂量和对照相同，而的剂量是对照的一半。与相当于实施例B31的组合相比，在对照的情况下葡萄糖的降低更大。鉴于组合中的浓度是对照的一半，未预料到这种响应。另外，平台期的持续时间在组合的情况下与对照相同。这表明，在这种组合物中以及通过与实施例B29中描述的组合物(图9)相比，可以调整组合中的量而不改变的基础作用。

实施例B30的溶液

图11：与实施例B30中描述的根据本发明的组合物(0.64IU／kg)相比，依次施用(100IU／ml，0.24IU／kg)和(100IU／ml，0.4IU／kg)的平均值+平均值之标准偏差的曲线。

图11显示了对于每一种制剂的所测试犬血糖降低的平均曲线和平均值的标准偏差。两条曲线类似，使得血糖快速降低，表明多糖不影响的快速作用效果，峰之间的显著回升是由于平台期是由于然后的平台期一直到10小时，表明良好地保持了甘精胰岛素的基础作用。

实施例B32的溶液

图12显示了对于每一种制剂的所测试犬血糖降低的平均曲线和平均值的标准偏差。两条曲线类似一直到10小时，使得血糖快速降低，表明多糖不影响的快速作用效果，峰之间的显著回升是由于平台期是由于然后是甘精胰岛素平台期，表明甘精胰岛素基础作用一直保持到10小时。

总之，图7至12表明，通过调整多糖的组成以及赖脯胰岛素和甘精胰岛素的浓度，可以取得与双注射不同比例的快速作用胰岛素和基础胰岛素相同的曲线。还可调整基础胰岛素的持续时间而不影响快速作用胰岛素，或者可调整快速作用胰岛素的量而不影响基础胰岛素的作用。

实施例

C部分：证明包含根据本发明的GLP-1类似物或衍生物的组合物的性质

实施例C1：0.25mg／ml GLP-1类似物艾塞那肽溶液

该溶液是由礼来公司以名称出售的艾塞那肽溶液

实施例C2：6mg／ml GLP-1衍生物利拉鲁肽溶液

该溶液是由诺和诺德公司以名称出售的利拉鲁肽溶液

实施例C3：使用10mg／ml浓度的经取代葡聚糖使100IU／ml和pH7的容解

准确称出20mg的经取代葡聚糖，其选自表1中描述的那些。将该冻干物放置在2ml实施例B4的甘精胰岛素溶液中，以获得多糖浓度等于10mg／ml的溶液。在环境温度下于滚轴上机械搅拌之后，溶液变澄清。该溶液的pH为6.3。利用0.1N氢氧化钠溶液将pH调整至7。将该澄清溶液透过膜(0.22μm)滤器过滤，然后放置在+4℃。

概括：还根据与实施例C3中的描述相同的方案获得经取代葡聚糖的浓度为20和40mg／ml的pH7的100IU／ml甘精胰岛素澄清溶液。因此，准确称出表1中描述的那些冻干多糖的量。将该冻干物放置在实施例B4的甘精胰岛素溶液中，以获得表8中所述经取代葡聚糖浓度等于20或40mg／ml的溶液。在环境温度下于滚轴上机械搅拌之后，溶液变澄清。该溶液的pH为低于7。随后利用0.1N氢氧化钠溶液将pH调整至7。将该澄清的终溶液透过膜(0.22μm)滤器过滤，然后放置在+4℃。

表8：使用10、20或40mg/ml浓度的经取代葡聚糖制备pH7的100IU／ml的溶液

实施例C4：pH7.5的70／30组合物的制备

将0.09ml实施例C1的艾塞那肽溶液添加到0.21ml实施例B4的甘精胰岛素溶液中，在混合后得到pH为4.5的0.3ml组合物。包含70IU／ml和0.075mg／ml的组合物是澄清的，证明在这些制剂条件(pH4.5)下和良好的溶解度。随后利用0.1N氢氧化钠溶液将pH调整至7.5。组合物随后变浑浊，证明了在pH7.5组合物差的溶解度。

还通过与实施例C4中描述的类似的方案制备pH4.5、5.5、6.5、8.5和9.5的组合物。对于这些组合物中的每一种，将0.09ml实施例C1的艾塞那肽溶液添加到0.21ml实施例B4的甘精胰岛素溶液中，以在混合后得到的pH为4.5的0.3ml组合物。该组合物是澄清的，证明在这些制剂条件(pH4.5)下和良好的溶解度。利用0.1N氢氧化钠溶液将pH调整至5.5或6.5或8.5或9.5。在调整pH后，5.5的组合物稍浑浊，6.5-7.5和8.5的组合物非常浑浊，pH9.5的组合物澄清。将这些组合物在+4℃放置48小时。在+4℃下48小时之后，仅pH4.5的组合物保持澄清。不同pH值的70／30组合物在48小时之后的视觉外观总结在表9中。

表9：不同pH值的70／30组合物48小时之后的视觉外观

实施例C5：pH7.5的70／30组合物的制备

将0.09ml实施例C2的利拉鲁肽溶液添加到0.21ml实施例B4的甘精胰岛素溶液中，以在混合后得到pH为7的0.3ml组合物。包含70IU／ml甘精胰岛素和1.8mg／ml艾塞那肽的组合物是浑浊的，证明在这些制剂条件(pH4.5)下和差的溶解度。利用0.1N氢氧化钠溶液将pH调整至7.5。在调整pH之后，组合物保持浑浊。将该组合物在+4℃放置48小时。

还通过与实施例C5中的描述类似的方案制备pH4.5-5.5-6.5-8.5和9.5的70／30组合物。对于这些组合物中的每一种，将0.09ml实施例C1的利拉鲁肽溶液添加到0.21ml实施例B4的甘精胰岛素溶液中，以得到的pH为7的0.3ml组合物。该组合物是浑浊的，证明在这些制剂条件(pH7)下和差的溶解度。利用0.1N盐酸溶液将pH调整至4.5或5.5或6.5，或者用0.1N氢氧化钠溶液将pH调整至pH9.5。在调整pH后，pH4.5-5.5和6.5的组合物浑浊，证明在这些制剂条件下和差的溶解度。将这些组合物在+4℃放置48小时。在+4℃下48小时之后，仅pH9.5的组合物澄清。不同pH值的70／30组合物48小时之后的视觉外观总结在表10中。

表10：不同pH值的70／30组合物48小时之后的视觉外观

实施例C6：pH7的经取代葡聚糖-70／30组合物的制备

将0.09ml实施例C1的艾塞那肽溶液添加到0.21ml在实施例C3中制备的经取代葡聚糖/溶液中，得到0.3ml pH5.3的组合物。利用0.1N氢氧化钠溶液将pH调整至7。包含7mg／ml多糖、70IU／ml和0.075mg／ml的组合物是澄清的，证明在pH7的经取代葡聚糖存在下和良好的溶解度。将该澄清溶液放置在+4℃。

概括：还通过与实施例C6中描述的相同的方案以90／10、50／50、30／70和10／90的V_Lantus／V_Byetta的体积比制备pH7的经取代葡聚糖组合物。因此，将体积V_Byetta的实施例C1的艾塞那肽溶液添加到体积V_Lantus的在实施例C3中制备的经取代葡聚糖/溶液中，以得到利用0.1N氢氧化钠溶液将pH调整至7的组合物。得到的组合物(见表11)是澄清的，证明在pH7的经取代葡聚糖存在下和良好的溶解度。将该澄清溶液放置在+4℃。

实施例C7：pH7的经取代葡聚糖-100／50组合物的制备

将0.150ml实施例C1的艾塞那肽溶液冻干，然后向冻干物中添加0.3ml在实施例C3中制备的经取代葡聚糖/溶液，以得到利用0.1N氢氧化钠溶液将pH调整至7的组合物。包含10mg／ml多糖、100IU／ml和0.125mg／ml的组合物是澄清的，证明在pH7时在经取代葡聚糖存在下和良好的溶解度。将该澄清溶液放置在+4℃。

表11：实施例C6和C7中获得的组合物的经取代葡聚糖和的终浓度

实施例C8：pH7的经取代葡聚糖-70／30组合物的制备

将0.09ml实施例C2的利拉鲁肽溶液添加到0.21ml在实施例C3中制备的经取代葡聚糖/溶液中，得到0.3ml pH7.6的组合物。利用0.1N氢氧化钠溶液将pH调整至7。包含7mg／ml多糖、70IU／ml和1.8mg／ml的组合物是澄清的，证明在pH7的经取代葡聚糖存在下和良好的溶解度。将该澄清溶液放置在+4℃。

概括：还通过与实施例C6中描述的相同的方案以90／10、50／50、30／70和90／10的V_Lantus／V_Victoza的体积比制备pH7的经取代葡聚糖组合物。因此，将体积V_Victoza的实施例C2的利拉鲁肽溶液添加到体积V_Lantus的在实施例C3中制备的经取代葡聚糖/溶液中，以得到利用0.1N盐酸溶液将pH调整至7的组合物。

得到的组合物(见表12)是澄清的，证明在pH7的经取代葡聚糖存在下和良好的溶解度。将该澄清溶液放置在+4℃。

实施例C9：pH7的经取代葡聚糖-100／50组合物的制备

将0.150ml实施例C2的利拉鲁肽溶液冻干，然后向冻干物中添加0.3ml在实施例C3中制备的经取代葡聚糖/溶液的组合物，将其pH利用0.1N氢氧化钠溶液调整至7。包含10mg／ml多糖、100IU／ml和3mg／ml的组合物是澄清的，证明在pH7的经取代葡聚糖存在下和良好的溶解度。将该澄清溶液放置在+4℃。

表12：实施例C8和C9中获得的组合物中经取代葡聚糖和的终浓度

实施例C10：pH7的经取代葡聚糖-60／20／20组合物的制备

准确称出20mg在实施例A3中描述的冻干的多糖4。将该冻干物放置在2ml实施例B4的甘精胰岛素溶液中。在环境温度下于滚轴上机械搅拌之后，溶液变澄清。该溶液的pH为6.3。利用0.1N氢氧化钠溶液将pH调整至7。将0.2ml实施例C1的艾塞那肽溶液和0.2ml实施例B3的赖谷胰岛素溶液添加到0.6ml以上制备的经取代葡聚糖/容液中，以得到1ml pH7的组合物。这种包含6mg／ml多糖、60IU／ml20IU／ml和0.05mg／ml的组合物是澄清的，证明在pH7的经取代葡聚糖存在下和良好的溶解度。将该澄清溶液透过膜(0.22μm)过滤，然后放置在+4℃。

实施例C11：的沉淀

将0.250ml添加到包含20mg／ml BSA(牛血清白蛋白)的0.5ml PBS(磷酸盐缓冲液)溶液中。PBS／BSA混合物模拟皮下介质的组成。

出现了沉淀，其很好地符合了的作用机制(在注射后由于pH的提高而沉淀)。

在4000转/分钟下进行离心以使沉淀与上清液分离。随后，测定上清液中的。该结果为，发现90％的为沉淀形式。

实施例C12：经取代葡聚糖/组合物的沉淀

将0.250ml在实施例C3中制备的经取代葡聚糖/容液添加到包含20mg／mlBSA的0.5ml PBS溶液中。PBS／BSA混合物模拟皮下介质的组成。出现了沉淀。

在4000转/分钟下进行离心以使沉淀与上清液分离。随后，测定上清液中的。该结果为，发现90％的为沉淀形式。的这一沉淀百分比与在实施例C11中描述的对照获得的沉淀百分比相同。

实施例C13：经取代葡聚糖组合物的沉淀

将0.250ml在实施例C6中制备的经取代葡聚糖组合物添加到包含20mg／ml BSA的0.5 ml PBS溶液中。PBS／BSA混合物模拟皮下介质的组成。出现了沉淀。

在4000转/分钟下进行离心以使沉淀与上清液分离。随后，测定上清液中的和沉淀的百分比与实施例C11中描述的对照类似。

实施例C14：经取代葡聚糖-70／30组合物的沉淀

将0.250ml在实施例C8中制备的经取代葡聚糖组合物添加到包含20mg／ml BSA(牛血清白蛋白)的0.5ml PBS溶液中。PBS／BSA混合物模拟皮下介质的组成。出现了沉淀。

实施例C15：改变经取代葡聚糖的性质的不同组合物的沉淀

在另一些葡聚糖存在下，在与实施例C13和C14相同的条件下进行另一些测试。

利用最多20mg／ml经取代葡聚糖和70／30组成的结果合并在下表13中。观察到保持了的溶解和沉淀。

表13：利用最多20mg/ml经取代葡聚糖和70／30组成获得的溶解和沉淀测试的结果

利用最多20mg／ml经取代葡聚糖和不同组成的结果合并在下表14中。观察到保持了的溶解和沉淀。

表14：利用最多20mg／ml经取代葡聚糖和不同组成获得的溶解和沉淀测试的结果

利用最多40mg／ml经取代葡聚糖和70／30组成的结果合并在以下表15中。观察到保持了的溶解和沉淀。

表15：利用最多40mg/ml经取代葡聚糖和70／30组成获得的溶解和沉淀测试的结果

利用最多20mg／ml经取代葡聚糖和不同组成的结果合并在下表16中。观察到保持了的溶解和沉淀。

表16：利用最多20mg/ml经取代葡聚糖和不同组成获得的溶解和沉淀测试的结果

实施例C16：pH7的经取代葡聚糖-60／20／20组合物的沉淀

将0.250ml在实施例C10中制备的经取代葡聚糖组合物添加到包含20mg／ml BSA的0.5ml PBS溶液中。PBS／BSA混合物模拟皮下介质的组成。出现了沉淀。

在4000转／分钟下进行离心以使沉淀与上清液分离。随后，测定上清液中的沉淀的百分比与实施例C11中描述的对照类似。

Claims

1.可注射水溶液形式的组合物，其pH为6.0至8.0，所述组合物至少包含：

a)甘精胰岛素；

b)式I的被带有羧酸荷载的基团和疏水基团取代的葡聚糖：

其中：

·R是-OH或选自以下基团：

о-(f-[A]-COOH)_n；

о-(g-[B]-k-[D])_m，D包含至少一个含至少8个碳原子的烷基链；

·n表示-f-[A]-COOH对葡糖苷单元的取代度，并且0.1≤n≤2；

·m表示-g-[B]-k-[D]对葡糖苷单元的取代度，并且0＜m≤0.5；

·q表示葡糖苷单元的聚合度，换言之，是每个多糖链中葡糖苷单元的平均数，并且3≤q≤50；

·-(f-[A]-COOH)_n：

о-A-是包含1至4个碳原子的直链或支链基团；所述-A-基团：

о通过官能团f与葡糖苷单元键合，所述官能团f选自醚、酯和氨基甲酸酯官能团；

·-(g-[B]-k-[D])_m：

о-B-是包含1至4个碳原子的直链或支链的至少二价的基团；所述-B-基团：

о通过官能团g与葡糖苷单元键合，所述官能团g选自醚、酯和氨基甲酸酯官能团；

о通过官能团k与-D基团键合，k为酰胺官能团；所述-D基团：

·是-X(-l-Y)_p基团，X是包含选自C、N和O原子的1至12个原子的至少二价基团，其来自于选自甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸、二胺或者选自二甘醇胺和三甘醇二胺的聚乙二醇单胺或二胺；Y是任选地被一个或更多个C₁至C₃烷基取代的8至30个碳原子的直链烷基或者来自于甾醇或生育酚的基团；p≥1，并且l是选自酯和酰胺官能团的官能团；

·游离酸官能团-(f-[A]-COOH)_n为选自Na⁺和K⁺的碱金属阳离子的盐的形式；

·并且，当p＝1时，如果Y是C₈至C₁₄烷基，那么q＊m≥2，如果Y是C₁₅烷基，那么q＊m≥2；并且如果Y是C₁₆至C₂₀烷基，那么q＊m≥1；

·并且，当p≥2时，如果Y是C₈至C₉烷基，那么q＊m≥2，并且如果Y是C₁₀至C₁₆烷基，那么q＊m≥0.2。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于X来自于乙二胺。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述被带有羧酸荷载的基团和疏水基团取代的葡聚糖选自式I的葡聚糖，其中-(f-[A]-COOH)_n基团选自以下序列，f具有权利要求1给出的含义：

4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其特征在于所述被带有羧酸荷载的基团和疏水基团取代的葡聚糖选自式I的葡聚糖，其中，-(g-[B]-k-[D])_m基团选自以下序列，g、k和D具有权利要求1给出的含义：

5.根据权利要求1或3所述的组合物，其特征在于所述被带有羧酸荷载的基团和疏水基团取代的葡聚糖选自式I的葡聚糖，其中-(g-[B]-k-[D])_m基团是这样的：

·-B-是包含1个碳原子的基团，所述-B-基团通过醚官能团g与葡糖苷单元键合，并且X是来自于氨基酸的基团，所述氨基酸选自甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。

6.根据权利要求1或3所述的组合物，其特征在于所述被带有羧酸荷载的基团和疏水基团取代的葡聚糖选自式I的葡聚糖，其中X基团是来自于氨基酸的至少二价基团，所述氨基酸选自甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其特征在于所述被带有羧酸荷载的基团和疏水基团取代的葡聚糖选自式I的葡聚糖，其中Y基团为来自于疏水醇或疏水酸的烷基，或者来自于甾醇或生育酚的基团。

8.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其特征在于所述被带有羧酸荷载的基团和疏水基团取代的葡聚糖选自式I的葡聚糖，其中Y基团是选自胆固醇衍生物的甾醇。

9.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其特征在于所述被带有羧酸荷载的基团和疏水基团取代的葡聚糖选自如下的式I葡聚糖：

-经甘氨酸辛酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经甘氨酸鲸蜡酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经苯丙氨酸辛酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经苯丙氨酸3，7-二甲基-1-辛酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经天冬氨酸二辛酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经天冬氨酸二癸酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经天冬氨酸二月桂酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经N-(2-氨基乙基)十二烷酰胺修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经甘氨酸月桂酯修饰的葡聚糖琥珀酸钠，

-经天冬氨酸二月桂酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经十二烷酸2-(2-氨基乙氧基)乙酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经亮氨酸胆固醇酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

-经1-乙二胺羧酸胆固醇酯修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，

10.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其特征在于所述组合物包含40IU/ml至500IU/ml的甘精胰岛素。

11.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其特征在于所述组合物还包含餐时胰岛素。

12.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其特征在于所述组合物包含40IU/ml至800IU/ml的总胰岛素。

13.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于所述组合物包含25/75、30/70、40/60、50/50、60/40、70/30、80/20和90/10的以百分比表示之比例的甘精胰岛素与餐时胰岛素。

14.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其特征在于所述组合物还包含浓度为0至5000μM的锌盐。

15.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其特征在于所述组合物还包含浓度为0至100mM的缓冲剂，所述缓冲剂选自Tris、柠檬酸盐和磷酸盐。

16.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其特征在于所述组合物还包含浓度为0至50mM的缓冲剂，所述缓冲剂选自Tris、柠檬酸盐和磷酸盐。

17.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于所述餐时胰岛素选自由人胰岛素、赖谷胰岛素、赖脯胰岛素和门冬胰岛素形成的组。

18.单剂量制剂，其包含pH为6.6至7.8的根据权利要求1至17中任一项所述的组合物以及餐时胰岛素。

19.根据权利要求18所述的单剂量制剂，其特征在于所述餐时胰岛素选自包含人胰岛素的组。

20.根据权利要求18所述的单剂量制剂，其特征在于所述餐时胰岛素选自包含赖脯胰岛素、赖谷胰岛素和门冬胰岛素的组。