KR20110061639A - 폴리사카라이드 및 ｈｐｂ로 구성된 복합체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 폴리사카라이드 및 HBP로 구성된 복합체에 관한 것으로서, 상기 폴리사카라이드는 하나 이상의 염화가능한 또는 염화된 트립토판 유도체로 관능화된, (1,6) 및/또는 (1,4) 및/또는 (1,3) 및/또는 (1,2) 유형의 글리코시드 결합으로 이루어진 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 복합체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이며, 하나 이상의 염화가능한 또는 염화된 트립토판 유도체로 관능화된, (1,6) 및/또는 (1,4) 및/또는 (1,3) 및/또는 (1,2) 유형의 글리코시드 결합으로 이루어진 폴리사카라이드의, 안정한 HBP의 약학 제제를 제조하기 위한 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 치료적 단백질의 제형, 특히 헤파린-결합 단백질(HBP: Heparin-Binding Protein)로 알려진 헤파린에 결합하는 단백질의 제형에 관한 것이며, 이는 복합체의 형태로 헤파린과 생체내에서 조합되며, 상기 단백질을 안정화시키고 상기 단백질의 생체내 활성을 유지시킨다.
헤파린은 카복실레이트 및 설페이트 관능기를 포함하는 천연 폴리사카라이드이며, 이의 전체 전하는 음이온성이다. 그러나, 상기 폴리사카라이드는 트롬빈과 항트롬빈 III 사이의 복합체의 형성에 개입하기 때문에, 그의 항응고 활성으로 알려져 있으며, 이러한 항응고 활성은 치료적 용도, 예를 들어 상처의 아물기, 성장 조절 또는 골 복원 치료에 적합하지 않다.
상기 HBP의 일부는 약학적 개발의 대상이 되어 왔다. 그러나, 상기 단백질은 물리적으로 불안정하고(응집) 화학적으로 불안정한(효소적 또는 화학적 분해) 것으로 알려져 있다. 이러한 불안정성은 제형에서 및/또는 투여 부위에서 나타날 수 있다. 이는 면역 반응을 야기할 수도 있고 효능의 손실을 야기할 수도 있다. 활성의 손실을 보상하기 위하여, 용액은 예를 들어 그 용량 또는 투여의 빈도를 증가시킴으로써 이용된다. 이는 특히 상기 단백질의 높은 비용 때문에 만족스럽지 못하다.
예를 들어, Genentech 회사는 당뇨병성 족부궤양을 아물게 하기 위한 VEGF 제형을 개발하였다. 첫번째 임상 연구에서는, 이틀마다 투여되어 치료가 수행되었다. 두번째 임상 연구에서는, 이틀마다의 적용에 대해 너무 짧은, VEGF의 작용 동안의 문제에 확실히 대답하기 위하여, 매일 투여되었다.
또한, 안정화, 가용성 증가 및/또는 활성 증가의 목적을 위해, 성장인자와 중합체 사이에 복합체를 형성할 수 있다는 것이 입증되었다.
따라서, 본 출원인의 특허 FR 05/09803에서, 짧은 형태의 PDGF-BB와 중합체 사이에 복합체의 형성이 특히 상기의 매우 항응고성인 단백질의 가용성을 증가시킬 수 있다는 것이 입증되었다.
그러나, 짧은 형태의 PDGF-BB는 헤파린에 PDGF-AA보다 100배 덜 결합하므로(Lustig F. et al., Journal of Molecular Recognition, 1999, 12, 112-120); 이는 HBP 패밀리에 속하는 성장인자로서 고려될 수 없다.
비교적 친수성으로 알려진 FGF의 경우, 중합체와의 복합체의 제형이 그의 세포 활성을 촉진시킬 수 있다는 것이 입증되었으나(Rouet et al., Journal of Biomedical Materials research, 2006, 78A, 792-797), 사용된 중합체는 설페이트화되었는데, 그 이유는 벤질아민 설페이트로 관능화됨에 따라 약학적 제형에 부적합한 항응고 활성을 가졌기 때문이다.
또한, Logeart-Avramoglou D. 등은 문헌 [Biomedical Pharmacology 2002, 63, 129-137]에 벤질아민 및/또는 설페이트로 변형된 덱스트란을 개시한다. 용액 중 이러한 중합체는 겔 전기영동에 의한 상호작용의 테스트에서 입증된 바와 같이 TGF 베타 1과 복합체를 형성한다. 그러나, 설페이트화되지 않은 중합체는 2000보다 더 높은 비율에서도 어떠한 실제 상호작용도 나타내지 않는다. 설페이트화된 중합체의 경우, 항응고 성질을 갖는 매우 설페이트화된 중합체에 대해 상호작용이 입증될 수 있었다.
또한, 벤질아민은 독성의 특정 수준을 가질 수 있으며, 전술한 두 개의 특허에 기재되어 있는 중합체들의 생체 적합성에 해로울 수 있다고 알려져 있다.
치료적 단백질의 갈레닉(galenic) 제형은 부형제의 무해성 측면에서의 요구를 반드시 충족시켜야 하며, 이러한 요구를 충족시키기 위하여 생체 적합성인 화합물을 사용하되 활성 원칙에 대해 상대적으로 이의 양을 제한하는 것이 필수적이다.
HBP들은 단백질의 8개의 패밀리(family)에 속하며, 이들은 매우 다른 크기, 생화학적 성질 및 활성을 갖지만, 이들은 모두 복합체의 형태로 헤파린과 조합될 수 있다(Bernfield M. et al., Annu. Rev. Biochem., 1999, 68, 729-777).
상기 단백질 중에는 특히 하기의 패밀리에 속하는 단백질이 있다:
- 호르몬,
- 성장인자.
이러한 다양한 패밀리는 하기와 같이 정의될 수 있다.
"호르몬"은 내분비계에 의해 생성되는 전달(messenger) 단백질을 의미한다. 이러한 단백질은 혈액 또는 림프 또는 이의 외부에 의해 전신을 통해 운반된 후에 멀리서 작용한다. 상기 호르몬에는 성장 호르몬(hGH: 인간 성장 호르몬) 및 부갑상선 호르몬(PTH)이 있다.
"성장인자"는 체내에서 일반적으로 생성되는 단백질로서 세포의 증식 또는 분화를 자극하는 단백질을 의미한다. 여기에는 형질전환 성장인자 β1 및 2(TGF-β), 인슐린-유사 성장인자 2(IGF-2), 헤파린 결합 EGF-유사 성장인자(HB-EGF), 섬유아세포 성장인자(FGF) 1 내지 14, 케라틴세포 성장인자(KGF), 신경 성장인자 베타(NGF-베타), 결합조직 성장인자(CTGF), 태반 성장인자(PIGF), R-스폰딘 1 내지 4 및 혈관내피 성장인자(VEGF) A 및 B와 같은 단백질이 포함된다.
기재된 복합체 모두는 헤파린에 대해 구조적 또는 생물학적인 유사성을 갖는 중합체로 제조되었다.
본 발명에 의해 해결되는 문제점은, 특히 헤파린의 항응고 생물학적 활성을 갖는 중합체 없이 HBP를 안정화시키고 이의 가용성을 증가시키기 위하여 HBP와 복합체를 형성할 수 있는 생체 적합성 폴리사카라이드의 매우 한정된 군을 동정하는 것이다.
또한, 단백질에 대한 폴리사카라이드의 친화력 및 HBP에 대한 이의 선택성을 증가시키기 위하여, 특허출원 FR 05/09803에 개시된 해결방안과 달리 중합체의 양친매성 성질을 추가로 증가시킬 필요가 없다는 것이 관찰되었다.
또한, 과도한 소수성을 상쇄하기 위하여, 상기 기재된 특허출원에 개시된 해결방안은 친수성기 외에 폴리사카라이드 사슬에서 친수성기 X 또는 Y를 그래프트하는 것으로 이루어졌다.
이러한 결과는, 산 관능기를 포함하는 트립토판 잔기와 같이 염화가능하거나 염화된 소수성기를 그래프트함으로써 출발 폴리사카라이드에서 카복실 관능기의 수를 감소시키지 않고 단백질에 대한 폴리사카라이드의 친화력 및 HBP에 대한 선택성이 증가되기 때문에, 더욱 놀라운 것이다.
이러한 치환체를 선택함으로써, HBP에 대한 선택성은 현저하게 증가된다.
따라서, 본 발명은 트립토판 또는 트립토판 유도체로 치환된 폴리사카라이드의 HBP 안정화를 위한 용도에 관한 것으로서, 상기 트립토판 또는 트립토판 유도체는 염화될 수 있거나 또는 염화된 것이다.
특히, 본 발명은 안정한 HBP의 약학적 제형을 제조하기 위한 상기 폴리사카라이드의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 폴리사카라이드 및 HBP로 이루어진 복합체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 폴리사카라이드는 주로 (1,6) 및/또는 (1,4) 및/또는 (1,3) 및/또는 (1,2) 유형의 글리코시드 결합으로 구성된다. 이는 중성, 즉 산 관능기를 포함하지 않는 것일 수 있으며, 또는 음이온성, 즉 산 관능기를 포함하는 것일 수 있다.
이는 Trp로 표시되는 하나 이상의 트립토판 잔기 또는 하나 이상의 트립토판 유도체로 관능화된다:
- 상기 트립토판 유도체는 산 관능기와의 커플링에 의해 폴리사카라이드에 그래프트(graft)되거나 결합되며, 상기 산 관능기는 관능기 F에 의해 폴리사카라이드에 결합된 링커(linker) R에 의해 운반되는 산 관능기 및/또는 음이온성 폴리사카라이드의 산 관능기일 수 있으며, 상기 관능기 F는 중성 또는 음이온성 폴리사카라이드의 관능기 -OH와 링커 R 사이의 커플링으로부터 생성된 것임,
- F는 에스테르 관능기, 티오에스테르 관능기, 아미드 관능기, 카보네이트 관능기, 카바메이트 관능기, 에테르 관능기, 티오에테르 관능기 또는 아민 관능기임,
- R은 1 내지 18개의 탄소 원자를 포함하고, 하나 이상의 헤테로원자, 예컨대 O, N 및/또는 S를 포함하고, 하나 이상의 산 관능기를 갖는, 선택적으로 분지형 및/또는 불포화인 사슬임,
- Trp는 트립토판의 아민과 R 기에 의해 운반되는 하나 이상의 산 및/또는 음이온성 폴리사카라이드에 의해 운반되는 하나 이상의 산 사이의 커플링으로부터 생성되는, L 또는 D의 트립토판 잔기 또는 트립토판 유도체이며, 상기 트립토판 또는 트립토판 유도체는 염화될 수 있거나 또는 염화된 것임.
일구현예에서, Trp는 D-배열의 트립토판 잔기 또는 트립토판 유도체이다.
일구현예에서, Trp는 L-배열의 트립토판 잔기 또는 트립토판 유도체이다.
HPB는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
- 호르몬, 예컨대 성장 호르몬(hGH: 인간 성장 호르몬) 또는 부갑상선 호르몬(PTH),
- 성장인자, 예컨대 형질전환 성장인자 β1 및 2(TGF-β), 인슐린-유사 성장인자 2(IGF-2), 헤파린-결합 EGF-유사 성장인자(HB-EGF), 유형 1 내지 14의 섬유아세포 성장인자(FGF), 케라틴세포 성장인자(KGF), 신경 성장인자 β(NGF-β), 결합조직 성장인자(CTGF), 태반 성장인자(PIGF), R-스폰딘 1 내지 4, 및 혈관내피 성장인자(VEGF) A 및 B와 같은 단백질.
본 발명에 따르면, 관능화된 폴리사카라이드는 하기의 일반식을 가질 수 있다:
[식 I]
상기 식 중,
- F는 중성 또는 음이온성 폴리사카라이드의 관능기 -OH와 링커 R 사이의 커플링으로부터 생성된 것이며, 이는 에스테르 관능기, 티오에스테르 관능기, 아미드 관능기, 카보네이트 관능기, 카바메이트 관능기, 에테르 관능기, 티오에테르 관능기 또는 아민 관능기이며,
- R은 1 내지 18개의 탄소를 포함하고, 하나 이상의 헤테로원자, 예컨대 O, N 및/또는 S를 포함하고, 하나 이상의 산 관능기를 갖는, 선택적으로 분지형 및/또는 불포화인 사슬이며,
- Trp는 트립토판 또는 트립토판 유도체의 아민과 R 기에 의해 운반되는 하나 이상의 산 및/또는 음이온성 폴리사카라이드에 의해 운반되는 하나 이상의 산 사이의 커플링으로부터 생성되는, L 또는 D의 트립토판-기재 잔기이며, 상기 트립토판 또는 트립토판 유도체는 염화가능하거나 또는 염화된 것이며,
- n은 Trp로 치환된 R의 몰분율을 나타내고, 이는 0.2 내지 0.7이며,
- o는 Trp로 치환된 폴리사카라이드의 산 관능기의 몰분율을 나타내고, 이는 0.2 내지 0.7이며,
- i는 사카라이드 단위 당 R 기에 의해 운반되는 산 관능기의 몰분율을 나타내고, 이는 0 내지 2이며,
- j는 사카라이드 단위 당 음이온성 폴리사카라이드에 의해 운반되는 산 관능기의 몰분율을 나타내고, 이는 0 내지 1이며,
- (i + j)는 사카라이드 단위 당 산 관능기의 몰분율을 나타내고, 0.5 내지 2이며,
- R이 Trp로 치환되지 않은 경우, R 기의 산(들)은 양이온, 바람직하게는 알칼리금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+의 카르복실레이트이며,
- 폴리사카라이드가 음이온성 폴리사카라이드인 경우, 폴리사카라이드의 하나 이상의 산 관능기가 Trp로 치환되지 않은 경우, 이는 양이온, 바람직하게는 알칼리금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+로 염화되며,
- 상기 폴리사카라이드는 중성 pH임.
일구현예에서, F는 에스테르, 카보네이트, 카바메이트 또는 에테르이다.
일구현예에서, 폴리사카라이드는 주로 (1,6) 유형의 글리코시드 결합으로 구성된다.
일구현예에서, 주로 (1,6) 유형의 글리코시드 결합으로 구성된 폴리사카라이드는 덱스트란이다.
일구현예에서, 폴리사카라이드는 주로 (1,4) 유형의 글리코시드 결합으로 구성된다.
일구현예에서, 주로 (1,4) 유형의 글리코시드 결합으로 구성되는 폴리사카라이드는 풀루란, 알기네이트, 히알루로난, 크실란, 갈락투로난 및 수용성 셀룰로스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일구현예에서, 상기 폴리사카라이드는 풀루란이다.
일구현예에서, 상기 폴리사카라이드는 알기네이트이다.
일구현예에서, 상기 폴리사카라이드는 히알루로난이다.
일구현예에서, 상기 폴리사카라이드는 크실란(xylan)이다.
일구현예에서, 상기 폴리사카라이드는 갈락투로난(galacturonan)이다.
일구현예에서, 상기 폴리사카라이드는 수용성 셀룰로스이다.
일구현예에서, 폴리사카라이드는 주로 (1,3) 유형의 글리코시드 결합으로 구성된다.
일구현예에서, 주로 (1,3) 유형의 글리코시드 결합으로 구성되는 폴리사카라이드는 커들란(curdlan)이다.
일구현예에서, 폴리사카라이드는 주로 (1,2) 유형의 글리코시드 결합으로 구성된다.
일구현예에서, 주로 (1,2) 유형의 글리코시드 결합으로 구성되는 폴리사카라이드는 이눌린(inulin)이다.
일구현예에서, 폴리사카라이드는 주로 (1,4) 및 (1,3) 유형의 글리코시드 결합으로 구성된다.
일구현예에서, 주로 (1,4) 및 (1,3) 유형의 글리코시드 결합으로 구성되는 폴리사카라이드는 글루칸(glucan)이다.
일구현예에서, 폴리사카라이드는 주로 (1,4), (1,3) 및 (1,2) 유형의 글리코시드 결합으로 구성된다.
일구현예에서, 주로 (1,4), (1,3) 및 (1,2) 유형의 글리코시드 결합으로 구성되는 폴리사카라이드는 만난(mannan)이다.
일구현예에서, 본 발명에 따른 폴리사카라이드는 R 기가 하기의 군 또는 이의 알칼리금속 양이온 염으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다:
일구현예에서, 본 발명에 따른 폴리사카라이드는 트립토판 또는 트립토판 유도체가 트립토판, 트립토판올, 트립토판아미드 및 2-인돌 에틸아민, 및 이의 알칼리금속 양이온 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
상기 트립토판 치환체 또는 트립토판 유도체 치환체는 염화가능한 또는 염화된 치환체이며, 이는 즉 하나 이상의 음이온성 또는 양이온성 친수성 관능기, 즉 카복실레이트, 알콕시드 또는 아민 염을 제공할 수 있는 산, 알코올 또는 아민을 포함한다.
상기 폴리사카라이드의 중합도 m은 10 내지 10000일 수 있다.
일구현예에서, 폴리사카라이드의 중합도 m은 10 내지 1000이다.
또다른 구현예에서, 폴리사카라이드의 중합도 m은 10 내지 500이다.
일구현예에서, 본 발명에 따른 복합체는 폴리사카라이드/HBP 중량비가 0.5 내지 500, 바람직하게는 1 내지 300인 것을 특징으로 한다.
일구현예에서, 본 발명에 따른 복합체는 폴리사카라이드/HBP 중량비가 0.5 내지 100, 바람직하게는 1 내지 10인 것을 특징으로 한다.
일구현예에서, 본 발명에 따른 복합체는 HBP가 성장 호르몬(hGH: 인간 성장 호르몬) 또는 부갑상선 호르몬(PTH)과 같은 호르몬의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
일구현예에서, 본 발명에 따른 복합체는 HBP가 성장인자, 예컨대 형질전환 성장인자 β1 및 2(TGF-β), 인슐린-유사 성장인자 2(IGF-2), 헤파린 결합 EGF-유사 성장인자(HB-EGF), 섬유아세포 성장인자(FGF) 1 내지 14, 케라틴세포 성장인자(KGF), 신경 성장인자 베타(NGF-베타), 결합조직 성장인자(CTGF), 태반 성장인자(PIGF), R-스폰딘 1 내지 4, 및 혈관내피 성장인자(VEGF) A 및 B와 같은 단백질의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리사카라이드의 제조방법에 관한 것이며, 트립토판 또는 트립토판 유도체의 아민 관능기와 폴리사카라이드의 알코올 관능기에 대해 전술한 하나 이상의 산 관능기를 포함하는 R 기를 그래프트하여 수득한 산 관능기 사이를 커플링함으로써, 중성 폴리사카라이드에 대해 전술한 트립토판 유도체를 그래프트함으로써, j=0인 식 I의 폴리사카라이드를 수득한다.
일구현예에서, 본 발명에 따른 폴리사카라이드는 트립토판 또는 트립토판 유도체의 아민 관능기와 음이온성 폴리사카라이드에 의해 운반되는 산 관능기 사이를 커플링함으로써, 음이온성 폴리사카라이드의 산 관능기에 대해 전술한 트립토판 유도체를 그래프트함으로써, i=0인 식 I의 폴리사카라이드를 수득한다.
일구현예에서, 상기 폴리사카라이드가 음이온성 폴리사카라이드인 경우, R 기는 폴리사카라이드의 알코올 관능기에 대해 그래프트될 수 있으며, 트립토판 또는 트립토판 유도체의 그래프트는 하기와 같이 수행될 수 있다:
- 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 보호 및 탈보호 반응을 통해, o=0인 식 I의 폴리사카라이드를 얻기 위하여, R 기의 산 관능기에서 선택적으로 수행되거나, 또는
- n>0이고 o>0인 식 I의 폴리사카라이드를 얻기 위하여, 두 개 유형의 산 관능기에서 조합되어 수행됨.
전술한 모든 구현예에서, 커플링(coupling) 반응 후에, 트립토판 유도체와 반응하지 않은 산 관능기의 중화, 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법들 중 하나에 의한 염화가 수행되어, 알칼리금속, 바람직하게는 Na 또는 K의 양이온의 염이 수득된다.
또한, 본 발명은 전술한 본 발명에 따른 복합체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 건조 및/또는 동결건조에 의해 수득되는, 전술한 본 발명에 따른 약학 조성물에 관한 것이다.
HBP는 외인성일 수 있으며, 이는 즉 본 발명에 따른 조성물에 의해 제공된다. 또한, HBP는 내인성일 수도 있으며, 이는 예를 들어 상처가 아무는 제1기 동안 상처로 분비되며, 생체내 상처에서 본 발명에 따른 복합체의 형성을 통해 안정화될 수 있는 성장인자이다.
표적화되는 병적 측면에 따라, 국부적 또는 전신적 치료가 의도된다.
국부적 또는 전신적 방출의 경우, 고려되는 투여 방식은 정맥내, 피하, 피부내, 경피, 근육내, 경구, 코, 질, 안구, 구강, 폐 등의 경로를 통한다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 수용액으로서 액체 형태이거나 분말, 임플란트 또는 막의 형태이다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 또한 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 표준 약학 부형제를 포함한다.
병적 측면과 투여 방식에 의존하여, 약학 조성물은 또한 이를 겔, 스펀지, 주사액, 음료액, 리오크(lyoc) 등의 형태로 제형화시킬 수 있는 부형제를 포함하는 것이 유리할 수도 있다.
또한, 본 발명은 스텐트, 막 또는 주입가능한 생체재료의 "코팅", 또는 임플란트의 형태로 투여될 수 있는, 전술한 본 발명에 따른 약학 조성물에 관한 것이다.
A - 중합체의 합성
실시예 1: 트립토판의 소듐 염으로 변형된 소듐 덱스트란메틸 카복실레이트(중합체 1)의 합성
약 40 kg/mol의 중량 평균 몰질량을 갖는 덱스트란 70 g(즉, 1295 mmol의 히드록실 관능기)(Fluka)을 42 g/L까지 물에 용해한다. 130 mL의 10 N NaOH(1295 mmol의 NaOH)를 상기 용액에 첨가한다. 상기 혼합물을 35℃가 되게 하고, 201 g(1727 mmol)의 소듐 클로로아세테이트를 첨가한다. 반응 매질의 온도를 0.5℃/분의 속도로 60℃까지 증가시킨 후, 100분 동안 60℃에서 유지한다. 상기 반응 매질을 200 mL의 물로 희석시키고, 아세트산으로 중화시키고, 6 부피의 물에 대해 5 kD PES 막에서 한외여과에 의해 정제한다. 최종 용액에 대해, 중합체 농도를 결정하기 위해 건조 추출(dry extract)에 의해 분석하고, 그 후 메틸카복실레이트에 의한 치환 정도를 결정하기 위해 50/50(V/V) 물/아세톤에서 산/염기 검정에 의해 분석한다.
건조 추출에 따르는 경우: [중합체] = 51.5 mg/g
산/염기 검정에 따르는 경우: 메틸카복실레이트 관능기에 의한 히드록실 관능기의 치환 정도는 사카라이드 단위 당 1.04이다.
소듐 덱스트란메틸 카복실레이트의 용액을 Purolite 수지(음이온성)에 통과시켜 덱스트란메틸카복실산을 수득하고, 그 후 18시간 동안 동결건조시킨다.
14.5 g의 덱스트란메틸카복실산(즉, 66 mmol의 메틸카복실 산 관능기)을 57 g/L까지 DMF에 용해시킨 후, 0℃까지 냉각시킨다. 6.67 g(66 mmol)의 NMM 및 7.15 g(66 mmol)의 EtOCOCl을 이어서 첨가한다. 10분 동안 반응시킨 후에, 6.06 g(30 mmol)의 TrpOH를 첨가한다. 상기 매질을 그 후 10℃까지 따뜻하게 하고, 30분 동안 이 온도에서 유지한다. 그 후, 물 중 340 g/L의 이미다졸 용액(8.97 g, 132 mmol)을 첨가하고, 반응 매질을 잠시 30℃까지 가열한다. 이어서, 반응 매질을 70 ml의 물로 희석한 후, 깨끗이 한 공극률 1 소결 깔때기, 그 후 공극률 3 소결 깔때기를 통해 여과한다. 상기 용액을 10 부피의 0.9% NaCl 용액, 그 후 6 부피의 물에 대해 10 kD PES 막을 통해 한외여과한다. 중합체 1의 용액의 농도를 건조 추출에서 결정한다. 용액의 분획(fraction)을 동결건조하고, 그래프트된 트립토판의 DS를 결정하기 위하여 D2O에서 1H NMR에 의해 분석하였다.
건조 추출에 따르는 경우: [중합체] = 54 mg/g
1H NMR에 따르는 경우: 트립토판-변형된 산의 몰분율은 0.38이다.
실시예 2: 트립토판의 소듐 염으로 변형된 소듐 풀루란메틸 카복실레이트(중합체 2)의 합성
약 100 kg/mol의 중량 평균 몰질량을 갖는 풀루란 8 g(즉, 148 mmol의 히드록실 관능기)(Fluka)을 42 g/L까지 물에 용해한다. 15 mL의 10 N NaOH(148 mmol의 NaOH)를 상기 용액에 첨가한다. 상기 혼합물을 35℃가 되게 하고, 23 g(198 mmol)의 소듐 클로로아세테이트를 첨가한다. 반응 매질의 온도를 0.5℃/분의 속도로 60℃까지 증가시킨 후, 100분 동안 60℃에서 유지한다. 상기 반응 매질을 200 mL의 물로 희석시키고, 아세트산으로 중화시키고, 6 부피의 물에 대해 5 kD PES 막에서 한외여과에 의해 정제한다. 최종 용액에 대해, 중합체 농도를 결정하기 위해 건조 추출(dry extract)에 의해 분석하고, 그 후 메틸카복실레이트에 의한 치환 정도를 결정하기 위해 50/50(V/V) 물/아세톤에서 산/염기 검정에 의해 분석한다.
건조 추출에 따르는 경우: [중합체] = 31.5 mg/g
산/염기 검정에 따르는 경우: 메틸카복실레이트 관능기에 의한 히드록실 관능기의 치환 정도는 사카라이드 단위 당 1.17이다.
소듐 풀루란메틸 카복실레이트 용액을 Purolite 수지(음이온성)에 통과시켜 풀루란메틸카복실산을 수득하고, 그 후 18시간 동안 동결건조시킨다.
3.51 g의 풀루란메틸카복실산(즉, 18 mmol의 카복실메틸 산 관능기)을 57 g/L까지 DMF에 용해시킨 후, 0℃까지 냉각시킨다. 1.81 g(18 mmol)의 NMM 및 1.94 g(18 mmol)의 EtOCOCl을 이어서 첨가한다. 10분 동안 반응시킨 후에, 1.40 g(7 mmol)의 TrpOH를 첨가한다. 상기 매질을 그 후 10℃까지 따뜻하게 하고, 30분 동안 이 온도에서 유지한다. 그 후, 물 중 340 g/L의 이미다졸 용액(2.43 g, 36 mmol)을 첨가하고, 반응 매질을 잠시 30℃까지 가열한다. 이어서, 반응 매질을 70 ml의 물로 희석한 후, 깨끗이 한 공극률 1 소결 깔때기, 그 후 공극률 3 소결 깔때기를 통해 여과한다. 상기 용액을 10 부피의 0.9% NaCl 용액, 그 후 6 부피의 물에 대해 10 kD PES 막을 통해 한외여과한다. 중합체 2의 용액의 농도를 건조 추출에서 결정한다. 용액의 분획(fraction)을 동결건조하고, 그래프트된 트립토판의 DS를 결정하기 위하여 D2O에서 1H NMR에 의해 분석하였다.
건조 추출에 따르는 경우: [중합체] = 17.2 mg/g
1H NMR에 따르는 경우: 트립토판-변형된 산의 몰분율은 0.40이다.
실시예 3: 트립토판의 에틸 에스테르로 변형된 소듐 덱스트란메틸 카복실레이트(중합체 3)의 합성
중합체 3은, L-트립토판의 소듐 염을 대신해 L-트립토판의 에틸 에스테르를 사용하여 실시예 1에 기재된 과정에 따라 40 kg/mol의 중량 평균 몰질량을 갖는 덱스트란(Pharmacosmos)으로부터 수득한 L-트립토판의 에틸 에스테르로 변형된 소듐 덱스트란메틸 카복실레이트이다.
실시예 4: 페닐알라닌의 에틸 에스테르로 변형된 소듐 덱스트란메틸 카복실레이트(중합체 4)의 합성
중합체 4는, L-트립토판의 소듐 염을 대신해 L-페닐알라닌의 에틸 에스테르를 사용하여 실시예 1에 기재된 과정에 따라 40 kg/mol의 중량 평균 몰질량을 갖는 덱스트란(Pharmacosmos)으로부터 수득한 L-페닐알라닌의 에틸 에스테르로 변형된 소듐 덱스트란메틸 카복실레이트이다.
B - 공-전기영동에 의한 헤파린-결합 단백질에 대한 중합체의 친화력의 입증
실시예 3: 1/500의 단백질/중합체 비
1/500 비의 단백질/중합체 복합체의 제조
1.5 μg의 단백질을 750 μg의 중합체 및 15 μl의 10x 이동(migration) 완충액(pH 7 트리스-아세테이트)에 첨가한다. 상기 용액을 H2O로 150 μl까지 만든다. 상기 용액을 20분 동안 실온에서 인큐베이트한다. 50 ng의 단백질 및 25 μg의 중합체를 포함하는 제2 용액 5 μl를 5 μl의 1x 이동 완충액에서 희석한다. 단백질 또는 중합체만을 포함하는 유사한 용액을 대조군으로 제조한다.
단백질과 중합체 사이의 복합체의 입증
단백질/중합체 용액(10 μl)을 3 μl의 로딩(loading) 완충액(물 중 글리세롤, 트리스-아세테이트 및 브로모페놀 블루)과 혼합한다. 50 ng의 단백질 및 25 μg의 중합체를 포함하는 용액 13 μl를 0.8% 아가로스 겔의 웰에 위치시킨다. 대조 용액(단백질 또는 중합체 단독)을 유사한 방식으로 놓아둔다. 전기영동 탱크는 폐쇄되고, 발전기는 30V에서 설정된다. 이동은 1시간 동안 지속한다.
이동 후에, 겔은 실온에서 2시간 동안 Apelex 시스템의 모세관 작용에 의해 PVDF 막으로 이전된다. 이어서, 상기 막을 실온에서 1시간 동안 탈지유로 포화시킨 후, 단백질에 대한 토끼 일차 항체와 인큐베이트하고(밤새 4℃에서), 마지막으로 항염소 HRP 토끼 이차 항체와 인큐베이트한다(1시간 동안 실온에서). 발현은 HRP를 Opti-4CN과 반응시킴으로써 수행한다. 상기 발현은 배색이 충분할 때 물로 헹굼으로써 중지되는데, 그 이유는 반응 생성물이 가시부에서 흡수하기 때문이다.
단백질이 단독이거나 또는 중합체와 복합체를 형성하지 않을 때, 단백질이 음이온성이라면 이동할 수 있으며, 또는 단백질이 양이온성이라면 증착 위치에 남아있을 수 있다. 그 후, 상기 단백질은 로딩 웰에서 검출되거나 또는 증착으로부터 단일 스폿(single spot) 약 0.3-0.4 cm의 형태에서 검출된다. 상기 단백질이 중합체와 복합체를 형성할 때, 복합체는 중합체의 전하에 의해 더 강하게 혼입(entrain)되며, 양극을 향해 이동한다. 이는 증착으로부터 단일 스폿 0.7 cm의 형태에서 검출된다.
실시예 1에서 수득한 중합체 1, 실시예 2에서 수득한 중합체 2, 및 세포 부착 단백질, 호르몬, 응고 단백질, 헤파린-결합 성장인자, 성장인자 결합 단백질, 시토카인 및 지방-대사 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 수득한 결과는 하기 표 1에 기재한다.
또한, 헤파린을 결합하지 않는 단백질(IGF-1) 및 실시예 1과 실시예 2에서 수득한 중합체 1과 2로부터 수득한 결과, 및 전술한 헤파린-결합 단백질 및 트립토판으로 치환되지 않은 중합체로부터 수득한 결과는 반증예로서 하기 표 1에 기재한다.
| 단백질 패밀리 | 단백질 | 중합체 | ||
| 중합체 1 (트립토판으로 치환된 덱스트란메틸 카복실레이트) |
중합체 2 (트립토판으로 치환된 풀루란메틸 카복실레이트) |
반증예 1 (덱스트란메틸 카복실레이트) |
||
| 호르몬 | hGH | + | + | - |
| 헤파린-결합 성장인자 | VEGF 165 | + | + | - |
| FGF-2 | + | + | - | |
| NGF-베타β | + | + | - | |
| 헤파린을 결합하지 않는 성장인자 | IGF 1 | - | - | - |
상기 수득한 결과는 트립토판-치환된 덱스트란메틸 카복실레이트 중합체 1(실시예 1) 또는 트립토판-치환된 풀루란메틸 카복실레이트 중합체 2(실시예 2)가 헤파린 결합 단백질과 복합체를 형성할 수 있게 하는 반면, 치환되지 않은 덱스트란메틸 카복실레이트(반증예 1)는 복합체를 형성할 수 있도록 하지 못한다는 것을 보여준다.
또한, 상기 수득한 결과는 트립토판으로 치환되거나 치환되지 않은 덱스트란메틸 카복실레이트(실시예 1 및 반증예 1)가 헤파린을 결합하지 않는 성장인자와 복합체를 형성하지 않는다는 것을 보여준다.
실시예 4: 1/1의 단백질/중합체 비
1/1 비의 단백질/중합체 복합체의 제조
1.5 μg의 단백질을 1.5 μg의 중합체 및 3 μl의 10x 이동 완충액(pH 7 트리스-아세테이트)에 첨가한다. 상기 용액을 H2O로 60 μl까지 만든다. 상기 용액을 20분 동안 실온에서 인큐베이트한다. 50 ng의 단백질 및 50 ng의 중합체를 포함하는 제2 용액 2 μl를 8 μl의 1x 이동 완충액에서 희석한다.
단백질과 중합체 사이의 복합체의 입증
단백질/중합체 용액(10 μl)을 3 μl의 로딩 완충액(물 중 글리세롤, 트리스-아세테이트 및 브로모페놀 블루)과 혼합한다. 50 ng의 단백질 및 50 ng의 중합체를 포함하는 용액 13 μl를 0.8% 아가로스 겔의 웰에 위치시킨다. 전기영동 탱크는 폐쇄되고, 발전기는 30V에서 설정된다. 이동은 1시간 동안 지속한다.
이동 후에, 겔은 실온에서 2시간 동안 Apelex 시스템의 모세관 작용에 의해 PVDF 막으로 이전된다. 이어서, 상기 막을 실온에서 1시간 동안 탈지유로 포화시킨 후, 단백질에 대한 토끼 일차 항체와 인큐베이트하고(밤새 4℃에서), 마지막으로 항염소 HRP 토끼 이차 항체와 인큐베이트한다(1시간 동안 실온에서). 발현은 HRP를 Opti-4CN과 반응시킴으로써 수행한다. 상기 발현은 배색이 충분할 때 물로 헹굼으로써 중지되는데, 그 이유는 반응 생성물이 가시부에서 흡수하기 때문이다.
단백질이 단독이거나 또는 중합체와 복합체를 형성하지 않을 때, 단백질이 음이온성이라면 이동할 수 있으며, 또는 단백질이 양이온성이라면 증착 위치에 남아있을 수 있다. 그 후, 상기 단백질은 로딩 웰에서 또는 증착으로부터 단일 스폿 약 0.3-0.4 cm의 형태에서 검출된다. 상기 단백질이 중합체와 복합체를 형성할 때, 복합체는 중합체의 전하에 의해 더 강하게 혼입되며, 양극을 향해 이동한다. 이는 증착으로부터 단일 스폿 0.7 cm의 형태에서 검출된다.
중합체 1, 3 및 4와 두 개의 성장인자 FGF-2 및 NGF-베타로부터 수득한 결과는 하기 표 2에 기재한다.
모든 단백질/중합체 복합체들은 1/1 중량비에서 시험된다.
| NGF-베타 | FGF-2 | |
| 중합체 1 | + | + |
| 중합체 3 | - | - |
| 중합체 4 | - | - |
상기 테스트는 중합체 1과 HBP 사이의 상호작용이 중합체의 양을 감소시킬 수 있을 정도로 충분히 강하며, 이는 약학적 개발의 목적에 대해 유리하다는 것을 입증할 수 있게 해준다. 중합체 3 및 4는 1/1의 비로 복합체를 수득하기 위해 테스트된 두 개의 HBP와 충분히 강한 상호작용을 나타내지 않는다.
C - ITC에 의한 헤파린-결합 단백질에 대한 중합체의 친화력의 입증
실시예 5: 헤파린 및 중합체 1과 PTH(1-34)의 상호작용
PTH(1-84)는 ITC 실험(등온 적정 열량측정) 동안 300 nM의 Kd로 헤파린에 결합한다는 것이 문헌 [Kamerzell, 2007]에서 입증되었다. 동일한 조건하에서, 본 발명자는 PTH(1-34)가 227 nM의 Kd로 헤파린과 상호작용한다는 것을 입증하였다.
헤파린을 4.8 mM 시트르산염 pH 5.3 및 42 mM NaCl 완충액에서 2 μM의 농도로 세포내에 위치시킨다. PTH(1-34)는 208.6 μM의 농도로 주사기 내에 위치시킨다. 50회의 5 μl 주사를 수행하였으며, 그 결과는 227 nM의 Kd가 계산될 수 있도록 n개의 독립 부위들의 모델에 대해 조정되었다.
유사한 조건하에서, 중합체 1을 4.8 mM 시트르산염 pH 5.3 및 42 mM NaCl 완충액에서 0.5 μM의 농도로 세포내에 위치시킨다. PTH(1-34)는 191 μM의 농도로 주사기 내에 위치시킨다. 50회의 5 μl 주사를 수행하였으며, 그 결과는 6.9 μM의 Kd가 계산될 수 있도록 n개의 독립 부위들의 모델에 대해 조정되었으며, 이는 중합체 1과 PTH의 상호작용이 헤파린의 상호작용에 가깝다는 것을 입증한다.
D - 제형의 실시예
실시예 6: 중합체/헤파린-결합 단백질 복합체의 제조
하기의 작업은 무균실에서 수행한다. 실시예 1에 기재되어 있는 중합체(중합체 1)의 동결건조물 5 g을 50 mL의 물에 용해시켜, 용액 1(중합체 1의 농도 100 mg/mL)을 제공한다. 동시에, 10 μg의 VEGF 동결건조물을 5 μl의 물에 용해시켜, 용액 2(VEGF의 농도 2 mg/mL)을 제공한다. 5 μl의 용액 1을 실온에서 5 μl의 용액 2와 혼합하여, 중합체 1을 50 mg/mL의 농도로 포함하고 VEGF를 1 mg/mL의 농도로 포함하는 용액 3을 형성한다. 용액 3을 0.22 μM 막을 통해 여과시켜, 멸균 용액을 제조한다. 용액 3에서 복합체의 형성은 공-전기영동에 의해 입증될 수 있다.
그 결과, 본 발명에 따른 중합체와 헤파린-결합 단백질 사이의 복합체는 유기 용매를 첨가하지 않고 실온에서 수용액을 단순히 혼합함으로써 형성된다.
실시예 7: 중합체/헤파린-결합 단백질 복합체의 제조
물에 의해 5 μl까지 만든 1 μl의 용액 1 및 5 μl의 용액 2를 사용하여, 1/10의 비로 중합체 1/VEGF 복합체를 수득하기 위하여 실시예 6에 기재되어 있는 작업을 수행한다. 중합체 1을 10 mg/mL의 농도로 포함하고 VEGF를 1 mg/mL의 농도로 포함하는 10 μl의 용액 4가 수득된다.
실시예 8: 중합체/헤파린-결합 단백질 복합체의 제조
물에 의해 5 μl까지 만든 0.2 μl의 용액 1 및 5 μl의 용액 2를 사용하여, 1/2의 비로 중합체 1/VEGF 복합체를 수득하기 위하여 실시예 6에 기재되어 있는 작업을 수행한다. 중합체 1을 2 mg/mL의 농도로 포함하고 VEGF를 1 mg/mL의 농도로 포함하는 10 μl의 용액 5가 수득된다.
실시예 9: 중합체/헤파린-결합 단백질 복합체의 제조
실시예 2에 기재되어 있는 중합체(중합체 2) 및 헤파린-결합 단백질로서 FGF-2를 사용하여, 실시예 6에 기재되어 있는 작업을 수행한다. 중합체 2/FGF-2 복합체의 다양한 수용액들이 수득되었으며, 상기 중합체 2/FGF-2의 비는 1 내지 100의 범위이다.
실시예 10: 중합체/헤파린-결합 단백질 복합체의 제조
하기의 작업은 무균실에서 수행한다. 실시예 2에 기재되어 있는 중합체(중합체 2)의 동결건조물 5 g을 100 mL의 물에 용해시켜, 용액 1(중합체 1의 농도 50 mg/mL)을 제공한다. 10 μl의 상기 용액을 50 μl 플라스크에 도입한다. 그 후, 10 μg의 VEGF 동결건조물을 실온에서 상기 용액에 첨가한다. 수득된 용액은 중합체 2를 50 mg/mL의 농도로 포함하고 VEGF를 1 mg/mL의 농도로 포함한다. 상기 용액은 15분 동안 조심스럽게 교반된 후 깨끗하며, 0.22 μM 막을 통해 여과되어 멸균 용액이 제조될 수 있다. 최종 용액에서 복합체의 형성은 공-전기영동에 의해 입증될 수 있다.
반면, 500 μg의 동결건조된 중합체 2를 10 μl의 VEGF 용액에 1 mg/mL로 첨가함으로써, 동일한 최종 용액을 수득한다.
그 결과, 본 발명에 따른 중합체와 헤파린-결합 단백질 사이의 복합체는 유기 용매를 첨가하지 않고 실온에서 단백질 또는 중합체의 수용액에 중합체 또는 단백질의 동결건조물을 단순히 첨가함으로써 형성될 수 있다.
Claims (24)
- 트립토판 또는 트립토판 유도체로 치환된 폴리사카라이드 및 HBP로 구성된 복합체로서,
상기 폴리사카라이드는, Trp로 표시되는 하나 이상의 트립토판 또는 트립토판 유도체로 관능화되고, 중성 또는 음이온성일 수 있는, 주로 (1,6) 및/또는 (1,4) 및/또는 (1,3) 및/또는 (1,2) 유형의 글리코시드 결합으로 이루어진 폴리사카라이드의 군으로부터 선택되며,
- 상기 트립토판 또는 트립토판 유도체는 산 관능기와의 커플링에 의해 폴리사카라이드에 그래프트(graft)되거나 결합되며, 상기 산 관능기는 관능기 F에 의해 폴리사카라이드에 결합된 링커(linker) R에 의해 운반되는 산 관능기 및/또는 음이온성 폴리사카라이드의 산 관능기일 수 있으며, 상기 관능기 F는 중성 또는 음이온성 폴리사카라이드의 관능기 -OH와 링커 R 사이의 커플링으로부터 생성된 것이며,
- F는 에스테르 관능기, 티오에스테르 관능기, 아미드 관능기, 카보네이트 관능기, 카바메이트 관능기, 에테르 관능기, 티오에테르 관능기 또는 아민 관능기이며,
- R은 1 내지 18개의 탄소 원자를 포함하고, O, N 및/또는 S와 같은 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 하나 이상의 산 관능기를 갖는, 선택적으로 분지형 및/또는 불포화인 사슬이며,
- Trp는 트립토판의 아민과 R 기에 의해 운반되는 하나 이상의 산 및/또는 음이온성 폴리사카라이드에 의해 운반되는 하나 이상의 산 사이의 커플링으로부터 생성되는, L 또는 D의 트립토판 또는 트립토판 유도체의 잔기이며,
- 상기 트립토판 또는 트립토판 유도체는 염화될 수 있거나 또는 염화된 것이며, 트립토판, 트립토판올, 트립토판아미드, 2-인돌 에틸아민, 및 이의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
- 상기 HPB는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 복합체:
- 호르몬, 예컨대 성장 호르몬(hGH: 인간 성장 호르몬) 또는 부갑상선 호르몬(PTH),
- 성장인자, 예컨대 형질전환 성장인자 β1 및 2(TGF-β), 인슐린-유사 성장인자 2(IGF-2), 헤파린-결합 EGF-유사 성장인자(HB-EGF), 유형 1 내지 14의 섬유아세포 성장인자(FGF), 케라틴세포 성장인자(KGF), 신경 성장인자 β(NGF-β), 결합조직 성장인자(CTGF), 태반 성장인자(PIGF), R-스폰딘 1 내지 4, 및 혈관내피 성장인자(VEGF) A 및 B와 같은 단백질. - 제1항에 있어서,
상기 폴리사카라이드가 하기의 식 I의 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체:
[식 I]
상기 식 중,
- F는 중성 또는 음이온성 폴리사카라이드의 관능기 -OH와 링커 R 사이의 커플링으로부터 생성된 것이며, 이는 에스테르 관능기, 티오에스테르 관능기, 아미드 관능기, 카보네이트 관능기, 카바메이트 관능기, 에테르 관능기, 티오에테르 관능기 또는 아민 관능기이며,
- R은 1 내지 18개의 탄소를 포함하고, O, N 및/또는 S와 같은 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 하나 이상의 산 관능기를 갖는, 선택적으로 분지형 및/또는 불포화인 사슬이며,
- Trp는 트립토판 아민 또는 트립토판-기재(based) 아민과 R 기에 의해 운반되는 하나 이상의 산 및/또는 음이온성 폴리사카라이드에 의해 운반되는 하나 이상의 산 사이의 커플링으로부터 생성되는, L 또는 D의 트립토판-기재 잔기이며,
- n은 Trp로 치환된 R의 몰분율을 나타내고, 이는 0.2 내지 0.7이며,
- o는 Trp로 치환된 폴리사카라이드의 산 관능기의 몰분율을 나타내고, 이는 0.2 내지 0.7이며,
- i는 사카라이드 단위 당 R 기에 의해 운반되는 산 관능기의 몰분율을 나타내고, 이는 0 내지 2이며,
- j는 사카라이드 단위 당 음이온성 폴리사카라이드에 의해 운반되는 산 관능기의 몰분율을 나타내고, 이는 0 내지 1이며,
- (i + j)는 사카라이드 단위 당 산 관능기의 몰분율을 나타내고, 이는 0.5 내지 2이며,
- R이 Trp로 치환되지 않은 경우, R 기의 산은 양이온, 바람직하게는 Na+ 또는 K+와 같은 알칼리금속 양이온의 카복실레이트이며,
- 폴리사카라이드가 음이온성 폴리사카라이드인 경우, 폴리사카라이드의 하나 이상의 산 관능기가 Trp로 치환되지 않은 경우, 이는 양이온, 바람직하게는 Na+ 또는 K+와 같은 알칼리금속 양이온으로 염화되며,
상기 폴리사카라이드는 중성 pH임. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 F가 에스테르, 카보네이트, 카바메이트 또는 에테르인 것을 특징으로 하는 복합체. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리사카라이드가 주로 (1,6) 유형의 글리코시드 결합으로 구성되는 것을 특징으로 하는 복합체. - 제4항에 있어서,
주로 (1,6) 유형의 글리코시드 결합으로 구성된 폴리사카라이드가 덱스트란인 것을 특징으로 하는 복합체. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리사카라이드가 주로 (1,4) 유형의 글리코시드 결합으로 구성되는 것을 특징으로 하는 복합체. - 제6항에 있어서,
주로 (1,4) 유형의 글리코시드 결합으로 구성되는 폴리사카라이드는 풀루란, 알기네이트, 히알루로난, 크실란, 갈락투로난 및 수용성 셀룰로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리사카라이드가 주로 (1,3) 유형의 글리코시드 결합으로 구성되는 것을 특징으로 하는 복합체. - 제8항에 있어서,
주로 (1,3) 유형의 글리코시드 결합으로 구성되는 폴리사카라이드가 커들란인 것을 특징으로 하는 복합체. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리사카라이드가 주로 (1,2) 유형의 글리코시드 결합으로 구성되는 것을 특징으로 하는 복합체. - 제10항에 있어서,
주로 (1,2) 유형의 글리코시드 결합으로 구성되는 폴리사카라이드가 이눌린인 것을 특징으로 하는 복합체. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리사카라이드가 주로 (1,4) 및 (1,3) 유형의 글리코시드 결합으로 구성되는 것을 특징으로 하는 복합체. - 제12항에 있어서,
주로 (1,4) 및 (1,3) 유형의 글리코시드 결합으로 구성되는 폴리사카라이드가 글루칸인 것을 특징으로 하는 복합체. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리사카라이드가 주로 (1,4), (1,3) 및 (1,2) 유형의 글리코시드 결합으로 구성되는 것을 특징으로 하는 복합체. - 제14항에 있어서,
주로 (1,4), (1,3) 및 (1,2) 유형의 글리코시드 결합으로 구성되는 폴리사카라이드가 만난인 것을 특징으로 하는 복합체. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 R 기가 하기의 군 또는 이의 알칼리금속 양이온 염으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체:
.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
폴리사카라이드/HBP의 비가 0.5 내지 500, 바람직하게는 1 내지 300인 것을 특징으로 하는 복합체. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
폴리사카라이드/HBP의 비가 0.5 내지 100, 바람직하게는 1 내지 10인 것을 특징으로 하는 복합체. - 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 HBP가 성장 호르몬(hGH: 인간 성장 호르몬) 또는 부갑상선 호르몬(PTH)과 같은 호르몬의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체. - 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 HBP가 성장인자, 예컨대 형질전환 성장인자 β1 및 2(TGF-β), 인슐린-유사 성장인자 2(IGF-2), 헤파린-결합 EGF-유사 성장인자(HB-EGF), 유형 1 내지 14의 섬유아세포 성장인자(FGF), 케라틴세포 성장인자(KGF), 신경 성장인자 β(NGF-β), 결합조직 성장인자(CTGF), 태반 성장인자(PIGF), R-스폰딘 1 내지 4, 및 혈관내피 성장인자(VEGF) A 및 B와 같은 단백질의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체. - 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 복합체를 포함하는 약학 조성물.
- 제21항에 있어서,
건조 및/또는 동결건조에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물. - 트립토판 또는 트립토판 유도체로 치환된 폴리사카라이드를 HBP의 안정화를 위해 사용하는 방법으로서, 상기 폴리사카라이드가 Trp로 표시되는 하나 이상의 트립토판 또는 트립토판 유도체로 관능화되고, 중성 또는 음이온성일 수 있는, 주로 (1,6) 및/또는 (1,4) 및/또는 (1,3) 및/또는 (1,2) 유형의 글리코시드 결합으로 구성된 폴리사카라이드의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
- 상기 트립토판 또는 트립토판 유도체는 산 관능기와의 커플링에 의해 폴리사카라이드에 그래프트(graft)되거나 결합되며, 상기 산 관능기는 관능기 F에 의해 폴리사카라이드에 결합된 링커(linker) R에 의해 운반되는 산 관능기 및/또는 음이온성 폴리사카라이드의 산 관능기일 수 있으며, 상기 관능기 F는 중성 또는 음이온성 폴리사카라이드의 관능기 -OH와 링커 R 사이의 커플링으로부터 생성된 것이며,
- F는 에스테르 관능기, 티오에스테르 관능기, 아미드 관능기, 카보네이트 관능기, 카바메이트 관능기, 에테르 관능기, 티오에테르 관능기 또는 아민 관능기이며,
- R은 1 내지 18개의 탄소 원자를 포함하고, O, N 및/또는 S와 같은 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 하나 이상의 산 관능기를 갖는, 선택적으로 분지형 및/또는 불포화인 사슬이며,
- Trp는 트립토판의 아민과 R 기에 의해 운반되는 하나 이상의 산 및/또는 음이온성 폴리사카라이드에 의해 운반되는 하나 이상의 산 사이의 커플링으로부터 생성되는, L 또는 D의 트립토판 또는 트립토판 유도체의 잔기이며,
- 상기 트립토판 또는 트립토판 유도체는 염화될 수 있거나 또는 염화된 것이며, 트립토판, 트립토판올, 트립토판아미드, 2-인돌 에틸아민, 및 이의 염으로 이루어진 군으로부터 선택됨. - 트립토판 또는 트립토판 유도체로 치환된 폴리사카라이드를 안정한 HBP의 약학 제제의 제조를 위해 사용하는 방법으로서, 상기 폴리사카라이드가 Trp로 표시되는 하나 이상의 트립토판 또는 트립토판 유도체로 관능화되고, 중성 또는 음이온성일 수 있는, 주로 (1,6) 및/또는 (1,4) 및/또는 (1,3) 및/또는 (1,2) 유형의 글리코시드 결합으로 구성된 폴리사카라이드의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
- 상기 트립토판 또는 트립토판 유도체는 산 관능기와의 커플링에 의해 폴리사카라이드에 그래프트(graft)되거나 결합되며, 상기 산 관능기는 관능기 F에 의해 폴리사카라이드에 결합된 링커(linker) R에 의해 운반되는 산 관능기 및/또는 음이온성 폴리사카라이드의 산 관능기일 수 있으며, 상기 관능기 F는 중성 또는 음이온성 폴리사카라이드의 관능기 -OH와 링커 R 사이의 커플링으로부터 생성된 것이며,
- F는 에스테르 관능기, 티오에스테르 관능기, 아미드 관능기, 카보네이트 관능기, 카바메이트 관능기, 에테르 관능기, 티오에테르 관능기 또는 아민 관능기이며,
- R은 1 내지 18개의 탄소를 포함하고, O, N 및/또는 S와 같은 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 하나 이상의 산 관능기를 갖는, 선택적으로 분지형 및/또는 불포화인 사슬이며,
- Trp는 트립토판의 아민과 R 기에 의해 운반되는 하나 이상의 산 및/또는 음이온성 폴리사카라이드에 의해 운반되는 하나 이상의 산 사이의 커플링으로부터 생성되는, L 또는 D의 트립토판 또는 트립토판 유도체의 잔기이며,
- 상기 트립토판 또는 트립토판 유도체는 염화될 수 있거나 또는 염화된 것이며, 트립토판, 트립토판올, 트립토판아미드, 2-인돌 에틸아민, 및 이의 염으로 이루어진 군으로부터 선택됨.
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