CN102196822A - 由多糖和hbp构成的复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由多糖和HBP构成的复合物，所述多糖由(1，6)和/或(1，4)和/或(1，3)和/或(1，2)类型的糖苷键构成并且通过至少一个可成盐的或成盐的色氨酸衍生物进行官能化。本发明还涉及包含根据本发明的复合物的药物组合物，以及由(1，6)和/或(1，4)和/或(1，3)和/或(1，2)类型的糖苷键构成并且通过至少一个可成盐的或成盐的色氨酸衍生物进行官能化的多糖在制备稳定的HBP的药物制剂中的用途。

Description

由多糖和HBP构成的复合物
本发明涉及治疗性蛋白质的制剂，和更特别地涉及与肝素相结合的蛋白质(称为肝素结合蛋白(HBP))的制剂，所述肝素结合蛋白在体内以复合物的形式与肝素相联合，这允许其稳定化和其体内活性的维持。
肝素是携带羧酸根和硫酸根官能团的天然多糖，其总电荷为阴离子的。但是，该多糖因其抗凝活性而知名，因为它参与凝血酶和抗凝血酶III之间的复合物的形成，并且该抗凝活性与治疗用途，例如在瘢痕形成、生长调节、骨重构的治疗中的治疗用途不相容。
这些HBP中的一些已成为药物开发的目标。然而，已知这些蛋白质是在物理上(聚集)和在化学上(酶促或化学降解)不稳定的。该不稳定性可以在制剂中和/或在施用部位处表现出来。它可以引起免疫反应或效力丧失。为了补偿活性的丧失，采用诸如增加施用的剂量或频率的解决办法。这些解决办法不是令人满意的，尤其是由于这些蛋白质的高价格。
例如，Genentech公司开发了VEGF制剂，其用于糖尿病性足溃疡的瘢痕形成。进行了第一个临床研究，其中每两天进行治疗施用。第二个研究以每天施用来进行，这毫无疑问地是为了答复对于每两天进行应用而言太短的VEGF作用持续时间的问题。
此外，已证实，可能在生长因子和聚合物之间形成复合物，以便使其稳定、增加其溶解度和/或增加其活性。
因此，在申请者的专利FR0509803中，可以证实，在以其短形式的PDGF-BB和聚合物之间的复合物的形成尤其使得能够增加非常疏水的该蛋白质的溶解度。
然而，以其短形式的PDGF-BB与肝素的结合为PDGF-AA的1/100(Lustig F等人，Journal of Molecular Recognition，1999，12，112-120)，因此，不可以将其认为是属于HBP家族的生长因子。
在已知相对亲水的FGF的情况下，可以证实，形成与聚合物的复合物可以有助于其细胞活性(Rouet等人，Journal of BiomedicalMaterials research，2006，78A，792-797)，但所使用的聚合物是硫酸化的，因为它们通过硫酸苄胺进行官能化并因此具有与药物制剂不相容的抗凝活性。
Logeart-Avramoglou D等人在Biomedical Pharmacology 2002，63，129-137的文章中还描述了通过苄胺和/或硫酸盐进行修饰的右旋糖酐。处于溶液中的这些聚合物与TGFβ1形成复合物，如在通过凝胶电泳的相互作用测试中所显示的。然而，非硫酸化的聚合物即使在大于2000的比率下也不表现出真正的相互作用。在硫酸化的聚合物的情况下，对于具有抗凝特性的高度硫酸化的聚合物，可以证明相互作用。
此外，还已知，苄胺可以具有某种毒性，并且可以损害在前面提及的两个专利中所描述的聚合物的生物相容性。
治疗目的的蛋白质的盖仑氏制剂应当必须满足赋形剂的无害的要求，并且为了达到这些要求，必要的是，使用生物相容的化合物，但还限制其相对于活性成分而言的量。
HBP属于八个蛋白质家族，它们具有非常不同的大小、生物化学特性和活性，然而它们都能够以复合物的形式与肝素相联合(Bernfield M.等人，Annu.Rev.Biochem.，1999，68，729-777)。
在这些蛋白质中，包括尤其属于下列家族的蛋白质：
-激素，
-生长因子。
可以将这些不同的家族定义如下：
“激素”意指由内分泌系统产生的信使蛋白质。在通过血液或淋巴液运送遍及整个生物体或者运送到生物体外部后，这些蛋白质随后远距离地起作用。在激素之中，包括生长激素(hGH：人生长激素)和甲状旁腺激素(PTH)。
“生长因子”意指通常在生物体中产生的蛋白质，其刺激细胞的增殖或其分化。在生长因子之中，包括诸如下列的蛋白质：转化生长因子β1和β2(TGF-β)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)、肝素结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF：肝素结合性EGF-样生长因子)、成纤维细胞生长因子1至14(FGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、神经生长因子β(NGF-β)、结缔组织生长因子(CTGF)、胎盘生长因子(PIGF)、R-spondin 1至4、和血管内皮生长因子A和B(VEGF)。
所描述的所有复合物均用与肝素具有结构或生物学相似性的聚合物来制备。
通过本发明所解决的问题是，鉴定出了非常有限的生物相容性多糖家族，这些生物相容性多糖能够与HBP形成复合物，以便尤其是，使其稳定并增加其溶解度，而该聚合物不具有肝素的抗凝生物学活性。
此外，观察到，为了增加该多糖对于所述蛋白质的亲和力和其对于HBP的选择性，不需要进一步增加聚合物的两亲性，这与在申请FR0509803中所叙述的解决办法相反。
此外，为了抵消过大的疏水性，在上面所提及的申请中所叙述的解决办法在于，除了疏水基团之外，还在多糖链上嫁接亲水基团X或Y。
这些结果是更加令人惊讶的，因为通过嫁接可成盐的或成盐的疏水基团例如具有酸官能团的色氨酸残基，增加了该多糖对于该蛋白质的亲和力和对于HBP的选择性，而不减少起始多糖的羧基官能团的数目。
通过选择这些取代基，大大地增加了对于HBP的选择性。
因此，本发明涉及被色氨酸或色氨酸衍生物取代的多糖用于稳定HBP的用途，其中所述色氨酸或色氨酸衍生物是可成盐的或成盐的。
更特别地，本发明涉及所述多糖在制备稳定的HBP的药物制剂中的用途。
本发明还涉及由多糖和HBP构成的复合物。
根据本发明的多糖由(1，6)和/或(1，4)和/或(1，3)和/或(1，2)类型的糖苷键构成。它们可以是中性的，即不携带酸官能团，或者是阴离子的，即携带酸官能团。
它们通过至少一个色氨酸或色氨酸衍生物的残基进行官能化，所述色氨酸或色氨酸衍生物的残基标注为Trp：
-所述色氨酸衍生物通过与酸官能团的偶联而嫁接或连接至所述多糖，所述酸官能团可以是阴离子多糖的酸官能团和/或由连接臂R所携带的酸官能团，所述连接臂R通过官能团F而与该多糖相连接，所述官能团F由于连接臂R和该中性或阴离子多糖的-OH官能团之间的偶联而产生，
-F为酯官能团、硫酯官能团、酰胺官能团、碳酸酯官能团、氨基甲酸酯官能团、醚官能团、硫醚官能团或胺官能团，
-R为包含1-18个碳的链，其任选地是支化的和/或不饱和的，包含一个或多个杂原子，例如O、N或/和S，并且具有至少一个酸官能团，
-Trp为L-或D-色氨酸或L-或D-色氨酸衍生物的残基，其从该色氨酸的胺和至少一个由基团R所携带的酸和/或由该阴离子多糖所携带的酸之间的偶联而产生，所述色氨酸或色氨酸衍生物是可成盐的或成盐的。
在一个实施方案中，Trp为D构型的色氨酸或色氨酸衍生物的残基。
在一个实施方案中，Trp为L构型的色氨酸或色氨酸衍生物的残基。
所述HBP选自：
-激素，例如生长激素(hGH：人生长激素)或甲状旁腺激素(PTH)，
-生长因子，例如诸如下列的蛋白质：转化生长因子β1和β2(TGF-β)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)、肝素结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF：肝素结合性EGF-样生长因子)、成纤维细胞生长因子1至14(FGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、神经生长因子β(NGF-β)、结缔组织生长因子(CTGF)、胎盘生长因子(PIGF)、R-spondin1至4、和血管内皮生长因子A和B(VEGF)。
根据本发明，所述官能化的多糖可以符合下述通式：
Figure BDA0000056492100000051
式I
-F由于连接臂R和该中性或阴离子多糖的-OH官能团之间的偶联而产生，为酯官能团、硫酯官能团、酰胺官能团、碳酸酯官能团、氨基甲酸酯官能团、醚官能团、硫醚官能团或胺官能团，
-R为包含1-18个碳的链，其任选地是支化的和/或不饱和的，包含一个或多个杂原子，例如O、N或/和S，并且具有至少一个酸官能团，
-Trp为L-或D-色氨酸衍生物的残基，其从该色氨酸或色氨酸衍生物的胺和至少一个由基团R所携带的酸和/或由该阴离子多糖所携带的酸之间的偶联而产生，所述色氨酸或色氨酸衍生物是可成盐的或成盐的，
-n表示被Trp取代的R的摩尔份数，并且为0.2-0.7，
-o表示被Trp取代的多糖的酸官能团的摩尔份数，并且为0.2-0.7，
-i表示由基团R所携带的酸官能团的摩尔份数/糖单元，并且为0-2，
-j表示由该阴离子多糖所携带的酸官能团的摩尔份数/糖单元，并且为0-1，
-(i+j)表示酸官能团的摩尔份数/糖单元，并且为0.5-2，
-当R不被Trp取代时，那么基团R的所述酸为阳离子的羧酸盐，所述阳离子优选地为碱金属阳离子，例如Na+或K+，
-当该多糖为阴离子多糖时，当该多糖的酸官能团不被Trp取代时，那么所述酸官能团与阳离子成盐，所述阳离子优选地为碱金属例如Na或K的阳离子，
-所述多糖处于中性pH。
在一个实施方案中，F为酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或醚。
在一个实施方案中，该多糖占多数地由(1，6)类型的糖苷键构成。
在一个实施方案中，该占多数地由(1，6)类型的糖苷键构成的多糖为右旋糖酐。
在一个实施方案中，该多糖占多数地由(1，4)类型的糖苷键构成。
在一个实施方案中，该占多数地由(1，4)类型的糖苷键构成的多糖选自出芽短梗霉聚糖、藻酸盐、乙酰透明质酸、木聚糖、聚半乳糖醛酸或水溶性纤维素。
在一个实施方案中，该多糖为出芽短梗霉聚糖。
在一个实施方案中，该多糖为藻酸盐。
在一个实施方案中，该多糖为乙酰透明质酸。
在一个实施方案中，该多糖为木聚糖。
在一个实施方案中，该多糖为聚半乳糖醛酸。
在一个实施方案中，该多糖为水溶性纤维素。
在一个实施方案中，该多糖占多数地由(1，3)类型的糖苷键构成。
在一个实施方案中，该占多数地由(1，3)类型的糖苷键构成的多糖为凝乳聚糖。
在一个实施方案中，该多糖占多数地由(1，2)类型的糖苷键构成。
在一个实施方案中，该占多数地由(1，2)类型的糖苷键构成的多糖为菊粉。
在一个实施方案中，该多糖占多数地由(1，4)和(1，3)类型的糖苷键构成。
在一个实施方案中，该占多数地由(1，4)和(1，3)类型的糖苷键构成的多糖为葡聚糖。
在一个实施方案中，该多糖占多数地由(1，4)和(1，3)和(1，2)类型的糖苷键构成。
在一个实施方案中，该占多数地由(1，4)和(1，3)和(1，2)类型的糖苷键构成的多糖为甘露聚糖。
在一个实施方案中，根据本发明的多糖的特征在于，基团R选自下列基团：
Figure BDA0000056492100000071
或其碱金属阳离子盐。
在一个实施方案中，根据本发明的多糖的特征在于，所述色氨酸或色氨酸衍生物选自色氨酸、色氨醇(tryptophanol)、色氨酰胺(tryptophanamide)、2-吲哚乙胺以及其碱金属阳离子盐。
该取代基，色氨酸或色氨酸衍生物，是可成盐的或成盐的取代基，也就是说，它具有至少一个亲水的、阴离子或阳离子的官能团，即能够产生羧酸盐、醇化物或胺盐的酸、醇或胺官能团。
所述多糖可以具有10-10000的聚合度m。
在一个实施方案中，它具有10-1000的聚合度m。
在另一个实施方案中，它具有10-500的聚合度m。
在一个实施方案中，根据本发明的复合物的特征在于，质量比“多糖/HBP”为0.5至500，优选地1至300。
在一个实施方案中，根据本发明的复合物的特征在于，质量比“多糖/HBP”为0.5至100，优选地1至10。
在一个实施方案中，根据本发明的复合物的特征在于，所述HBP选自激素，例如生长激素(hGH：人生长激素)或甲状旁腺激素(PTH)。
在一个实施方案中，根据本发明的复合物的特征在于，所述HBP选自生长因子，例如诸如下列的蛋白质：转化生长因子β1和β2(TGF-β)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)、肝素结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF：肝素结合性EGF-样生长因子)、成纤维细胞生长因子1至14(FGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、神经生长因子β(NGF-β)、结缔组织生长因子(CTGF)、胎盘生长因子(PIGF)、R-spondin1至4、和血管内皮生长因子A和B(VEGF)。
本发明还涉及通过下列方式来制备所述多糖的方法：将前面所定义的色氨酸衍生物嫁接在中性多糖上，这通过该色氨酸或色氨酸衍生物的胺官能团和经由将前面所定义的携带至少一个酸官能团的基团R嫁接在该多糖的醇官能团上而获得的酸官能团之间的偶联来进行，从而获得其中j＝0的式I的多糖。
在一个实施方案中，根据本发明的多糖通过下列方式来获得：将前面所定义的色氨酸衍生物嫁接在阴离子多糖的酸官能团上，这通过该色氨酸或色氨酸衍生物的胺官能团和由该阴离子多糖所携带的酸官能团之间的偶联来进行，从而获得其中i＝0的式I的多糖。
在一个实施方案中，当该多糖为阴离子多糖时，可以将基团R嫁接在该多糖的醇官能团上，并且色氨酸或色氨酸衍生物的嫁接可以：
-通过本领域技术人员熟知的保护和去保护反应，选择性地在基团R的酸官能团上进行，从而获得其中o＝0的式I的多糖，或者
-共同地在所述两种类型的酸官能团上进行，从而获得其中n＞0并且o＞0的式I的多糖。
在上面所描述的所有实施方案中，在偶联反应之后，经由本领域技术人员熟知的方法，通过成盐作用来进行未与色氨酸衍生物反应的酸官能团的中和，从而获得碱金属(优选地，Na或K)阳离子的盐。
本发明还涉及药物组合物，其包含前面所描述的根据本发明的复合物。
本发明还涉及前面所描述的根据本发明的药物组合物，其特征在于，它通过干燥和/或冻干而获得。
HBP可以是外源的，即它由根据本发明的组合物提供。它还可以是内源的，例如生长因子，其将会在瘢痕形成的第一阶段期间分泌到伤口中并且将可以通过在伤口中在体内形成根据本发明的复合物而稳定化。
根据所针对的病理学状况，将HBP用于局部或全身的治疗。
在局部和全身释放的情况下，所考虑的施用方式为通过静脉内、皮下、皮内、透皮、肌内、口服、鼻、阴道、眼、颊、肺等的途径。
根据本发明的药物组合物要么以液体的形式(以水溶液)，要么以粉末、植入物或薄膜的形式。此外，它们还包含本领域技术人员熟知的常规的药学赋形剂。
根据病理学状况和施用方式，所述药物组合物有利地可以另外还包含允许将它们配制成凝胶、海绵、可注射的溶液、可饮用的溶液、冻干片(lyoc)等形式的赋形剂。
本发明还涉及前面所描述的根据本发明的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是可以以支架、可植入型生物材料的薄膜或“涂层”、植入物的形式进行施用的。
实施例：
A- 聚合物的合成
实施例1：通过色氨酸钠盐进行修饰的右旋糖酐甲基羧酸钠(聚合物1)的合成。
将70g(即1295mmol的羟基官能团)具有大约40kg/mol的重均摩尔质量的右旋糖酐(Fluka)以42g/L溶解在水中。向该溶液中添加130mL 10N NaOH(1295mmol NaOH)。将混合物带至35℃，随后添加201g(1727mmol)氯乙酸钠。将反应介质的温度以0.5℃/分钟带至60℃，随后维持在60℃ 100分钟。用200mL水稀释反应介质，用乙酸中和，并且通过在5kD的PES膜上逆6体积的水进行超滤来施行纯化。最终的溶液通过干提取物来进行计量，以测定聚合物的浓度；随后通过在50/50(V/V)的水/丙酮中的酸/碱含量测定来进行计量，以测定甲基羧酸根的取代度。
根据干提取物：[聚合物]＝51.5mg/g。
根据酸/碱含量测定：羟基官能团被甲基羧酸根官能团取代的取代度为1.04/糖基元。
使右旋糖酐甲基羧酸钠溶液通过Purolite树脂(阴离子的)以获得右旋糖酐甲基羧酸，其然后冻干18小时。
将14.5g右旋糖酐甲基羧酸(即66mmol的甲基羧酸官能团)以57g/L溶解在DMF中，随后冷却至0℃。然后，添加6.67g(66mmol)NMM和7.15g(66mmol)EtOCOCl。在反应10分钟后，添加6.06g(30mmol)TrpOH。然后，将介质加热至10℃，并维持在该温度下30分钟。然后，添加340g/L(8.97g，132mmol)的在水中的咪唑溶液，将反应介质短暂地加热至30℃。然后，用70mL水稀释反应介质，随后在孔隙率1的烧结玻璃上，接着在孔隙率3的烧结玻璃上进行过滤，从而它成为澄清的。将该溶液在10kD PES膜上逆10体积的0.9％NaCl溶液，随后逆6体积的水进行超滤。通过干提取物来测定聚合物1溶液的浓度。将一部分溶液冻干，并且在D2O中通过1H NMR进行分析，以测定所嫁接的色氨酸的DS。
根据干提取物：[聚合物]＝54mg/g。
根据1H NMR：通过色氨酸进行修饰的酸的摩尔份数为0.38。
实施例2：通过色氨酸钠盐进行修饰的出芽短梗霉聚糖甲基羧酸钠(聚合物2)的合成。
将8g(即148mmol的羟基官能团)具有大约100kg/mol的重均摩尔质量的出芽短梗霉聚糖(Fluka)以42g/L溶解在水中。向该溶液中添加15mL 10N NaOH(148mmol NaOH)。将混合物带至35℃，随后添加23g(198mmol)氯乙酸钠。将反应介质的温度以0.5℃/分钟带至60℃，随后维持在60℃ 100分钟。用200mL水稀释反应介质，用乙酸中和，并且通过在5kD的PES膜上逆6体积的水进行超滤来施行纯化。最终的溶液通过干提取物来进行计量，以测定聚合物的浓度；随后通过在50/50(V/V)的水/丙酮中的酸/碱含量测定来进行计量，以测定甲基羧酸根的取代度。
根据干提取物：[聚合物]＝31.5mg/g。
根据酸/碱含量测定：羟基官能团被甲基羧酸根官能团取代的取代度为1.17/糖基元。
使出芽短梗霉聚糖甲基羧酸钠溶液通过Purolite树脂(阴离子的)以获得出芽短梗霉聚糖甲基羧酸，其然后冻干18小时。
将3.51g出芽短梗霉聚糖甲基羧酸(即18mmol的羧甲基酸官能团)以57g/L溶解在DMF中，随后冷却至0℃。然后，添加1.81g(18mmol)NMM和1.94g(18mmol)EtOCOCl。在反应10分钟后，添加1.40g(7mmol)TrpOH。然后，将介质加热至10℃，并维持在该温度下30分钟。然后，添加340g/L(2.43g，36mmol)的在水中的咪唑溶液，将反应介质短暂地加热至30℃。然后，用70mL水稀释反应介质，随后在孔隙率1的烧结玻璃上，接着在孔隙率3的烧结玻璃上进行过滤，从而它成为澄清的。将该溶液在10kD PES膜上逆10体积的0.9％NaCl溶液，随后逆6体积的水进行超滤。通过干提取物来测定聚合物2溶液的浓度。将一部分溶液冻干，并且在D2O中通过1H NMR进行分析，以测定所嫁接的色氨酸的DS。
根据干提取物：[聚合物]＝17.2mg/g。
根据1H NMR：通过色氨酸进行修饰的酸的摩尔份数为0.40。
实施例3：通过色氨酸乙酯进行修饰的右旋糖酐甲基羧酸钠(聚合物3)的合成。
聚合物3为通过L-色氨酸乙酯进行修饰的右旋糖酐甲基羧酸钠，其根据实施例1中所描述的方法，通过使用L-色氨酸乙酯代替L-色氨酸钠盐，从具有40kg/mol的重均摩尔质量的右旋糖酐(Pharmacosmos)开始来获得。
实施例4：通过苯丙氨酸乙酯进行修饰的右旋糖酐甲基羧酸钠(聚合物4)的合成。
聚合物4为通过L-苯丙氨酸乙酯进行修饰的右旋糖酐甲基羧酸钠，其根据实施例1中所描述的方法，通过使用L-苯丙氨酸乙酯代替L-色氨酸钠盐，从具有40kg/mol的重均摩尔质量的右旋糖酐(Pharmacosmos)开始来获得。
B- 通过共同电泳来证明聚合物对于肝素结合蛋白的亲和力
实施例3：1/500的“蛋白质/聚合物”比率
比率为1/500的“蛋白质/聚合物”复合物的制备
将1.5μg蛋白质添加至750μg聚合物、15μl 10×迁移缓冲液(tris-乙酸盐，pH 7)。用H2O将该溶液补足至150μl。将该溶液在环境温度下温育20分钟。将5μl的包含50ng蛋白质和25μg聚合物的该第二溶液在5μl 1×迁移缓冲液中进行稀释。制备仅包含该蛋白质或该聚合物的类似溶液作为对照。
该蛋白质和该聚合物之间的复合物的证明
将蛋白质/聚合物的溶液(10μl)与3μl加样缓冲液(在水中的甘油、tris-乙酸盐和溴酚蓝)相混合。将包含50ng蛋白质和25μg聚合物的这些13μl置于0.8％琼脂糖凝胶的孔中。以类似的方式放置对照溶液(仅蛋白质或聚合物)。合上电泳槽，并将电发生器调至30V。迁移持续1小时。
在迁移后，在环境温度下，在2小时期间，用Apelex系统通过毛细作用将凝胶转移至PVDF膜上。然后，在环境温度下用脱脂乳使该膜饱和1小时，随后与针对该蛋白质的兔的一抗进行温育(于4℃下过夜)，并最后与二抗即山羊抗兔-HRP一起进行温育(在环境温度下1小时)。通过HRP对于Opti-4CN的反应来进行揭示。当着色足够时通过在水中漂洗来终止揭示，因为反应产物吸收可见光。
当该蛋白质是单独的或未与该聚合物形成复合物时，如果其是阴离子的，它可以迁移，或者如果其是阳离子的，它停留在上样的地方。因而，要么在加样孔范围内，要么在离上样处0.3-0.4cm处以单个点的形式检测到该蛋白质。当该蛋白质与该聚合物形成复合物时，该复合物通过聚合物的电荷而被更强烈地拖曳并向阳极移动。在离上样处0.7cm处以单个点的形式检测到该复合物。
用下列物质而获得的结果总结在下面的表I中：在实施例1中获得的聚合物1，在实施例2中获得的聚合物2，以及选自细胞粘附分子、激素、凝血蛋白、结合肝素的生长因子、结合生长因子的蛋白、细胞因子和脂类代谢蛋白的蛋白质。
用不结合肝素的蛋白(IGF-1)以及在实施例1和实施例2中获得的聚合物1和2而获得的结果，以及用上面提及的肝素结合蛋白以及未用色氨酸取代的聚合物而获得的结果，作为相反实施例，也总结在下面的表I中。
表I
Figure BDA0000056492100000131
所获得的结果显示，被色氨酸取代的右旋糖酐甲基羧酸盐即聚合物1(实施例1)或被色氨酸取代的出芽短梗霉聚糖甲基羧酸盐即聚合物2(实施例2)使得能够与结合肝素的蛋白形成复合物，然而未取代的右旋糖酐甲基羧酸盐(相反实施例1)则不允许如此。
所获得的结果还显示，被色氨酸取代或未被色氨酸取代的右旋糖酐甲基羧酸盐(实施例1和相反实施例1)并不与不结合肝素的生长因子形成复合物。
实施例4：1/1的蛋白质/聚合物比率
比率为1/1的“蛋白质/聚合物”复合物的制备
将1.5μg蛋白质添加至1.5μg聚合物、3μl 10×迁移缓冲液(tris-乙酸盐，pH 7)。用H2O将该溶液补足至60μl。将该溶液在环境温度下温育20分钟。将2μl的包含50ng蛋白质和50ng聚合物的该第二溶液在8μl 1×迁移缓冲液中进行稀释。
该蛋白质和该聚合物之间的复合物的证明
将蛋白质/聚合物的溶液(10μl)与3μl加样缓冲液(在水中的甘油、tris-乙酸盐和溴酚蓝)相混合。将包含50ng蛋白质和50ng聚合物的这些13μl置于0.8％琼脂糖凝胶的孔中。合上电泳槽，并将电发生器调至30V。迁移持续1小时。
在迁移后，在环境温度下，在2小时期间，用Apelex系统通过毛细作用将凝胶转移至PVDF膜上。然后，在环境温度下用脱脂乳使该膜饱和1小时，随后与针对该蛋白质的兔的一抗进行温育(于4℃下过夜)，并最后与二抗即山羊抗兔-HRP一起进行温育(在环境温度下1小时)。通过HRP对于Opti-4CN的反应来进行揭示。当着色足够时通过在水中漂洗来终止揭示，因为反应产物吸收可见光。
当该蛋白质是单独的或未与该聚合物形成复合物时，如果其是阴离子的，它可以迁移，或者如果其是阳离子的，它停留在上样的地方。因而，要么在加样孔范围内，要么在离上样处0.3-0.4cm处以单个点的形式检测到该蛋白质。当该蛋白质与该聚合物形成复合物时，该复合物通过聚合物的电荷而被更强烈地拖曳并向阳极移动。在离上样处0.7cm处以单个点的形式检测到该复合物。
用聚合物1、3和4以及两种生长因子(FGF-2和NGF-β)而获得的结果总结在下面的表II中。
所有的“聚合物/蛋白质”复合物均以1/1的质量比进行研究。
表II
该测试使得能够证明，聚合物1和HBP之间的相互作用是足够强的，从而使得能够减少聚合物的量，这对于药物开发目的来说是有利的。聚合物3和4与所测试的两种HBP没有足够强的相互作用来获得比率为1/1的复合物。
C -通过ITC来证明聚合物对于肝素结合蛋白的亲和力
实施例5：PTH(1-34)与肝素和聚合物1的相互作用
在文献(Kamerzell 2007)中已证实，在ITC(等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry))实验期间，PTH(1-84)以300nM的Kd结合肝素。在相同的条件下，我们证实了，PTH(1-34)以227nM的Kd与肝素相互作用。
以在4.8mM柠檬酸盐(pH＝5.3)，42mM NaCl的缓冲液中2μM的浓度，将肝素置于小室中。以208.6μM的浓度，将PTH(1-34)置于注射器中。进行50次5μl的注射，并且将结果调整至n个独立位点的模式，它们使得能够计算出227nM的Kd。
在类似的条件下，以在4.8mM柠檬酸盐(pH＝5.3)，42mM NaCl的缓冲液中0.5μM的浓度，将聚合物1置于小室中。以191μM的浓度，将PTH(1-34)置于注射器中。进行50次5μl的注射，并且将结果调整至n个独立位点的模式，它们使得能够计算出6.9μM的Kd，这证实了聚合物1与PTH的相互作用，该相互作用接近于肝素的相互作用。
D- 配制实施例
实施例6：“聚合物/肝素结合蛋白”复合物的获得
在干净的区域中进行下列操作。将5g在实施例1中所描述的聚合物(聚合物1)的冻干物溶解在50mL水中，从而产生溶液1(100mg/mL的聚合物1的浓度)。平行地，将10μg VEGF冻干物溶解在5μL水中，从而产生溶液2(2mg/mL的VEGF的浓度)。在环境温度下，将5μL溶液1与5μL溶液2相混合，从而形成溶液3，其包含浓度为50mg/mL的聚合物1和浓度为1mg/mL的VEGF。将溶液3在0.22μm的滤器上进行过滤，从而导致获得无菌溶液。在溶液3中复合物的形成可以通过共同电泳来证明。
总之，根据本发明的聚合物和肝素结合蛋白之间的复合物通过在环境温度下简单地混合水溶液来形成，而无需添加有机溶剂。
实施例7：“聚合物/肝素结合蛋白”复合物的获得
进行在实施例6中所描述的操作，以便获得比率为1/10的“聚合物1/VEGF”复合物，其中使用1μL的溶液1(其用水补足至5μL)和5μL的溶液2。获得10μL的溶液4，其包含浓度为10mg/mL的聚合物1和浓度为1mg/mL的VEGF。
实施例8：“聚合物/肝素结合蛋白”复合物的获得
进行在实施例6中所描述的操作，以便获得比率为1/2的“聚合物1/VEGF”复合物，其中使用0.2μL的溶液1(其用水补足至5μL)和5μL的溶液2。获得10μL的溶液5，其包含浓度为2mg/mL的聚合物1和浓度为1mg/mL的VEGF。
实施例9：“聚合物/肝素结合蛋白”复合物的获得
用在实施例2中所描述的聚合物(聚合物2)和作为肝素结合蛋白的FGF-2来进行在实施例6中所描述的操作。获得“聚合物2/FGF-2”复合物的各种不同水溶液，其中“聚合物2/FGF-2”比率从1至100变动。
实施例10：“聚合物/肝素结合蛋白”复合物的获得
在干净的区域中进行下列操作。将5g在实施例2中所描述的聚合物(聚合物2)的冻干物溶解在100mL水中，从而产生溶液1(50mg/mL的聚合物1的浓度)。将10μL该溶液引入到50μL的烧瓶中。随后，在环境温度下，向该溶液中添加10μg VEGF冻干物。所获得的溶液包含浓度为50mg/mL的聚合物2和浓度为1mg/mL的VEGF。该溶液在温和地搅拌15分钟后成为澄清的，并且可以在0.22μm的滤器上进行过滤，从而导致获得无菌溶液。在最终溶液中复合物的形成可以通过共同电泳来证明。
相反地，通过向10μL 1mg/mL VEGF溶液中添加500μg冻干的聚合物2获得了相同的最终溶液。
总之，根据本发明的聚合物和肝素结合蛋白之间的复合物可以通过在环境温度下向蛋白质或聚合物的水溶液中简单地添加聚合物或蛋白质的冻干物来形成，而无需添加有机溶剂。

Claims (24)

1.由被色氨酸或色氨酸衍生物取代的多糖和HBP构成的复合物，其特征在于，所述多糖选自占多数地由(1，6)和/或(1，4)和/或(1，3)和/或(1，2)类型的糖苷键构成的、中性或阴离子的、至少通过色氨酸或色氨酸衍生物进行官能化的多糖，所述色氨酸或色氨酸衍生物标注为Trp：
-所述色氨酸或色氨酸衍生物通过与酸官能团的偶联而嫁接或连接至所述多糖，所述酸官能团可以是阴离子多糖的酸官能团和/或由连接臂R所携带的酸官能团，所述连接臂R通过官能团F而与该多糖相连接，所述官能团F由于连接臂R和该中性或阴离子多糖的-OH官能团之间的偶联而产生，
-F为酯官能团、硫酯官能团、酰胺官能团、碳酸酯官能团、氨基甲酸酯官能团、醚官能团、硫醚官能团或胺官能团，
-R为包含1-18个碳的链，其任选地是支化的和/或不饱和的，包含一个或多个杂原子，例如O、N或/和S，并且具有至少一个酸官能团，
-Trp为L-或D-色氨酸或L-或D-色氨酸衍生物的残基，其从该色氨酸的胺和至少一个由基团R所携带的酸和/或由该阴离子多糖所携带的酸之间的偶联而产生，
-所述色氨酸或色氨酸衍生物是可成盐的或成盐的，并且选自色氨酸、色氨醇、色氨酰胺、2-吲哚乙胺以及其盐，
-所述HBP选自：
-激素，例如生长激素(hGH：人生长激素)或甲状旁腺激素(PTH)，
-生长因子，例如诸如下列的蛋白质：转化生长因子β1和β2(TGF-β)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)、肝素结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF：肝素结合性EGF-样生长因子)、成纤维细胞生长因子1至14(FGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、神经生长因子β(NGF-β)、结缔组织生长因子(CTGF)、胎盘生长因子(PIGF)、R-spondin1至4、和血管内皮生长因子A和B(VEGF)。
2.根据权利要求1的复合物，其特征在于，所述多糖选自通式I的多糖：
Figure FDA0000056492090000021
式I
-F由于连接臂R和该中性或阴离子多糖的-OH官能团之间的偶联而产生，为酯官能团、硫酯官能团、酰胺官能团、碳酸酯官能团、氨基甲酸酯官能团、醚官能团、硫醚官能团或胺官能团，
-R为包含1-18个碳的链，其任选地是支化的和/或不饱和的，包含一个或多个杂原子，例如O、N或/和S，并且具有至少一个酸官能团，
-Trp为L-或D-色氨酸衍生物的残基，其从该色氨酸或色氨酸衍生物的胺和至少一个由基团R所携带的酸和/或由该阴离子多糖所携带的酸之间的偶联而产生，
-n表示被Trp取代的R的摩尔份数，并且为0.2-0.7，
-o表示被Trp取代的多糖的酸官能团的摩尔份数，并且为0.2-0.7，
-i表示由基团R所携带的酸官能团的摩尔份数/糖单元，并且为0-2，
-j表示由该阴离子多糖所携带的酸官能团的摩尔份数/糖单元，并且为0-1，
-(i+j)表示酸官能团的摩尔份数/糖单元，并且为0.5-2，
-当R不被Trp取代时，那么基团R的所述酸为阳离子的羧酸盐，所述阳离子优选地为碱金属阳离子，例如Na+或K+，
-当该多糖为阴离子多糖时，当该多糖的酸官能团不被Trp取代时，那么所述酸官能团与阳离子成盐，所述阳离子优选地为碱金属例如Na或K的阳离子，
所述多糖处于中性pH。
3.根据前一项权利要求的复合物，其特征在于，F为酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或醚。
4.根据前述权利要求中任一项的复合物，其特征在于，所述多糖占多数地由(1，6)类型的糖苷键构成。
5.根据权利要求4的复合物，其特征在于，所述占多数地由(1，6)类型的糖苷键构成的多糖为右旋糖酐。
6.根据权利要求1至3中任一项的复合物，其特征在于，所述多糖占多数地由(1，4)类型的糖苷键构成。
7.根据权利要求6的复合物，其特征在于，所述占多数地由(1，4)类型的糖苷键构成的多糖选自出芽短梗霉聚糖、藻酸盐、乙酰透明质酸、木聚糖、聚半乳糖醛酸或水溶性纤维素。
8.根据权利要求1至3中任一项的复合物，其特征在于，所述多糖占多数地由(1，3)类型的糖苷键构成。
9.根据权利要求8的复合物，其特征在于，所述占多数地由(1，3)类型的糖苷键构成的多糖为凝乳聚糖。
10.根据权利要求1至3中任一项的复合物，其特征在于，所述多糖占多数地由(1，2)类型的糖苷键构成。
11.根据权利要求10的复合物，其特征在于，所述占多数地由(1，2)类型的糖苷键构成的多糖为菊粉。
12.根据权利要求1至3中任一项的复合物，其特征在于，所述多糖占多数地由(1，4)和(1，3)类型的糖苷键构成。
13.根据权利要求12的复合物，其特征在于，所述占多数地由(1，4)和(1，3)类型的糖苷键构成的多糖为葡聚糖。
14.根据权利要求1至3中任一项的复合物，其特征在于，所述多糖占多数地由(1，4)和(1，3)和(1，2)类型的糖苷键构成。
15.根据权利要求14的复合物，其特征在于，所述占多数地由(1，4)和(1，3)和(1，2)类型的糖苷键构成的多糖为甘露聚糖。
16.根据前述权利要求中任一项的复合物，其特征在于，基团R选自下列基团：
Figure FDA0000056492090000041
或其碱金属阳离子盐。
17.根据前述权利要求中任一项的复合物，其特征在于，比率“多糖/HBP”为0.5至500，优选地1至300。
18.根据前述权利要求中任一项的复合物，其特征在于，比率“多糖/HBP”为0.5至100，优选地1至10。
19.根据权利要求1至18中任一项的复合物，其特征在于，所述HBP选自激素，例如生长激素(hGH：人生长激素)或甲状旁腺激素(PTH)。
20.根据权利要求1至18中任一项的复合物，其特征在于，所述HBP选自生长因子，例如诸如下列的蛋白质：转化生长因子β1和β2(TGF-β)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)、肝素结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF：肝素结合性EGF-样生长因子)、成纤维细胞生长因子1至14(FGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、神经生长因子β(NGF-β)、结缔组织生长因子(CTGF)、胎盘生长因子(PIGF)、R-spondin1至4、和血管内皮生长因子A和B(VEGF)。
21.包含根据前述权利要求中任一项的复合物的药物组合物。
22.根据前一项权利要求的药物组合物，其特征在于，它通过干燥和/或冻干而获得。
23.被色氨酸或色氨酸衍生物取代的多糖用于稳定HBP的用途，所述多糖选自占多数地由(1，6)和/或(1，4)和/或(1，3)和/或(1，2)类型的糖苷键构成的、中性或阴离子的、至少通过色氨酸或色氨酸衍生物进行官能化的多糖，所述色氨酸或色氨酸衍生物标注为Trp：
-所述色氨酸或色氨酸衍生物通过与酸官能团的偶联而嫁接或连接至所述多糖，所述酸官能团可以是阴离子多糖的酸官能团和/或由连接臂R所携带的酸官能团，所述连接臂R通过官能团F而与该多糖相连接，所述官能团F由于连接臂R和该中性或阴离子多糖的-OH官能团之间的偶联而产生，
-F为酯官能团、硫酯官能团、酰胺官能团、碳酸酯官能团、氨基甲酸酯官能团、醚官能团、硫醚官能团或胺官能团，
-R为包含1-18个碳的链，其任选地是支化的和/或不饱和的，包含一个或多个杂原子，例如O、N或/和S，并且具有至少一个酸官能团，
-Trp为L-或D-色氨酸或L-或D-色氨酸衍生物的残基，其从该色氨酸的胺和至少一个由基团R所携带的酸和/或由该阴离子多糖所携带的酸之间的偶联而产生，
-所述色氨酸或色氨酸衍生物是可成盐的或成盐的，并且选自色氨酸、色氨醇、色氨酰胺、2-吲哚乙胺以及其盐。
24.多糖在制备稳定的HBP的药物制剂中的用途，所述多糖被色氨酸或色氨酸衍生物取代，其特征在于，所述多糖选自占多数地由(1，6)和/或(1，4)和/或(1，3)和/或(1，2)类型的糖苷键构成的、中性或阴离子的、至少通过色氨酸或色氨酸衍生物进行官能化的多糖，所述色氨酸或色氨酸衍生物标注为Trp：
-所述色氨酸或色氨酸衍生物通过与酸官能团的偶联而嫁接或连接至所述多糖，所述酸官能团可以是阴离子多糖的酸官能团和/或由连接臂R所携带的酸官能团，所述连接臂R通过官能团F而与该多糖相连接，所述官能团F由于连接臂R和该中性或阴离子多糖的-OH官能团之间的偶联而产生，
-F为酯官能团、硫酯官能团、酰胺官能团、碳酸酯官能团、氨基甲酸酯官能团、醚官能团、硫醚官能团或胺官能团，
-R为包含1-18个碳的链，其任选地是支化的和/或不饱和的，包含一个或多个杂原子，例如O、N或/和S，并且具有至少一个酸官能团，
-Trp为L-或D-色氨酸或L-或D-色氨酸衍生物的残基，其从该色氨酸的胺和至少一个由基团R所携带的酸和/或由该阴离子多糖所携带的酸之间的偶联而产生，
-所述色氨酸或色氨酸衍生物是可成盐的或成盐的，并且选自色氨酸、色氨醇、色氨酰胺、2-吲哚乙胺以及其盐。
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