CN101237854B - 将胰岛素输送到哺乳动物的脂构建体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有与脂构建体相连的胰岛素的肝细胞靶向组合物，所述脂构建体含有两亲脂质和延伸两亲脂质，所述延伸两亲脂质将所述构建体靶向肝细胞展示的受体。该组合物可含有游离胰岛素和与络合物相连的胰岛素的混合物。可修饰组合物以保护胰岛素和络合物免于降解。本发明也包括制造组合物和将胰岛素装载入组合物以及回收组合物各种成分的方法。治疗遭受糖尿病的个体的方法。

Description

将胰岛素输送到哺乳动物的脂构建体

发明背景

糖尿病是影响全世界很多人的病症。控制I型和II型糖尿病的治疗方法主要针对正常化血糖水平，以预防短期和长期的并发症。许多患者每天需要多次注射胰岛素以控制他们的糖尿病。已经生产了几种在不同时间间隔内控制血糖水平的胰岛素产品。在尝试提供在更长时期内控制葡萄糖水平的制剂中，若干种产品组合了不同形式的胰岛素。

以前，正常化I型和II型糖尿病患者血糖水平的尝试集中于皮下施用各种缓释剂型(time-released formulation)的胰岛素，例如长效胰岛素(ultralente)和优泌林(humulin)NPH胰岛素药品。这些制剂尝试通过对将胰岛素释放到外周组织的调节，延迟并随后控制胰岛素的生物分布(bio-distribution)，期望对胰岛素生物利用度的持续控制将导致更好的葡萄糖控制。甘精胰岛素(Glargine insulin)是长效型胰岛素，其中全天以相对恒定速率将胰岛素从注射位置附近的皮下组织释放到血流中。尽管甘精胰岛素全天以恒定速率释放，释放的胰岛素到达宽范围的体内系统，而不是被输送到体内的靶区域。所需要的是胰岛素组合物，其中所给予的胰岛素的一部分全天以相对恒定速率释放，而另一部分胰岛素从给药位置随时间释放并且将其靶向输送至肝脏，以更好的控制葡萄糖产生。

因此，在本领域，对于控制I型和II型糖尿病患者的血糖水平的组合物和方法，仍然存在未被满足的需求。本发明通过提供长效组合物满足这些需求，所述长效组合物包括游离胰岛素和与靶向输送到肝细胞的脂构建体相结合的胰岛素。脂构建体是脂质/磷脂颗粒，其中各个脂质分子协同相互作用，产生两极脂膜，该两极脂膜封入并隔离一部分介质，脂构建体在所述介质中形成。脂构建体随时间释放游离胰岛素，并且将一部分剩余胰岛素靶向肝脏中的肝细胞，以更好的控制葡萄糖的储存和产生。

发明简述

一方面，本发明包括脂构建体(lipid construct)，其包括两亲脂质和延伸两亲脂质(extended amphipathic lipid)，其中延伸两亲脂质包括近侧部分、中间部分和远侧部分，其中近侧部分将延伸两亲脂质连接到构建体，远侧部分将构建体靶向肝细胞展示(display)的受体，而中间部分连接近侧部分和远侧部分。

在另一方面，脂构建体进一步包括至少一种胰岛素。

在仍旧另一方面，至少一种胰岛素选自赖脯胰岛素(insulin lispro)、门冬胰岛素(insulin aspart)、普通胰岛素、甘精胰岛素、锌胰岛素、人长效锌胰岛素、鱼精蛋白锌胰岛素、人缓冲普通胰岛素、谷赖胰岛素(insulin glulisine)、重组人普通胰岛素、重组人鱼精蛋白锌胰岛素、任意上述胰岛素的预混组合、它们的衍生物和任意上述胰岛素的组合。

在另一方面，脂构建体进一步包括不溶形式的至少一种与脂构建体连接的胰岛素。

在又另一方面，两亲脂质包括至少一种选自下列的脂质：1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、胆固醇、磷酸联十六烷酯、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-[3-磷酸-rac-甘油](1，2-dipalmitoyl-sn-glycerol-[3-phospho-rac-(1-glycero)])、1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺N-(琥珀酰)(1，2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(succinyl))、它们的衍生物和任意前述化合物的混合物。

在一方面，延伸两亲脂质的近侧部分包括至少一个但不超过两个，结合到骨架的长的酰基烃链，其中每一个烃链独立地选自饱和烃链和不饱和烃链。

在另一方面，骨架包括甘油。

在仍旧另一方面，延伸两亲脂质的远侧部分包括选自下列的至少一种：生物素、生物素衍生物、亚氨基生物素、亚氨基生物素衍生物、生物胞素、生物胞素衍生物、亚氨基生物胞素、亚氨基生物胞素衍生物和结合到肝细胞上受体的肝细胞特异性分子。

在又另一方面，延伸两亲脂质选自N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)生物素；磺基-NHS-生物素；N-羟基琥珀酰亚胺长链生物素；磺基-N-羟基琥珀酰亚胺长链生物素；D-生物素；生物胞素；磺基N-羟基琥珀酰亚胺-S-S-生物素；生物素-BMCC；生物素-HPDP；碘乙酰基-LC-生物素；生物素-酰肼；生物素-LC-酰肼；生物胞素-酰肼；生物素尸胺；羧基生物素；光生物素；对氨基苯甲酰生物胞素三氟乙酸酯；对重氮基苯甲酰生物胞素；生物素DHPE；生物素-X-DHPE；12-((生物素酰)氨基)十二酸；12-((生物素酰)氨基)十二酸琥珀酰亚胺酯；S-生物素酰高半胱氨酸；生物胞素-X；生物胞素-X-酰肼；生物素乙二胺；生物素-XL；生物素-X乙二胺；生物素-XX-酰肼；生物素-XX-SE；生物素-XX，SSE；生物素-X-尸胺；α-(t-BOC)生物胞素；N-(生物素酰)-N′-(碘乙酰基)乙二胺；DNP-X-生物胞素-X-SE；生物素-X-酰肼；降生物素胺氢氯化物；3-(N-马来酰亚胺基丙酰)生物胞素；ARP；生物素-1-亚砜；生物素甲酯；生物素-马来酰亚胺；生物素-聚(乙二醇)胺；(+)生物素4-酰氨基苯甲酸钠盐；生物素2-N-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷；生物素-α-D-N-乙酰神经氨酸苷；生物素-α-L-岩藻糖苷；生物素-乳-N-二糖苷；生物素-路易斯-A三糖；生物素-路易斯-Y四糖；生物素-α-D-吡喃甘露糖苷；生物素6-O-磷酸-α-D-吡喃甘露糖苷；和聚铬-聚(二)-N-[2，6-(二异丙基苯基)氨基甲酰甲基亚氨基]双乙酸。

在一方面，延伸两亲脂质的中间部分包含硫代-乙酰三甘氨酸聚合物或它的衍生物，其中延伸两亲脂质分子从脂构建体的表面向外延伸。

在另一方面，脂构建体进一步包括至少一种与水不溶性靶分子络合物连接的胰岛素，其中所述络合物包括大量连接的独立单元，所述独立单元包括：选自过渡元素、内过渡元素、过渡元素的相邻元素和任意上述元素的混合物的桥连成分，以及络合成分，假设当过渡元素是铬时，形成铬靶分子络合物(targetmolecule complex)。

在又另一方面，脂构建体进一步包括至少一种不与靶分子络合物结合的胰岛素。

在进一步的方面，桥连成分是铬。

在一方面，络合成分包括聚(二)-[(N-(2，6-二异丙基苯基)氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸]。

在另一方面，延伸两亲脂质的远侧部分包括非极性衍生的苯环或杂双环结构。

在仍旧另一方面，构建体包括正电荷、负电荷或它们的组合。

在一方面，延伸两亲脂质在与远侧部分的末端距离约13.5埃或更小的位置，包括至少一个羰基部分。

在另一方面，延伸两亲脂质包括至少一个含有仲胺的氨基甲酰部分。

在又另一方面，延伸两亲脂质在中间位置包括带电的铬。

在进一步的方面，脂构建体进一步包括邻苯二甲酸醋酸纤维素。

在又另一方面，脂构建体进一步包括至少一种结合到胰岛素的带电有机分子。

在一方面，带电有机分子选自鱼精蛋白、聚赖氨酸衍生物、高碱性氨基酸聚合物、摩尔比1∶1∶1的聚(精氨酸-脯氨酸-苏氨酸)_n、摩尔比6∶1的聚(DL-丙氨酸-聚-L-赖氨酸)_n、组蛋白、含有伯氨基提供的正电荷的糖聚合物、具有伯氨基的多核苷酸、羧基化聚合物和聚合氨基酸、包含大量具有羧基(COO-)或巯基(S-)官能团的氨基酸残基的蛋白质片段、具有负电荷的末端酸性羧基的蛋白质衍生物、酸性聚合物、含有负电荷羧基的糖聚合物、它们的衍生物和上述化合物的组合。

在另一方面，制造含有两亲脂质和延伸两亲脂质的脂构建体的方法，其中延伸两亲脂质包括近侧部分、中间部分和远侧部分，其中近侧部分将延伸两亲脂质连接到构建体，远侧部分将构建体靶向肝细胞展示的受体，而中间部分连接近侧部分和远侧部分，所述方法包括：产生含有两亲脂质和延伸两亲脂质的混合物；和在水中形成脂构建体的悬浮液。

在仍旧另一方面，制造含有胰岛素、两亲脂质和延伸两亲脂质的脂构建体的方法，其中延伸两亲脂质包括近侧部分、中间部分和远侧部分，其中近侧部分将延伸两亲脂质连接到构建体，远侧部分将构建体靶向肝细胞展示的受体，而中间部分连接近侧部分和远侧部分，所述方法包括：产生含有两亲脂质和延伸两亲脂质的混合物；在水中形成脂构建体的悬浮液；和将胰岛素装载入脂构建体。

在另一方面，将胰岛素装载入脂构建体的步骤包括平衡装载和非平衡装载(equilibrium loading and non-equilibrium loading)。

在仍旧另一方面，将胰岛素装载入脂构建体的步骤包括将含有游离胰岛素的溶液加入到水中脂构建体的混合物中，并且使胰岛素保持与混合物接触，直到达到平衡。

在又另一方面，该方法进一步包括在混合物达到平衡后，停止将胰岛素装载入脂构建体的步骤，其中含有游离胰岛素的溶液被从构建体除去，进一步，其中构建体包含结合到构建体的胰岛素。

在一方面，该方法进一步包括从含有结合到构建体的胰岛素的脂构建体中除去含有游离胰岛素的溶液的步骤，这是通过选自快速过滤步骤、离心、过滤离心和使用离子交换树脂或链霉抗生物素琼脂糖亲和树脂凝胶的层析法的方法实现的，所述链霉抗生物素琼脂糖亲和树脂凝胶对生物素、亚氨基生物素或它们的衍生物具有亲和性。

在另一方面，该方法进一步包括将含有大量连接的独立单元的铬络合物加入到脂构建体的步骤。

在仍旧另一方面，该方法进一步包括将邻苯二甲酸醋酸纤维素加入到脂构建体的步骤。

在又另一方面，该方法进一步包括步骤：从所述方法回收至少一种选自胰岛素、离子交换树脂和链霉抗生物素琼脂糖亲和凝胶的材料。

在另一方面，将胰岛素装载入脂构建体的步骤包括在将胰岛素装载入脂构建体之前，将至少一种带电有机分子加入到胰岛素的步骤。

在仍旧另一方面，增加患者体内至少一种胰岛素的生物利用度的方法包括：将至少一种胰岛素与脂构建体结合，其中脂构建体包括多个非共价多配位基结合位点(multi-dentate binding sites)；以及将含有胰岛素的构建体施用给患者。

在另一方面，增加生物利用度进一步包括调节至少一种活性成分的等电点的步骤。

在又另一方面，胰岛素选自赖脯胰岛素、门冬胰岛素、普通胰岛素、甘精胰岛素、锌胰岛素、人长效锌胰岛素、鱼精蛋白锌胰岛素、人缓冲普通胰岛素、谷赖胰岛素、重组人普通胰岛素、重组人鱼精蛋白锌胰岛素、任意上述胰岛素的预混组合、它们的衍生物和任意上述胰岛素的组合。

权利要求33所述的方法，其中所述脂构建体包括胰岛素、1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、胆固醇、磷酸联十六烷酯、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-[3-磷酸-rac-甘油]、1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、和1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(琥珀酰)或衍生物以及肝细胞受体结合分子。

在一方面，该方法进一步包括在将胰岛素与脂构建体结合之前，将至少一种带电有机分子加入胰岛素的步骤。

在另一方面，形成在宿主中提供胰岛素生物分布增加的缓释组合物的方法，包括：通过含有亚氨基生物素或亚氨基生物素衍生物的脂质将脂构建体结合到pH 9.5或更高的链霉抗生物素琼脂糖亲和凝胶，从体相介质除去脂构建体；从体相介质分离构建体；并且通过将亲和凝胶的水混合物的pH调节到pH4.5，从亲和凝胶释放构建体，其中，释放的构建体包含不溶胰岛素；其中将构建体施用给温血宿主后，胰岛素在宿主内生理pH条件下重新溶解。

在仍旧另一方面，治疗遭受糖尿病的患者的方法包括将有效量的含有与构建体结合的胰岛素的脂构建体施用给患者。

在又另一方面，胰岛素选自赖脯胰岛素、门冬胰岛素、普通胰岛素、甘精胰岛素、锌胰岛素、人长效锌胰岛素、鱼精蛋白锌胰岛素、人缓冲普通胰岛素、谷赖胰岛素、重组人普通胰岛素、重组人鱼精蛋白锌胰岛素、任意上述胰岛素的预混组合、它们的衍生物和任意上述胰岛素的组合。

在一方面，脂构建体进一步包括靶分子络合物，其中所述络合物包括大量连接的独立单元，进一步，其中所述连接的独立单元包括：选自过渡元素、内过渡元素、过渡元素的相邻元素和任意上述元素的混合物的桥连成分；以及络合成分；假设当过渡元素是铬时，形成铬靶分子络合物。

在另一方面，脂构建体进一步包括不与靶分子络合物结合的胰岛素。

在仍旧另一方面，施用是经口或皮下的。

在又另一方面，与构建体结合的胰岛素包括至少一种结合到胰岛素的带电有机分子。

在一方面，本发明包括通过将包含胰岛素、两亲脂质和延伸脂质的脂构建体施用给患者，增强胰岛素向遭受糖尿病的患者的肝脏中肝细胞的输送的方法，其中延伸脂质包括结合到肝细胞受体的部分，其中脂构建体以多种尺寸存在。

在另一方面，至少一种胰岛素选自赖脯胰岛素、门冬胰岛素、普通胰岛素、甘精胰岛素、锌胰岛素、人长效锌胰岛素、鱼精蛋白锌胰岛素、人缓冲普通胰岛素、谷赖胰岛素、重组人普通胰岛素、重组人鱼精蛋白锌胰岛素、任意上述胰岛素的预混组合、它们的衍生物和任意上述胰岛素的组合。

在仍旧另一方面，该方法进一步包括通过提供三维结构排列的脂质分子以便防止水解酶接近胰岛素，来保护脂构建体内的胰岛素免于水解降解。

在又另一方面，该方法进一步包括将邻苯二甲酸醋酸纤维素加入到脂构建体，以与各个脂质分子反应。

在仍旧另一方面，该方法进一步包括在脂构建体内产生不溶剂型的胰岛素。

在一方面，本发明包括用于治疗遭受糖尿病的哺乳动物的试剂盒，该试剂盒包括脂构建体、生理缓冲溶液、施用器和其使用说明材料，其中脂构建体包括两亲脂质和延伸两亲脂质，其中延伸两亲脂质包括近侧部分、中间部分和远侧部分，其中近侧部分将延伸两亲脂质连接到构建体，远侧部分将构建体靶向肝细胞展示的受体，而中间部分连接近侧部分和远侧部分。

在另一方面，试剂盒进一步包括至少一种胰岛素。

在一方面，本发明包括肝细胞-靶向组合物，其包括：至少一种游离胰岛素；至少一种与水不溶性靶分子络合物连接的胰岛素和包括至少一种脂质成分的脂构建体基质；其中靶分子络合物由下述组合而构成：多个连接的独立单元，所述独立单元包括：至少一种选自过渡元素、内过渡元素、和过渡元素的相邻元素的桥连成分；以及络合成分；假设当过渡元素是铬时，产生铬靶分子络合物；进一步其中靶分子络合物包括负电荷。

在另一方面，至少一种胰岛素选自赖脯胰岛素、门冬胰岛素、普通胰岛素、甘精胰岛素、锌胰岛素、人长效锌胰岛素、鱼精蛋白锌胰岛素、人缓冲普通胰岛素、谷赖胰岛素、重组人普通胰岛素、重组人鱼精蛋白锌胰岛素、任意上述胰岛素的预混组合、它们的衍生物和任意上述胰岛素的组合。

在仍旧另一方面，胰岛素包括胰岛素样部分，包括胰岛素分子的片段，其具有胰岛素的生物活性。

在另一方面，脂质成分包括至少一种选自1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、胆固醇、胆固醇油酸酯、磷酸联十六烷酯、1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸酯(1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphate)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸酯(1，2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate)和1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸酯(1，2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate)的脂质。

在一方面，脂质成分包括至少一种选自1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、胆固醇和磷酸联十六烷酯的脂质。

在另一方面，脂质成分包括1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、胆固醇和磷酸联十六烷酯的混和物。

在仍旧另一方面，桥连成分是铬。

在又另一方面，络合成分包括至少一个选自下列的成员：

N-(2，6-二异丙基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(2，6-二乙基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(2，6-二甲基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(4-异丙基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(4-丁基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(2，3-二甲基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(2，4-二甲基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(2，5-二甲基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(3，4-二甲基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(3，5-二甲基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(3-丁基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(2-丁基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(4-叔丁基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(3-丁氧基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(2-己氧基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(4-己氧基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

氨基吡咯亚氨基二乙酸；

N-(3-溴-2，4，6-三甲基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

苯并咪唑甲基亚氨基二乙酸；

N-(3-氰基-4，5-二甲基-2-吡咯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(3-氰基-4-甲基-5-苄基-2-吡咯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；和

N-(3-氰基-4-甲基-2-吡咯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸。

在仍旧另一方面，络合成分包括聚(二)[N-(2，6-二异丙基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸]。

在一方面，本发明包括制造肝细胞靶向组合物的方法，其包括：产生靶分子络合物，其中络合物包括多个连接的独立单元和脂构建体基质；在缓冲液中形成靶分子络合物的悬浮液；以及结合胰岛素和靶分子络合物。

在另一方面，制造肝细胞靶向组合物的方法包括：产生靶分子络合物，其中络合物包括多个连接的独立单元和脂构建体基质；在水中形成靶分子络合物的悬浮液；将水悬浮液的pH调节到约pH5.3；将甘精胰岛素的pH调节到约4.8；以及结合甘精胰岛素和靶分子络合物，其中胰岛素是甘精胰岛素。

在仍旧另一方面，制造肝细胞靶向组合物的方法包括：产生靶分子络合物，其中络合物包括多个连接的独立单元和脂构建体基质；在水中形成靶分子络合物的悬浮液；将水悬浮液的pH调节到约pH5.3；将甘精胰岛素的pH调节到约4.8；以及结合甘精胰岛素、非甘精胰岛素和靶分子络合物，其中胰岛素包括甘精胰岛素和至少一种非甘精胰岛素。

在一方面，本发明包括治疗I型或II型糖尿病患者的方法，包括将有效量的肝细胞-靶向组合物施用给患者。

在另一方面，给药途径选自口服、肠胃外、皮下、肺部和颊部。

在仍旧另一方面，给药途径是经口或皮下。

在一方面，本发明包括治疗I型或II型糖尿病患者的方法，包括将有效量的肝细胞靶向组合物施用给患者，其中胰岛素包括甘精胰岛素和至少一种非甘精胰岛素，进一步，其中非甘精胰岛素选自赖脯胰岛素、门冬胰岛素、普通胰岛素、甘精胰岛素、锌胰岛素、人长效锌胰岛素、鱼精蛋白锌胰岛素、人缓冲普通胰岛素、谷赖胰岛素、重组人普通胰岛素、重组人鱼精蛋白锌胰岛素、任意上述胰岛素的预混组合、它们的衍生物和任意上述胰岛素的组合。

在另一方面，非甘精胰岛素包括胰岛素样部分，包括胰岛素分子的片段，其具有胰岛素的生物活性。

在仍旧另一方面，本发明包括治疗I型或II型糖尿病患者的方法，包括将有效量的肝细胞-靶向组合物施用给患者。

在另一方面，给药途径选自口服、肠胃外、皮下、肺部和颊部。

在仍旧另一方面，给药途径是经口或皮下。

在又另一方面，本发明包括治疗I型或II型糖尿病患者的方法，包括将有效量的肝细胞靶向组合物施用给患者，其中胰岛素包括重组人鱼精蛋白锌胰岛素和至少一种不是重组人鱼精蛋白锌胰岛素的胰岛素。

在另一方面，至少一种不是重组人鱼精蛋白锌胰岛素的胰岛素包括胰岛素样部分，包括胰岛素分子的片段，其具有胰岛素的生物活性。

在一方面，本发明包括用于治疗哺乳动物I型或II型糖尿病的试剂盒，该试剂盒包括生理缓冲溶液、施用器和使用其的说明性材料，和水不溶性靶分子络合物，其中络合物包括多个连接的独立单元和含有负电荷的脂构建体基质，多个连接的独立单元包括：选自过渡元素、内过渡元素、过渡元素的相邻元素和任意上述元素的混合物的桥连成分，以及络合成分，假设当过渡元素是铬时，产生铬靶分子络合物，其中多个连接的独立单元与脂构建体基质相结合。

在另一方面，试剂盒进一步包括至少一种胰岛素，其中胰岛素与靶分子络合物相连接，其中络合物含有电荷。

附图简述

为了阐述本发明的目的，在附图中描述本发明的某些实施方式。然而，本发明没有限定于在附图中描述的实施方式的精确安排和手段(arrangement andinstrumentality)。

图1是胰岛素结合的脂构建体的描述，所述脂构建体包括胰岛素、两亲脂质分子和延伸两亲脂质。

图2是制造生物胞素的途径的描述。

图3是制造亚氨基生物胞素的途径的描述。

图4是制造苯甲酰硫乙酰三甘氨酸亚氨基生物胞素(BTA-3-甘氨酸-亚氨基生物胞素)的途径的描述。

图5是制造苯甲酰硫代乙酰三甘氨酸的途径的描述。

图6是制造苯甲酰硫代乙酰三甘氨酸磺基N-羟基琥珀酰亚胺(BTA-3-甘氨酸-磺基-NHS)的途径的描述。

图7是制造苯甲酰硫代乙酰三甘氨酸亚氨基生物胞素(BTA-3-甘氨酸-亚氨基生物胞素)的途径的描述。

图8是制造脂质锚定和肝细胞受体结合分子(lipid anchoring andhepatocyte receptor binding molecule，LA-HRBM)的途径的描述。

图9是在邻苯二甲酸醋酸纤维素和胰岛素之间的潜在结合位点的描述。

图10是酸性条件对碱性条件下，亚氨基生物素的结构变化的描述。

图11是甘精胰岛素的化学结构的描述。

图12是重组人鱼精蛋白锌胰岛素和鱼精蛋白的化学结构的描述。

图13是药物组合物的描述，所述药物组合物组合了游离胰岛素和与水不溶性靶分子络合物结合的胰岛素。

图14是制造含有两亲脂质分子和延伸两亲脂质的胰岛素结合脂构建体的方法的概要。

图15是制造肝细胞靶向药物组合物的方法的概要，该肝细胞靶向药物组合物组合游离甘精胰岛素和与水不溶性靶分子络合物结合的甘精胰岛素。

图16是制造肝细胞靶向药物组合物的方法的概要，该肝细胞靶向药物组合物组合游离重组人鱼精蛋白锌胰岛素和与水不溶性靶分子络合物结合的重组人鱼精蛋白锌胰岛素，其中水不溶性靶分子络合物包括一部分游离和与脂构建体结合的重组人普通胰岛素。

图17表示用多种肝细胞靶向组合物处理的大鼠肝脏中存在的糖原的浓度。

图18是在早餐前用HDV-甘精胰岛素治疗一次的个体患者血液中的葡萄糖浓度图。

图19是单一剂量HDV-甘精胰岛素对一天进3餐的患者的平均血糖浓度的影响图。

图20是相对于禁食期间血糖浓度，HDV-甘精胰岛素随时间对血糖浓度的影响的图。

图21是在早餐前用HDV-Humulin NPH胰岛素治疗一次的个体患者血液中的葡萄糖浓度图。

图22是单一剂量HDV-Humulin NPH胰岛素对一天进3餐的患者的平均血糖浓度的影响图。

图23是相对于禁食期间血糖浓度，HDV-Humulin NPH胰岛素随时间对血糖浓度的影响的图。

发明详述

本发明包括肝细胞靶向药物组合物，其中胰岛素在构建体内与水不溶性靶分子络合物相结合，并且组合物被靶向患者肝脏中的肝细胞，以提供治疗糖尿病的有效手段。

本发明包括含有胰岛素、两亲脂质和延伸两亲脂质(受体结合分子)的脂构建体。延伸两亲脂质包括近侧部分、中间部分和远侧部分。近侧部分将延伸两亲脂质连接到构建体，远侧部分将构建体靶向肝细胞展示的受体，而中间部分连接近侧部分和远侧部分。

脂构建体是球形脂质和磷脂颗粒，在其中各个脂质分子协同相互作用，产生两极脂膜，该两极脂膜封入并隔离一部分在其中形成脂构建体的介质。脂构建体可将胰岛素靶向输送到肝脏中的肝细胞，并提供持续释放的胰岛素，以更好地控制糖尿病。

本发明也包括肝细胞靶向药物组合物，所述肝细胞靶向药物组合物组合了游离胰岛素和与靶向患者肝脏中肝细胞的水不溶性靶分子络合物结合的胰岛素，以提供控制血糖水平的有效手段。当不同形式的胰岛素的混合物与靶分子络合物连接以产生胰岛素分子的独特混合物(unique mixture)时，在这些胰岛素被结合在肝细胞靶向脂构建体中之后，治疗益处得到增加。为了治疗遭受糖尿病的哺乳动物的目的，本发明的组合物可通过各种途径加以施用，包括皮下或口服。

本发明进一步提供制造含有胰岛素、两亲脂质和延伸两亲脂质的脂构建体的方法。延伸两亲脂质分子包括近侧部分、中间部分和远侧部分。近侧部分将延伸脂质连接到构建体，远侧部分将构建体靶向肝细胞展示的受体，而中间部分连接近侧部分和远侧部分。

本发明也提供制造包括游离胰岛素和在脂构建体中与水不溶性靶分子络合物结合的胰岛素的组合物的方法，所述构建体将络合物靶向输送到肝细胞。靶分子络合物包括脂构建体基质，其含有多个连接的、具有金属络合物形成的结构的独立单元。

另外，本发明提供通过施用有效剂量的含有胰岛素、两亲脂质和延伸两亲脂质的脂构建体——其被靶向输送到肝细胞，而治疗患有糖尿病的个体的方法。

另外，本发明还提供通过施用有效剂量的含有胰岛素、两亲脂质、延伸两亲脂质和水不溶性靶分子络合物的脂构建体——其被靶向输送到肝细胞，而治疗遭受糖尿病的个体的方法。

本发明也提供用胰岛素治疗患者的方法，所述胰岛素被极性有机化合物或化合物的混合物所结合，从而改变了胰岛素的等电点。等电点的这种改变将改变用该组合物治疗的患者机体内的胰岛素释放。

另外，本发明通过施用有效剂量的肝细胞靶向药物组合物，提供控制I型或II型糖尿病个体的血糖水平的方法，所述肝细胞靶向药物组合物组合游离胰岛素和与靶向输送到肝细胞的水不溶性靶分子络合物结合的胰岛素。游离胰岛素和与水不溶性靶分子络合物结合的胰岛素组合在两种形式的胰岛素之间产生动态平衡过程，这在体内发生，以在指定时期之内帮助控制游离胰岛素向激素作用的受体位点运动，例如糖尿病患者的肌肉和脂肪组织。在与游离胰岛素不同的指定时期内，肝细胞靶向胰岛素也被输送到糖尿病患者的肝脏中，因此当游离胰岛素从脂构建体释放时，引入新的胰岛素药物动力学特点。另外，一部分与脂构建体结合的胰岛素靶向肝脏。该产品的这种新的胰岛素药物动力学特点不但提供用于外周组织的长效基础胰岛素(basal insulin)，而且提供在进餐时间用于控制肝糖(hepatic glucose)储存的餐时(meal-time)肝胰岛素刺激。游离胰岛素从给药位置释放，并且分布到全身。与水不溶性靶分子络合物相连接的胰岛素被输送到肝脏，在这里胰岛素随时间从络合物中释放。与靶分子络合物相连接的胰岛素的释放速率不同于游离胰岛素从给药位置释放的速率。胰岛素输送的这些不同释放速率，与脂构建体连接的胰岛素向肝脏的靶向输送相结合，提供了I型和II型糖尿病患者的葡萄糖浓度的正常化。肝细胞靶向组合物也可包括其它类型的胰岛素，或其它类型的胰岛素的组合。

定义

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意思。一般而言，本文使用的命名法则和有机化学和蛋白质化学中的实验室方法是本领域公知的和普遍使用的那些。

冠词“一个(或种)(a)”和“一个(或种)(an)”用于本文，是指一个(或种)或一个(或种)以上(即，至少一个(或种))该冠词在语法上的对象。作为示例，“一种要素(an element)”意味着一种要素或一种以上要素。

术语“活性成分”指重组人鱼精蛋白锌胰岛素、重组人普通胰岛素和其它胰岛素。

如本文使用的，氨基酸通过其全名、相应的三字母密码以及单字母密码进行表示，如在下表所表示：

全名	三字母密码	单字母密码	全名	三字母密码	单字母密码
						丙氨酸精氨酸天冬酰胺天冬氨酸半胱氨酸胱氨酸谷氨酶	AlaArgAsnAspCysCys-CysGlu	ARNDCC-CE	亮氨酸赖氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸脯氨酸丝氨酸苏氨酸	LeuLysMetPheProSerThr	LKMFPST

谷氨酰胺甘氨酸组氨酸异亮氧酸

GlnGlyHisIle

QGHI

色氨酸酪氨酸缬氨酸

TrpTyrVal

WYV

术语“低级(lower)”指其描述的基团含有1到6个碳原子。

术语“烷基”本身或作为其它取代基的一部分，除非另有说明，指具有指定碳原子数量(即C₁-C₆指一到六个碳)的直链、支链或环链烃，并且包括直链、支链或环状基团。实例包括：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、环己基和环丙基甲基。最优选是(C₁-C₃)烷基、特别是乙基、甲基和异丙基。

术语“亚烷基”，本身或作为其它取代基的一部分，除非另有说明，指具有两个取代位点的直链、支链或环链烃，例如亚甲基(-CH₂-)、亚乙基(-CH₂CH₂-)、亚异丙基(-CH(CH₃)＝CH₂)等。

术语“芳基”，单独或与其它术语一起使用，除非另有说明，指饱和或不饱和的环碳环结构，其包括一个或多个环(一般一个、两个或三个环)，其中这些环可以以侧链的方式连接在一起，例如联苯基，或者可以稠合例如萘。实例包括苯基；蒽基；和萘基。该结构可具有一个或多个取代位点，在那里官能团例如醇、烷氧基、酰胺、氨基、氰化物、卤素和硝基被结合。

术语“芳基低碳烷基(arylloweralkyl)”指官能团，其中芳基被连接到低级亚烷基，例如-CH₂CH₂-苯基。

术语“烷氧基”，单独或与其它术语一起使用，除非另有说明，指烷基或含有取代基例如羟基的烷基，其具有指定碳原子数，通过氧原子被连接到分子其它部分，例如，-OCHOH-，-OCH₂OH，甲氧基(-OCH₃)，乙氧基(-OCH₂CH₃)，1-丙氧基(-OCH₂CH₂CH₃)，2-丙氧基(异丙氧基)，丁氧基(-OCH₂CH₂CH₂CH₃)，戊氧基(-OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₃)，以及高级同系物和异构体。

术语“酰基”指具有通式-C(＝O)-R的官能团，其中-R是氢、烃基、氨基或烷氧基。实例包括乙酰基(-C(＝O)CH₃)，丙酰(-C(＝O)CH₂CH₃)，苯甲酰基(-C(＝O)C₆H₅)，苯乙酰基(-C(＝O)CH₂C₆H₅)，乙氧羰基(-CO₂CH₂CH₃)，和二甲基氨基甲酰(-C(＝O)N(CH₃)₂)。

术语“卤(halo)”或“卤素(halogen)”，本身或作为其它取代基的一部分，除非另有说明，指氟、氯、溴或碘原子。

术语“杂环(heterocycle)”、或“杂环基(heterocyclyl)”、或“杂环的(heterocyclic)”，本身或作为其它取代基的一部分，除非另有说明，指取代或未取代的、稳定的、单环-或多环杂环体系，其包括碳原子和选自N、O和S的至少一个杂原子，并且其中氮和硫杂原子可被任选地氧化，并且任选地氮原子可被季铵化。除非另有说明，杂环体系可在提供稳定结构的任何杂原子或碳原子处被连接。实例包括吡咯、咪唑、苯并咪唑、酞、吡啶基、吡喃基、呋哺基、噻唑、噻吩、唑、吡唑、3-吡咯啉、吡咯烷(pyrrolidene)、嘧啶、嘌呤、喹啉、异喹啉、咔唑等。

术语“铬靶分子络合物”指包括大量独立的单元的络合物，其中，每一单元包含由于多价分子而可接受多达六个配体的铬原子(Cr)，例如来自大量N-(2，6-二异丙基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸的分子的配体。独立单元彼此连接，形成以三维排列连接的复杂聚合结构。聚合络合物不溶于水，但是可溶于有机溶剂。

术语“脂构建体”指脂质和/或磷脂颗粒，其中各个脂质分子协同相互作用，产生两极脂膜，该两极脂膜封入并隔离一部分脂构建体在其中存在的介质。

术语“两亲脂质”指具有极性端和非极性端的脂质分子。

术语“延伸两亲脂质”指两亲脂质具有如此结构，该结构当作为脂构建体的一部分时，从脂构建体延伸进入构建体周围的介质，并可结合受体或与受体相互作用。

“络合剂(complexing agent)”是将与选定的金属桥连剂例如铬盐、锆盐等形成聚合络合物的化合物，其表现出聚合性能，其中，聚合络合物基本上不溶于水而可溶于有机溶剂。

“水介质”指水或含水缓冲液或盐。

“基本可溶”指材料在室温下表现不溶于水的性能，所述材料例如所生成的聚合铬靶分子络合物或其它金属靶向络合物，其在由络合剂形成的组合物中，可以是晶状的或非晶形的。这样的聚合络合物或其解离的形式当与脂构建体基质连接时，形成运输剂，其行使将胰岛素携带和输送到温血宿主肝脏中肝细胞的功能。

“基本不溶”指聚合络合物在室温下表现不溶于水的性能，所述络合物例如聚合铬靶分子络合物或其它金属靶向络合物。这样的聚合络合物——其在组合物中可以是晶状的、非晶形的——或其解离的形式当与脂构建体基质连接时，形成运输剂，其行使将胰岛素携带和输送到肝脏中肝细胞的功能。

使用术语“与…连接(或结合)(associated with)”指将引用的材料并入脂构建体基质，或者在脂构建体基质的表面上或其中。

术语“胰岛素”指天然或重组形式的胰岛素，或前述胰岛素的衍生物。胰岛素的实例包括但不限于赖脯胰岛素、门冬胰岛素、普通胰岛素、甘精胰岛素、锌胰岛素、人长效锌胰岛素、鱼精蛋白锌胰岛素、人缓冲普通胰岛素、谷赖胰岛素、重组人普通胰岛素、重组人鱼精蛋白锌胰岛素。也包括动物胰岛素，例如牛或猪胰岛素。

术语“游离胰岛素”指不与靶分子络合物相连接的胰岛素。

术语“甘精”和“甘精胰岛素”都指重组人胰岛素类似物，其与人胰岛素的差异在于在A21位置的氨基酸天冬酰胺被甘氨酸所取代，并且将两个精氨酸加入到B-链的C-末端。化学上，其为21^A-Gly-30^Ba-L-Arg-30^Bb-L-Arg-人胰岛素，并且具有经验式C₂₆₇H₄₀₄N₇₂O₇₈S₆和6063的分子量。甘精胰岛素的结构式提供在图11中。

术语“非-甘精胰岛素”指不是甘精胰岛素的天然或重组的所有胰岛素。该术语包括胰岛素样部分，包括胰岛素分子的片段，其具有胰岛素的生物活性。

术语“重组人鱼精蛋白锌胰岛素”指用鱼精蛋白处理的人胰岛素。重组人鱼精蛋白锌胰岛素和鱼精蛋白的结构式提供在图12中。

术语“至少一种不是重组人鱼精蛋白锌胰岛素的胰岛素”指不是重组人鱼精蛋白锌胰岛素的天然或重组的所有胰岛素。该术语包括胰岛素样部分，包括胰岛素分子的片段，其具有胰岛素的生物活性。

“HDV”或“肝细胞输送载体(Hepatocyte Delivery Vehicle)”是含有脂构建体基质的水不溶性靶分子络合物，其包括多个连接的、具有由金属桥连剂和络合剂的组合形成的结构的独立单元。“HDV”被描述于WO 99/59545，靶向脂质体药物输送系统(Targeted Liposomal Drug Delivery System)。

“HDV-甘精胰岛素”是如此肝细胞靶向组合物的名称，所述肝细胞靶向组合物包括游离甘精胰岛素和与水不溶性靶分子络合物相连接的甘精胰岛素的混合物，其中络合物包括多个连接的、铬和N-(2，6-二异丙基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸的独立单元，以及脂构建体基质，所述多个连接的独立单元由金属桥连剂和络合剂的组合形成。

“HDV-NPN”是如此肝细胞靶向组合物的名称，所述肝细胞靶向组合物包括游离重组人鱼精蛋白锌胰岛素、游离非优泌林胰岛素(non-humulininsulin)和与水不溶性靶分子络合物相连接的重组人鱼精蛋白锌胰岛素和非优泌林胰岛素，其中络合物包括铬和多个连接的、N-(2，6-二异丙基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸的独立单元，以及脂构建体基质，所述多个连接的独立单元由金属桥连剂和络合剂的组合形成。

术语“生物利用度”指胰岛素到达体循环并在作用部位可利用的速率和程度的量度。

术语“等电点”指蛋白质上正电荷和负电荷浓度相等时的pH，结果，蛋白质将表现零净电荷。在等电点，蛋白质将几乎完全以两性离子或者蛋白质多个形式之间的混合物的形式存在。蛋白质在其等电点下是最不稳定的，并且在该pH下更容易凝结或沉淀。然而，蛋白质在等电点沉淀之后不被变性，因为这个过程基本上是可逆的。

如本文使用的术语，“调节(to modulate)”生物或化学过程或状态，或者生物或化学过程或状态的“调节(modulation of)”指改变生物或化学过程的正常过程，或者将生物或化学过程的状态改变为不同于目前状态的新的状态。例如，多肽等电点的调节可涉及增加多肽等电点的变化。可选地，多肽等电点的调节可涉及降低多肽等电点的变化。

“统计结构(statistical structure)”指可以从一个脂构建体迁移至另一脂构建体的分子形成的结构，并且该结构以高斯分布可表示的多种粒径存在。

“多配位基结合(Multi-dentate binding)”是化学结合过程，其使用脂构建体中的多个结合位点，例如邻苯二甲酸醋酸纤维素、磷脂和胰岛素。这些结合位点促进氢键合、离子-偶极和偶极-偶极相互作用，这里单独的分子协力起作用，以形成用于结合或连接两个或更多个分子的非共价连接。

如本文使用的，“治疗”指减低病人经受的疾病症状、病症或不利状况等的频率。

如本文使用的，术语“药学上可接受载体”指与活性成分组合的化学组分，并且在组合之后，该化学组分可被用来将活性成分施用给对象。

如本文使用的，术语“生理上可接受的”指成分不会对组合物施用给的对象有害。

发明描述-组合物

脂构建体

含有胰岛素、两亲脂质和延伸两亲脂质的胰岛素结合脂构建体的描述在图1中示出。延伸两亲脂质，也被称为受体结合分子，包含近侧部分、中间部分和远侧部分，其中近侧部分将延伸脂质分子连接到构建体，远侧部分将构建体靶向肝细胞展示的受体，而中间部分连接近侧部分和远侧部分。合适的两亲脂质一般包括极性首基和非极性尾基团，它们通过甘油骨架彼此相连接。

适合的两亲脂质包括1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、胆固醇、胆固醇油酸酯、磷酸联十六烷酯、1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸酯、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸酯、1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸酯、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(Cap生物素酰)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(琥珀酰)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-[磷酸-rac-(1-甘油)](钠盐)、三乙铵2，3-二乙酰氧基丙基2-(5-((3aS，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)磷酸乙酯以及任意前述脂质的混合物或这些脂质的适当衍生物。

在一实施方式，两亲脂质分子包括1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、胆固醇、磷酸联十六烷酯、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(Cap生物素酰)；1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(琥珀酰)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-[磷酸-rac-(1-甘油)](钠盐)、三乙铵2，3-二乙酰氧基丙基2-(5-((3aS，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)磷酸乙酯以及任意前述脂质的混合物。

延伸两亲脂质分子，也被称为受体结合分子，包含近侧部分、中间部分和远侧部分。近侧部分将延伸脂质分子连接到构建体，远侧部分将构建体靶向肝细胞展示的受体。近侧部分和远侧部分通过中间部分相连接。下面描述各种受体结合分子的组成。在脂构建体中，下面列出的一个或多个组的肝细胞受体结合分子可以存在，以将构建体结合到肝细胞中的受体。

一个组的肝细胞受体结合分子包括末端生物素或亚氨基生物素部分，以及它们的衍生物。生物素、亚氨基生物素、羧基生物素和生物胞素的结构式在表1中示出。

表1

使用各种技术可将这些分子连接到磷脂分子，以产生脂质锚定分子，其可被插入脂构建体。这些肝细胞受体结合分子包括位于脂构建体近侧位置的锚定部分。该锚定部分包括两个亲脂烃链，其可与脂构建体内磷脂分子上其它亲脂烃链连接并结合。

在一个优选的实施方式中，第二组肝细胞受体结合分子包括位于脂构建体远侧位置的末端生物素或亚氨基生物素部分。这类化合物的结构在表2中给出。

表2

生物素和亚氨基生物素都包含适度亲脂性双环结构，其在双环上4-碳位置处连接到五碳戊酸链。在一个实施方式中，通过戊酸上羧基与L-赖氨酸的N-末端α-氨基或ε-氨基反应，L-赖氨酸可被共价结合到戊酸C-末端羧基官能团。使用碳二亚胺连接方法，施行这种偶联反应，并导致在L-赖氨酸和生物素之间形成酰胺健，如图2所阐明。

第三组肝细胞受体结合分子包括亚氨基生物素、羧基生物素和生物胞素，其中戊酸侧链通过酰胺键连接到氨基酸L-赖氨酸的α-氨基或ε-氨基。一优选的实施方式在形成亚氨基生物胞素部分中，使用亚氨基生物素，如图3所示。在肝细胞受体结合分子合成期间，亚氨基生物胞素的α-氨基可与活化酯苯甲酰硫代乙酰三甘氨酸-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺(BTA-3gly-磺基-NHS)反应形成活性肝细胞结合分子(BTA-3gly-亚氨基生物胞素)，如图4所示。BTA-3gly-亚氨基生物胞素行使分子间隔团的功能，其最终表现出活性亲核巯基官能团，可被用于接下来的偶联反应。该间隔团位于脂构建体的中间位置，并且使末端亚氨基生物胞素部分从脂构建体的表面延伸大约30埃，以形成亚氨基生物胞素最适和非限制性的取向，以结合到肝细胞受体。该中间间隔团可包括提供末端生物素部分的正确立体化学取向的其它衍生物。该中间间隔团的主要功能是适当和共价连接近侧和远侧部分，形成线性排列。

肝细胞受体结合分子的BTA-3gly-磺基-NHS部分可通过大量方法合成，并且在接下来的步骤中，将其连接到生物胞素和亚氨基生物胞素。起始步骤包括将苯甲酰氯加入到硫代乙酸，以通过亲核加成形成活性硫官能度的保护基。反应的产物是苯甲酰硫代乙酸络合物和盐酸，如图5所示出。在合成中另外的步骤涉及使用二环己基碳二亚胺或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺作为偶联剂，将苯甲酰硫代乙酸与磺基-N-羟基琥珀酰亚胺反应，形成苯甲酰硫代乙酰磺基-N-羟基琥珀酰亚胺(BTA-磺基-NHS)，如图5所描述的。然后，苯甲酰硫代乙酰磺基-N-羟基琥珀酰亚胺与氨基酸多聚体(甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸)反应。在用三甘氨酸的α-氨基亲核攻击后，形成苯甲酰硫代乙酰三甘氨酸(BTA-3gly)，同时用水介质溶解磺基-N-羟基琥珀酰亚胺离去基团，如图5所示。苯甲酰硫代乙酰三甘氨酸再次与二环己基碳二亚胺或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺反应，以与磺基-N-羟基琥珀酰亚胺形成酯键，如图6所示。然后，活化的苯甲酰硫代乙酰三甘氨酸的磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(BTA-3gly-磺基-NHS)与生物胞素或亚氨基生物胞素的L-赖氨酸官能团的α-氨基反应，以形成肝细胞受体结合部分——在图7中阐明的苯甲酰硫代乙酰三甘氨酸-亚氨基生物胞素(BTA-3gly-亚氨基生物胞素)的延伸两亲脂质分子。

合成肝细胞受体结合分子的第二主要偶联反应被阐明，其中苯甲酰硫代乙酰三甘氨酸亚氨基生物胞素通过硫醚键被共价连接到N-对-马来酰亚胺基苯基丁酸酯磷脂酰乙醇胺——优选的磷脂锚定分子。该反应得到在末端亚氨基生物胞素环和脂构建体之间提供正确分子间隔的分子。形成肝细胞受体结合分子的完整的反应方案被描述在图8中，所述肝细胞受体结合分子行使延伸两亲脂质分子的功能。在苯甲酰硫代乙酰三甘氨酸亚氨基生物胞素与N-对-马来酰亚胺基苯基丁酸酯磷脂酰乙醇胺反应形成硫醚键之前，通过加热除去苯甲酰保护基以便暴露游离巯基官能度。该反应应该在无氧的环境中施行，以使巯基氧化成二硫化物最小化。进一步的氧化可导致形成砜、亚砜、次磺酸或磺酸衍生物。

在一实施方式中，分子的锚定部分包括形成分子脂质部分的一对酰基烃链。分子的该部分在脂构建体的脂质结构域内被非共价结合。在一实施方式中，锚定部分从N-对-马来酰亚胺基苯基丁酸酯磷脂酰乙醇胺产生。可以使用其它的锚定分子。在一实施方式中，锚定分子可包括硫代-胆固醇、胆固醇油酸酯、磷酸联十六烷酯；1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(琥珀酰)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-[磷酸-rac-(1-甘油)](钠盐)和它们的混合物。称为LA-HRBM的充分研发的脂质锚定和肝细胞受体结合分子的完整分子结构在图8中示出。

肝细胞受体结合分子的第四组包括具有水可溶部分和水不可溶部分的两亲有机分子。通过配位作用和生物接枝化学反应(bioconjugation chemicalreaction)，水不可溶部分与中间部分或连接部分反应，而该水不可溶部分在肝中结合到肝细胞结合受体。所述分子含有远侧成分，所述远侧成分由非极性衍生苯环结构——例如2，6-二异丙基苯衍生物——或亲脂杂双环结构所构成。完整的肝细胞受体结合分子拥有固定电荷或瞬变电荷，其为正的或负的，或者它们的各种组合。这些分子包含至少一个位于距远侧部分的末端等于或小于但不大于约13.5埃处的羰基，和至少一个含有仲胺和羰基的氨基甲酰部分。氨基甲酰部分或多个氨基甲酰部分的存在增强该有机分子的分子稳定性。在分子中可存在多个仲胺。这些仲胺包括一对未共享电子，其使与构建体内其它分子发生离子-偶极和偶极-偶极键相互作用。这些胺增强分子稳定性，并且提供部分产生的负电荷，所述负电荷与远侧部分相互作用，促进肝细胞受体结合和特异性。该组受体结合分子的实例为聚铬-聚(二)-[N-(2，6-(二异丙基苯基)氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸]。在一实施方式中，铬III位于肝细胞受体结合分子的中间位置。肝细胞特异性结合分子的近侧部分含有疏水和/或非极性结构，其允许分子被插入脂构建体，并且接下来在脂构建体内被结合。中间和近侧部分也使肝细胞受体结合分子的远侧部分具有正确立体化学取向。

脂构建体的结构和性能由脂质的结构和脂质之间的相互作用来控制。脂质的结构主要由共价键合所控制。共价键合是保持分子结构完整性所必需的分子键合力，所述分子包括脂构建体的各个成分。通过脂质之间的非共价相互作用，脂构建体保持三维构象。

可通过离子-偶极或诱导离子-偶极键，以及通过与脂质头部上各种极性基团有关的氢键，以一般性术语表示非共价键。疏水键和范德华相互作用可通过脂质酰基链之间的诱导的诱导偶极缔合而产生。这些键合机制本质上是瞬变的，并且导致键形成和键断裂过程，这发生在亚飞秒的时间间隔内。例如范德华相互作用缘自偶极矩的瞬间变化，该变化源自核外电子向一个原子或分子的一侧的短位移(brief shift)，这在相邻原子或分子中产生相似的位移。质子呈现δ⁺电荷并且单个电子呈现δ^-电荷，因此形成偶极。在两亲脂质分子的烃酰基链之间，偶极相互作用以大频率发生。在单独的偶极形成以后，它们可在含有亚甲基(-CH₂-)官能度的相邻原子中，瞬间诱导新的偶极形成。许多瞬间诱导的偶极相互作用形成于整个脂构建体的酰基脂质链之间。这些诱导的偶极相互作用仅持续一飞秒(1×10^-15)的若干分之一，但是当协同行使功能时施加强的力。这些相互作用持续变化，并且具有共价键强度的大约1/20的力。然而，它们不是稳定共价分子之间的瞬时键合的原因，所述稳定共价分子确定构建体的三维统计结构和脂构建体内分子的立体特异性分子取向。

作为这些诱导偶极相互作用的结果，脂构建体的结构通过构建体之间的脂质成分的交换来保持。当构建体的各个成分的组成固定时，脂构建体的各个成分经历构建体之间的交换反应。当脂质成分离开脂构建体时，这些交换最初受零级动力学支配。在脂质成分从脂构建体释放之后，其可被邻近脂构建体重新捕获。释放成分的重新捕获由二级反应动力学所控制，这受捕获该成分的构建体周围的水介质中释放成分的浓度影响，也受捕获释放成分的脂构建体的浓度影响。

延伸两亲脂质和它们各自的标识符的实例与它们的化学名称一起在表3中示出，为：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)生物素[1]；磺基-NHS-生物素[2]；N-羟基琥珀酰亚胺长链生物素[3]；磺基-N-羟基琥珀酰亚胺长链生物素[4]；D-生物素[5]；生物胞素[6]；磺基-N-羟基琥珀酰亚胺-S-S-生物素[7]；生物素-BMCC[8]；生物素-HPDP[9]；碘乙酰基-LC-生物素[10]；生物素-酰肼[11]；生物素-LC-酰肼[12]；生物胞素-酰肼[13]；生物素尸胺[14]；羧基生物素[15]；光生物素[16]；对氨基苯甲酰生物胞素三氟乙酸酯[17]；对重氮基苯甲酰生物胞素[18]；生物素DHPE[19]；生物素-X-DHPE[20]；12-((生物素酰)氨基)十二酸[21]；12-((生物素酰)氨基)十二酸琥珀酰亚胺酯[22]；S-生物素酰高半胱氨酸[23]；生物胞素-X[24]；生物胞素-X-酰肼[25]；生物素乙二胺[26]；生物素-XL[27]；生物素-X-乙二胺[28]；生物素-XX-酰肼[29]；生物素-XX-SE[30]；生物素-XX，SSE[31]；生物素-X-尸胺[32]；α-(t-BOC)生物胞素[33]；N-(生物素酰)-N′-(碘乙酰基)乙二胺[34]；DNP-X-生物胞素-X-SE[35]；生物素-X-酰肼[36]；降生物素胺氢氯化物[37]；3-(N-马来酰亚胺基丙酰)生物胞素[38]；ARP[39]；生物素-1-亚砜[40]；生物素甲酯[41]；生物素-马来酰亚胺[42]；生物素-聚(乙二醇)胺[43]；(+)生物素4-酰氨基苯甲酸钠盐[44]；生物素2-N-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷[45]；生物素-α-D-N-乙酰神经氨酸苷[46]；生物素-α-L-岩藻糖苷[47]；生物素-乳-N-二糖苷(bioside)[48]；生物素-路易斯-A三糖[49]；生物素-路易斯-Y四糖[50]；生物素-α-D-吡喃甘露糖苷[51]；生物素6-O-磷酸-α-D-吡喃甘露糖苷[52]；和聚铬-聚(二)-[N-(2，6-(二异丙基苯基)氨基甲酰甲基)亚氨基]双乙酸[53]。

表3

化合物48-50的名称

48.((2R，5S)-3-乙酰氨基-5-羟基-6-(羟甲基)-2，3，4，6-四甲基-4-((((2S，5R)-3，4，5-三羟基-6-(羟甲基)-2，3，4，5，6-五甲基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)甲基5-((3aS，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酸酯((2R，5S)-3-乙酰氨基-5-羟基-6-(羟甲基)-2，3，4，6-四甲基-4-((((2S，5R)-3，4，5-三羟基-6-(羟甲基)-2，3，4，5，6-五甲基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)甲基5-((3aS，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酸酯

49.(2R，3R，5S)-5-((((2S，3S，5S)-3-乙酰氨基-5-羟基-6-(羟甲基)-2，4，6-三甲基-4-((((2S，5R)-3，4，5-三羟基-6-(羟甲基)-2，3，4，5，6-五甲基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)甲基)-3，4-二羟基-2，4，5，6，6-五甲基四氢-2H-吡喃-2-基5-((3aS，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酸酯

50.(2S，5S)-3-乙酰氨基-4-((((2R，5S)-5-((((2R，5S)-4，5-二羟基-6-(羟甲基)-2，3，4，5，6-五甲基-3-((((2S，5R)-3，4，5-三羟基-2，3，4，5，6，6-六甲基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)甲基)-3，4-二羟基-2，3，4，5，6，6-六甲基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)甲基)-5-羟基-6-(羟甲基)-2，3，4，5，6-五甲基四氢-2H-吡喃-2-基5-((3aS，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酸酯亚氨基生物素化合物的结构没有在表3中示出。亚氨基生物素结构是生物素结构的类似物，其中生物素基团被亚氨基生物素基团取代。实例在下面用类似物N-羟基琥珀酰亚胺生物素和N-羟基琥珀酰亚胺亚氨基生物素示出。

N-羟基琥珀酰亚胺生物素                                           N-羟基琥珀酰亚胺亚氨基生物素

在一实施方式中，邻苯二甲酸醋酸纤维素聚合物被引入脂构建体，在那里，其可结合于胰岛素分子上的亲水官能团，并且保护胰岛素免于水解降解。邻苯二甲酸醋酸纤维素包括聚合排列中β(1→4)连接的两个葡萄糖分子，其中聚合物羟基基团上的一些氢原子被乙酰基官能度(结合于羰基碳的甲基基团)或邻苯二甲酸基团(由在苯环的第一和第二位置具有两个羧基的苯环表示)所取代。邻苯二甲酸醋酸纤维素聚合物的结构式在图9中示出。邻苯二甲酸环结构上仅一个羧基涉及醋酸纤维素分子的共价酯键。另一个羧基——其包括羰基碳和羟基官能度，参与与存在于胰岛素和各种脂质分子上的相邻负电偶极和正电偶极间的氢键合。

在一实施方式中，邻苯二甲酸醋酸纤维素聚合物通过与1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱磷酸酯和磷酸联十六烷酯分子的离子-偶极键合，与脂质相互作用。离子-偶极键合发生于纤维素羟基基团上的δ⁺氢和磷脂分子的磷酸酯部分上的带负电的氧原子之间。在离子-偶极相互作用中起最大作用的官能团是磷脂分子的磷酸酯基团上带负电的氧原子、胰岛素分子的羟基基团上的氢原子和胰岛素分子的酰胺键上的氢原子。带负电官能团形成离子-偶极相互作用的位点，以及与独立羟基和邻苯二甲酸醋酸纤维素上的羧基官能度上的羟基上的δ⁺氢原子反应的位点。可在磷酸胆碱官能度上的带正电的季铵类和见于邻苯二甲酸醋酸纤维素和胰岛素上的δ^-羰基氧之间，形成离子-偶极。在胰岛素中，包括支化亲水结构的糖分子可参与氢键合和离子-偶极相互作用。

分子构型和聚合物的大小(具有大约15,000或更高的分子量)能使邻苯二甲酸醋酸纤维素在亲水首基的区域中包覆脂构建体的各个磷脂分子。这种包覆保护脂构建体中的胰岛素免于胃部酸性环境的攻击。有几种方式可将邻苯二甲酸醋酸纤维素连接到脂构建体内分子的表面。将邻苯二甲酸醋酸纤维素连接到脂构建体表面的优选的方法是将聚合纤维素种类连接到存在从脂构建体表面伸出的糖的胰岛素分子的尾部。这保护胰岛素蛋白质尾免于酶水解。

延伸两亲脂质包括多种用来连接到受体的多配位基结合位点。如本文限定的，多配位基结合需要胰岛素表面和其伴随的糖部分上的多个潜在结合位点，以及在可与邻苯二甲酸醋酸纤维素聚合物上的羰基、羧基和羟基官能团形成表面(interface with carbonyl，carboxyl and hydroxyl functional groups on the celluloseacetate hydrogen phthalate polymer)的脂构建体上的多个潜在结合位点。这能使邻苯二甲酸醋酸纤维素聚合物结合到多个亲水区——不但在脂构建体上而且在胰岛素分子上，以建立脂构建体的水解防护罩。以这种方式，在经口施用胰岛素剂型后，胰岛素和脂构建体都被保护免于胃部酸性环境的进攻。即使当通过胃时邻苯二甲酸醋酸纤维素覆盖或保护脂构建体内部和脂构建体表面上的各个脂质分子，但是在构建体移入小肠的碱性区之后，邻苯二甲酸醋酸纤维素被水解降解。在邻苯二甲酸醋酸纤维素从脂构建体分子的表面除去之后，脂质锚定肝细胞受体结合分子——例如1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(Cap生物素酰)——被暴露，然后可结合受体。需要使用邻苯二甲酸醋酸纤维素包覆于胰岛素和脂构建体上，以确保达到更大的胰岛素生物利用度。

靶分子络合物

在一实施方式中，脂构建体包括含有由桥连成分和络合剂络合形成的多个连接的独立单元的靶分子络合物。桥连成分是能与络合剂形成水不溶性配位配合物的金属的水溶性盐。适当的金属选自过渡金属和内过渡金属或过渡金属的相邻金属。其中过渡金属和内过渡金属选自：Sc(钪)，Y(钇)，La(镧)，Ac(锕)，锕系；Ti(钛)，Zr(锆)，Hf(铪)，V(钒)，Nb(铌)，Ta(钽)，Cr(铬)，Mo(钼)，W(钨)，Mn(锰)，Tc(锝)，Re(铼)，Fe(铁)，Co(钴)，Ni(镍)，Ru(钌)，Rh(铑)，Pd(钯)，Os(锇)，Ir(铱)，和Pt(铂)。其中过渡金属的相邻金属可选自：Cu(铜)，Ag(银)，Au(金)，Zn(锌)，Cd(镉)，Hg(汞)，Al(铝)，Ga(镓)，In(铟)，Tl(铊)，Ge(锗)，Sn(锡)，Pb(铅)，Sb(锑)和Bi(铋)，以及Po(钋)。用作桥连剂的金属化合物的实例包括氯化铬(III)六水合物；氟化铬(III)四水合物；溴化铬(III)六水合物；柠檬酸锆(IV)铵络合物；氯化锆(IV)；水合氟化锆(IV)；碘化锆(IV)；溴化钼(III)；氯化钼(III)；硫化钼(IV)；氢氧化铁(III)；磷酸铁(III)四水合物，硫酸铁(III)五水合物，和类似物。

络合剂是可与桥连成分形成水不溶性配位配合物的化合物。有几个适合的络合剂家族。

络合剂可选自式(1)的亚氨基二乙酸家族，其中R₁是低碳烷基、芳基、芳基低碳烷基和杂环取代基。

适合的式(1)化合物包括：

N-(2，6-二异丙基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(2，6-二乙基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(2，6-二甲基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(4-异丙基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(4-丁基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(2，3-二甲基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(2，4-二甲基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(2，5-二甲基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(3，4-二甲基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(3，5-二甲基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(3-丁基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(2-丁基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(4-叔丁基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(3-丁氧基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(2-己氧基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(4-己氧基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

氨基吡咯亚氨基二乙酸；

N-(3-溴-2，4，6-三甲基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

苯并咪唑甲基亚氨基二乙酸；

N-(3-氰基-4，5-二甲基-2-吡咯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；

N-(3-氰基-4-甲基-5-苄基-2-吡咯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸；和

N-(3-氰基-4-甲基-2-吡咯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸以及式(2)的

N-(3-氰基-4-甲基-2-吡咯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸的其它衍生物，

其中R₂和R₃是下述：

R₂     R₃

H      异-C₄H₉

H      CH₂CH₂SCH₃

H      CH₂C₆H₄-p-OH

CH₃    CH₃

CH₃    异-C₄H₉

CH₃    CH₂CH₂SCH₃

CH₃    C₆H₅

CH₃    CH₂C₆H₅

CH₃    CH₂C₆H₄-p-OCH₃

络合剂选自通式(3)的亚氨基二酸衍生物家族，其中R₄、R₅和R₆彼此独立，并且可以是氢、低碳烷基、芳基、芳基低碳烷基、烷氧基低碳烷基和杂环。

适合的式(3)化合物包括：N′-(2-乙酰萘基)亚氨基二乙酸(NAIDA)；N′-(2-萘甲基)亚氨基二乙酸(NMIDA)；亚氨基二羧甲基-2-萘甲酮酞氨羧络合剂(iminodicarboxymethyl-2-naphthylketone phthalein complexone)；3(3:7a:12a:三羟基-24-降胆烷基-23-亚氨基二乙酸；苯并咪唑甲基亚氨基二乙酸；和N-(5，孕烯-3-对-醇-2-酰氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸。

络合剂选自式(4)的氨基酸的家族，

这里，R₇是氨基酸侧链，R₈是低碳烷基、芳基、芳基低碳烷基，R₉是吡哆醛(pyridoxylidene)。

适合的式(4)氨基酸是脂肪族氨基酸，包括但不限于：甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸；羟基氨基酸，包括丝氨酸，和苏氨酸；二羧基氨基酸和它们的酰胺，包括天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺；具有碱性官能的氨基酸，包括赖氨酸，羟赖氨酸，组氨酸，精氨酸；芳族氨基酸，包括苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，甲状腺素；和含硫氨基酸，包括胱氨酸，甲硫氨酸。

络合剂选自氨基酸衍生物，包括但不必限于(3-丙氨酸-y-氨基)丁酸，邻重氮乙酰丝氨酸(重氮丝氨酸)，高丝氨酸，鸟氨酸，瓜氨酸，青霉胺和吡哆醛类化合物成员，包括但不限于：吡哆谷氨酸；吡哆异亮氨酸；吡哆苯丙氨酸；吡哆色氨酸；吡哆-5-甲基色氨酸；吡哆-5-羟基色胺；和吡哆-5-丁基色胺。

络合剂选自通式(6)的二胺家族，

这里R₁₀是氢，低碳烷基，或芳基；R₁₁是低碳亚烷基或芳基低碳烷基；R₁₂和R₁₃独立为氢，低碳烷基，烷基，芳基，芳基低碳烷基，酰基杂环，甲苯，磺酰或甲苯磺酸盐(酯)。

一些适合的式(6)二胺包括但不限于，乙二胺-N，N双乙酸；乙二胺-N，N-二(-2-羟基-5-溴苯基)乙酸酯；N′-乙酰基乙二胺-N，N双乙酸；N′-苯甲酰乙二胺-N，N双乙酸；N′-(对甲苯磺酰)乙二胺-N，N双乙酸；N′-(对-叔丁基苯甲酰)乙二胺-N，N双乙酸；N′-(苯磺酰)乙二胺-N，N双乙酸；N′-(对氯苯磺酰)乙二胺-N，N双乙酸；N′-(对乙基苯磺酰)乙二胺-N，N双乙酸；N′-酰基和N′-磺酰乙二胺-N，N双乙酸；N′-(对-正-丙基苯磺酰)乙二胺-N，N双乙酸；N′-(萘-2-磺酰)乙二胺-N，N双乙酸；和N′-(2，5-二甲基苯磺酰)乙二胺-N，N双乙酸。

其它合适的络合化合物或络合剂包括但不限于：青霉胺；对-巯基异丁酸；二氢硫辛酸；6-巯基嘌呤；乙氧丁酮醛-二(缩氨基硫脲)(kethoxal-bis(thiosemicarbazone))；肝胆胺复合物(Hepatobiliary AmineComplexes)，1-肼基酞嗪(肼酞嗪)；磺酰脲；肝胆氨基酸席夫碱复合物(Hepatobiliary Amino Acid Schiff Base Complexes)；吡哆谷氨酸；吡哆异亮氨酸；吡哆苯丙氨酸；吡哆色氨酸；吡哆5-甲基色氨酸；吡哆-5-羟基色胺；吡哆-5-丁基色胺；四环素；7-羧基-对-羟基喹啉；酚酞；蓝曙红I；黄曙红I；verograffin；3-羟基1-4-甲酰基-吡啶谷氨酸(pyridene glutamic acid)；偶氮取代的亚氨基二乙酸；肝胆染料络合物，例如玫瑰红；刚果红；溴磺酚酞；溴酚蓝；甲苯胺蓝；和吲哚菁绿；肝胆造影剂，例如胆影酸；和碘甘卡酸；胆汁盐，例如胆红素；cholgycyliodohistamine；和甲状腺素；肝胆硫代复合物，例如青霉胺；对巯基异丁酸；二氢硫辛酸(dihydrothiocytic acid)；6-巯基嘌呤；和乙氧丁酮醛-二(缩氨基硫脲)；肝胆胺复合物，例如1-肼基酞嗪(肼酞嗪)；和磺酰脲；肝胆氨基酸席夫碱复合物，包括吡哆-5-羟基色胺；和吡哆-5-丁基色胺；肝胆蛋白复合物，例如鱼精蛋白；铁蛋白；和脱唾液酸血清类黏蛋白；和脱唾液酸复合物，例如乳糖胺白蛋白；免疫球蛋白，G，IgG；和血红蛋白。

通过结合桥连剂和络合剂制造三维靶分子络合物被描述于WO99/59545，其通过引用引入于本文。在一实施方式中，桥连剂是金属盐，例如氯化铬六水合物，其可与络合剂形成配位配合物，所述络合剂例如N-(2，6-二异丙基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸。将桥连剂和络合剂结合，形成以三维排列的多个连接单元组成的络合物。在一优选的实施方式中，络合物由多个连接在一起的二[N-(2，6-(二异丙基苯基)氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸]铬单元构成的。在一实施方式中，将铬靶分子络合物物质溶于含有1，2-二硬脂酰-Sn-甘油基-磷酸胆碱、磷酸联十六烷酯和胆固醇的脂质混合物中。该络合物被并入从先前描述的脂质的组形成的脂构建体中。

胰岛素等电点的改变

蛋白质的等电点可影响用蛋白质治疗的患者体内蛋白质的释放和分布。通过改变蛋白质的等电点，从给药位置释放蛋白质的速率可被改变，并且可改变蛋白质的药物动力学。

改变胰岛素等电点的一种方法是通过取代或添加各种氨基酸，来改变胰岛素分子结构。改变胰岛素结构以得到不同性能的两个实例是甘精胰岛素和门冬胰岛素。这些胰岛素都与重组人普通胰岛素的氨基酸组成不同。重组人普通胰岛素具有在5.30-5.35的等电点。甘精胰岛素在位置A21上由甘氨酸取代天冬酰胺，并且在B链的C末端加入两个精氨酸。甘氨酸和天冬酰胺的等电点分别是5.97和5.41。用甘氨酸取代天冬酰胺对甘精胰岛素的等电点几乎没有或者没有影响。然而加入两个高度碱性的精氨酸残基，其等电点为10.76，显著地将甘精胰岛素的等电点提高到pH 5.8-6.2。

门冬胰岛素在位置B-28处用天冬氨酸取代脯氨酸(praline)。天冬氨酸和脯氨酸的等电点分别为2.97和6.10。对于该单一酸性氨基酸取代，门冬胰岛素的等电点显著朝更低、更酸性pH移动。

这两个商业可得胰岛素的例子阐明了相对较少数量的氨基酸取代，是如何相对于重组人普通胰岛素明显升高或降低甘精胰岛素或门冬胰岛素的等电点的。通过改变胰岛素的化学性质，也改变了生物利用度和药物动力学特性。当为了提高生物利用度将具有改变了的结构的胰岛素施用给糖尿病患者时，新的药理反应提供了新的治疗益处。

不但可通过胰岛素一级氨基酸序列的内部分子的重构(restructure)，而且可通过将带电有机分子结合到胰岛素，来改变胰岛素的等电点。带电有机分子可结合到胰岛素结构的表面或内部。通过将1.0和1.5mg之间的高度碱性的蛋白质混合物加入到含有100单位或3.65mg胰岛素/ml的1.0ml胰岛素溶液中，天然胰岛素的等电点可从pH5.3变为pH7.2。鱼精蛋白是简单、高度碱性蛋白质组的实例，其可被用来改变胰岛素的等电点。鱼精蛋白在水解时产生大量碱性氨基酸，拥有高氮含量并且在鱼精子中天然存在，并与核酸结合。例如鱼精蛋白鲑精蛋白、鲱精蛋白、虹鳟精蛋白、鲟精蛋白和鲭精蛋白分别是从鲑鱼、鲱、鳟、鲟鱼和鲭鱼精子中分离的。这些碱性蛋白质，或者单独地或者作为混合物，与胰岛素相结合，并且增加胰岛素的等电点。

改变胰岛素表面电荷的化合物包括聚赖氨酸衍生物和其它高碱性氨基酸聚合体，例如聚鸟氨酸、聚羟基赖氨酸、聚精氨酸和聚组氨酸或它们的组合。其它聚合体包括摩尔比1∶1∶1的聚(arg-pro-thr)_n，其分子量范围为几百到数千，或者摩尔比6∶1的聚(DL-Ala-聚-L-lys)_n，其分子量范围为几百到数千。组蛋白和组蛋白片段也可被用来提供正电荷，所述组蛋白是以几种包含不同和变化量的精氨酸、赖氨酸和其它碱性氨基酸——可离子化结合到胰岛素羧基——的亚型存在的碱性蛋白。也包括聚合物例如聚氨基葡糖、聚氨基半乳糖和多种含有伯氨基提供的正电荷的其它糖聚合物。也使用多核苷酸例如聚腺嘌呤、聚胞嘧啶或聚鸟嘌呤，其通过离子化它们的伯氨基提供正电荷。所有上述聚合种类当结合到胰岛素时，提供正电荷的增加，这伴随着胰岛素等电点的增加。将少量这些聚合化合物，例如每毫升胰岛素几微克聚合物，加入来最小量——通常小于一pH单位——地改变胰岛素的等电点。可加入更大量的碱性有机化合物，通常在100单位/ml的每毫升胰岛素中加入一毫克或两毫克以上，以逐步增加胰岛素的等电点，至超过其天然等电点两个pH以上。

相反地，胰岛素的等电点可以相似的方式通过加入羧基化的聚合物和聚合氨基酸——例如聚天冬氨酸、聚谷氨酸，含有大量具有羧基(COO^-)或巯基(S^-)官能团的蛋白质或蛋白质片段——加以降低。高碱性蛋白质通过与适当的酸酐反应以形成负电荷末端羧基代替带正电碱性伯氨基，可被转化为高酸性蛋白质，所述酸酐例如乙酸酐。其它的酸性聚合物，例如负载硫酸盐的聚合物，可被加入到胰岛素以降低胰岛素的等电点。含有带负电羧基的糖聚合物例如聚半乳糖醛酸、聚葡糖酸、聚葡糖醛酸或聚葡糖二酸可被用来降低蛋白质的等电点。

改变胰岛素的等电点不仅改变天然胰岛素分子的离子特性，而且改变离子外壳(ionic envelope)——称为海姆霍兹双层(Hemholtz double layer)，其包围胰岛素，并且延伸入胰岛素周围的体相水介质中——的性质。包围胰岛素的离子环境倾向于以多层存在，其中具有与结合到胰岛素的、参与的带电有机分子相连的相反离子层。电势存在于修饰的胰岛素分子上，因为在胰岛素表面存在离子，所述胰岛素被保持在体相介质的胶状悬浮液中。存在于与结合的有机分子相连的固定的相反离子层和体相介质中的相反离子层之间的那部分电势被称为动电势或zeta(ξ)电势。ξ电势显著促成胶体体系的电性能和稳定性，胶体体系例如水介质中的胰岛素。

作为通过加入材料改变等电点来形成不同化学结构的结果，胶态悬浮体中的蛋白质胰岛素的稳定性从本质上被改变。由于较低的ξ电势，在新改变的等电点下，胰岛素的稳定性发生变化。当胰岛素为两性离子形式，或者混合形式时，其中带负电的官能团精确平衡带正电的官能团，在蛋白质上产生总净电荷为零，胰岛素是最不稳定的。尽管总净电荷为零，但是在整个蛋白质结构中仍然存在负电荷口袋和正电荷口袋。当胰岛素溶液的pH达到其等电点时，其溶解度下降并且胰岛素可以从溶液沉淀。在胰岛素等电沉淀期间，体相水缓冲介质的绝缘性质和介电性质被克服，并且海姆霍兹双层的离子气氛被破裂，以便胶体颗粒之间的异性电荷互相结合，这导致蛋白胶态悬浮体的不稳定性上升。这些影响最终导致蛋白质在等电点下凝结并随后沉淀。等电沉淀的理想范围是高于或低于胰岛素等电点pH5.3的两个或三个pH单位。然而，超过这个pH范围的等电点可被本领域技术人员通过使用信息所阐明。

随着pH从等电点改变，溶解度增加，并且在等电点沉淀的胰岛素可被重新溶解。这发生是因为随着pH从等电点增加或降低，分别有负电荷积聚(等电点以上)或正电荷积聚(等电点以下)，这由代表性(representative)官能团的pKa所调节。随着蛋白质逐渐形成更大的电荷差异，重新溶解发生，从而增加了蛋白质的ξ电势，这再提高蛋白质的稳定性。这些影响导致了包围蛋白质的离子外壳的重新形成，这促进了胰岛素分子的更大的胶态分散。

天然胰岛素的等电点——其发生在pH 5.3时，可通过加入结合到胰岛素并且改变胰岛素离子特性的蛋白质、肽片段、聚合物或聚合物片段而逐步提高。加入碱性官能团的综合影响是提高胰岛素的等电点，并且产生具有更慢药理作用开始的胰岛素，这通过使胰岛素在可溶形式到不可溶形式、然后到新的可溶形式之间变化而实现。通过改变天然胰岛素的等电点，特别是在HDV胰岛素存在的情况下，两种胰岛素形式的生物利用度都可被调节。

通过改变氨基酸序列而改变等电点的胰岛素可被引入脂构建体。在一实施方式中，甘精胰岛素被引入靶分子络合物，其含有脂质和由桥连成分和络合剂络合形成的多个连接的独立单元。靶分子络合物和其成分的描述在本文前面作了描述。在图11中，提供了甘精胰岛素的结构。甘精胰岛素与人胰岛素的不同之处在于甘精胰岛素具有这样的分子结构：在人胰岛素A链的C-末端用甘氨酸取代天冬酰胺，并且在人胰岛素B链的C-末端加入精氨酸二肽。化合物的等电点是化合物的总电荷是中性时的pH。然而，负电荷和正电荷区域仍旧保持在该化合物中。人胰岛素的等电点是pH 5.3。甘精胰岛素的等电点高于人胰岛素，因为甘精胰岛素的氨基酸取代将甘精胰岛素的等电点增加到pH 5.8-6.2。在等电点周围的pH范围内，化合物在水溶液中通常较少溶解。当溶液的pH比等电点高或低大约1-2 pH单位时，化合物通常在水系统中更可溶。更高的等电点使甘精胰岛素在更宽的pH范围内的中度酸性环境中，保持可溶。

甘精胰岛素的商业形式，LANTUS

(甘精胰岛素(rDNA来源)注射剂)，是甘精胰岛素无菌溶液，其用作对于糖尿病患者随后控制体内葡萄糖水平的可注射胰岛素。甘精胰岛素是重组人胰岛素类似物，其为长效作用(高达24小时的作用持续时间)的、肠胃外降低血糖的药剂。通过重组DNA技术，利用非病原性大肠杆菌(Escherichia coli)(K12)实验室菌株作为生产有机体，制造LANTUS

。LANTUS由溶解在透明的水流体(clear aqueous fluid)中的甘精胰岛素构成。每毫升LANTUS(甘精胰岛素注射剂)包含100 IU(3.6378mg)甘精胰岛素、30mcg锌、2.7mg间甲酚、20mg 85％的甘油和用于注射的水。商业可得的LANTUS胰岛素的pH通过加入生理上相容的酸、碱或缓冲液的水溶液，可被调节。LANTUS具有大约4的pH。

将游离胰岛素和与靶分子络合物相连的胰岛素组合的药物组合物的描述在图13示出。在一实施方式中，药物组合物可包含两种或多种胰岛素。靶分子络合物包含由桥连成分和络合剂络合形成的多个连接的独立单元。桥连成分是能与络合剂形成水不溶性配位配合物的水溶性金属盐。适当的金属选自过渡金属和内过渡金属或过渡金属的邻近金属。靶分子络合物和其组分的描述在本文前面作了描述。在一实施方式中，药物组合物包含游离胰岛素和与水不溶性靶分子络合物相连接的胰岛素的混合物。游离胰岛素不与靶分子络合物相连接，其在水中是可溶的。组合物中其它形式的胰岛素与水不溶性靶分子络合物相连接。

通过加入酸、碱或缓冲液，调节包围含有靶分子络合物的脂构建体的水溶液的pH，在脂构建体结构中产生负电荷。这发生时的pH范围依赖于脂质的组成。优选的脂质体系是1，2-二硬脂酰-Sn-甘油基-3-磷酸胆碱、胆固醇和磷酸联十六烷酯的混和物。该混合物在生理条件下形成带负电脂构建体结构。脂构建体表现出肝细胞靶向特异性，即对肝细胞具有特异性，从而使得该构建体靶向肝脏。

已发现在本发明，当使用用于注射的无菌水USP(SWI)将适当的脂质成分配制成水不溶性靶分子络合物——其最终pH被调节到pH 3.95±0.2时，靶分子络合物上的总电荷主要是负电荷。在低于蛋白质的等电点的pH 5.2±0.5下，甘精胰岛素具有净正电荷。在pH 5.2±0.5下，甘精胰岛素上的正电荷使甘精胰岛素的正电荷部分与靶分子络合物的负电荷部分相互作用。这导致正电荷的甘精胰岛素被吸引到负电荷的靶分子络合物。在通过脂构建体的各种脂质部分分配后，一部分带电的甘精胰岛素与脂质上的电荷缔合，并且带电的甘精胰岛素在脂质内移动，而其它带电甘精胰岛素分子被隔离在脂构建体的中心体积(core volume)内。

在溶液中的游离甘精胰岛素和与水不溶性靶分子络合物相连的甘精胰岛素之间存在平衡。因为甘精胰岛素和靶分子络合物之间相互作用涉及平衡，所以随着时间的过去，游离甘精胰岛素能进一步结合并分配入脂结构域和/或水不溶性靶分子络合物的中心体积。在一实施方式中，通过吸附到与水不溶性靶分子络合物平衡的各个脂质分子之上，或者与其反应，游离甘精胰岛素可被转化为短时脂质衍生物(transitory lipid derivatives)。这些衍生物与水不溶性靶分子络合物的脂质相连接，并且进入该络合物的中心体积，因此影响该产品的药理学活性。

通过将带电有机分子结合到胰岛素而改变等电点的胰岛素，可被引入脂构建体。在一实施方式中，重组人鱼精蛋白锌胰岛素被引入靶分子络合物，其含有脂质和通过将桥连蛋白与络合剂络合所形成的多个连接的独立单元。

在图12中，提供了重组人鱼精蛋白锌胰岛素和鱼精蛋白的结构。重组人鱼精蛋白锌胰岛素与人胰岛素的不同之处在于重组人胰岛素已经用鱼精蛋白处理，以便鱼精蛋白在胰岛素上形成包覆。重组人鱼精蛋白锌胰岛素的等电点(pH7.2)比人胰岛素(pH 5.3)高，因为将鱼精蛋白加入到重组人鱼精蛋白锌胰岛素增高了该蛋白的等电点。更高的等电点使重组人鱼精蛋白锌胰岛素在生理pH下，保持不可溶。市场上的Humulin NPH胰岛素产品目前以乳状悬浮液存在，其中重组人鱼精蛋白锌胰岛素位于小瓶的底部。

在一实施方式中，药物组合物包含游离重组人鱼精蛋白锌胰岛素和游离重组人普通胰岛素以及与水不溶性靶分子络合物相连的重组人鱼精蛋白锌胰岛素和重组人普通胰岛素的混合物。游离重组人鱼精蛋白锌胰岛素是在图12中描述的材料。游离重组人鱼精蛋白锌胰岛不与靶分子络合物相连接并且在大约7.2的生理pH——NPH胰岛素的等电点下，是不可溶的。重组人普通胰岛素在pH 7.2是可溶的。

对于每一种胰岛素，在溶液或悬浮液中游离形式的胰岛素和与水不溶性靶分子络合物连接形式的胰岛素之间存在平衡。因为每种形式的胰岛素和靶分子络合物之间的相互作用涉及平衡，所以随着时间的过去，游离形式的胰岛素结合并分配入脂结构域和/或水不溶性靶分子络合物的中心体积。在一实施方式中，通过吸附到与水不溶性靶分子络合物平衡的各个脂质分子之上，或者与其反应，游离重组人鱼精蛋白锌胰岛素和重组人普通胰岛素可被转化为短时脂质衍生物。这些衍生物与水不溶性靶分子络合物的脂质相连接，并且进入该络合物的中心体积，因此影响该产品的药理学活性。

发明描述-制造脂构建体的方法

图14表示制造含有两亲脂质、延伸两亲脂质和胰岛素的脂构建体的方法的概要。组合物的制造包括三个总步骤：制备两亲脂质和延伸两亲脂质的混合物、从两亲脂质和延伸两亲脂质的混合物制备脂构建体、以及将胰岛素结合到脂构建体。

通过本文公开的方法和在美国专利第4,946,787、4,603,044、和5,104,661号以及它们引用的参考文献中描述的那些方法，制造和装载脂质。一般地，本发明的含水脂构建体制剂按重量计包括水溶液中0.1％到10％的活性剂(即1-10mg药物/ml)，和按重量计0.1％到4％的脂质，任选地，包括盐和缓冲液，其量使得体积为100％。优选地为含有0.1％到5％活性剂的制剂。最优选地为含有按重量计0.01％到5％活性剂和按重量计可达2％的脂质成分的制剂，其在量足以(q.s.)得到按体积计100％的水溶液中。

在一实施方式中，通过下述方法制备脂构建体。在有机溶剂体系中，将各个脂质组分混合在一起，这里溶剂已通过分子筛干燥大约两个小时，以除去任何可能已存在于溶剂中的残留水分。在一实施方式中，溶剂体系包含体积比2∶1的氯仿和甲醇的混合物。也可使用可很容易从干燥脂质的混合物中去除的其它有机溶剂。在最初混合步骤中，使用单步添加脂质成分消除了引入任何另外的偶联反应的需要，这样将不必使脂构建体的结构复杂化而且不需要另外的分离步骤。将脂质成分和肝细胞受体结合分子在溶剂中溶解，然后在高真空下除去溶剂，直到干燥脂质混合物形成。在一实施方式中，在真空中使用旋转蒸发器或其它本领域已知的方法，在大约60℃下缓慢转动大约2小时除去溶剂。该脂质混合物可被储藏以进一步使用或者直接使用。

从多种两亲脂质和延伸两亲脂质的干燥混合物制备脂构建体。将干燥的脂质混合物加入到适当量的水缓冲介质中，然后使混合物旋涡振荡以形成均匀的悬浮液。然后加热脂质混合物，并且在干燥氮气氛中在大约80℃下混合大约30分钟。立刻，将加热过的均匀悬浮液转移到被预热到大约70℃的微流化床装置(micro-fluidizer)中。将悬浮液通过微流化床装置。悬浮液可以需要另外通过微流化床设备以得到均匀脂质微悬浮液。在一实施方式中，使用型号#M-110 EHI的微流化床装置，这里第一次通过的压力大约是9,000 psig。可能需要脂质悬浮液第二次通过微流化床装置，以产生展示出均匀脂质微悬浮液的性能的产品。这种产品在结构和形态上被定义为含有肝细胞受体结合分子的三维脂构建体。

使用两种方法之一，将胰岛素装载入脂构建体：平衡装载和非平衡装载。当将胰岛素加入到脂构建体的悬浮液中时，胰岛素的平衡装载开始。随时间的过去，胰岛素分子移入和移出脂构建体。通过分配平衡控制移动，这里在最初将胰岛素引入悬浮液之后，胰岛素移入脂构建体。

将胰岛素非平衡装载入脂构建体使胰岛素局限于脂构建体内部。在将游离胰岛素平衡装载入脂构建体后，除去含有游离胰岛素的体相介质。非平衡装载过程是方向驱动(vector-driven)过程，其在外部体相介质被除去的时刻开始。当已除去含有胰岛素的水相时，胰岛素移出脂构建体的梯度势被消除。总过程导致最终脂构建体中更大的胰岛素浓度，这是因为消除了从构建体内移出胰岛素。胰岛素的平衡装载是时间依赖性的现象，而非平衡装载过程实际上是瞬时的。多种方法可起始非平衡装载，其中溶液中的材料从脂构建体被分离。这类方法的实例包括但不限于：过滤、离心超滤(centricon filtration)、离心、分批式(batch style)亲和层析法、链霉抗生物素琼脂糖亲和-凝胶层析法(streptavidin agarose affinity-gelchromatography)或者分批式离子交换层析法。可以使用任何可消除胰岛素扩散和渗漏的梯度势并使得胰岛素保留在脂构建体内的方法。

当使用分批式层析法的时候，亲和或离子交换凝胶与胰岛素和构建体的混合物迅速混合。结合到层析介质快速发生，并且通过倾析水相或通过使用经典过滤技术例如使用滤纸和布氏漏斗，从水介质中除去层析介质。

脂构建体含有不连续量的装载的胰岛素，所述胰岛素不但位于脂构建体内部，而且位于脂构建体表面中和表面上。产生的脂构建体是新颖和新型的物质组合物，并且作为非平衡装载的结果，其成为用于输送有效量胰岛素的组合物。将胰岛素装载入该脂构建体和随后除去体相胰岛素，通过缩短用去除去外部相介质的所需时间，导致脂构建体内高浓度的胰岛素。使用时间-依赖性方法，例如离子交换法或凝胶过滤层析法，很难达到这种将胰岛素装载入构建体的水平，因为这些方法需要持续输入包含高浓度胰岛素的缓冲液。例如，使用小型柱层析法将胰岛素装载入构建体，需要大约20分钟以从含有胰岛素的构建体除去含有胰岛素的外部体相介质。在这段时间期间通过从构建体移出胰岛素，重建平衡条件。在脂构建体内和脂构建体上保持高浓度的胰岛素是使用非平衡装载的一个积极的益处。

在非平衡装载方法的扩展中，在将胰岛素装载入脂构建体的步骤期间，在胰岛素已经经过平衡装载之后，但是在非平衡装载过程开始之前，将邻苯二甲酸醋酸纤维素加入到脂构建体。胰岛素分子的性质和结构使其插入脂构建体，其中胰岛素被分散到整个脂构建体。胰岛素的亲水部分以及支链复合糖和另外的官能团，从脂构建体的表面伸入体相介质。在脂构建体表面，这些延伸的胰岛素亲水部分可参与到与邻苯二甲酸醋酸纤维素的羟基、羧基和羰基官能度的氢键合、偶极-偶极和离子-偶极相互作用中，如图9所阐述。邻苯二甲酸醋酸纤维素提供与脂构建体分子结合的独特方式，以提供保护脂构建体内容物免受胃消化环境影响的良好防护罩。胃消化过程是由胃蛋白酶水解切割蛋白质底物和酸水解切割产生的。胃的酸性环境降解游离胰岛素，并且可水解酯键，所述酯键将酰基烃链保持在磷脂分子的甘油骨架上。水解切割也可发生在磷酸胆碱中磷酸酯官能度的任意一边上。消化系统从胃的酸性区域变成小肠的碱性区域，在那里发生胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的酶作用。氨基酸裂解酶，例如α氨基肽酶，可从N-末端降解蛋白质例如胰岛素。在脂构建体中邻苯二甲酸醋酸纤维素的存在保护胰岛素免于水解降解。当小肠的碱性环境水解降解脂构建体的邻苯二甲酸醋酸纤维素罩时，肝细胞受体结合分子可以指引构建体结合到肝细胞结合受体。尽管不希望被任何具体理论所束缚，但是在非平衡装载的终点加入邻苯二甲酸醋酸纤维素之后存在水解保护的协同作用。该保护不仅分配给胰岛素和各个脂质分子，而且分配给整个的脂构建体。这种协同作用提供了免于酶和酸水解的整体以及单独的分子保护。

在一实施方式中，使用多种方法，将邻苯二甲酸醋酸纤维素共价结合到胰岛素或脂构建体。例如，一种方法涉及使用Mannich反应，将邻苯二甲酸醋酸纤维素上的羟基与1，2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺或胰岛素分子中10个L-赖氨酸中的ε氨基上的胺官能度偶联。

在一实施方式中，在将胰岛素平衡装载入构建体期间，将邻苯二甲酸醋酸纤维素装载入脂构建体。邻苯二甲酸醋酸纤维素的羟基和羰基官能度与脂构建体中的脂质分子发生氢键合。当胰岛素在平衡条件下被装载入脂构建体而在胰岛素周围和构建体周围产生罩时，邻苯二甲酸醋酸纤维素和构建物之间的氢键同步形成。

通过将HDV-胰岛素结合到链霉抗生物素琼脂糖亚氨基生物素，将其从水介质回收和再利用。共价结合到溴化氰活化的琼脂糖的链霉抗生物素提供了在将胰岛素非平衡装载入构建体结束时从水介质中的胰岛素分离亚氨基生物素基脂构建体的方法。在一实施方式中，亚氨基生物素衍生物在脂构建体内形成磷脂部分的肝细胞受体结合部分。脂质锚定分子的水溶性部分从脂质表面延伸大约30埃，以促进磷脂部分的肝细胞受体结合部分与肝细胞受体相结合，并且帮助将脂构建体结合到链霉抗生物素。

在9.5和更大的pH值下，链霉抗生物素可逆地结合于亚氨基生物素，其中亚氨基生物素不带电的胍基官能团强烈结合到蛋白质表面以下大约9埃位置的链霉抗生物素上的四个结合位点之一。通过将构建体的水混合物的pH提高到pH9.5，从缓冲介质中除去含有亚氨基生物素的脂构建体，这种pH的提高是通过加入20mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液实现的。在这个pH，体相介质含有游离胰岛素，使用多种方法，包括但不限于过滤、离心或层析法，将该游离胰岛素回收并且与脂构建体分离。

然后，在pH9.5下混合物与链霉抗生物素琼脂糖交联珠混合，其中构建体被吸附到链霉抗生物素上。这些珠直径大约120微米，被通过过滤从溶液中分离。通过加入pH 4.5的20mM乙酸钠-乙酸缓冲液将pH从pH9.5降低到pH4.5，脂构建体从链霉抗生物素琼脂糖亲和凝胶被释放。在pH 4.5时，亚氨基生物素的胍基质子化，并且带有正电，如图10所示。通过过滤从链霉抗生物素琼脂糖珠释放和分离脂构建体。回收链霉抗生物素琼脂糖珠以另外使用。因此，游离胰岛素和链霉抗生物素琼脂糖都被保存，并且可再次使用。

在一实施方式中，当应用链霉抗生物素琼脂糖珠，用胰岛素装载亚氨基生物素或亚氨基生物胞素脂构建体时，产生了提供胰岛素延长释放的组合物。当前述构建体的pH被从pH 9.5调节到pH 4.5时，在大约pH 5.9下，胰岛素将在脂构建体内沉淀。胰岛素的等电点是pH 5.9，并且其表示胰岛素具有最低水溶解度的pH。在从pH 5.9到pH 6.7的范围内，胰岛素保持基本上不溶，并且胰岛素表现出通常被归因于粒状物质的性能。脂构建体中不溶解的胰岛素产生新型的胰岛素制剂，其当通过皮下注射或通过口服给药施用时，提供胰岛素分子的缓慢释放。当脂构建体的pH接近pH7.4时，胰岛素开始溶解。

在给药以前，脂构建体是冻干的或保存在非水环境中。在水剂型胰岛素中，将胰岛素溶液的pH保持在大约pH6.5，以便保持胰岛素的不可溶形式。当胰岛素在体内被暴露于外部pH梯度时，胰岛素被溶解并且从脂构建体中移出，因而将胰岛素提供给其它含有病毒的组织。保持在脂构建体中的胰岛素保持被指引到肝脏中肝细胞上肝细胞结合受体的能力。因此，从该特定脂构建体，产生了两种形式的胰岛素。在体内环境中，游离胰岛素和脂质连接的胰岛素以时间依赖性的方式产生。预期，脂质连接的胰岛素的溶解，如先前所描述，可被制造以在指定的缓慢释放时期释放胰岛素。对遭受糖尿病的患者，这可导致更低频率的给药方案。

在一优选的实施方式中，胰岛素分子移入脂构建体并且被隔离在装载的脂构建体的脂质结构域中。在胰岛素装载过程的最后阶段期间，当化学平衡被破坏时，使用方向驱动的过程以在一个方向移动胰岛素分子。在胰岛素装载过程的最后阶段期间，缓冲液或水介质被快速除去，以便与脂构建体连接的胰岛素分子丧失了其移入的外部介质。除去外部介质有效地结束了与脂构建体连接的胰岛素和溶解在外部介质中的胰岛素之间的平衡。这个过程被称为非平衡装载，如本文其它地方所描述。

在一实施方式中，应用平衡方法，使用胰岛素装载脂构建体，选择每微克蛋白273,000单位胰岛素的胰岛素浓度，开始装载过程。继续平衡装载，直到脂构建体对胰岛素饱和。

将胰岛素非平衡装载入脂构建体的最后步骤需要使用从含有游离胰岛素的缓冲介质中分离固体脂构建体的步骤。在一实施方式中，使用非常细的微孔合成膜的过滤过程被用来从外部介质中分离脂构建体。在另一实施方式中，装备具有100,000截留分子量的膜的适当滤器例如NanoSep滤器的离心超滤(centricon)设备被用来从含有游离胰岛素的缓冲介质中除去脂构建体。脂构建体中胰岛素的浓度被保持，因为连接的胰岛素不再与位于体相介质的游离胰岛素平衡，该体相介质已从构建体除去。在溶液中的游离胰岛素可被装载到其它脂构建体。因此，在脂构建体中浓缩胰岛素的方向驱动过程以基本时间不依赖的步骤一步实现。

在脂构建体从体相介质中分离以后，其直径大小可从大约0.0200微米到0.4000微米范围内变化。脂构建体包括不同的粒径，所述粒径通常符合高斯分布。达到目的药理学功效所需的适当大小的脂构建体可通过肝细胞结合受体从含有高斯分布粒径的脂构建体中选择。

使用微流化过程制备含有胰岛素、脂质和肝细胞受体结合分子的脂构建体，所述微流化过程提供将较大的脂构建体降解为较小的构建体的高剪切力。脂构建体的两亲脂质成分是1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、胆固醇、磷酸联十六烷酯、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(Cap生物素酰)；1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(琥珀酰)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-[磷酸-rac-(1-甘油)](钠盐)、三乙铵2，3-二乙酰氧基丙基2-(5-((3aS，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)磷酸乙酯以及它们适当的衍生物，其代表结构被描述于表1。

在一实施方式中，构建体含有靶分子络合物，其含有通过将桥连成分与络合剂络合所形成的多个连接的独立单元。典型地，通过将选定的金属化合物例如氯化铬(III)六水合物与络合剂的水缓冲溶液相组合，形成靶分子络合物。在一实施方式中，通过将络合剂例如N-(2，6-二异丙基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸溶解在水缓冲溶液例如最终pH为3.2-3.3的10mM乙酸钠缓冲液，制造络合剂的水缓冲溶液。将金属化合物过量加入——以足够与络合剂的可分离部分(isolatableportion)络合的量，并且在20℃到33℃的温度下进行反应24到96小时，或者直到所形成的络合物沉淀出水缓冲溶液。然后，分离表现聚合性能的沉淀的络合剂，以将来使用。在制备脂构建体之前，将该络合物加入到两亲脂质分子和延伸两亲脂质的混合物中。

下面给出制造胰岛素组合物的方法，其中通过改变可并入水不溶性靶分子络合物的氨基酸序列，改变胰岛素的等电点。在一实施方式中，甘精胰岛素被并入水不溶性靶分子络合物。图15表示制造游离甘精胰岛素和与水不溶性靶分子络合物结合的甘精胰岛素的混合物的方法的概要。在一实施方式中，组合物的制造包括三个总步骤：制备靶分子络合物，将该靶分子络合物并入脂构建体，以及将靶分子络合物和甘精胰岛素相结合以形成药物组合物。

靶分子络合物包含多个以聚合排列连接在一起的独立单元。每一单元包含桥连成分和络合剂。在一实施方式中，通过将选定的金属化合物例如氯化铬(III)六水合物与络合剂的水缓冲溶液相结合，形成靶分子络合物。在一实施方式中，通过将络合剂例如N-(2，6-二异丙基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸溶解在水缓冲溶液例如最终pH为3.2-3.3的10mM乙酸钠缓冲液，制造络合剂的水缓冲溶液。将金属化合物过量加入——以足够与络合剂的可分离部分络合的量，并且在大约20℃到33℃的温度下进行反应大约24到96小时，或者直到所形成的络合物沉淀出水缓冲溶液。然后，分离沉淀的络合物，以将来使用。

然后混合沉淀的络合物与选定的脂质或脂构建体的脂质，并且将其溶于有机溶剂。在一实施方式中，有机溶剂为氯仿∶甲醇(2∶1 v/v)。脂质为足够将全部或部分金属络合物溶于并引入其中的浓度。当使用高转变温度的脂质例如1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱时，保持络合物和选定的形成脂构建体的脂质的混合物于大约60℃的温度。可以使用更低的温度，这取决于选定并入脂构建体的脂质的转变温度。在真空中，通常需要30分钟到2小时的时期来干燥脂质并且从脂质基质除去任意残留有机溶剂，以便形成靶分子络合物中间体。

通过本文公开的方法和在美国专利第4,946,787、4,603,044、和5,104,661号以及它们引用的参考文献中描述的方法，制造和装载脂质。一般地，本发明的含水脂构建体制剂按重量计包括水溶液中0.1％到10％的活性剂(即1-100mg药物/ml)，和按重量计0.1％到4％的脂质，任选地，包括盐和缓冲液，其量使得体积为100％。优选地为含有0.01％到5％活性剂的制剂。最优选地为含有按重量计0.01％到5％活性剂和可达按重量计2％的脂质成分的制剂，其在量足以(q.s.)得到按体积计100％的水溶液中。

在一实施方式中，在靶分子络合物和用于注射的水USP的悬浮液的pH被从约pH 4.89±0.2调节到5.27±0.5之后，将甘精胰岛素装载入靶分子络合物。甘精胰岛素溶液的pH被从pH 3.88±0.2调节到大约pH 4.78±0.5，然后加入水不溶性靶分子络合物。所形成的组合物是游离甘精胰岛素和与水不溶性靶分子络合物连接的甘精胰岛素的混合物。部分甘精胰岛素与脂构建体基质相连接或捕获在脂构建体的中心体积内。该药物组合物也被称为HDV-甘精。在一实施方式中，将等分部分的靶分子络合物引入含有100国际单位胰岛素/ml的一小瓶甘精胰岛素中，以提供含有游离甘精胰岛素和与靶分子络合物相连接的甘精胰岛素的肝细胞特异性输送系统。

通过下述方法，制备组合了游离甘精胰岛素和与水不溶性靶分子络合物相连接的甘精胰岛素的药物组合物。用于注射的无菌水(Sterile Water forInjection)USP样品的pH被调节到pH 3.95±0.2。取出等分部分的HDV悬浮液，并且用一系列的步骤调节其pH，直到最终pH为5.2±0.5。在pH 3.95±0.2下，将等分部分的用于注射的无菌水USP与靶分子络合物的悬浮液混合。所形成的悬浮液的pH是4.89±0.2。然后将该悬浮液的pH调节到5.27±0.5。将等分部分的甘精胰岛素的pH从pH 3.88±0.2调节到pH 4.78±0.5。然后，在pH 5.20±0.5下，将该溶液加入到靶分子络合物的悬浮液。所形成的药物组合物是游离甘精胰岛素和与水不溶性靶分子络合物相连的甘精胰岛素的混合物。该药物组合物也被称为HDV-甘精。

下面给出制造胰岛素组合物的方法，其中通过将带电有机分子结合到可被并入水不溶性靶分子络合物的胰岛素，改变胰岛素的等电点。在一实施方式中，重组人鱼精蛋白锌胰岛素被并入水不溶性靶分子络合物。图16表示制造游离重组人鱼精蛋白锌胰岛素、游离重组人普通胰岛素以及与水不溶性靶分子络合物结合的重组人鱼精蛋白锌胰岛素和重组人普通胰岛素混合物的方法的概要。在一实施方式中，组合物的制造包括三个总步骤：制备靶分子络合物，将该靶分子络合物并入含有游离和相连的重组人普通胰岛素的脂构建体，以及将靶分子络合物与游离和相连的重组人鱼精蛋白锌胰岛素相结合以形成药物组合物。

靶分子络合物包含以聚合排列连接在一起的多个独立单元。每一单元包含桥连成分和络合剂。在一实施方式中，通过将选定的金属化合物例如氯化铬(III)六水合物与络合剂的水缓冲溶液相结合，形成靶分子络合物。在一实施方式中，通过将络合剂例如N-(2，6-二异丙基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸溶解在水缓冲溶液例如最终pH为3.2-3.3的10mM乙酸钠缓冲液，制造络合剂的水缓冲溶液。将金属化合物过量加入——以足够与络合剂的可分离部分络合的量，并且在大约20℃到33℃的温度下进行反应大约24到96小时，或者直到所形成的络合物沉淀出水缓冲溶液。然后，分离沉淀的络合物，以将来使用。

然后混合沉淀的络合物与选定的脂质或脂构建体的脂质，并且将其溶于有机溶剂。在一实施方式中，有机溶剂为氯仿∶甲醇(2∶1 v/v)。脂质为足够将全部或部分金属络合物溶于并引入其中的浓度。当使用高转变温度的脂质例如1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱时，保持络合物和选定的形成脂构建体的脂质的混合物于大约60℃的温度。可以使用更低的温度，这取决于选定并入脂构建体的脂质的转变温度。在真空中，通常需要30分钟到2小时的时期来干燥脂质并且从脂质基质除去任意残留有机溶剂，以便形成靶分子络合物中间体。

通过本文公开的方法和在美国专利第4,946,787、4,603,044、和5,104,661号以及它们引用的参考文献中描述的方法，制造和装载脂质。一般地，本发明的含水脂构建体制剂按重量计包括水溶液中0.1％到10％的活性剂(即1-100mg药物/ml)，和按重量计0.1％到4％的脂质，任选地，包括盐和缓冲液，其量使得体积为100％。优选地为含有0.01％到5％活性剂的制剂。最优选地为含有按重量计0.01％到5％活性剂和可达按重量计2％的脂质成分的制剂，其在量足以(q.s.)得到按体积计100％的水溶液中。

在一实施方式中，将Humulin NPH胰岛素加入到先前形成的重组人普通胰岛素和脂构建体的混合物中。所形成的组合物是游离重组人普通胰岛素和游离重组人鱼精蛋白锌胰岛素的混合物。同样地，部分重组人普通胰岛素和重组人鱼精蛋白锌胰岛素与脂构建体基质相连接或捕获在脂构建体的中心体积内。该药物组合物也被称为HDV-NPH胰岛素。在一实施方式中，将等分部分的靶分子络合物引入一小瓶重组人鱼精蛋白锌胰岛素中，以提供含有游离重组人鱼精蛋白锌胰岛素和与靶分子络合物相连接的重组人鱼精蛋白锌胰岛素的肝细胞特异性输运系统。在一实施方式中，重组人鱼精蛋白锌胰岛素可与其它形式的胰岛素相组合，例如速效Humalog胰岛素和Novolog胰岛素，短效Regular

胰岛素，中效Lente胰岛素和长效Ultralente胰岛素和Lantus胰岛素，或者胰岛素的预混组合。可将等分部分的重组人鱼精蛋白锌胰岛素加入到与非重组人鱼精蛋白锌胰岛素结合的靶分子络合物的混合物。

发明描述-使用方法

将有效量的含有两亲脂质、延伸两亲脂质和胰岛素的肝细胞靶向脂构建体施用给I型或II型糖尿病患者。当将该组合物皮下施用时，一部分组合物进入循环系统，其中组合物被运输到肝脏和其它区域，在那里延伸两亲脂质将脂构建体结合到肝细胞受体。一部分施用的组合物在体内暴露于外部的梯度，在那里胰岛素能被溶解，然后从脂构建体移出，从而将胰岛素供给肌肉和脂肪组织。保留在脂构建体中的胰岛素保持被指引到肝脏中肝细胞上的肝细胞结合受体的能力。因此，从该特定的脂构建体产生两种形式的胰岛素。在体内环境中，游离和脂质连接的胰岛素以时间依赖性的方式产生。

本发明的脂构建体结构提供了有用的药剂，其用于将胰岛素施用给宿主的药物应用。因此，本发明的结构可用作与药学可接受载体联合的药物组合物。施用本文描述的结构可通过施用期望被施用的胰岛素的任何可接受的方式。这些方法包括经口、肠胃外、鼻和其它系统或气溶胶形式。

经口施用含有与靶分子络合物连接的胰岛素的药物组合物，然后通过肠吸收与靶分子络合物相连的胰岛素，进入身体的循环系统，在那里胰岛素也暴露于血液的生理pH。将脂构建体靶向输运到肝脏。在一实施方式中，构建体中邻苯二甲酸醋酸纤维素的存在保护脂构建体。在经口施用的情况下，被保护的脂构建体横穿口腔，穿过胃部，并且移入小肠，这里小肠的碱性pH降解邻苯二甲酸醋酸纤维素保护罩。去掉保护的脂构建体被吸收入循环系统。这样能使脂构建体输送到肝脏的窦状隙。受体结合分子例如1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(Cap生物素酰)或其它前述的肝细胞特异性分子，提供将脂构建体结合到受体的手段，然后肝细胞将其内吞或胞饮(engulfe or endocytose)。然后从脂构建体释放胰岛素，其中在得以进入细胞内环境后，其施行其作为药剂控制糖尿病的指定功能。

施用的胰岛素的量将取决于被治疗的对象、病痛的类型和严重性、给药方式和处方医生的判断。尽管对于具体目标生物活性物质的有效剂量的范围取决于多种因素，并且通常对本领域普通技术人员是已知的，但仍一般性地规定了一些剂量指导。对于大多的给药方式，将脂质成分悬浮于水溶液中，并且通常不超过总制剂的4.0％(w/v)。制剂的药物成分最可能在药剂的20％(w/v)以下，并且通常在0.01％(w/v)以上。

下面给出施用胰岛素组合物的方法，在其中通过改变可并入水不溶性靶分子络合物的氨基酸序列，改变胰岛素的等电点。在一实施方式中，将有效量的含有游离甘精胰岛素和与水不溶性靶分子络合物相连的甘精胰岛素的混合物的肝细胞靶向脂构建体施用给I型或II型糖尿病患者。在一实施方式中，甘精胰岛素可与其它形式的胰岛素组合，所述其它形式的胰岛素例如赖脯胰岛素、门冬胰岛素、普通胰岛素、锌胰岛素、人长效锌胰岛素、鱼精蛋白锌胰岛素、人缓冲普通胰岛素、谷赖胰岛素、重组人普通胰岛素、重组人鱼精蛋白锌胰岛素、任意上述胰岛素的预混组合、它们的衍生物和任意上述胰岛素的组合。在一实施方式中，可通过皮下或经口途径施用组合物。

本发明的脂构建体结构提供了用于将胰岛素施用给宿主的药物应用的可用药剂。因此，本发明的结构可用作与药物可接受载体结合的药物组合物。施用本文描述的结构可通过施用期望被施用的胰岛素的任何可接受的方式。这些方法包括经口、肠胃外、鼻和其它系统或气溶胶形式。

在通过皮下注射将组合物施用给患者之后，在注射区域的原位生理环境、游离甘精胰岛素和与水不溶性靶分子络合物连接的甘精胰岛素的形态学和化学结构开始变化。在用生理介质稀释后，随着游离甘精胰岛素和与水不溶性靶分子络合物连接的甘精胰岛素周围环境的pH增加，pH达到甘精胰岛素的等电点，这里对于游离甘精胰岛素和与靶分子络合物连接的甘精胰岛素，絮凝、聚集和沉淀反应都发生。在游离甘精胰岛素和与靶分子络合物连接的甘精胰岛素之间这些过程发生的速率不同。游离甘精胰岛素直接暴露于pH变化和稀释。与水不溶性靶分子络合物连接的甘精胰岛素暴露于较小的pH变化和在生理pH下的稀释被延迟了，这是由于生理流体或介质需要时间来扩散穿过水不溶性靶分子络合物的脂双层。胰岛素从脂构建体的的延迟释放以及在沉淀的游离甘精基质内具有连接的胰岛素的脂构建体的延迟释放是本发明的实质特征，因为其影响和扩大了体内生物和药理学反应。

经口施用组合了游离甘精胰岛素和与靶分子络合物连接的甘精胰岛素的药物组合物，然后通过肠吸收与靶分子络合物相连的甘精胰岛素进入身体的循环系统，这里胰岛素也暴露于血液的生理pH。所有或部分脂构建体被输运到肝脏。

当在皮下间隙(subcutaneous space)中或在进入循环系统后生理稀释被原位增加时，游离甘精胰岛素和与靶分子络合物连接的甘精胰岛素遇到pH 7.4的正常生理pH。结果，游离甘精胰岛素从注射时的可溶形式变为在其pH 5.8-6.2的等电点的pH附近下的不可溶形式，然后在生理pH下变为可溶形式。在可溶形式中，甘精胰岛素穿过机体到达它能诱导出药理学应答的部位。与水不溶性靶分子络合物连接的甘精胰岛素变为溶解的，并且以比游离甘精胰岛素慢的不同速率从络合物上释放。这是因为在与水不溶性靶分子络合物连接的甘精胰岛素与体相介质相接触之前，其必须横穿中心体积和水不溶性靶分子络合物的脂质结构域。

施用的甘精胰岛素的量将取决于被治疗的对象、病痛的类型和严重性、给药方式和处方医生的判断。尽管对于具体目标生物活性物质的有效剂量的范围取决于多种因素，并且通常对本领域普通技术人员是已知的，但仍一般性地规定了一些剂量指导。对于大多数的给药方式，将脂质成分悬浮于水溶液中，并且通常不超过总制剂的4.0％(w/v)。制剂的药物成分最可能在药剂的20％(w/v)以下，并且通常在0.01％(w/v)以上。

下面给出施用胰岛素组合物的方法，在其中通过将带电有机分子结合到可被并入水不溶性靶分子络合物的胰岛素，改变胰岛素的等电点。在一实施方式中，将有效量的肝细胞靶向脂构建体施用给I型或II型糖尿病患者，所述肝细胞靶向脂构建体含有游离重组人鱼精蛋白锌胰岛素和游离重组人普通胰岛素以及与水不溶性靶分子络合物相连的重组人鱼精蛋白锌胰岛素和重组人普通胰岛素的混合物。在一实施方式中，重组人鱼精蛋白锌胰岛素可与其它形式的胰岛素组合，所述其它形式的胰岛素例如赖脯胰岛素、门冬胰岛素、普通胰岛素、甘精胰岛素、锌胰岛素、人长效锌胰岛素、鱼精蛋白锌胰岛素、人缓冲普通胰岛素、谷赖胰岛素、重组人普通胰岛素、重组人鱼精蛋白锌胰岛素或任意上述胰岛素的预混组合、它们的衍生物和任意上述胰岛素的组合。

本发明的脂构建体结构提供用于将胰岛素施用给宿主的药物应用的可用药剂。因此，本发明的结构可用作与药物可接受载体结合的药物组合物。施用本文描述的结构可通过施用期望被施用的胰岛素的任何可接受的方式。这些方法包括经口、肠胃外、鼻和其它系统或气溶胶形式。

在通过皮下注射将组合物施用给患者之后，在注射区域的原位生理环境、游离重组人鱼精蛋白锌胰岛素和与水不溶性靶分子络合物连接的重组人鱼精蛋白锌胰岛素的形态学和化学结构开始变化。当游离重组人鱼精蛋白锌胰岛素和与水不溶性靶分子络合物连接的重组人鱼精蛋白锌胰岛素周围环境的pH用生理介质稀释，两种胰岛素都发生一些溶解。溶解和平衡条件的结果是，重组人鱼精蛋白锌胰岛素可与靶分子络合物连接。游离重组人鱼精蛋白锌胰岛素和与靶分子络合物连接的重组人鱼精蛋白锌胰岛素之间这些平衡过程发生的速率不同。游离重组人鱼精蛋白锌胰岛素直接暴露于的较小的pH变化和生理稀释。与靶分子络合物连接的重组人鱼精蛋白锌胰岛素暴露于较小的pH变化和在生理pH下的稀释被延迟了，这是由于生理流体或介质需要时间来扩散穿过水不溶性靶分子络合物的脂双层。从脂构建体释放胰岛素的延迟以及存在于沉淀的游离重组人鱼精蛋白锌胰岛素基质内的脂构建体的延迟释放是本发明的本质发现，因为其影响和扩大了体内生物学和药理学反应。

经口施用组合了游离重组人鱼精蛋白锌胰岛素和与靶分子络合物连接的重组人鱼精蛋白锌胰岛素的药物组合物，然后通过肠吸收与靶分子络合物相连的重组人鱼精蛋白锌胰岛素进入身体的循环系统，这里胰岛素也暴露于血液的生理pH。所有或部分脂构建体被输运到肝脏。

当在皮下间隙中或在进入循环系统后生理稀释被原位增加时，游离重组人鱼精蛋白锌胰岛素和与靶分子络合物连接的重组人鱼精蛋白锌胰岛素遇到pH7.4的正常生理pH环境。稀释的结果是，游离重组人鱼精蛋白锌胰岛素从注射时的不可溶形式变为生理pH下的可溶形式。在可溶形式中，重组人鱼精蛋白锌胰岛素穿过机体到达其能诱导出药理学应答的位置。与水不溶性靶分子络合物连接的重组人鱼精蛋白锌胰岛素变为溶解的，并且以比游离重组人鱼精蛋白锌胰岛素慢的不同速率从络合物上释放。这是因为在与水不溶性靶分子络合物连接的重组人鱼精蛋白锌胰岛素与体相介质接触之前，其必须横穿中心体积和水不溶性靶分子络合物的脂质结构域。

本发明的脂构建体结构提供将重组人鱼精蛋白锌胰岛素施用给宿主的药物应用的可用药剂。因此，本发明的结构可用作与制药上可接受载体结合的药物组合物。施用本文描述的结构可通过施用期望被施用的人重组鱼精蛋白锌胰岛素的任何可接受的方式进行。这些方法包括经口、肠胃外、经鼻和其它系统性或气溶胶形式。

施用的重组人鱼精蛋白锌胰岛素和重组人普通胰岛素的量将取决于被治疗的对象、病痛的类型和严重性、给药方式和处方医生的判断。尽管对于具体目标生物活性物质的有效剂量范围取决于多种因素，并且通常对本领域普通技术人员是已知的，但仍一般性地规定了一些剂量指导。对于大多的给药方式，将脂质成分悬浮于水溶液中，并且通常不超过总药剂的4.0％(w/v)。药剂的药物成分最可能在药剂的20％(w/v)以下，并且通常在0.01％(w/v)以上。

施用的胰岛素的量将取决于被治疗的对象、病痛的类型和严重性、给药方式和处方医生的判断。尽管对于具体目标生物活性物质的有效剂量范围取决于多种因素，并且通常对本领域普通技术人员是已知的，但仍一般性地规定了一些剂量指导。对于大多的给药方式，将脂质成分悬浮于水溶液中，并且通常不超过总药剂的4.0％(w/v)。药剂的药物成分最可能在药剂的20％(w/v)以下，并且通常在0.01％(w/v)以上。

可以制备剂型或组合物，该剂型或组合物含有0.005％到5％范围内的活性成分，余量由非毒性载体组成。

这些制剂的精确组成可依赖于正被讨论的药物的具体特性广泛变化。然而，它们通常包含0.01％到5％活性成分，优选地，对于高效能药物包含0.05％到1％的活性成分，以及对于中等活性药物，包含2％到4％的活性成分。

包含在这类肠胃外组合物中的活性成分的百分比高度依赖于其具体性能以及活性成分的活性和对象的需要。然而，溶液中0.01％到5％的活性成分百分比是可以使用的，如果组合物是随后将被稀释到上述百分比的固体，活性成分的百分比更高。优选地，组合物将包括溶液中的0.2％到2.0％的活性成分。

可通过任何在药理学领域已知的方法或今后发展的方法，制备本文描述的药物组合物制剂。通常而言，这类制备方法包括使活性成分与载体或一种或多种其它成分相关联的步骤，然后，如果需要或期望，将产品成形或包装成期望的单剂量或多剂量单元。

尽管本文提供的药物组合物的描述主要涉及适合凭处方施用给人的药物组合物，但是技术人员理解，这类组合物通常适合于施用给各种动物。修改适合施用给人的药物组合物以便使该组合物适合施用给各种动物是很好理解的，普通有技术的兽医药理学家可以用仅仅普通的实验——如果有的话，设计和实施这类修改。考虑来向其施用本发明的药物组合物的对象，包括但不限于人和其它灵长类动物、哺乳动物，所述哺乳动物包括商业相关的哺乳动物例如牛、猪、马、羊、猫和狗。

适用于本发明的方法的药物组合物可以以适合于经口、肠胃外、肺部、鼻内、口腔或其它给药途径的剂型被制备、包装或出售。

本发明的药物组合物可以以大批或单一单位剂量或多个单一单位剂量的形式被制备、包装或出售。如本文使用的，“单位剂量(unit dose)”是不连续量的药物组合物，其包括预先确定量的活性成分。活性成分的量通常等于将被施用给对象的活性成分的剂量或者该剂量的实用小部分(convenient fraction)，例如该剂量的一半或三分之一。然而，输送本发明提出的活性剂，可以低至正常施用剂量的1/10、1/100或1/1000或者在正常施用剂量以下，这是因为胰岛素治疗剂的靶向性能。

本发明的药物组合物的活性成分、药学可接受载体和任意另外成分的相对量依赖于被治疗对象的特征、大小(或身材)和症状，并且进一步依赖于施用组合物的途径而变化。作为实例，组合物可包括0.1％和100％(w/w)之间的活性成分。

适用于经口施用的本发明的药物组合物的制剂可以以不连续固体剂量单元的形式制备、包装或出售，所述固体剂量单元包括但不限于片剂、硬或软胶囊、扁囊剂、含片或锭剂，每一个含有预先确定量的活性成分。其它适用于经口施用的制剂包括但不限于粉末或颗粒制剂、水性或油状悬浮液、水性或油状溶液或者乳浊液。

如本文使用的，“油状”液是包括含碳液体分子的液体，并且表现比水极性更低的特性。

例如，可通过将活性成分压片或模压制备包括活性成分的片剂，任选的带有一种或多种另外的成分。在适当的设备上，通过以自由流动形式例如粉末或颗粒制剂将活性成分——其任选与一种或多种粘合剂、润滑剂、赋形剂、表面活性剂和分散剂相混合——压片，制备压制片剂。在适当的设备上，通过模压活性成分、药学可接受载体和至少足够润湿该混合物的液体的混合物，制备模压片剂。用于制造片剂的药学可接受赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、粒化和崩解剂、粘合剂和润滑剂。已知的分散剂包括但不限于马铃薯淀粉和羟基乙酸淀粉钠。已知的表面活性剂包括但不限于十二烷基硫酸钠。已知的稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、乳糖、微晶纤维素、磷酸钙、磷酸氢钙和磷酸钠。已知的粒化和崩解剂包括但不限于玉米淀粉和褐藻酸。已知的粘合剂包括但不限于明胶、阿拉伯树胶、预糊化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和羟丙基甲基纤维素。已知的润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、硅石和滑石。

片剂可以是非包衣的，或者可以使用已知的方法对片剂包衣，以达到在对象胃肠道中的延迟崩解，从而提供活性成分的持续释放和吸收。作为实例，可使用材料例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯来包衣片剂。进一步作为实例，可以使用在美国专利号4,256,108、4,160,452和4,265,874中描述的方法包衣片剂，以形成渗透控制的释放片剂。片剂可进一步包括增甜剂、调味剂、着色剂、防腐剂或它们的一些的组合，以便提供药学上精致和美味的制剂。

使用生理可降解的组合物例如明胶，可制备含有活性成分的硬胶囊。这类硬胶囊含有活性成分，并且可进一步含有另外的成分，所述成分包括例如惰性固体稀释剂如碳酸钙、磷酸钙、高岭土或邻苯二甲酸醋酸纤维素。

使用生理可降解的组合物例如明胶，可制备含有活性成分的软胶囊。这类软胶囊含有活性成分，其可与水或油介质如花生油、液体石蜡或橄榄油相混合。

适用于经口施用的本发明的药物组合物的液体制剂可以以液体形式或者拟在使用前与水或其它适合的载体重构的干燥产品的形式进行制备、包装和出售。

使用传统的方法可制备液体悬浮液，以获得水性或油状载体中活性成分的悬浮液。水性载体包括，例如水和等渗盐。油状载体包括，例如杏仁油、油酯、乙醇、植物油如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油、分馏的植物油、以及矿物油如液体石蜡。液体悬浮液可进一步包括一种或多种另外的成分，其包括但不限于悬浮剂、分散剂或润湿剂、乳化剂、润药、防腐剂、缓冲液、盐、调味剂、着色剂和增甜剂。油状悬浮液可进一步包括增稠剂。已知的悬浮剂包括但不限于山梨醇糖浆、氢化可食用脂肪、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、龙须胶、阿拉伯树胶和纤维素衍生物如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素。已知的分散剂或润湿剂包括但不限于天然发生的磷脂如卵磷脂、烯化氧与脂肪酸、长链脂肪醇、从脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯或者从脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的缩聚产物(例如，分别为聚氧乙烯硬脂酸酯、十七乙烯氧基十六醇(heptadecaethyleneoxycetanol)、聚氧乙烯山梨醇单油酸酯和聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)。已知的乳化剂包括但不限于卵磷脂和阿拉伯树胶。已知的防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯、抗坏血酸和山梨酸。已知的增甜剂的实例包括甘油、丙二醇、山梨醇、蔗糖和糖精。已知的油状悬浮液的增稠剂包括，例如蜂蜡、硬石蜡和十六醇。

可用与液体悬浮液基本相同的方式制备水性或油状溶剂中的活性成分的液体溶液，主要的差异是溶解活性成分而不是将其悬浮于溶剂中。本发明的药物组合物的液体溶液可包含对应于液体悬浮液描述的每一成分，可以理解，将不需要悬浮剂帮助活性成分溶解于溶剂中。水性溶剂包括例如水和等渗盐。油状溶剂包括，例如杏仁油、油酯、乙醇、植物油如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油、分馏的植物油和矿物油如液体石蜡。

使用已知的方法，可制备本发明药物制剂的粉末和颗粒制剂。这类制剂可直接施用给对象，例如用来形成片剂、填充胶囊或通过向其中加入水性或油状载体制备水性或油状悬浮液或溶液。每一个这些制剂可进一步包括分散剂或润湿剂、悬浮剂和防腐剂中的一种或多种。另外的赋形剂例如填料和增甜剂、调味剂或着色剂也可被包括在这些制剂中。

本发明的药物组合物也可以以水包油乳液或油包水乳液的形式进行制备、包装或出售。油相可以是植物油如橄榄油或花生油、矿物油如液体石蜡或者这些的组合。这些组合物可进一步包括一种或多种乳化剂，例如天然发生的树胶如阿拉伯树胶或龙须胶、天然发生的磷脂如大豆磷脂或卵磷脂、从脂肪酸和己糖醇酐的组合衍生的酯或偏酯如山梨聚糖单油酸酯以及这些偏酯和氧乙烯的缩聚产物如聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯。这些乳液也可包括另外的成分，其包括例如增甜剂或调味剂。

如本文使用的，药物组合物的“肠胃外施用”包括以物理破裂对象组织和通过组织中的裂口施用药物组合物为特征的任何施用途径。因此，肠胃外施用包括但不限于通过注射组合物施用药物组合物、通过外科切口应用组合物、通过组织穿透性非外科创伤应用组合物和类似方法。具体而言，被考虑的肠胃外施用包括但不限于皮下注射、腹膜内注射、肌内注射、胸骨内注射和肾透析灌流技术。

适用于肠胃外施用的药物组合物制剂包括与药学上可接受载体如无菌水或无菌等渗盐组合的活性成分。这类制剂可以以适合快速施用或连续施用的形式进行制备、包装或出售。可以以单位剂量形式例如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中，制备、包装或出售可注射制剂。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于油状或水性载体中的悬浮液、溶液、乳状液，糊剂和可植入持续释放或可生物降解的制剂。这类制剂可进一步包括一种或多种另外的成分，其包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在肠胃外施用制剂的一个实施方式中，提供了干燥形式(即粉末或颗粒)的活性成分，其与适当载体(例如无菌无致热原的水)重构，然后肠胃外施用该重构的组合物。

可以以无菌可注射的水性或油状悬浮液或溶液的形式制备、包装或出售药物组合物。可以根据已知技术配制悬浮液或溶液，并且除了所述活性成分之外，该悬浮液或溶液可包含另外的成分，如本文描述的分散剂、润湿剂、或悬浮剂。例如，可使用非毒性肠胃外可接受稀释液或溶剂如水或1，3-丁二醇，制备这类无菌可注射制剂。其它可接受稀释液和溶剂包括但不限于林格溶液、等渗氯化钠溶液和固定油类例如合成的甘油一酯或甘油二酯。其它可用的肠胃外可施用的制剂包括包含微晶型的、在脂构建体制剂中的、或作为可生物降解的聚合物体系成分的活性成分的那些制剂。用于持续释放或植入的组合物可包括药学上可接受的聚合或疏水材料例如乳剂、离子交换树脂、微溶聚合物或者微溶盐。

本发明的药物组合物可以以适合通过口腔(buccal cavity)进行肺部施用的制剂制备、包装或出售。这类制剂可包括干燥颗粒，所述干燥颗粒包含活性成分并且其具有大约0.5到大约7微米范围内的直径，优选具有大约1到大约6微米的直径。方便地，使用包含干粉储存器的装置施用这类干粉形式的组合物，其中推进剂流可被指引以将粉末分散到所述储存器，或者使用自推进溶剂/粉末-分配容器，施用这类干粉形式的组合物，所述自推进溶剂/粉末-分配容器例如在密封容器中含有溶解或悬浮于低沸点推进剂的活性成分的装置。优选地，这类粉末含有颗粒，其中按重量计至少98％的颗粒具有0.5微米以上的直径，按数量计至少95％的颗粒具有7微米以下的直径。更优选地，按重量计至少95％的颗粒具有1纳米以上的直径，按数量计至少90％的颗粒具有6微米以下的直径。干粉组合物优选包括固体细粉末稀释剂例如糖，并且被以单位剂量形式方便地提供。

低沸点推进剂一般包括大气压下具有65

以下沸点的液体推进剂。一般而言，推进剂可构成组合物的50到99.9％(w/w)，并且活性成分可构成组合物的0.1到20％(w/w)。推进剂可进一步包括另外的成分例如液体非离子或固体阴离子表面活性剂或固体稀释剂(优选地，与含有活性成分的颗粒具有相同级的粒径)。

配制用于肺部输送的本发明的药物组合物也可提供溶液或悬浮液的滴状形式的活性成分。这类制剂可作为含有活性成分的含水或稀释醇溶液或悬浮液——其任选地无菌，加以制备、包装或出售，并且使用任意雾化或喷雾仪器，可方便地施用这类制剂。这类制剂进一步包括一种或多种另外的成分，其包括但不限于调味剂如糖精钠、挥发油、缓冲剂、表面活性剂或防腐剂如羟基苯甲酸甲酯。这种施用途径提供的小滴优选具有大约0.1到大约200微米范围的平均直径。

本文描述成用于肺部输送的制剂也可用于本发明药物组合物的鼻内输送。

适用于鼻内施用的另一种制剂是包括活性成分和具有大约0.2到500微米平均粒径的粗粉。施用这类制剂以服用嗅剂的方式进行，即从放置在鼻孔附近的粉末容器中通过鼻道快速吸入。

适用于鼻内施用的制剂例如可包括从少至大约0.1％(w/w)到多至75％(w/w)的活性成分，并且可进一步包括一种或多种本文描述的另外的成分。

可以以适用于口腔施用的剂型，制备、包装或出售本发明的药物组合物。这种剂型例如可以是例如使用传统方法制造的片剂或锭剂，并且例如可以包含0.1到20％(w/w)的活性成分，余量包含经口可溶或可降解的组合物，并且任选地含有一种或多种本文描述的另外的组分。可选地，适用于口腔施用的制型可包括含有活性成分的粉末或烟雾化的或雾化的溶液或悬浮液。这些粉末的、烟雾化的或雾化的制剂当分散时，优选具有在大约0.1到大约200微米的平均粒径或小滴大小，并且可进一步包括一种或多种本文描述的另外的成分。

可以以适合于眼部施用的剂型制备、包装或出售本发明的药物组合物。这类制剂例如可以是滴眼剂形式，其包括例如水性或油状液载体中活性成分0.1％-1.0％(w/w)的溶液或悬浮液。此类滴眼剂可进一步包括缓冲剂、盐或一种或多种本文描述的另外的成分。其它可用的可眼部施用的制剂包括含有微晶形式的或在脂构建体制剂中的活性成分的那些制剂。

如本文使用的“另外的成分”包括但不限于一种或多种下述成分：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；粒化和崩解剂；粘合剂；润滑剂；增甜剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理上可降解组合物，例如明胶；水性载体和溶剂；油状载体和溶剂；悬浮剂；分散或润湿剂；乳化剂、润药；缓冲液；盐；增稠剂；填料；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；和药学上可接受的聚合材料或疏水材料。其它可包含在本发明的药物组合物中的“另外的成分”是本领域已知的，并描述在例如Genaro，ed.，1985，Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA，其通过引用并入本文。

可施用给动物——优选人——的本发明组合物中活性成分的典型剂量在1微克到大约100克/千克动物体重的范围内。然而，施用的精确剂量将根据多种因素变化，所述因素包括但不限于动物类型和被治疗的疾病状态的类型、动物的年龄和施用途径。优选地，活性成分的剂量从大约1毫克/千克动物变化到大约10克/千克动物体重体重。更优选地，剂量从大约10毫克/千克动物体重到大约1克/千克动物体重变化。

将组合物施用给动物可以以每天几次的频率，或者可以以更低的频率施用，例如一天一次、一周一次、每两周一次、一月一次或者甚至更低的频率如每隔几个月一次或甚至一年一次或更低。给药的频率对熟练的医师是十分明显的，并且取决于许多因素，所述因素例如但不限于被治疗疾病的类型和严重性、动物的类型和年龄等。

本发明也包括含有本发明组合物和描述将组合物施用给哺乳动物组织的说明性材料的试剂盒。在另一实施方式中，该试剂盒包括在将本发明组合物施用给哺乳动物之前适用于溶解或悬浮该组合物的(优选无菌的)溶剂。

如本文使用的，“说明性材料”包括出版物、记录媒介、图表、或可用于传达试剂盒中本发明的蛋白质在实现减轻本文描述的各种疾病或紊乱的有用性的任何其它表达媒介。任选地或可选地，说明性材料可以描述一种或多种缓解哺乳动物细胞或组织中疾病或紊乱的方法。本发明试剂盒的说明性材料可以，例如，附于含有本发明的成分的容器中，或者与含有本发明成分的容器一起运输。可选地，说明性材料可以与容器分开运输，目的是接受者协同使用说明性材料和化合物。

可将用于实践本发明的药物组合物施用，以输送与胰岛素的标准剂量相等的剂量。

尽管本文提供的药物组合物的描述主要涉及适合凭处方施用给人的药物组合物，但是技术人员理解，这类组合物通常适合于施用给各种动物。修改适合施用给人的药物组合物以便使该组合物适合施用给各种动物是很好理解的，普通熟练的兽医药理学家可以仅仅普通的实验——如果有的话，设计和实施这类修改。考虑来对其施用本发明的药物组合物的对象，包括但不限于人和其它灵长类动物、伴侣动物和其它哺乳动物。

适用于本发明的方法的药物组合物可以以适合于经口或可注射施用途径的剂型被制备、包装或出售。

本发明的药物组合物中的活性成分、药学上可接受载体和任意另外成分的相对量将依赖于被治疗对象的特征、大小(或身材)和症状，并且进一步依赖于施用组合物的途径而变化。

实验实施例

现在，本发明参考下述实施例进行描述。提供这些实施例仅以阐明的目的，本发明绝不应该理解为限制于这些实施例，而应该理解为包括由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。

下面描述出现在实验实施例的实验中使用的材料和方法。

实验实施例1：药物组合物1

脂构建体包括脂质1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、胆固醇、磷酸联十六烷酯、1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(琥珀酰)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-[磷酸-rac-(1-甘油)](钠盐)，受体结合分子1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(Cap生物素酰)，和胰岛素的混合物。

实验实施例2：药物组合物2

脂构建体包括脂质1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、胆固醇、磷酸联十六烷酯、1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(琥珀酰)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-[磷酸-rac-(1-甘油)](钠盐)，胰岛素，受体结合分子1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(Cap生物素酰)，和/或聚铬-聚(二)-[N-(2，6-(二异丙基苯基)氨基甲酰甲基)亚氨基]双乙酸]的混合物。脂质锚定肝细胞受体结合分子1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(Cap生物素酰)和聚铬-聚(二)-[N-(2，6-(二异丙基苯基)氨基甲酰甲基)亚氨基双乙酸]分别以按重量计1.68％±0.5％和按重量计1.2％±0.5％的水平加入到脂构建体。

实验实施例3：药物组合物3

脂构建体含有两亲脂质1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(12.09g)、胆固醇(1.60g)、磷酸联十六烷酯(3.10g)、聚铬-聚(二)-[N-(2，6-(二异丙基苯基)氨基甲酰甲基)亚氨基]双乙酸](0.20g)和胰岛素的混合物。将该混合物加入到含水介质中，总质量为1200g。

实验实施例4：制备含有胰岛素的脂构建体

通过制备两亲脂质分子和延伸两亲脂质的混合物、从两亲脂质分子和延伸两亲脂质的混合物制备脂构建体、以及将胰岛素结合入脂构建体，形成脂构建体。

使用下列步骤，制造两亲脂质分子和延伸两亲脂质的混合物。通过组合等分部分的1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(5.6881g)、胆固醇晶体(0.7980g)、磷酸联十六烷酯(1.5444g)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(Cap生物素酰)(0.1436g)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(0.1144g)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(琥珀酰)(0.1245g)和1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-[磷酸-rac-(1-甘油)](钠盐)(0.1186g)，制备脂构建体的脂质成分的混合物(总质量8.5316g)。

100ml氯仿∶甲醇(2∶1 v∶v)的溶液在5.0g分子筛上脱水。将脂构建体的脂质成分的混合物置于3升烧瓶中，并且将45ml该氯仿/甲醇溶液加入该脂质混合物。将溶液放置于旋转蒸发器上带有60±2℃水浴的烧瓶中并缓慢转动。在真空中，在旋转蒸发器上使用吸气器大约45分钟除去氯仿/甲醇溶液，然后用真空泵大约2小时以除去残留溶剂，形成脂质的固体混合物。可将干燥的脂质混合物于大约-20℃-0℃的冷藏箱中不定期储存。

使用下列步骤，从两亲脂质分子和延伸两亲脂质的混合物制备脂构建体。脂质混合物与pH7.0的大约600ml 28.4mM的磷酸钠(一价-二价的)缓冲液混合。使脂质混合物旋涡振荡，然后放置于80℃±4℃的加热的水浴中30分钟，同时缓慢转动以水合脂质。

使用pH在6.5-7.5之间的SWI，将M-110 EHI微流化床设备预热到70℃±10℃。将水合靶复合物的悬浮液转移到微流化床设备并且在大约9000 psig下，通过水合靶分子络合物的悬浮液单程通过流化床，微流化该悬浮液。在通过微流化床设备后，收集流化过的悬浮液的未过滤样品(2.0-5.0ml)，以使用来自Coulter N-4 plus粒径分析仪的单峰分布数据进行粒径分析。在所有的粒径确定之前，用0.2微米过滤的、pH已被调节为6.5-7.5的SWI稀释该样品。粒径要求在0.020-0.40微米的范围内。如果粒径不在此范围内，那么悬浮液在大约9000psig下再次通过微流化床设备，并再次分析粒径，直到达到粒径的要求。在无菌容器中，收集微流化的靶分子络合物。

将微流化的靶分子络合物保持在60℃±2℃，同时用连接到5.0ml注射器的无菌0.8微米+0.2微米的组合滤器过滤两次。分析等分部分的过滤悬浮液，以确定悬浮液中颗粒的粒径范围。最终0.2微米过滤的样品的粒径范围应该在0.0200-0.2000微米的范围内，如通过粒径分析仪的单峰分布打印输出所确定的。

使用美国5,104,661描述的方法通过反向装载(reverse loading)构建体，将胰岛素装载入构建体，所述文件通过引用并入本文。

实验实施例5：使用方法

在大鼠模型中，评估肝糖原上的肝定向小泡(hepatic directed vesicle，HDV)胰岛素的功效。总共60只雄性Sprague-Dawley大鼠(8周龄、250g)被分为按下面所述的5个治疗组。

对于研究的第一天，所有大鼠被禁食24小时，并任意给予水。在第二天，用四氧嘧啶和链脲菌素的混合物(AS)腹膜内注射大鼠。通过称量5mg/ml的每样材料——以便终浓度为5mg四氧嘧啶/ml和5mg链脲菌素/ml，在pH7、0.01M磷酸盐缓冲液中制备四氧嘧啶和链脲菌素的混合物。通过腹膜内注射20mg/kg体重(10mg/kg四氧嘧啶和10mg/kg链脲菌素)，AS混合物以0.5mL的四氧嘧啶和链脲菌素的混合物加以施用。在注射AS几小时后，AS将引起胰岛素大量释放，这导致深远的和暂时的低血糖。在第二天期间，根据需要皮下注射10％的葡萄糖水溶液，以防止低血糖，并且使大鼠充分补水(hydrate)。普通饮食和水是任意可得的。

在第三天，相应于大鼠被分配的组，在0分钟取尾静脉血糖基线样品，随后立刻以0.32U胰岛素/大鼠皮下注射下述溶液中的一个，

(1)具有铬-地索苯宁(disofenin)[聚铬-聚(二)-[N-(2，6-(二异丙基苯基)氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸]]的HDV-胰岛素肝细胞靶分子(hepatocyte target molecule，HTM)(阳性)对照。没有延伸两亲脂质存在。两亲脂质存在的量提供了大约14.5微克两亲脂质/千克大鼠的剂量。

(2)普通胰岛素(阴性)对照；

(3)HDV-胰岛素测试材料1，其中延伸两亲脂质是生物素-X DHPE[三乙铵2，3-二乙酰氧基丙基2-(6-(5-((3aS，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)己酰氨基)磷酸乙酯。两亲脂质存在的量提供了大约14.5微克两亲脂质/千克大鼠的剂量。延伸两亲脂质存在的量提供了大约191纳克延伸两亲脂质/千克大鼠的剂量。

(4)HDV-胰岛素测试材料2，其中延伸两亲脂质是生物素DHPE[三乙铵2，3-二乙酰氧基丙基2-(5-((3aS，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)磷酸乙酯]。两亲脂质存在的量提供了大约7.25微克两亲脂质/千克大鼠的剂量。延伸两亲脂质存在的量提供了大约95.5纳克延伸两亲脂质/千克大鼠的剂量。

(5)HDV-胰岛素测试材料3，其中延伸两亲脂质是生物素DHPE[三乙铵2，3-二乙酰氧基丙基2-(5-((3aS，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)磷酸乙酯]。两亲脂质存在的量提供了大约14.5微克两亲脂质/千克大鼠的剂量。延伸两亲脂质存在的量提供了大约191纳克延伸两亲脂质/千克大鼠的剂量。

对于治疗组1和3-5，两亲脂质是1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、胆固醇和磷酸联十六烷酯的混合物。

在“0”分钟，每只大鼠也被强饲在3.75ml水中的375mg葡萄糖(10％葡萄糖)。

使用克他命(ketamine)(150mg/kg)/甲苯噻嗪(15mg/kg)，在一小时(onehour minutes)时，将每组一半的动物麻醉并且安乐死，并且剩余的鼠在2小时时经过腹腔内注射麻醉并安乐死。先前用铬-地索苯宁HTM的研究已经示出了在2个小时内的统计学上显著的效应。移去整个肝脏，并且储存于-80℃的液氮中，直到进行肝糖原分析。

通过下列方法，确定肝糖原，所述方法由Ong KC和Kho HE，LifeSciences 67(2000)1695-1705所描述。冷冻肝脏组织的称量量(0.3-0.5g)在10体积冰冷的30％KOH中匀浆，然后在100℃下煮沸30分钟。用乙醇将糖原沉淀，离心、洗涤并且重新溶解于蒸馏水。通过用蒽酮试剂(1g蒽酮溶解于500ml浓硫酸中)处理水溶液，确定肝糖原含量。在分光光度计中，测量溶液在625nm处的吸光度，计算存在的糖原量。

结果在图17中示出，其比较了5个治疗组的肝中存在的糖原浓度。该值为一小时值和两小时值的平均，它们彼此相似。普通胰岛素——其示出作为肝糖和糖原储存的刺激物是无效的，被用作阴性对照。含有铬-地索苯宁HTM的HDV-胰岛素是阳性对照，并且其具有明显高于普通胰岛素阴性对照的肝糖原含量(p＜0.05)。因此，给药后，观察到阴性对照和阳性对照之间的期望的统计学和生物学上的显著差异。

测试材料1和3——其具有延伸两亲脂质生物素DHPE[三乙铵2，3-二乙酰氧基丙基2-(5-((3aS，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)磷酸乙酯]和生物素-X DHPE[三乙铵2，3-二乙酰氧基丙基2-(6-(5-((3aS，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)己酰氨基)磷酸乙酯]，具有统计学上高于普通胰岛素所得到的糖原水平(p＝0.05)。测试材料2——其也具有生物素-XDHPE，但是脂质浓度为测试材料3的脂质浓度的一半，具有更高的糖原水平，但是组内差异性大，足以得到p＝0.08。

实验实施例6：HDV-甘精胰岛素的药物组合物

肝细胞靶向组合物包含游离甘精胰岛素和与水不溶性靶分子络合物连接的甘精胰岛素的混合物。该络合物包括多个连接的独立单元和脂构建体基质，其包含1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、胆固醇、磷酸联十六烷酯的混合物。桥连剂聚铬-聚(二)-[N-(2，6-(二异丙基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸]存在于该络合物中。

实验实施例7：制备HDV-甘精胰岛素

通过下列方法，制造靶分子络合物成分的中间体混合物。通过将等分部分的脂质1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(2.015g)、晶体胆固醇(0.266g)和磷酸联十六烷酯(0.515g)加入到桥连剂聚铬-聚(二)-[N-(2，6-(二异丙基苯基)氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸](0.034g)，制备靶分子络合物成分的混合物(总质量2.830g)。氯仿(50ml)和甲醇(25ml)的溶液已经通过分子筛脱水。将靶分子络合物成分的混合物加入到该氯仿/甲醇溶液中，然后将其放置于60℃±2℃的水浴中以形成溶液。在真空下在旋转蒸发器上使用吸气器然后通过真空泵除去氯仿/甲醇溶液，并且形成固体中间体混合物。

通过下列方法，制造靶分子络合物。通过加入105μl 0.1N的NaOH溶液，将530ml的用于注射的无菌水USP(SWI)的pH调节到pH 6.5-7.5。加入足够的水，以产生200g产物。将pH调节的SWI加入到中间体混合物(2.830g)中，并且通过将混合物放置于80℃±2℃的水浴中，水合该中间体混合物，同时旋转混合物大约30分钟±15分钟，或者直到混合物为外观均匀的悬浮液。在先前的过程中，悬浮液的pH下降。然后，通过加入大约1.0ml 0.1N NaOH，调节悬浮液的pH至5.44±0.5pH单位。

将水合的靶络合物的悬浮液和28mM pH7.0的磷酸钠缓冲液一起转移到型号M-110 EHI的微流化床设备，所述M-110 EHI微流化床设备被预热到70℃±10℃。在大约9,000psig下，通过水合靶分子络合物的悬浮液单程通过流化床，微流化该悬浮液。在通过微流化床设备后，收集经流化的悬浮液的未过滤样品(2.0-5.0ml)，以使用CoulterN-4plus粒径分析仪的单峰分布数据进行粒径分析。在所有的粒径确定之前，用0.2微米过滤的、pH已被调节为6.5-7.5之间的SWI稀释该样品。要求粒径在0.020-0.40微米范围内。如果粒径不在此范围内，那么悬浮液再次通过微流化床设备，并再次分析粒径，直到达到粒径的要求。在无菌容器中，收集微流化的靶分子络合物。

将微流化的靶分子络合物的悬浮液保持在60℃±2℃，同时用连接到5.0ml注射器的无菌0.8微米+0.2微米的组合滤器过滤两次。分析等分部分的过滤的悬浮液，以确定悬浮液中颗粒的粒径范围。最终0.2微米过滤的样品的粒径范围在0.0200-0.2000微米的范围内，其通过粒径分析仪的单峰分布打印输出所确定。pH调节前，过滤的靶分子络合物悬浮液的pH是3.74±0.2pH单位。将样品储存在2°-8℃之间的冰箱中，直到进一步使用。

包含游离甘精胰岛素和与水不溶性靶分子络合物连接的甘精胰岛素的混合物的药物组合物也被称为HDV-甘精胰岛素，其可通过下列过程进行制造。通过根据下列步骤连续加入无菌的0.1N NaOH，将5.0ml等分部分的两次过滤的靶分子络合物悬浮液的pH从pH为3.74±0.2的最初pH调节到pH5.2±pH0.5：

pH3.74+10μl 0.1N NaOH→pH3.96

pH3.96+20μl 0.1N NaOH→pH4.52

pH4.52+10μl 0.1N NaOH→pH4.69

pH4.69+10μ1 0.1N NaOH→pH5.01

pH5.01+10μl 0.1N NaOH→pH5.20

将1.6ml、pH5.20±0.5的等分部分的靶分子络合物悬浮液与18.4ml已被调节到pH 3.95±0.2的SWI相组合。通过加入10μl±1.0μl的0.1N的NaOH，将所形成的悬浮液的pH从pH4.89调节到pH5.27±0.5。

通过在混合下加入60μl±2μl的无菌0.1N的NaOH，将5.0ml等分部分的Lantus

Glargine-U-100胰岛素的pH从pH3.88±0.2增加到pH4.78±0.5。将pH5.27±0.5的2.5ml±0.1ml等分部分的靶分子络合物悬浮液加入到5.0ml±0.1ml的pH4.78±0.5的甘精胰岛素的溶液中，以产生包含游离甘精胰岛素和与水不溶性靶分子络合物连接的甘精胰岛素的混合物的药物组合物。该产物包括66.1IU的甘精胰岛素/ml悬浮液。在一实施方式中，游离甘精胰岛素和与络合物连接的甘精胰岛素的混合物可在一小瓶甘精胰岛素内原位产生，以便制造单独的剂型。

实施例8：使用HDV-甘精胰岛素控制I型糖尿病患者血糖的方法

将HDV-甘精胰岛素施用给患者以确定HDV-甘精胰岛素控制膳食后血糖水平的能力。选择七个I型糖尿病患者。根据列在研究方案中的标准仔细筛选和选择患者。用基础甘精胰岛素和餐时的短效胰岛素治疗患者，然后进入HDV-甘精胰岛素治疗时期。在施用HDV-甘精胰岛素之前，监控患者(通过日记卡和部位接触(site contact))四天，以确保它们的血糖水平在可接受的控制中。确定清晨空腹的葡萄糖水平在100-150mg/dl的范围内。

在研究期间，每个患者的HDV-甘精胰岛素剂量是它们的基础甘精胰岛素日常剂量的1.2X，以补偿在测试日内他们未接受的短效胰岛素的量。根据设定时间表在13小时内采取血样。使用先前描述的方法，将HDV加入到甘精胰岛素，以产生具有66.1IU甘精/ml和0.37mg HDV/ml最终浓度的悬浮液。在早餐前一小时，用HDV-甘精胰岛素注射患者。在每日三餐——早餐、午餐和晚餐中的每一餐中，营养学家规定60g糖类膳食。

现在描述在该实验实施例中描述的实验的结果。患者良好耐受HDV-甘精胰岛素，并且在注射部位没有观察到不利反应。也没在接受这种治疗的患者中观察到低血糖反应。用HDV-甘精胰岛素治疗的患者的血糖值被图形表示在图18中。图18示出：餐后血糖浓度如预期增加，并且血糖浓度随时间降低直到进食下一餐。对于所有四个患者都观察到这种模式。图19示出单一剂量HDV-甘精胰岛素对于每天进食三餐的患者的平均血糖浓度的影响。对于各个患者，餐后血糖浓度增加，并且血糖浓度随时间降低直到进食下一餐。在所有时间点，平均血糖浓度都在基线值之上。曲线表示，HDV-甘精胰岛素的功效在整天得到了提高，因为在午餐和晚餐后之后的高浓度和低浓度之间的变化比早餐后更小。相对于禁食期间血糖浓度，HDV-甘精胰岛素随时间对血糖浓度变化的影响在图20示出。在餐后血糖浓度增加，然后随着时间朝禁食期间的葡萄糖浓度降低，直到进食下一餐。在整个研究中，血糖浓度在空腹浓度之上。用HDV-甘精胰岛素治疗患者导致一定程度的膳食后血糖水平的控制，这表明HDV在餐时能将足够量的甘精胰岛素运至肝脏以提供这种控制。血糖水平是通常接受基础胰岛素治疗加上餐时短效胰岛素的I型患者的特征。

实验实施例9：HDV-Humulin NPH胰岛素#1的药物组合物

肝细胞靶向组合物包含游离重组人鱼精蛋白锌胰岛素和与水不溶性靶分子络合物连接的重组人鱼精蛋白锌胰岛素的混合物。该络合物包括多个连接的独立单元和脂构建体基质，其包含1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、胆固醇、磷酸联十六烷酯的混合物。桥连剂聚铬-聚(二)-[N-(2，6-(二异丙基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸]存在于该络合物中。

实验实施例10：HDV-Humulin NPH胰岛素#2的药物组合物

肝细胞靶向组合物包含游离重组人鱼精蛋白锌胰岛素、游离重组人普通胰岛素以及与水不溶性靶分子络合物连接的重组人鱼精蛋白锌胰岛素和重组人普通胰岛素的混合物。该络合物包括多个连接的独立单元和脂构建体基质，其包含1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、胆固醇、磷酸联十六烷酯的混合物。桥连剂聚铬-聚(二)-[N-(2，6-(二异丙基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸]存在于该络合物中。

实验实施例11：制备HDV-Humulin NPH胰岛素

通过下列步骤，制造靶分子络合物成分的中间体混合物。通过将等分部分的脂质1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(2.015g)、晶体胆固醇(0.266g)和磷酸联十六酯(0.515g)加入到桥连剂聚铬聚(二)-[N-(2，6-(二异丙基苯基氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸](0.034g)，制备靶分子络合物成分的混合物(总质量2.830g)。氯仿(50ml)和甲醇(25ml)的溶液已经通过分子筛脱水。将靶分子络合物成分的混合物加入到25.0ml的该氯仿/甲醇溶液中，然后将其放置于60℃±2℃的水浴中以形成溶液。在真空下在旋转蒸发器上使用吸气器然后通过真空泵除去氯仿/甲醇溶液，并且形成固体中间体混合物。

通过下列方法，制造靶分子络合物。将大约200ml、pH7.0的28mM的磷酸钠缓冲液加入到该中间体混合物，以形成含水悬浮液。将该含水混合物在80℃±2℃的水浴中水合，同时转动混合物大约30分钟±15分钟，或者直到混合物为外观均匀的悬浮液。

将水合的靶络合物的悬浮液和28mM pH7.0的磷酸钠缓冲液一起转移到型号M-110 EHI的微流化床设备，所述M-110 EHI微流化床设备被预热到70℃±10℃。在大约9000psig下，通过使水合靶分子络合物的悬浮液单程通过流化床，微流化该悬浮液。在通过微流化床设备后，收集流化悬浮液的未过滤样品(2.0-5.0ml)，以使用Coulter N-4 plus粒径分析仪的单峰分布数据进行粒径分析。在所有的粒径确定之前，用pH7.0的28mM的磷酸钠缓冲液稀释该样品。如果粒径不在0.020-0.40微米的范围内，那么悬浮液再次通过微流化床设备，并再次分析粒径。重复该过程直到到粒径在0.020-0.40微米的范围内。在无菌容器中，收集微流化的靶分子络合物悬浮液。

将微流化的靶分子络合物的悬浮液保持在60℃±2℃，同时用连接到5.0ml注射器的无菌0.8微米+0.2微米的组合滤器过滤。分析等分部分的过滤悬浮液，以确定悬浮液中颗粒的粒径范围。最终0.2微米过滤的样品的粒径范围在0.0200-0.2000微米的范围内，其通过从粒径分析仪的单峰分布打印输出所确定。过滤的靶分子络合物悬浮液的pH是7.0±0.5pH单位。将样本储存在2°-8℃之间的冰箱中，直到进一步使用。

过滤的HDV-脂质悬浮液包含14.15mg HDV脂质/ml。将0.8ml等分部分的该悬浮液加入到10.0ml瓶的Humulin R胰岛素中，并且使其在2°-8℃下培育数天。然后用无菌注射器除去该10.0ml Humulin R胰岛素HDV悬浮液中的5.0ml。向该瓶中剩余的5.0ml Humulin R胰岛素，加入5.0ml Humulin NPH胰岛素，以形成最终HDV产物。最终的HDV组合物包含96.3单位组合的HDV Humulin R和HDV Humulin NPH胰岛素/ml悬浮液和0.52mg HDV脂质/ml。这种组合物——其可在原位产生以制造单独的剂型，包括游离Humulin R胰岛素、游离Humulin NPH胰岛素和与脂构建体连接的Humulin R胰岛素和HumulinNPH胰岛素的混合物。

实施例12：使用组合的HDV Humulin R胰岛素和HDV-Humulin NPH胰岛素 控制I型糖尿病患者血糖水平的方法

将HDV-Humulin NPH胰岛素施用给患者，以确定HDV-Humulin NPH胰岛素控制餐后血糖水平的能力。选择七个I型糖尿病患者。根据列在研究方案中的标准仔细筛选和选择患者。用基础Humulin NPH胰岛素和餐时短效胰岛素治疗患者，然后进入HDV-Humulin NPH胰岛素治疗期。在施用HDV-Humulin NPH胰岛素之前，监控患者(通过日记卡和部位接触(site contact))四天，以确保它们的血糖水平在可接受的控制中。确定清晨空腹的葡萄糖水平在100-150mg/dl的范围内。

在研究期间，每个患者的HDV-Humulin NPH胰岛素剂量是它们的基础HumulinNPH胰岛素日常剂量的1.2X，以补偿在测试日中未接受的短效胰岛素量。根据设定时间表在13小时内采取血样。使用先前描述的方法，将HDV加入到HumulinNPH胰岛素，以产生悬浮液，其终浓度为93.6单位组合的HDV-HumulinR胰岛素和HDV-Humulin NPH胰岛素/ml。最终悬浮液包括0.52mg HDV脂质/ml。在早餐前一小时，用组合的HDV-胰岛素注射患者。在每日三餐——早餐、午餐和晚餐中的每一餐中，营养学家规定60g糖类膳食。

现在描述在该实验实施例中陈述的实验的结果。患者良好耐受HDV-Humulin NPH胰岛素，并且在注射部位没有观察到副作用。也没在接受这种治疗的患者中观察到低血糖反应。用HDV-HumulinNPH胰岛素治疗的患者的血糖值被图形表示在图21中。图21示出：餐后血糖浓度如预期增加，并且血糖浓度随时间降低直到进食下一餐。对于所有四个患者都观察到这种模式。图22示出单一剂量HDV-Humulin NPH胰岛素对于每天进食三餐的患者的平均血糖浓度的影响。对于各个患者，餐后血糖浓度增加，并且血糖浓度随时间降低，直到进食下一餐。在所有时间点，平均血糖浓度均在基线值之上。曲线表明，HDV-HumulinNPH胰岛素的功效在整天得到了提高，因为在午餐和晚餐后高低浓度间的变化比早餐后更小。相对于禁食期间血糖浓度，HDV-Humulin NPH胰岛素随时间对血糖浓度变化的影响在图23示出。在餐后血糖浓度增加，然后随着时间朝禁食期间的葡萄糖浓度的方向降低，直到进食下一餐。在整个研究中，血糖浓度在空腹浓度之上。用HDV-Humulin NPH胰岛素治疗患者导致一定程度的餐后血糖水平的控制，这表明HDV在餐时能将足够量的Humulin NPH胰岛素运至肝脏，以提供这种控制。血糖水平是通常接受基础胰岛素治疗加上餐时短效胰岛素的I型患者的特征。

尽管参考具体实施方式公开了本发明，明显地，本发明的其它实施方式和改变可被本领域其他技术人员所设计，而没有背离本发明的真实精神和范围。附加的权利要求拟被解释为包括所有这些实施方式和等同的变化。

Claims (31)

1.包含至少一种游离胰岛素和脂构建体的组合物，所述脂构建体包括两亲脂质和延伸两亲脂质，其中所述构建体包括与所述脂构建体相连的至少一种胰岛素，其中在所述组合物中所述至少一种游离胰岛素和与所述脂构建体相连的所述至少一种胰岛素处于平衡，并且其中所述延伸两亲脂质选自：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)生物素；磺基-NHS-生物素；N-羟基琥珀酰亚胺长链生物素；磺基-N-羟基琥珀酰亚胺长链生物素；D-生物素；生物胞素；磺基-N-羟基琥珀酰亚胺-S-S-生物素；生物素-BMCC；生物素-HPDP；碘乙酰-LC-生物素；生物素-酰肼；生物素-LC-酰肼；生物胞素-酰肼；生物素尸胺；羧基生物素；光生物素；对氨基苯甲酰生物胞素三氟乙酸酯；对重氮基苯甲酰生物胞素；生物素DHPE；生物素-X-DHPE；12-((生物素酰)氨基)十二酸；12-((生物素酰)氨基)十二酸琥珀酰亚胺酯；S-生物素酰高半胱氨酸；生物胞素-X；生物胞素-x-酰肼；生物素乙二胺；生物素-XL；生物素-X-乙二胺；生物素-XX-酰肼；生物素-XX-SE；生物素-XX，SSE；生物素-X-尸胺；α-(t-BOC)生物胞素；N-(生物素酰)-N’-(碘乙酰)乙二胺；DNP-X-生物胞素-X-SE；生物素-X-酰肼；降生物素胺氢氯化物；3-(N-马来酰亚胺基丙酰)生物胞素；ARP；生物素-1-亚砜；生物素甲酯；生物素-马来酰亚胺；生物素-聚(乙二醇)胺；(+)生物素4-酰氨基苯甲酸钠盐；生物素2-N-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷；生物素-α-D-N-乙酰神经氨酸苷；生物素-α-L-岩藻糖苷；生物素-乳-N-二糖苷；生物素-路易斯-A三糖；生物素-路易斯-Y四糖；生物素-α-D-吡喃甘露糖苷和生物素6-O-磷酸-α-D-吡喃甘露糖苷。

2.权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种游离胰岛素选自赖脯胰岛素、门冬胰岛素、普通胰岛素、甘精胰岛素、锌胰岛素、人长效锌胰岛素、鱼精蛋白锌胰岛素、人缓冲普通胰岛素、谷赖胰岛素、重组人普通胰岛素、重组人鱼精蛋白锌胰岛素、任意上述胰岛素的预混组合和任意上述胰岛素的组合。

3.权利要求1所述的组合物，其中所述两亲脂质包括至少一种选自下列的脂质：1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、胆固醇、磷酸联十六烷酯、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-[3-磷酸-rac-(1-甘油)]、1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(琥珀酰)和任意前述化合物的混合物。

4.权利要求1所述的组合物，其中所述延伸两亲脂质分子从所述脂构建体的表面向外延伸。

5.权利要求1所述的组合物，其中所述构建体包括正电荷、负电荷或它们的组合。

6.权利要求1所述的组合物，进一步包括邻苯二甲酸醋酸纤维素。

7.权利要求1所述组合物，进一步包括至少一种结合到所述游离胰岛素的带电有机分子。

8.权利要求7所述组合物，其中所述带电有机分子选自：鱼精蛋白、高碱性氨基酸聚合物、摩尔比1∶1∶1的聚(精氨酸-脯氨酸-苏氨酸)_n、摩尔比6∶1的聚(DL-丙氨酸-聚-L-赖氨酸)_n、组蛋白、含有伯氨基提供的正电荷的糖聚合物、具有伯氨基的多核苷酸、羧基化聚合物和聚合氨基酸、包含大量具有羧基(COO-)或巯基(S-)官能团的氨基酸残基的蛋白质片段、酸性聚合物、含有负电荷羧基的糖聚合物和上述化合物的任意组合。

9.制造包含至少一种游离胰岛素和含有胰岛素、两亲脂质和延伸两亲脂质的脂构建体的组合物的方法，其中所述构建体包括与所述脂构建体相连的至少一种胰岛素，其中在所述组合物中所述至少一种游离胰岛素和与所述脂构建体相连的所述至少一种胰岛素处于平衡，所述方法包括：

a.产生含有所述两亲脂质和延伸两亲脂质的混合物；

b.在水介质中形成所述脂构建体的悬浮液；和

c.将所述胰岛素装载入所述脂构建体，其中该步骤包括平衡装载和非平衡装载，

并且其中所述延伸两亲脂质选自：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)生物素；磺基-NHS-生物素；N-羟基琥珀酰亚胺长链生物素；磺基-N-羟基琥珀酰亚胺长链生物素；D-生物素；生物胞素；磺基-N-羟基琥珀酰亚胺-S-S-生物素；生物素-BMCC；生物素-HPDP；碘乙酰-LC-生物素；生物素-酰肼；生物素-LC-酰肼；生物胞素-酰肼；生物素尸胺；羧基生物素；光生物素；对氨基苯甲酰生物胞素三氟乙酸酯；对重氮基苯甲酰生物胞素；生物素DHPE；生物素-X-DHPE；12-((生物素酰)氨基)十二酸；12-((生物素酰)氨基)十二酸琥珀酰亚胺酯；S-生物素酰高半胱氨酸；生物胞素-X；生物胞素-x-酰肼；生物素乙二胺；生物素-XL；生物素-X-乙二胺；生物素-XX-酰肼；生物素-XX-SE；生物素-XX，SSE；生物素-X-尸胺；α-(t-BOC)生物胞素；N-(生物素酰)-N’-(碘乙酰)乙二胺；DNP-X-生物胞素-X-SE；生物素-X-酰肼；降生物素胺氢氯化物；3-(N-马来酰亚胺基丙酰)生物胞素；ARP；生物素-1-亚砜；生物素甲酯；生物素-马来酰亚胺；生物素-聚(乙二醇)胺；(+)生物素4-酰氨基苯甲酸钠盐；生物素2-N-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷；生物素-α-D-N-乙酰神经氨酸苷；生物素-α-L-岩藻糖苷；生物素-乳-N-二糖苷；生物素-路易斯-A三糖；生物素-路易斯-Y四糖；生物素-α-D-吡喃甘露糖苷和生物素6-O-磷酸-α-D-吡喃甘露糖苷。

10.权利要求9所述的方法，其中所述将所述胰岛素装载入所述脂构建体的步骤包括将含有游离胰岛素的溶液加入到所述脂构建体在水介质中的混合物，并且使所述胰岛素保持与所述混合物接触，直到达到平衡。

11.权利要求9所述的方法，进一步包括下列步骤：

d.在所述混合物达到平衡后，停止将所述胰岛素装载入所述脂构建体，其中含有游离胰岛素的溶液从所述构建体被除去，进一步，其中所述构建体包括胰岛素。

12.权利要求11所述方法，进一步包括下列步骤：

e.从含有结合到所述构建体的胰岛素的所述脂构建体除去含有游离胰岛素的溶液，这通过选自下列的方法进行：快速过滤方法、离心、过滤离心和使用离子交换树脂或链霉抗生物素琼脂糖亲和树脂凝胶的层析法，所述链霉抗生物素琼脂糖亲和树脂凝胶对生物素或亚氨基生物素具有亲和性。

13.权利要求9所述的方法，进一步包括下列步骤：

将邻苯二甲酸醋酸纤维素加入到所述脂构建体。

14.权利要求9所述的方法，进一步包括下列步骤：

从所述方法回收至少一种选自胰岛素、离子交换树脂和链霉抗生物素琼脂糖亲和凝胶的材料。

15.权利要求9所述的方法，其中将所述胰岛素装载入所述脂构建体的所述步骤包括在将所述胰岛素装载入所述脂构建体之前，将至少一种带电有机分子加入到所述胰岛素的步骤。

16.根据权利要求1所述的组合物在制备用于增加患者体内至少一种胰岛素的生物利用度的药物中的应用，其中所述脂构建体包括多个非共价多配位基结合位点，其中所述脂构建体与所述胰岛素结合并且含有胰岛素的所述构建体被施用给所述患者。

17.根据权利要求1所述的组合物在制备用于增加患者体内至少一种胰岛素的生物利用度的药物中的应用，其中所述脂构建体包括多个非共价多配位基结合位点，其中所述脂构建体与所述胰岛素结合并且含有胰岛素的所述构建体被施用给所述患者，并且其中至少一种活性成分的等电点被调节。

18.权利要求17所述的应用，其中所述胰岛素选自：赖脯胰岛素、门冬胰岛素、普通胰岛素、甘精胰岛素、锌胰岛素、人长效锌胰岛素、鱼精蛋白锌胰岛素、人缓冲普通胰岛素、谷赖胰岛素、重组人普通胰岛素、重组人鱼精蛋白锌胰岛素、任意上述胰岛素的预混组合和任意上述胰岛素的组合。

19.权利要求17所述的应用，其中所述脂构建体包括：胰岛素，1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、胆固醇、磷酸联十六烷酯、1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-[3-磷酸-rac-(1-甘油)]、1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、和1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(琥珀酰)，以及肝细胞受体结合分子。

20.根据权利要求1所述的组合物在制备用于增加患者体内至少一种胰岛素的生物利用度的药物中的应用，其中所述脂构建体包括多个非共价多配位基结合位点，其中所述脂构建体与所述胰岛素结合并且含有胰岛素的所述构建体被施用给所述患者，并且其中在将所述胰岛素结合到所述脂构建体之前，至少一种带电有机分子被加入到所述胰岛素。

21.形成缓释组合物的方法，其在宿主中提供胰岛素生物分布的增加，包括：

a.通过含有亚氨基生物素的脂质将脂构建体结合到pH 9.5或更高的链霉抗生物素琼脂糖亲和凝胶，从体相介质除去所述脂构建体；

b.从所述体相介质分离所述构建体；和

c.通过将所述亲和凝胶的水混合物的pH调节到pH 4.5，从所述亲和凝胶释放所述构建体，其中所述释放的构建体包含不溶胰岛素；

其中将所述构建体施用给温血宿主后，所述胰岛素在所述宿主内的生理pH条件下重新溶解。

22.脂构建体在制备用于治疗糖尿病的药物中的应用，所述脂构建体含有与所述构建体相连接的胰岛素。

23.权利要求22所述的应用，其中所述胰岛素选自：赖脯胰岛素、门冬胰岛素、普通胰岛素、甘精胰岛素、锌胰岛素、人长效锌胰岛素、鱼精蛋白锌胰岛素、人缓冲普通胰岛素、谷赖胰岛素、重组人普通胰岛素、重组人鱼精蛋白锌胰岛素、任意上述胰岛素的预混组合和任意上述胰岛素的组合。

24.权利要求22所述的应用，其中所述脂构建体进一步包括不与所述构建体相连接的胰岛素。

25.权利要求22所述的应用，其中与所述构建体相连接的所述胰岛素包括至少一种结合到所述胰岛素的带电有机分子。

26.包含至少一种游离胰岛素和含有胰岛素、两亲脂质和延伸脂质的脂构建体的组合物在制备用于增强胰岛素向遭受糖尿病的患者肝脏中肝细胞的输送的药物中的应用，其中所述延伸脂质结合到肝细胞受体并且所述脂构建体以多种尺寸存在，其中所述构建体包括与所述脂构建体相连的至少一种胰岛素，其中在所述组合物中所述至少一种游离胰岛素和与所述脂构建体相连的所述至少一种胰岛素处于平衡，并且其中所述延伸脂质选自：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)生物素；磺基-NHS-生物素；N-羟基琥珀酰亚胺长链生物素；磺基-N-羟基琥珀酰亚胺长链生物素；D-生物素；生物胞素；磺基-N-羟基琥珀酰亚胺-S-S-生物素；生物素-BMCC；生物素-HPDP；碘乙酰-LC-生物素；生物素-酰肼；生物素-LC-酰肼；生物胞素-酰肼；生物素尸胺；羧基生物素；光生物素；对氨基苯甲酰生物胞素三氟乙酸酯；对重氮基苯甲酰生物胞素；生物素DHPE；生物素-X-DHPE；12-((生物素酰)氨基)十二酸；12-((生物素酰)氨基)十二酸琥珀酰亚胺酯；S-生物素酰高半胱氨酸；生物胞素-X；生物胞素-x-酰肼；生物素乙二胺；生物素-XL；生物素-X-乙二胺；生物素-XX-酰肼；生物素-XX-SE；生物素-XX，SSE；生物素-X-尸胺；α-(t-BOC)生物胞素；N-(生物素酰)-N’-(碘乙酰)乙二胺；DNP-X-生物胞素-X-SE；生物素-X-酰肼；降生物素胺氢氯化物；3-(N-马来酰亚胺基丙酰)生物胞素；ARP；生物素-1-亚砜；生物素甲酯；生物素-马来酰亚胺；生物素-聚(乙二醇)胺；(+)生物素4-酰氨基苯甲酸钠盐；生物素2-N-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷；生物素-α-D-N-乙酰神经氨酸苷；生物素-α-L-岩藻糖苷；生物素-乳-N-二糖苷；生物素-路易斯-A三糖；生物素-路易斯-Y四糖；生物素-α-D-吡喃甘露糖苷和生物素6-O-磷酸-α-D-吡喃甘露糖苷。

27.权利要求26所述的应用，其中所述胰岛素选自：赖脯胰岛素、门冬胰岛素、普通胰岛素、甘精胰岛素、锌胰岛素、人长效锌胰岛素、鱼精蛋白锌胰岛素、人缓冲普通胰岛素、谷赖胰岛素、重组人普通胰岛素、重组人鱼精蛋白锌胰岛素、任意上述胰岛素的预混组合和任意上述胰岛素的组合。

28.包含胰岛素、两亲脂质和延伸两亲脂质的脂构建体在制备用于增强胰岛素向遭受糖尿病的患者肝脏中肝细胞的输送的药物中的应用，其中所述延伸两亲脂质结合到肝细胞受体并且所述脂构建体以多种尺寸存在，另外，其中通过三维结构排列的脂质分子以便防止水解酶接近所述胰岛素而将所述胰岛素保护在所述脂构建体内免于水解降解，并且其中所述延伸两亲脂质选自：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)生物素；磺基-NHS-生物素；N-羟基琥珀酰亚胺长链生物素；磺基-N-羟基琥珀酰亚胺长链生物素；D-生物素；生物胞素；磺基-N-羟基琥珀酰亚胺-S-S-生物素；生物素-BMCC；生物素-HPDP；碘乙酰-LC-生物素；生物素-酰肼；生物素-LC-酰肼；生物胞素-酰肼；生物素尸胺；羧基生物素；光生物素；对氨基苯甲酰生物胞素三氟乙酸酯；对重氮基苯甲酰生物胞素；生物素DHPE；生物素-X-DHPE；12-((生物素酰)氨基)十二酸；12-((生物素酰)氨基)十二酸琥珀酰亚胺酯；S-生物素酰高半胱氨酸；生物胞素-X；生物胞素-x-酰肼；生物素乙二胺；生物素-XL；生物素-X-乙二胺；生物素-XX-酰肼；生物素-XX-SE；生物素-XX，SSE；生物素-X-尸胺；α-(t-BOC)生物胞素；N-(生物素酰)-N’-(碘乙酰)乙二胺；DNP-X-生物胞素-X-SE；生物素-X-酰肼；降生物素胺氢氯化物；3-(N-马来酰亚胺基丙酰)生物胞素；ARP；生物素-1-亚砜；生物素甲酯；生物素-马来酰亚胺；生物素-聚(乙二醇)胺；(+)生物素4-酰氨基苯甲酸钠盐；生物素2-N-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷；生物素-α-D-N-乙酰神经氨酸苷；生物素-α-L-岩藻糖苷；生物素-乳-N-二糖苷；生物素-路易斯-A三糖；生物素-路易斯-Y四糖；生物素-α-D-吡喃甘露糖苷和生物素6-O-磷酸-α-D-吡喃甘露糖苷。

29.权利要求28所述的应用，其中所述构建体进一步包括邻苯二甲酸醋酸纤维素。

30.权利要求29所述的应用，其中所述构建体进一步包括产生在所述脂构建体内的不溶剂型的胰岛素。

31.用于治疗遭受糖尿病的哺乳动物的试剂盒，所述试剂盒包括包含至少一种游离胰岛素和脂构建体的组合物、生理缓冲溶液、施用器和其使用的说明性材料，其中所述脂构建体包括两亲脂质和延伸两亲脂质，其中所述延伸两亲脂质将所述构建体靶向肝细胞展示的受体，其中所述构建体包括与所述脂构建体相连的至少一种胰岛素，其中在所述组合物中所述至少一种游离胰岛素和与所述脂构建体相连的所述至少一种胰岛素处于平衡，并且其中所述延伸两亲脂质选自：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)生物素；磺基-NHS-生物素；N-羟基琥珀酰亚胺长链生物素；磺基-N-羟基琥珀酰亚胺长链生物素；D-生物素；生物胞素；磺基-N-羟基琥珀酰亚胺-S-S-生物素；生物素-BMCC；生物素-HPDP；碘乙酰-LC-生物素；生物素-酰肼；生物素-LC-酰肼；生物胞素-酰肼；生物素尸胺；羧基生物素；光生物素；对氨基苯甲酰生物胞素三氟乙酸酯；对重氮基苯甲酰生物胞素；生物素DHPE；生物素-X-DHPE；12-((生物素酰)氨基)十二酸；12-((生物素酰)氨基)十二酸琥珀酰亚胺酯；S-生物素酰高半胱氨酸；生物胞素-X；生物胞素-x-酰肼；生物素乙二胺；生物素-XL；生物素-X-乙二胺；生物素-XX-酰肼；生物素-XX-SE；生物素-XX，SSE；生物素-X-尸胺；α-(t-BOC)生物胞素；N-(生物素酰)-N’-(碘乙酰)乙二胺；DNP-X-生物胞素-X-SE；生物素-X-酰肼；降生物素胺氢氯化物；3-(N-马来酰亚胺基丙酰)生物胞素；ARP；生物素-1-亚砜；生物素甲酯；生物素-马来酰亚胺；生物素-聚(乙二醇)胺；(+)生物素4-酰氨基苯甲酸钠盐；生物素2-N-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷；生物素-α-D-N-乙酰神经氨酸苷；生物素-α-L-岩藻糖苷；生物素-乳-N-二糖苷；生物素-路易斯-A三糖；生物素-路易斯-Y四糖；生物素-α-D-吡喃甘露糖苷和生物素6-O-磷酸-α-D-吡喃甘露糖苷。

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