CA2694600A1 - Complexes entre un polymere amphiphile et une proteine osteogenique appartenant a la famille des bmps - Google Patents

Complexes entre un polymere amphiphile et une proteine osteogenique appartenant a la famille des bmps Download PDF

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Abstract

L'invention concerne un complexe polymère amphiphile-BMP, stable physiquement et chimiquement, soluble dans l'eau, caractérisé en ce que: les polymères amphiphiles sont constitués d'un squelette polysaccharide hydrophile fonctionnalisé par des substituants hydrophobes et des groupements hydrophiles la BMP est choisie dans le groupe des BMP (Bone morphogenetic Proteins) thérapeutiquement actives, le ratio massique polymère/BMP est inférieur ou égal à 700. L'invention concerne également le procédé de préparation du complexe polymère amphiphile-BMP en milieu aqueux et en absence de solvant organique susceptible de dénaturer la protéine. L'invention comprend également les compositions thérapeutiques de complexe polymère amphiphile-BMP selon l'invention.

Description

COMPLEXES ENTRE UN POLYMERE AMPHIPHILE ET UNE PROTEINE
OSTEOGENIQUE APPARTENANT A LA FAMILLE DES BMPs La présente invention concerne la formation de complexes originaux hydrosolubles entre un polymère amphiphile et une protéine ostéogénique appartenant à la famille des Bone Morphogenetic Proteins, BMPs, complexes stables physiquement et chimiquement et qui de ce fait améliorent la stabilité physique et chimique des BMPs, à la fois in vitro et in vivo.

Les Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sont des facteurs de croissance impliqués dans les mécanismes d'ostéoinduction. Les BMPs appelées également Osteogenic Proteins (OPs) ont été initialement caractérisées par Urist en 1965 (Urist MR. Science 1965; 150, 893). Ces protéines isolées à partir d'os cortical ont la capacité d'induire la formation d'os chez un grand nombre d'animaux (Urist MR. Science 1965; 150, 893).
Les BMPs sont exprimées sous forme de propeptides qui, après maturation post-traductionnelle, ont une longueur comprise entre 104 et 139 résidus. Elles possèdent une grande homologie de séquences entre elles et ont des structures tridimensionnelles similaires. En particulier, elles possèdent 6 résidus cystéine impliqués dans des ponts disulfure intramoléculaires formant un cysteine knot (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287, 103 ;
Schlunegger MP, J. Mol. Biol. 1993; 231, 445). Certaines d'entre elles possèdent une 7e cystéine impliquée également dans un pont disulfure intermoléculaire à l'origine de la formation du dimère (Scheufler C. 2004 J.
Mol.
Biol. 1999; 287:103.).

Sous leur forme active, les BMPs s'assemblent en homodimères, voire en hétérodimères comme cela a été décrit par Israel et al. (Israel DI, Growth Factors. 1996; 13(3-4), 291). Les BMPs dimériques interagissent avec les récepteurs transmembranaires de type BMPR (Mundy et al. Growth Factors, 2004, 22 (4), 233). Cette reconnaissance est à l'origine d'une cascade de signalisation intracellulaire impliquant notamment les protéines Smad aboutissant ainsi à l'activation ou à la répression des gènes cibles.
2 Les BMPs, à l'exception des BMP 1 et 3, jouent un rôle direct et indirect sur la différenciation des cellules mésenchymateuses provoquant leur différenciation en ostéoblastes (Cheng H., J. Bone and Joint Surgery, 2003, 85A 1544-1552). Elles possèdent en outre des propriétés de chimiotactisme et induisent la prolifération, la différentiation et l'angiogénèse.

Certaines BMPs recombinantes humaines et notamment la rhBMP-2 et la rhBMP-7 ont clairement montré une capacité à induire la formation d'os in vivo chez l'homme et ont été approuvées pour certaines applications médicales. Ainsi, la BMP-2 recombinante humaine, dibotermine alfa selon la dénomination commune internationale, est formulée dans les produits commercialisés sous le nom de InFUSE aux Etats-Unis et de InductOs en Europe. Ce produit est prescrit dans la fusion des vertèbres lombaires et la régénération osseuse du tibia pour les fractures dites non-union. Dans le cas d'InFUSE pour la fusion des vertèbres lombaires, l'intervention chirurgicale consiste tout d'abord, à imbiber une éponge de collagène avec une solution de rhBMP-2, puis à placer l'éponge dans une cage creuse, LT Cage, préalablement implantée entre les vertèbres.

La BMP-7 recombinante humaine, eptotermine alpha selon la dénomination commune internationale, a les mêmes indications thérapeutiques que la BMP-2 et constitue la base de deux produits : OP-1 Implant pour les fractures ouvertes du tibia et OP-1 Putty pour la fusion des vertèbres lombaires. OP- 1 Implant se compose d'une poudre contenant de la rhBMP-7 et du collagène à reprendre dans une solution saline à 0,9%. La pâte obtenue est ensuite appliquée au niveau de la fracture lors d'une intervention chirurgicale. OP-1 Putty se présente sous la forme de deux poudres : l'une contenant la rhBMP-7 et du collagène, l'autre de la carboxyméthylcellulose (CMC). Au cours d'une intervention chirurgicale, la CMC est reconstituée avec une solution saline 0,9% et mélangée avec la rhBMP-7 et le collagène. La pâte ainsi obtenue est appliquée sur le site à traiter.

Parmi toutes les protéines actuellement commercialisées, les BMPs se singularisent par leur forte hydrophobicité et leur capacité à
s'agréger ce qui conduit à une très faible solubilité à pH physiologique. Dans le cas de la
3 BMP-2, ces propriétés ont été documentées dans le cadre des études ayant servies à son développement clinique. Elle est peu soluble en conditions physiologiques et a tendance à s'agréger (Schmoekel, 2004 J. Orthop. Res.
2004; 22(2), 376, Friess, W., Drug Delivery Systems Based on Collagen, Shaker Verlag, Thesis Aachen Germany 1999, Schwartz DH, Thesis München Germany 2005). Ainsi, Abbatiello et Porter (Protein Sci. 1997, 6,Suppl 2 99) ont montré que la BMP-2 dans un tampon de faible force ionique devient de plus en plus insoluble lorsque le pH croît au-delà de 4.5. La précipitation de la protéine est observée pour un pH supérieur à 6,5 mais également à des pH
moins élevés en présence d'ions chlorures et/ou sulfates (pH 5.8 à 50 mM
NaCI, and pH 5.5 à 5 mM Na2SO4) comme cela a été montré par Friess (Friess, W., Drug Delivery Systems Based on Collagen, Shaker Verlag, Thesis Aachen Germany 1999). La formulation de la BMP-2 en conditions physiologiques est donc un problème à part entière.

Un autre exemple de ce problème d'instabilité physique des BMPs est mis en évidence par Biopharm dans le brevet US2004132653 avec une protéine de la sous-classe de la BMP-14, le GDF-5 pour Growth and Differentiation Factor, aussi appelé MP-52. Les propriétés du GDF-5 sont très similaires à celles de la BMP-2 et il a été constaté une instabilité du lyophilisat qui a tendance à se condenser et à ne pas pouvoir être redissout totalement lors de la reconstitution de la solution. Ces deux phénomènes sont liés à une agrégation irreversible des protéines. Pour répondre à ce problème, le mannitol est ajouté avant lyophilisation et permet ainsi de prévenir ces problèmes à
l'état solide. Cependant, le mannitol n'apporte qu'une stabilisation faible in vitro et ne prévient pas l'instabilité physique in vivo.

Compte tenu des contraintes imposées par les propriétés physiques de ces facteurs de croissance, le produit InFUSE a du être formulé
à pH acide (tampon acide acétique, pH 4) et en présence d'un tensio-actif, le polysorbate 80 pour assurer la solubilité et la stabilité physique de la rhBMP-2.
Or, les fabricants de médicaments à base de protéines thérapeutiques sont extrêmement concernés par les problèmes de stabilité
physique des protéines. En effet, la formation d'agrégats de BMP peut être à
l'origine :
4 = d'une diminution de la quantité des espèces biologiquement actives, = d'une modification de la bioactivité ou de la vitesse d'absorption, = d'une réponse immunologique potentielle vis-à-vis de ces agrégats, = d'une apparence indésirable due à une opalescence du produit, = d'une obstruction des équipements de filtration et des dispositifs d'injection.

Pour obtenir l'effet thérapeutique souhaité, il est nécessaire d'employer des doses thérapeutiques de BMP très importantes, supérieures d'un facteur 10 000 à la dose physiologique. Ceci est en particulier le cas dans le traitement de la fusion vertébrale avec un produit tel qu'InFUSE puisque plusieurs milligrammes de rhBMP-2 sont administrés. Cette forte quantité de BMP à administrer implique de devoir travailler à des concentrations élevées de BMP en solution, de l'ordre de 1.5 mg/ml. A ces concentrations, les BMPs s'agrègent très facilement et ne sont donc pas stables physiquement. Les solutions apportées emploient des tampons acides et des tensio-actifs. Or du point de vue de l'application thérapeutique, l'emploi d'une solution acide et contenant des tensio-actifs est problématique.

Plusieurs approches ont été développées pour répondre à ces problèmes de stabilité physique et chimique.

Tout d'abord, l'héparine et les héparanes sulfates sont bien connus pour stabiliser les facteurs de croissance dont les BMPs puisque ces polysaccharides sont des molécules endogènes de stabilisation (Ruppert et al.
Eur. J. Biochem. 1996, 237, 295). Cependant, l'héparine et les héparanes sulfates ont une très forte activité anti-coagulante et anti-complémentaire et ne peuvent donc pas être employés dans une composition pharmaceutique.

Hubbell a décrit une approche de greffage de la protéine qui consiste à créer une liaison chimique entre la protéine et un vecteur afin de la stabiliser dans une matrice du type fibrine. Cette liaison est établie par le biais d'une protéine de fusion clivable par les enzymes. Cette voie, rapportée dans la publication Biotechno. Bioeng. 2005, 89, 3, 253, permet effectivement de stabiliser physiquement la protéine en empéchant l'agrégation. Cependant,
5 cette voie conduit à employer un analogue de la BMP-2 qui n'a pas démontré, à ce jour, son efficacité thérapeutique et son innocuité.

Dans le brevet US20050209145, Stupp et al. décrivent des peptides amphiphiles pour la vectorisation de facteurs de croissance, et en particulier de BMP-2. Ces peptides amphiphiles sont constitués d'une chaîne alkyle terminale, d'une séquence peptidique hydrophile et d'un épitope permettant l'adhésion de la BMP-2. Ces peptides s'organisent en solution pour former des structures macromoléculaires de type batonnet dans lesquelles les groupements hydrophobes se regroupent au cceur. Les aminoacides en périphérie permettent d'apporter la compatibilité avec l'eau et l'adhésion de la protéine. Cependant, ces peptides présentent un risque immunologique à
cause de leur structure primaire complexe.

Takaoka et al. se sont intéressés à la vectorisation de la BMP pour des applications de régénération osseuse dans le brevet US6258382. Ces auteurs ont mis au point de nouveaux polymères à base d'acide lactique et/ou glycolique, de p-dioxanone, de polyéthylène glycolique permettant de contrôler la libération de ces protéines. Cependant, ces auteurs n'adressent aucun des problèmes liés à ce facteur de croissance, en terme de stabilité physique ou chimique. De plus, ces polymères ne sont pas soiubles dans l'eau mais adsorbent l'eau pour former des gels. Ces polymères sont en revanche solubles en milieu organique et sont solubilisés dans l'acétone. La préparation de la formulation polymère-BMP-2 nécessite donc l'emploi d'un solvant organique, ce qui représente un risque de dénaturation de la protéine (Nature Biotechnology, 2001, 19, 332).

Dans le brevet US2005/0287135, Wyeth décrit des hyaluronanes modifiés par un groupement hydrophobe, l'alcool benzylique, pour la vectorisation de BMPs. Dans ces polymères, le taux de groupement hydrophobe est compris entre 50 et 100% de telle sorte que le polymère n'est pas soluble dans l'eau mais peut adsorber de l'eau. Dans ce cas, ces polymères hygroscopiques ne peuvent former un complexe hydrosoluble avec la protéine permettant de résoudre les problèmes de stabilité des BMPs. Des formulations du même type sont également décrites dans EP1454640 au nom de Fidia et Genetics Institute, cependant les formulations décrites ne forment
6 pas de complexes, les polysaccharides exemplifiés ne sont pas solubles dans l'eau et comprennent plus de 50 % de groupe esters hydrophobes.

Dans le brevet NZ530701, Brodbeck et al. emploient des PLAGA
pour la vectorisation de BMPs. Ces polymères sont insolubles dans l'eau et ne peuvent donc pas former de complexe hydrosoluble avec la protéine. L'objectif des auteurs est, à l'inverse de la demanderesse, d'insolubiliser, en milieu aqueux, la BMP dans un solide constitué de PLAGA ce qui là encore requiert l'emploi d'un solvant organique lequel représente un risque de dénaturation de la protéine.
A titre d'exemple, on peut citer les travaux de Blanquaert et al. et Barritault et al. publiés sous le titre Effects of heparin-like polymers associated with growth factors on osteoblast proliferation and phenotype expression , 1998, J. Biomed. Mater. Res., vol 44, p. 63-72, décrivent l'utilisation de dextrans modifiés par de la benzylamine supposés interagir avec différents facteurs de croissance. Les polymères sont décrits pour avoir une activité thérapeutique par eux-mêmes. Ces auteurs revendiquent également que certains de ces dextrans et plus particulièrement les dextrans subsitués par des groupes carboxyméthyles (CM), benzylamides (B) et sulfonates (S), (composés CMDBS) permettraient de stimuier la reconstruction osseuse sans ajout de facteur de croissance (1995, Bone, 17, 6, 499-506).

Selon une démarche similaire, dans le brevet FR2794649, Blanchat et al. décrivent des dextrans modifiés par de la benzylamine et des sulfates insolubilisés par réticulation des chaînes de polymères à l'aide de triméthylphosphate. Ces éponges en milieu aqueux servent de réservoirs de BMP puisqu'ils sont capables de retenir cette protéine. Les polymères amphiphiles avant réticulation forment des complexes avec la BMP-2 comme démontré dans un essai d'interaction par électrophorèse sur gel. Cependant, les ratios massiques polymére/BMP utilisés sont très élevés, supérieurs à
5 000. Ces ratios élévés sont employés en raison d'une interaction polymère/protéine très faible qui conduit à la dissociation du complexe en solution. D'ailleurs, la stabilisation chimique ou physique de la BMP n'est pas documentée. De tels ratios sont rédibitoires pour le développement d'un produit pharmaceutique.
7 Il est également connu que la benzylamine peut présenter une certaine toxicité et peut nuire à la biocompatibilité des polymères décrits dans les deux brevets cités précédemment.

La formulation galénique de telles protéines destinées à la reconstruction osseuse doit obligatoirement répondre à des impératifs d'innocuité des excipients et pour atteindre ces impératifs, il est indispensable d'utiliser des composés qui soient biocompatibles mais également d'en limiter la quantité par rapport au principe actif.
Ainsi le problème de la mise au point de formulations injectables permettant de solubiliser et de stabiliser les protéines ostéogéniques comme les BMPs choisies dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 n'est pas résolu de façon satisfaisante.

La présente invention permet de former un complexe hydrosoluble stable entre les protéines ostéogéniques et un polymère amphiphile biocompatible à un ratio massique polymère/BMP inférieur à 700. Ce complexe permet :
= d'éviter l'agrégation des BMPs qui a lieu en raison de leur hydrophobicité à pH physiologique in vitro et in vivo, = de stabiliser les BMPs en présence de cellules à 37 C.
Ce complexe hydrosoluble est formé en milieu totalement aqueux sans recourir à l'usage de solvant organique.

La présente invention concerne donc un complexe polymère amphiphile-BMP, stable physiquement et chimiquement, soluble dans l'eau, caractérisé en ce que :

= les polymères amphiphiles sont constitués d'un squelette polysaccharide hydrophile fonctionnalisé par des substituants hydrophobes et des groupements hydrophiles selon la formule générale I, suivante :
8 Polysaccharide DP = m unités monomère F 1 y R
jh X

= R, R' identiques ou différents représentent une liaison ou une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N
ou/et S, = F, F' identiques ou différents représentent un ester, un thioester, un amide, un carbonate, un carbamate, un éther, un thioéther ou une amine, = X représente un groupement hydrophile choisi dans le groupe constitué
des carboxylates, des sulfates, des sulfonates, des phosphates, des phosphonates, = Y représente un groupement hydrophile choisi dans le groupe constitué des sulfates, des sulfonates, des phosphates des phosphonates, = Hy représente un groupement hydrophobe choisi dans le groupe constitué par :

o les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30, éventuellement insaturés et/ou contenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou S.

o les alkylaryles ou un arylalkyles linéaires ou ramifiés en C8 à
C18, éventuellement insaturés et/ou contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou S.

o les polycycles en C8 à C30 éventuellement insaturé. et/ou contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou S, o à l'exclusion de la benzylamine.
9 = n et o sont compris entre 1 et 3, = h représente la fraction molaire de motif hydrophobe par rapport à une unité saccharidique comprise entre 0.01 et 0.5 = x représente la fraction molaire de groupements hydrophiles par rapport à une unité saccharidique, comprise entre 0 et 2Ø

= y représente la fraction molaire de groupements hydrophiles par rapport à une unité saccharidique, comprise entre 0 et 0.5.

= la BMP est choisie dans le groupe des BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) thérapeutiquement actives, = le ratio massique polymère/BMP est inférieur ou égal à 700.

Dans un mode de réalisation, dans le complexe selon l'invention le polysaccharide est choisi parmi les polysaccharides de formule générale I, telle que précédemment définie, dans laquelle y =0.

Dans un mode de réalisation, dans le complexe selon l'invention le polysaccharide est choisi parmi les polysaccharides de formule générale I, telle que précédemment définie, dans laquelle X représente un carboxylate.
Dans un mode de réalisation, dans le complexe selon l'invention le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le groupe R est choisi dans les groupes suivants :

F F F
O O O O yly 30 OH OH OH OH

Dans un mode de réalisation, elle concerne un complexe caractérisé en ce que le ratio massique polymère/BMP est inférieur ou égal à
600.

5 Dans un mode de réalisation, elle concerne un complexe caractérisé en ce que le ratio massique polymère/BMP est inférieur ou égal à
500.

La concentration de BMP d'usage thérapeutique est d'environ 1.5
10 mg/ml en solution. Lorsque le ratio est supérieur à 700, on obtient des compositions comprenant 1.0 g/mI de polymère amphiphile. A partir de telles concentrations en polymère, les formulations ont un comportement physico-chimique qui n'est plus adapté à une application pharmaceutique, par exemple au niveau de la viscosité.
Elle concerne un complexe caractérisé en ce que la BMP est choisie dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (eptotermine alpha), la BMP-14 et le GDF-5.

Les substituants des polymères amphiphiles sont répartis de façon contrôlée ou statistique. Parmi les polymères ayant une répartition contrôlée des substituants, on peut citer, par exemple, les copolymères à blocs et les copolymères alternés.

Copolymère statistique *-Monomer-Monomer Monomer-Monomer Monomer-Monomer Hydrophobe Hydrophobe Hydrophobe Copolymère à blocs *-Monomer-Monomer Monomer-Monomer Monomer-Monomer-*

Hydrophobe Hydrophobe Hydrophobe Copolymère alterné

*-Monomer -Monomer Monomer -Monomer Monomer -Monomer -*

Hydrophobe Hydrophobe Hydrophobe
11 Ainsi dans un mode de réalisation, l'invention concerne également un complexe polymère amphiphile-BMP caractérisé en ce que le polymère est choisi parmi les polymères dont les substituants sont répartis de façon statistique.
Dans un mode de réalisation, les polysaccharides sont choisis dans le groupe constitué par les hyaluronanes, les alginates, les chitosans, les galacturonanes, la chondroitin-sulfate, les dextrans, les celluloses.

Le groupe des celluloses est constitué des celluloses fonctionnalisées par des acides comme la carboxyméthylcellulose.

Le groupe des dextrans est constitué des dextrans fonctionnalisés par des acides comme le carboxyméthyldextran.
Dans un mode de réalisation, les polysaccharides sont choisis dans le groupe constitué par les hyaluronanes, les alginates, les chitosans.
Ces différents polysaccharides peuvent être représentés comme su it :

ri Galacturonane OH OH
O H~~(D0i HO O
OH NH
Hyaluronane
12 O
RO
RO
OR
O m R = H, Dextran R = CH2COOH ou H, Carboxymethyl Dextran OH
O
HO
NH2 m Chitosan OH OH OH
O O O O *
HO O HO O
OH m Alginate Le polysaccharide peut avoir un degré de polymérisation moyen m compris entre 10 et 10000.
Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation moyen m compris entre 10 et 1000.
Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation moyen m compris entre 10 et 500.
Dans un mode de réalisation, l'invention concerne également un complexe polymère amphiphile-BMP caractérisé en ce que le groupe hydrophobe Hy est choisi dans le groupe constitué par les acides aminés hydrophobes d'origine naturelle, choisis dans le groupe constitué par le tryptophane, la tyrosine, la phénylalanine, la leucine ou l'isoleucine ou leurs dérivés alcools, esters, décarboxylés ou amides.

Dans un mode de réalisation, l'invention concerne également un complexe polymère amphiphile-BMP caractérisé en ce que le groupe hydrophobe Hy est le tryptophane ou un dérivé ester ou amide du tryptophane.
13 Parmi les dérivés du tryptophane, on citera le tryptophanol, le tryptophanamide, le 2-indole-éthylamine.

Dans un mode de réalisation, le complexe polymère amphiphile-BMP selon l'invention est réversible.
Les polymères utilisés sont synthétisés selon les techniques connues de l'Homme de l'art ou achetés auprès de fournisseurs comme par exemple Sigma-Aldrich, NOF Corp. ou CarboMer Inc.

Les BMP sont choisies parmi les BMP recombinantes humaines, obtenues selon les techniques connues de l'Homme de l'art ou achetées auprès de fournisseurs comme par exemple la société Research Diagnostic Inc. (USA).

La BMP est un facteur de croissance très hydrophobe. A pH
physiologique, l'hydrophobie de cette protéine conduit à l'agrégation puis à
la précipitation. Les complexes polymère amphiphile-BMP selon l'invention permettent de stabiliser physiquement cette protéine en solution à pH
physiologique.
On entend par dégradation physique ou chimique tout évènement d'ordre physique, tel que l'agrégation, ou chimique, tel que la protéolyse, conduisant à une diminution de l'activité biologique de la protéine.

Parallèlement, on entend par stabilisation physique ou chimique de la protéine l'action de maintien de l'activité biologique de la protéine.

La stabilité du complexe est suivie par la mesure de la stabilité de la BMP.
La stabilisation de la protéine par un polymère amphiphile peut ainsi être mise en évidence, notamment par la mise en ceuvre des tests suivants :
= un test de mise en évidence du complexe polymère amphiphile-BMP
par coélectrophorèse sur gel
14 = un test de stabilité thermique de la BMP en présence de cellules dans le complexe polymère amphiphile-BMP réalisé à 37 C et à pH neutre = un test de stabilisation physique de la BMP dans ledit complexe à pH
physiologique.

Le test de mise en évidence du complexe polymère amphiphile-BMP par coéléctrophorèse est basé sur le déplacement d'ions sous l'effet d'un champ électrique. Les complexes anioniques migrent vers l'anode et les complexes cationiques se déplacent vers la cathode. Après migration, les protéines sont transférées par capillarité sur membrane de PVDF et révélées par un anticorps spécifique de la protéine reconnu par un deuxième anticorps couplé à la peroxidase. La protéine seule ne migre pas, la protéine complexée au polymère amphiphile migre vers l'anode ou la cathode en fonction de la charge globale du complexe.
Le test de stabilité thermique de la BMP en présence de cellules est réalisé à 37 C - pH neutre et consiste à déposer une solution de BMP dans un milieu de culture contenant des myoblastes C2C12. La concentration en BMP en solution est déterminée par dosage ELISA après le dépôt (J2) et au bout de 5 jours de culture (J7). L'activité bioiogique de la BMP est évaluée par dosage de l'activité de l'alcaline phosphatase produite entre J2 et J7 lors de la différenciation des myoblastes en ostéoblastes.

Le test de stabilisation physique d'une BMP à pH physiologique est basé sur la mise à pH physiologique d'une solution de protéine par échange du tampon d'origine de la protéine, en général à pH acide, par une solution de PBS à pH 7.4. Trois échanges sont réalisés en maintenant la BMP à
concentration constante en fin d'échange. La concentration de la BMP en solution à la fin du processus est déterminée par dosage ELISA après centrifugation. Ce test peut également être réalisé par dilution d'une solution concentrée de BMP-2 avec un tampon fixant le pH à 7,4.

Le complexe polymère amphiphile-BMP selon l'invention est formé
par la mise en solution aqueuse d'une BMP et d'un polymère amphiphile à pH
physiologique en l'absence de tout solvant organique susceptible de dénaturer 5 la protéine. La formation du complexe polymère amphiphile-BMP est spontanée et n'implique pas de liaison covalente entre la BMP et le polymère amphiphile. Cette association se fait par des liaisons faibles qui sont essentiellement des interactions hydrophobes et des interactions ioniques.
Cette formation de complexe ne nécessite aucun solvant organique.
D'autres tests peuvent éventuellement être mis en place pour parfaire la mise en évidence de la formation du complexe polymère amphiphile-BMP selon l'invention.
= un test de maintien de la structure tertiaire de la BMP déterminé par dichroïsme circulaire = un test de stabilité d'une BMP dans le complexe polymère amphiphile-BMP selon l'invention à pH physiologique sous stress. Le stress peut être un mode d'agitation particulier, la présence de sels, etc.
= un test de résistance à des enzymes de protéolyse telle que la thermolysine.

L'un des problèmes résolus par l'invention est une stabilisation accrue de la protéine et donc le maintien de l'activité biologique in vitro et in vivo. Cette activité biologique peut être évaiuée par différents tests mettant en évidence la capacité d'une BMP à différencier les myoblastes en ostéoblastes.
Cette différentiation peut être mesurée par :
= le dosage de l'activité de la phosphatase alcaline produite dans une culture de cellules.
= la coloration des cellules produisant de la phosphatase alcaline.
= RT-PCR de l'ARN de l'osteocalcine produite dans une culture de cellules.

L'invention concerne également une composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend un complexe polymère amphiphile-BMP
selon l'invention.

On entend par composition thérapeutique une composition utilisable en médecine humaine ou vétérinaire.

La composition pharmaceutique selon l'invention est de préférence une composition à application locale pouvant se présenter sous la forme d'un soluté, d'un gel, d'une crème, d'un lyophilisat, d'une poudre ou d'une pâte.

La nature des excipients susceptibles d'être formulés avec le complexe polymère amphiphile-BMP selon l'invention est choisie en fonction de sa forme de présentation selon les connaissances générales du galéniste.

Ainsi, lorsque la composition selon l'invention est sous la forme d'une pâte, celle-ci est par exemple obtenue à partir de produits tels que les carboxyméthylcelluloses (CMC), le tricalcium phospate et le collagène.

D'autres excipients peuvent être utilisés dans cette invention afin d'ajuster les paramètres de la formulation comme un tampon pour ajuster le pH, un agent permettant d'ajuster l'isotonicité, des conservateurs comme le parahydroxybenzoate de méthyle, le parahydroxybenzoate de propyle, le m-crésol, ou le phénol ou encore un agent anti-oxydant comme le chlorhydrate de L-lysine.

Selon l'invention, la composition thérapeutique est caractérisée en ce qu'elle permet une administration d'environ 1,5 mg/ml de BMP.

La présente invention concerne également l'utilisation d'un complexe polymère amphiphile-BMP selon l'invention pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée à induire la formation d'os in-vivo.
Elle concerne également une méthode de traitement thérapeutique à usage humain ou vétérinaire caractérisée en ce qu'elle consiste à
administrer au site de traitement une composition thérapeutique comprenant le complexe polymère amphiphile-BMP selon l'invention.

Synthèse des Polymères amphiphiles Exemple 1: carboxyméthyldextran modifié par l'ester éthylique du tryptophane (PA 1) Ce polymère amphiphile est synthétisé à partir d'un carboxyméthyldextran ayant un degré de substitution en carboxyméthyl par unité saccharidique de 1.0 et une masse molaire moyenne de 60 kg/mol. L'ester éthylique du tryptophane est greffé sur les acides de ce polymère selon une méthode classique de couplage en solvant organique employant le chloroformiate d'éthyle et la N-MéthylMorpholine. Après dilution du milieu réactionnel dans l'eau et réglage du pH à 7 par ajout de NaOH 1 N, le polymère est purifié par ultrafiltration. Le poiymère final est caractérisé par :
x un degré de substitution en TrpOEt par unité saccharidique de 0.45, déterminé par RMN ' H dans D20/NaOD.
x un degré de substitution en carboxylates (méthylcarboxylate) par unité
saccharidique de 0.55, déterminé par dosage potentiométrique.
Exemple 2: carboxyméthyldextran modifié par le tryptophane, sel de sodium (PA 2) Ce polymère amphiphile est obtenu par hydrolyse basique du PA 1. De la soude 1 N (3.79 ml) est ajoutée à une solution aqueuse du polymère amphiphile 1 (64 ml à 31 mg/ml) pour atteindre pH 12.7. La solution obtenue est agitée une nuit à température ambiante. Le polymère est purifié par dialyse contre de l'eau (NaCI 0.9% et H20). Le polymère final est caractérisé par :
X un degré de substitution en TrpONa par unité saccharidique de 0.45, déterminé par RMN ' H dans D2O/NaOD.
x un degré de substitution en carboxylates (méthylcarboxylate, carboxylate du tryptophane) par unité saccharidique de 1.0 déterminé
par dosage potentiométrique.

Exemple 3: carboxyméthyldextran modifié par l'ester éthylique de la phénylalanine (PA 3) Ce polymère amphiphile est synthétisé selon l'exemple 1 à partir d'un carboxyméthyldextran ayant un degré de substitution en carboxyméthyl par unité saccharidique de 1.0 et une masse molaire moyenne de 60 kg/mol. Le polymère final est caractérisé par :
x un degré de substitution en PheOEt par unité saccharidique de 0.45, déterminé par RMN ' H dans D20/NaOD.
x un degré de substitution en carboxylates (méthylcarboxylate) par unité
saccharidique de 0.55, déterminé par dosage potentiométrique.
Exemple 4: carboxyméthyldextran modifié par l'ester méthylique de la tyrosine (PA 4) Ce polymère amphiphile est synthétisé selon l'exemple 1 à partir d'un carboxyméthyldextran ayant un degré de substitution en carboxyméthyl par unité saccharidique de 1.0 et une masse molaire moyenne de 60 kg/mol. Le polymère final est caractérisé par :
x un degré de substitution en TyrOMe par unité saccharidique de 0.45, déterminé par RMN ' H dans D20/NaOD.
x un degré de substitution en carboxylates (méthylcarboxylate) par unité
saccharidique de 0.55, déterminé par dosage potentiométrique.
Exemple 5: acide dextransuccinique modifié par l'ester éthylique du tryptophane (PA 5) Ce polymère amphiphile est synthétisé à partir d'un acide dextransuccinique ayant un degré de substitution en acide succinique par unité saccharidique de 1.0 et une masse molaire moyenne de 70 kg/mol obtenu selon l'article de (Sanchez-Chaves, Manuel et al., Polymer 1998, 39 (13), 2751-2757.). L'ester éthylique du tryptophane est greffé sur les acides de ce polymère selon une méthode classique de couplage en solvant organique employant le chloroformiate d'éthyle et la N-MéthylMorpholine. Après dilution du milieu réactionnel dans l'eau et réglage du pH à 7 par ajout de NaOH 1 N, le polymère est purifié par ultrafiltration. Le polymère final est caractérisé par :

x un degré de substitution en TrpOEt par unité saccharidique de 0.45, déterminé par RMN ' H dans D20/NaOD.
x un degré de substitution en carboxylates (succinic carboxylate) par unité
saccharidique de 0.55, déterminé par dosage potentiométrique.

Contre-exemple 1: carboxyméthyldextran modifié par la dodécylamine (PA 6) Ce polymère amphiphile est synthétisé selon l'exemple 1 à partir d'un carboxyméthyldextran ayant un degré de substitution en carboxyméthyl par unité saccharidique de 1.0 et une masse molaire moyenne de 60 kg/mol. Le polymère final est caractérisé par x un degré de substitution en dodécylamine par unité saccharidique de 0.10, déterminé par RMN ' H dans D20/NaOD.
x un degré de substitution en carboxylates (méthylcarboxylate) par unité
saccharidique de 0.90, déterminé par dosage potentiométrique.
Contre-exemple 2: carboxyméthyldextran modifié par la benzylamine (PA
7) Ce polymère amphiphile est décrit dans le brevet FR2794649A, il est caractérisé par :
x un degré de substitution en benzylamine par unité saccharidique de 0.45, x un degré de substitution en carboxylates (méthylcarboxylate) par unité
saccharidique de 0.55.

Affinité de la BMP-2 pour un Polymère Amphiphile par coélectrophorèse Préparation du complexe BMP-2/Polymère Amphiphile 5 pl d'une solution de BMP-2 à 0.28 mg/ml dans un tampon H20 / AcN / TFA
(64.9 / 35 / 0.1 %) sont ajoutés à 7 pl d'une solution de PA à 100 mg/ml tamponnée à pH 7.4. Cette solution est complétée à 14 pl par une solution de NaCI 0.9%. Cette solution a une concentration en BMP-2 de 0.1 mg/ml et un ratio BMP-2/PA de 1/500. Cette solution est mise sous agitation douce 30 minutes à température ambiante.

Mise en évidence du complexe BMP-2/Polymère Amphiphile La solution de BMP-2 / PA est diluée au 20ème dans du tampon de migration (solution de tris-acétate à pH 7). 2 pl de la solution diluée sont ensuite ajoutés 10 à 8 pl d'eau et 7 pl de tampon de charge (glycérol, tris-acétate et bleu de bromophénol dans de l'eau). Ces 17 pI contenant 10 ng de BMP-2 et 5 pg de PA sont déposés dans un puit d'un gel d'agarose 0.8%. La cuve d'éléctrophorèse est fermée et le générateur est réglé à 30V. La migration dure 1 heure.
15 Après migration, le gel est transféré sur une membrane de PVDF placé sur l'anode sous un champ électrique (20 minutes, 15V, Trans-Blot SD de Bio-Rad). La membrane est saturée avec du lait écrémé pendant 1 heure à
température ambiante puis incubée avec des anticorps primaires de la BMP-2 (une nuit à 4 C) et enfin incubée avec des anticorps secondaires, rabbit anti 20 goat HRP (1 heure à température ambiante). La révélation se fait par réaction de l'HRP sur le Opti-4CN. La révélation est stoppée lorsque la coloration est suffisante puisque le produit de la réaction absorbe dans le visible.

Lorsque la BMP-2 forme un complexe avec le PA, le complexe est détecté
sous forme d'un spot unique à 0,7 cm du dépôt (migration vers l'anode).
Lorsque la BMP-2 est seule ou ne forme pas de complexe avec le PA, elle est détectée à l'endroit du dépôt et n'a donc pas migré.

Les résultats pour les 5 polymères sont résumés dans le tableau suivant.

Polymère Amphiphile Migration Aucun Non PA 1 Oui PA 2 Oui PA 3 Oui PA 4 Oui PA 5 Oui PA 6 Non PA 7 Non Stabilité de la BMP-2 en présence de Polymère Amphiphile à pH
physiologique Préparation du complexe BMP-2 / Polymère Amphiphile A partir d'une solution de BMP-2 à 0.28 mg/ml dans un tampon H20 / AcN / TFA (64.9 / 35 / 0.1 %), sont préparées différentes solutions :

1. une solution de BMP-2 à 0.084 mg/ml obtenue par dilution dans l'eau 2. une solution de BMP-2 / Polymère Amphiphile à 0.084 / 9.8 mg/ml obtenue par dilution de la BMP-2 avec une solution de PA à 14 mg/ml.
Chaque solution est ensuite diluée au 1/10 par une solution de PBS 10 mM à
pH 7.4 et 300 mOsm puis reconcentrée par centrifugation sur cellule Microcon (YM10, 10 kD, 500 pl). Cette opération est répétée deux fois. A l'issue de ces trois lavages, chaque solution est centrifugée et la concentration en BMP-2 dans le surnageant est déterminée par dosage ELISA.

Une partie de la solution de BMP-2 à 0.084 mg/mi ne subit aucun lavage afin de servir de contrôle. Une autre partie de la solution de BMP-2 à 0.084 mg/ml subit trois cycles de lavage contre une solution de HCI 1 mM (pH 3). Ce tampon est connu pour stabiliser la BMP-2 mais n'est pas compatible avec une application pharmaceutique.

Le dosage ELISA de la solution de BMP-2 n'ayant subi aucun lavage donne une concentration en BMP-2 de 83.4 pg/ml. Cette valeur correspond à 100%
de BMP-2. Les concentrations déterminées par ELISA des autres solutions à
l'issue des trois lavages contre du PBS sont rapportées à cette valeur de la BMP-2 non lavée. Les pourcentages de BMP-2 retrouvée sont rassemblés dans le tableau suivant.

Solution % BMP-2 présente Les PA capables de former un complexe avec la BMP-2 rendent la BMP-2 stable à pH physiologique. En absence de PA, la BMP-2 n'est plus présente en solution à pH physiologique. De la même façon, en présence d'un PA qui ne forme pas de complexe avec la BMP-2, la protéine n'est plus présente en solution.

Stabilité et activité biologique de la BMP-2 en présence de Polymère Amphiphile en milieu de culture à 37 C et à pH physiologique A JO, les cellules C2C12 (cellules musculaires de souris) sont ensemencées (7000 cellules/puit) dans des plaques de culture 96 puits contenant du DMEM à
10% SVF et 1% ATB puis sont mises à l'étuve pendant 24h. A J1, après adhésion des cellules, le milieu est remplacé par du DMEM à 2% SVF et 1%
ATB pendant 24h. A J2, le milieu est remplacé par du DMEM à 2% SVF et 1%
ATB supplémenté avec une solution de BMP-2 seule (0.3 pg/ml) ou une solution du complexe BMP-2 / PA 1(0.3 / 150 pg/ml, ratio 1/500). Le complexe est préparé par dilution de la BMP-2 et du PA séparément dans du DMEM à
2% SVF et 1% ATB. Le mélange protéine / PA 1 est laissé à reposer pendant 1 h avant dépôt.

A J7, soit 5 jours après dépôt, le surnageant est prélevé afin de doser la BMP-résiduelle par ELISA.

% BMP-2 dans le surnageant Dépôt Dépôt + 5 jours BMP-2 seule 100 2 Après 5 jours au contact des cellules, il reste moins de 5% de BMP-2 seule alors qu'il reste plus de 40% de BMP-2 lorsqu'elle est complexée avec PA 1.

A J7, dans cette même expérience, les cellules sont lavées 2 fois au PBS puis lysées par 50 pl de tampon de lyse et subissent 3 cycles de congélation (-80 C) / décongélation (37 C). L'activité enzymatique de la phosphatase alcaline est mesurée dans les lysats sur un substrat, la p-nitrophényl phosphate qui absorbe à 405 nm. Cette activité est ramenée à la quantité de protéines mesurée par microBCA et est donc exprimée en nmol pnP/min.pg de protéines.

Activité ALP
(nmol pnP /.min. g protéine) BMP-2 seule 0,9 0,12 BMP-2/PA 1 1,7 0,05 La BMP-2 est stabilisée par le complexe dans les conditions du vivant au-delà
de 5 jours alors qu'elle n'est pas stable seule sur une telle durée.

L'activité de la BMP-2 se révélant par un processus lent de différentiation cellulaire, le complexe de la BMP-2 est plus actif in vitro que la BMP-2 seule.
Protection par le polymère de la BMP-2 contre la dégradation enzymatique.

Préparation du complexe BMP-2/polymère 19 pI d'une solution de BMP-2 à 0,315 mg/ml dans un tampon acétonitrile TFA
sont mélangés à 4,6 pl d'une solution de polymère (PA 2) à 66 mg/ml, à 50 pl de Tris 50 mM pH 7,5, à 60 pl de thermolysine à 25 pg/ml et à 366,4 pl H20.
Une solution similaire mais ne contenant pas de polymère est préparée comme contrôle. Dans ces deux solutions, la thermolysine représente 25% de la protéine (masse/masse).

Cinétique de digestion :

Les solutions de BMP-2 seule et de complexe contenant de la thermolysine sont incubées à 60 C pendant 6 heures. Des échantillons de 20 pl sont prélevés à T=O, 20 min, 40 min, 1 h, 2h et 6h. A chaque prélèvement, on ajoute immédiatement 5 pI d'EDTA à 250 mM soit une concentration de 50 mM finale pour inhiber la réaction enzymatique. L'échantillon est ensuite congelé à-20 C.

Révélation La révélation se fait au moyen d'un western-blot réalisé à partir d'un gel SDS-Page 15%. 7 pl de chaque prélèvement (contenant 65 ng de BMP-2) sont mélangés à 7 pl de tampon de charge Laemli contenant du SDS. Les 10 échantillons sont ensuite dénaturés 10 min à 95 C puis déposés sur le gel SDS-Page 15%. Comme contrôle, des quantités équivalentes de BMP-2 (65 ng) et de Thermolysine (16,25 ng) sont aussi déposés sur le gel. La cuve d'éléctrophorèse est fermée et le générateur est réglé à 125V. La migration dure 1 heure 15.

15 Après migration, le gel est transféré sur une membrane de PVDF par un système de transfert BioRad pendant 1 h à 100 volts. La membrane est ensuite saturée avec du lait écrémé pendant 1 heure à température ambiante puis incubée avec des anticorps primaires anti-BMP-2 (une nuit à 4 C) et enfin incubée avec des anticorps secondaires couplés à l'HRP (1 heure à
20 température ambiante). La révélation se fait par réaction de l'HRP sur le Opti-4CN. La révélation est stoppée lorsque la coloration est suffisante puisque le produit de la réaction absorbe dans le visible.

Lorsque la BMP-2 est seule, on observe l'apparition d'une bande de poids moléculaire plus faible dès 20 minutes ce qui traduit la dégradation de la 25 protéine par la Thermolysine. En présence de polymère, cette bande n'est pas présente ce qui indique que le polymère protége la protéine contre la dégradation.

Après avoir vérifié que le polymère n'inhibe pas l'action de la thermolysine, il peut être conclu que les résultats obtenus montrent donc que le polymère PA 2 protège bien la BMP-2 contre la dégradation enzymatique.

Solubilisation de la BMP-2 sous forme de complexe dans l'eau à pH
physiologique.

Solubilité de la BMP-2 à pH physiologigue La BMP-2 a un point isoélectrique de 8,5 ce qui signifie que, au pH
physiologique de 7,4, la BMP-2 est proche de son minimum de solubilité. Cela peut être mis en évidence par une expérience de neutralisation d'une solution acide de BMP-2.

Une solution limpide de BMP-2 à 1,5 mg/mL est préparée en tampon acide (tampon Infuse, pH 4,5). Cette solution est neutralisée par ajout d'un tampon phospate pour atteindre un pH de 7,4 (concentration finale en BMP-2 de 1,2 mg/mL). A pH 7,4, la BMP-2 a précipité et les agrégats formés sont visibles. La neutralisation a conduit à l'obtention d'une suspension.

Solubilité du complexe BMP-2/PA2 à pH physiologique Une solution limpide de BMP-2 à 1,5 mg/mL est préparée en tampon acide (tampon Infuse, pH 4,5). A cette solution est ajouté le PA2 lyophilisé pour atteindre une concentration en PA2 de 75 mg/mL. Cette solution de complexe BMP-2/PA2 est ensuite neutralisée par ajout d'un tampon phosphate pour atteindre un pH de 7,4 (concentration finale en BMP-2 de 1,2 mg/mL et de 60 mg/mL en PA2). A pH 7,4, la BMP-2 est entièrement soluble et aucun agrégat n'est visible. La solubilité de la BMP-2 à pH physiologique sous forme de complexe BMP-2/PA2 est donc fortement augmentée.

Claims (20)

1. Complexe polymère amphiphile-BMP, stable physiquement et chimiquement, soluble dans l'eau, caractérisé en ce que :

= ~ les polymères amphiphiles sont constitués d'un squelette polysaccharide hydrophile fonctionnalisé par des substituants hydrophobes et des groupements hydrophiles selon la formule générale I suivante :

.cndot. R, R' identiques ou différents représentent une liaison ou une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N
ou/et S, .cndot. F, F' identiques ou différents représentent un ester, un thioester, un amide, un carbonate, un carbamate, un éther, un thioéther ou une amine, .cndot. X représente un groupement hydrophile choisi dans le groupe constitué
des carboxylates, des sulfates, des sulfonates, des phosphates, des phosphonates, .cndot. Y représente un groupement hydrophile choisi dans le groupe constitué des sulfates, des sulfonates, des phosphates des phosphonates, .cndot. Hy représente un groupement hydrophobe choisi dans le groupe constitué par :

~ les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30, éventuellement insaturés et/ou contenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou S.

~ les alkylaryles ou un arylalkyles linéaires ou ramifiés en C8 à
C18, éventuellement insaturés et/ou contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou S.

~ les polycycles en C8 à C30 éventuellement insaturé et/ou contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou S, ~ à l'exclusion de la benzylamine.
.cndot. n et o sont compris entre 1 et 3, .cndot. h représente la fraction molaire de motif hydrophobe par rapport à une unité saccharidiquecomprise entre 0.01 et 0.5 .cndot. x représente la fraction molaire de groupements hydrophiles par rapport à une unité saccharidique, comprise entre 0 et 2Ø

.cndot. y représente la fraction molaire de groupements hydrophiles par rapport à une unité saccharidique, comprise entre 0 et 0.5.

~ la BMP est choisie dans le groupe des BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) thérapeutiquement actives, ~ le ratio massique polymère/BMP est inférieur ou égal à 700.
2. Complexe selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polysaccharide est choisi parmi les polysaccharides de formule générale I, dans laquelle y =0.
3. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polysaccharide est choisi parmi les polysaccharides de formule générale I, dans laquelle X représente un carboxylate.
4. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes,, caractérisé en ce que le ratio massique polymère/BMP est inférieur ou égal à 600.
5. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 3,, caractérisé en ce que le ratio massique polymère/BMP est inférieur ou égal à
500.
6. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la BMP est choisie dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), Ia BMP-4, Ia BMP-7 (Eptotermine alpha), Ia BMP-14 et Ia GDF-5.
7. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polymère est choisi parmi les polymères dont les substituants sont répartis de façon statistique.
8. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les polysaccharides sont choisis dans le groupe constitué par les hyaluronanes, les alginates, les chitosans, les galacturonanes, la chondroitin-sulfate, les dextrans, les celluloses.
9. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le groupe des celluloses est constitué des celluloses fonctionnalisées par des acides comme la carboxyméthylcellulose.
10. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le groupe des dextrans est constitué des dextrans fonctionnalisés par des acides comme le carboxyméthyldextran.
11. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les polysaccharides sont choisis dans le groupe constitué par les hyaluronanes, les alginates, les chitosans.
12. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le groupe hydrophobe Hy est choisi dans le groupe constitué par les acides aminés hydrophobes d'origine naturelle, choisis dans le groupe constitué par le tryptophane, la tyrosine, la phénylalanine, la leucine ou l'isoleucine ou leurs dérivés alcools, esters, décarboxylés ou amides.
13. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le groupe Hydrophobe Hy, est le tryptophane ou un dérivé ester ou amide du tryptophane.
14. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la formation du complexe polymère amphiphile-BMP est réversible.
15. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la BMP est stable à pH physiologique.
16. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la BMP présente une activité biologique à
37°C et à pH neutre.
17. Procédé de préparation du compiexe polymère amphiphile-BMP selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on prépare ce complexe polymère/BMP en milieu aqueux et en absence de solvant organique susceptible de dénaturer la protéine.
18. Composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend un complexe polymère amphiphile-BMP selon l'une quelconque des revendications 1 à 16.
19. Composition thérapeutique selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'elle permet une administration d'environ 1,5 mg par ml de BMP.
20. Utilisation d'un complexe polymère amphiphile-BMP selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée à induire la formation d'os in vivo.
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Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2914305B1 (fr) * 2007-03-29 2009-07-03 Proteins & Peptides Man Dextran fonctionnalise par des amino-acides hydrophobes.
US20120041079A1 (en) * 2006-09-26 2012-02-16 Adocia Dextran functionalized by hydrophobic amino acids
AU2007234612B2 (en) 2006-12-14 2013-06-27 Johnson & Johnson Regenerative Therapeutics, Llc Protein stabilization formulations
US7678764B2 (en) 2007-06-29 2010-03-16 Johnson & Johnson Regenerative Therapeutics, Llc Protein formulations for use at elevated temperatures
JP5323832B2 (ja) 2007-08-07 2013-10-23 アドバンスト・テクノロジーズ・アンド・リジェネレイティブ・メディスン・エルエルシー 酸性水溶液中にｇｄｆ−５を含むタンパク質製剤
JP5599778B2 (ja) 2008-04-14 2014-10-01 デピュイ・シンセス・プロダクツ・エルエルシー 液体緩衝ｇｄｆ−５製剤
CN102065882A (zh) * 2008-04-14 2011-05-18 阿道恰公司 包含生长因子/两亲性聚合物复合物、阳离子的可溶性盐和有机支持物的成骨组合物
WO2009127939A1 (fr) * 2008-04-14 2009-10-22 Adocia Composition osteogenique comprenant un facteur de croissance un sel soluble de cation et un support organique
FR2934999B1 (fr) * 2008-08-13 2011-07-29 Adocia Polysaccharides fonctionnalises par des derives du tryptophane
CN102196822A (zh) 2008-09-26 2011-09-21 阿道恰公司 由多糖和hbp构成的复合物
FR2948573B1 (fr) 2009-07-31 2011-11-18 Adocia Nouvelle forme d'administration de complexes de proteines osteogeniques
US8529933B2 (en) 2009-07-27 2013-09-10 Warsaw Orthopedic, Inc. Biphasic calcium phosphate cement for drug delivery
JP2011030455A (ja) * 2009-07-30 2011-02-17 Uha Mikakuto Co Ltd トリプトファン−ヒアルロン酸食品素材及びトリプトファン高含有ペプチド−ヒアルロン酸食品素材並びにそれらの製造方法
FR2952375A1 (fr) * 2009-11-10 2011-05-13 Adocia Polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles substitues par esterification par un derive d'alcool hydrophobe
FR2956116A1 (fr) * 2010-02-09 2011-08-12 Adocia Complexes polysaccharide/bmp-7 solubles a ph physiologique
WO2011097342A1 (fr) * 2010-02-04 2011-08-11 University Of Utah Research Foundation Hyaluronanne à modification hydrophobe et procédés de fabrication et d'utilisation de celui-ci
JP5950458B2 (ja) * 2010-02-09 2016-07-13 アドシア 少なくとも３価のスペーサーにより保有される少なくとも２つの疎水性基により官能化されたアニオン性多糖類
FR2958647B1 (fr) * 2010-04-08 2013-08-23 Adocia Polysaccharides comportant des groupes fonctionnels carboxyles substitues par un derive hydrophobe porte par un spacer au moins trivalent.
JP5837930B2 (ja) * 2010-07-30 2015-12-24 ビオファーム・ゲゼルシャフト・ツァ・ビオテヒノロジッシェン・エントヴィックルング・フォン・ファルマカ・エムベーハー 創傷の治癒を加速する医薬送達装置及び増殖因子製剤
CN101942101A (zh) * 2010-09-02 2011-01-12 四川大学 含疏水烷基侧链的两亲性聚电解质接枝物制备方法
JP2012082180A (ja) * 2010-10-14 2012-04-26 Nagoya Univ 骨再生用自己組織化ペプチドハイドロゲル
JP5950477B2 (ja) 2011-08-10 2016-07-13 アドシア 少なくとも１種の基礎インスリンの注射溶液
CN104114155B (zh) 2012-01-09 2019-02-15 阿道恰公司 Ph为7并且至少包含pi为5.8至8.5之基础胰岛素和经取代共聚(氨基酸)的可注射溶液
US9815912B2 (en) * 2012-03-19 2017-11-14 University Of Massachusetts Hydrophilic modification of water insoluble polysaccharide as surface-active agents
US20150314003A2 (en) 2012-08-09 2015-11-05 Adocia Injectable solution at ph 7 comprising at least one basal insulin the isoelectric point of which is between 5.8 and 8.5 and a hydrophobized anionic polymer
SG10201703742SA (en) * 2012-11-13 2017-06-29 Adocia Substituted anionic compounds consisting of a backbone consisting of a discrete number of saccharide units
KR20150082640A (ko) 2012-11-13 2015-07-15 아도시아 치환된 음이온성 화합물을 포함하는 속효성 인슐린 제형
US9795678B2 (en) 2014-05-14 2017-10-24 Adocia Fast-acting insulin composition comprising a substituted anionic compound and a polyanionic compound
FR3020947B1 (fr) 2014-05-14 2018-08-31 Adocia Composition aqueuse comprenant au moins une proteine et un agent solubilisant, sa preparation et ses utilisations
FR3043557B1 (fr) 2015-11-16 2019-05-31 Adocia Composition a action rapide d'insuline comprenant un citrate substitue
CN105820270A (zh) * 2016-03-30 2016-08-03 中国药科大学 硫酸化透明质酰脂肪烃胺

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2808405A (en) 1955-03-11 1957-10-01 Ohio Commw Eng Co Acylated amino acid esters of dextran products and method of making same
DE4136324A1 (de) 1991-11-05 1993-05-13 Hoechst Ag Dextranderivate als adsorptionsmittel fuer gallensaeuren, mit gallensaeuren beladene dextranderivate und verfahren zu deren herstellung sowie deren anwendung als arzneimittel
US6573251B2 (en) 1994-03-30 2003-06-03 Denis Barritault Drug and pharmaceutical composition for the treatment of lesions of the nervous system and fractions enriched in heparan sulfate
DE4433101A1 (de) 1994-09-16 1996-03-21 Bauer Kurt Heinz Prof Dr Wasserlösliche Dextranfettsäureester und ihre Verwendung als Solubilisatoren
CA2192725C (fr) 1995-12-28 2004-04-20 Kenji Tsujihara Derives de la camptothecine
US20040132653A1 (en) 1997-01-30 2004-07-08 Biopharm Gmbh Lyophilized composition of bone morphogenetic factor human MP52
US5977076A (en) 1997-04-14 1999-11-02 Anderson; Byron E. Method and material for inhibiting complement
IL135415A0 (en) * 1997-10-03 2001-05-20 Macromed Inc Biodegradable low molecular weight triblock poly(lactide-co-glycolide) polyethylene glycol copolymers having reverse thermal gelation properties
FR2772382B1 (fr) 1997-12-11 2000-03-03 Solutions Derives de dextrane, leur procede de preparation et leurs applications comme medicaments a action biologique specifique
US6423345B2 (en) * 1998-04-30 2002-07-23 Acusphere, Inc. Matrices formed of polymer and hydrophobic compounds for use in drug delivery
FR2781485B1 (fr) * 1998-07-21 2003-08-08 Denis Barritault Polymeres biocompatibles leur procede de preparation et les compositions les contenant
JP4548623B2 (ja) 1999-02-24 2010-09-22 多木化学株式会社 生体材料
CA2372994C (fr) 1999-06-04 2010-03-23 Alza Corporation Compositions de gel implantables et procede de fabrication
FR2794649B1 (fr) * 1999-06-11 2003-04-11 Solutions Biomateriau a base d'un derive de dextrane insolubilise et d'un facteur de croissance, son procede de preparation et ses applications
EP1481695A1 (fr) * 1999-10-15 2004-12-01 Genetics Institute, LLC Formulations a base d'acide hyaluronique aux fins de l'administration de proteines osteogenes
US7189392B1 (en) * 1999-10-15 2007-03-13 Genetics Institute, Llc Injectable carrier formulations of hyaluronic acid derivatives for delivery of osteogenic proteins
WO2002055185A2 (fr) * 2000-10-19 2002-07-18 Eidgenoess Tech Hochschule Copolymeres blocs pour systemes auto-assembles multifonctionnels
EP1420792A4 (fr) * 2001-08-01 2007-10-10 Smithkline Beecham Corp Produits et excipients pour l'administration de medicaments
TWI282283B (en) * 2002-05-17 2007-06-11 Wyeth Corp Injectable solid hyaluronic acid carriers for delivery of osteogenic proteins
AU2004296181A1 (en) 2003-12-05 2005-06-23 Northwestern University Self-assembling peptide amphiphiles and related methods for growth factor delivery
FR2891149B1 (fr) * 2005-09-26 2007-11-30 Biodex Sarl Composition pharmaceutique a action cicatrisante comprenant un derive de dextrane soluble et un facteur de croissance derive des plaquettes.
FR2914305B1 (fr) 2007-03-29 2009-07-03 Proteins & Peptides Man Dextran fonctionnalise par des amino-acides hydrophobes.
MX2008012837A (es) * 2006-04-07 2008-10-17 Adocia Polisacaridos bifuncionalizados.
US20080102128A1 (en) * 2006-07-28 2008-05-01 Flamel Technologies, Inc. Modified-release microparticles based on amphiphilic copolymer and on active principles(s) and pharmaceutical formulations comprising them

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