EP2349338A2 - Complexe constitue d'un polysaccharide et d'une hpb - Google Patents

Complexe constitue d'un polysaccharide et d'une hpb

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EP2349338A2
EP2349338A2 EP09740953A EP09740953A EP2349338A2 EP 2349338 A2 EP2349338 A2 EP 2349338A2 EP 09740953 A EP09740953 A EP 09740953A EP 09740953 A EP09740953 A EP 09740953A EP 2349338 A2 EP2349338 A2 EP 2349338A2
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EP
European Patent Office
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polysaccharide
tryptophan
acid
growth factor
function
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP09740953A
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German (de)
English (en)
Inventor
Olivier Soula
Rémi SOULA
Martin Gaudier
Gérard Soula
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Adocia SAS
Original Assignee
Adocia SAS
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein

Definitions

  • the present invention relates to the formulation of therapeutic proteins and more particularly the formulation of Heparin-Binding Proteins, HBPs, heparin-binding proteins, which are associated, in vivo, with heparin in the form of a complex, which allows their stabilization and maintenance of their activity in vivo.
  • Heparin is a natural polysaccharide carrying carboxylate and sulphate functions whose overall charge is anionic. But this polysaccharide is known for its anti-coagulant activity since it is involved in the formation of a complex between thrombin and anti-thrombin III and this anti-coagulant activity is not compatible with a therapeutic use, for example , in healing treatments, growth control, bone reconstruction.
  • HBPs have been the subject of pharmaceutical development.
  • these proteins are known to be physically unstable (aggregation) and chemically (enzymatic or chemical degradation). This instability may occur in the formulations and / or at the site of administration. It can cause immunoglogic reactions or loss of efficacy.
  • solutions such as increasing doses or the frequency of administrations are used. They are unsatisfactory, particularly because of the high price of these proteins.
  • Genentech has developed a VEGF formulation for the healing of diabetic foot ulcers. A first clinical study in which the treatment was administered every other day took place. The second study was performed with daily administration, probably to answer the problem of a VEGF action time too short for one application every other day.
  • HBPs belong to eight families of proteins, they have very different sizes, biochemical properties and activities, but they are all likely to associate with heparin complex form, Bernfield M. et al., Annu. Rev. Biochem., 1999, 68, 729-777.
  • Hormones are messenger proteins produced by the endocrine system. These proteins then act at a distance after being carried throughout the body by the blood or lymph or outside of it. Hormones include growth hormone (hGH) and parathyroid hormone (PTH). [00015]. By growth factors is meant proteins normally produced in the body stimulating the proliferation of cells or their differentiation.
  • TGF- ⁇ transforming growth factor beta
  • IGF-2 Insulin-like growth factor 2
  • HB-EGF Heparin Binding EGF-like Growth Factor
  • FGF fibroblast growth factors type 1 to 14
  • KGF Keratinocyte Growth Factor
  • NGF-beta Nerve Growth Factor beta
  • CGF Connective Tissue Growth Factor
  • PIGF Placental Growth Factor
  • R-spondines 1 to 4 vascular endothelial growth factors A and B
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factors
  • the invention therefore relates to the use of a polysaccharide substituted with a tryptophan or a tryptophan derivative, said tryptophan or tryptophan derivative being salifiable or salified for the stabilization of HBPs. [00023]. It relates more particularly to the use of said polysaccharide for the preparation of a pharmaceutical formulation of stable HBPs.
  • the polysaccharides according to the invention consist of glycoside bonds of (1,6) and / or (1,4) and / or (1,3) and / or (1,2) type. They can be neutral, that is to say they can not carry acidic or anionic functions, that is to say they carry acid functions. They are functionalized by at least one residue of tryptophan or a derivative of tryptophan, noted Trp:
  • said tryptophan derivative being grafted or bound to the polysaccharides by coupling with an acid function, said acid function possibly being an acid function of an anionic polysaccharide and / or an acid function carried by a linker R linked to the polysaccharide by a function F, said function F resulting from the coupling between the linker R and a function -OH of the neutral or anionic polysaccharide,
  • F being either an ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, ether, thioether or amine
  • - R being a chain comprising between 1 and 18 carbons, optionally branched and / or unsaturated, comprising one or more heteroatoms, such as O, N or / and S, and having at least one acid function
  • Trp being a residue of tryptophan or a tryptophan derivative, L or D, produces coupling between the amine of tryptophan and at least one acid carried by the R group and / or an acid carried by the anionic polysaccharide, said tryptophan or derivative of tryptophan being salifiable or salified.
  • Trp is a residue of tryptophan or a tryptophan derivative of configuration D.
  • Trp is a residue of tryptophan or a tryptophan derivative of configuration L.
  • HPB is selected from the group consisting of: - hormones such as growth hormone (hGH) or parathyroid hormone (PTH: parathyroid hormone). growth factors such as transforming growth factor beta (TGF- ⁇ ) and transforming growth factors ⁇ 1 and 2, type 2 insulin-like growth factor (IGF-2: Insulin-like growth factor 2), heparin-binding growth factor and epidermal growth factor-like analogue
  • - hormones such as growth hormone (hGH) or parathyroid hormone (PTH: parathyroid hormone).
  • growth factors such as transforming growth factor beta (TGF- ⁇ ) and transforming growth factors ⁇ 1 and 2, type 2 insulin-like growth factor (IGF-2: Insulin-like growth factor 2), heparin-binding growth factor and epidermal growth factor-like analogue
  • HB-EGF Heparin Binding EGF-like Growth Factor
  • FGF fibroblast growth factors
  • KGF keratinocyte growth factor
  • the functionalized polysaccharides may correspond to the following general formulas:
  • R being a chain comprising between 1 and 18 carbons, optionally branched and / or unsaturated, comprising one or more heteroatoms, such as O, N or / and S, and having at least one acid function
  • - Trp being a residue of a tryptophan derivative, L or D, produced from the coupling between the amine of tryptophan or of a tryptophan derivative and at least one acid carried by the R group and / or an acid carried by the anionic polysaccharide, said tryptophan or derivative of tryptophan being salifiable or salified.
  • n represents the molar fraction of the Rs substituted with Trp and is between 0.2 and 0.7,
  • 0 represents the mole fraction of the acid functions of the polysaccharides substituted with Trp and is between 0.2 and 0.7,
  • j represents the mole fraction of acid functions carried by the anionic polysaccharide per saccharide unit and is between 0 and 1
  • (i + j) represents the mole fraction of acid functions per saccharide unit and is between 0.5 and 2, when R is not substituted by Trp, then the acid or acids of the R group are alkali metal cation carboxylates. preferably as Na + or K +, when the polysaccharide is an anionic polysaccharide, when one or more acid functions of the polysaccharide are not substituted by Trp, then they are salified by a cation, alkaline preferably as Na or K, said polysaccharides being neutral pH.
  • F is either an ester, a carbonate, a carbamate or an ether.
  • the polysaccharide consists predominantly of glycoside bonds of (1,6) type.
  • the polysaccharide consisting predominantly of glycoside bonds of (1,6) type is a dextran.
  • the polysaccharide consists predominantly of glycoside bonds of (1,4) type.
  • the polysaccharide consisting predominantly of (1,4) type glycosidic linkages is selected from the group consisting of pullulan, alginate, hyaluronan, xylan, galacturonan or a cellulose soluble in the water.
  • the polysaccharide is a pullulan.
  • the polysaccharide is an alginate.
  • the polysaccharide is a hyaluronan.
  • the polysaccharide is a xylan.
  • the polysaccharide is a galacturonan.
  • the polysaccharide is a water-soluble cellulose.
  • the polysaccharide consists predominantly of glycoside bonds of (1,3) type. [00042]. In one embodiment, the polysaccharide consisting predominantly of glycoside bonds of (1,3) type is a curdlane. [00043]. In one embodiment, the polysaccharide consists predominantly of glycoside bonds of (1,2) type.
  • the polysaccharide consisting predominantly of glycoside bonds of (1,2) type is an inulin. [00045]. In one embodiment, the polysaccharide consists predominantly of glycoside bonds of (1,4) and (1,3) [00046] type. In one embodiment, the polysaccharide consisting predominantly of glycoside bonds of (1,4) and (1,3) type is a glucan. [00047]. In one embodiment, the polysaccharide consists predominantly of glycoside bonds of (1,4), and (1,3) and (1,2) type.
  • the polysaccharide consisting predominantly of (1,4) and (1,3) and (1,2) glycosidic linkages is mannan.
  • the polysaccharide according to the invention is characterized in that the group R is chosen from the following groups:
  • the polysaccharide according to the invention is characterized in that the tryptophan or tryptophan derivative is selected from the group consisting of tryptophan, tryptophanol, tryptophanamide, 2-indole ethylamine and their alkaline cation salts. .
  • This tryptophan or tryptophan derivative substituent is a salifiable or salified substituent, that is to say it has at least one hydrophilic, anionic or cationic function, namely acid, alcohol or amine capable of giving carboxylates, alcoholates or amine salts.
  • the polysaccharide may have a degree of polymerization m of between 10 and 10,000.
  • it has a degree of polymerization m of between 10 and 1000. [00054]. In another embodiment, it has a degree of polymerization m of between 10 and 500.
  • the complex according to the invention is characterized in that the mass ratio polysaccharide / HBP is between 0.5 and 500, preferably between 1 and 300.
  • the complex according to the invention is characterized in that the mass ratio polysaccharide / HBP is between 0.5 and 100, preferably between 1 and 10.
  • BPH is selected from the group of hormones such as growth hormone (hGH: human growth hormone) or parathyroid hormone (PTH: parathyroid hormone ). [00058].
  • the complex according to the invention is characterized in that HBP is selected from the group of growth factors such as proteins such as transforming growth factors ⁇ 1 and 2 (TGF- ⁇ : transforming growth factor beta), type 2 insulin-like growth factor (IGF-2), heparin-binding growth factor and epidermal growth factor analogue (HB-EGF: Heparin Binding EGF-like Growth Factor), fibroblast growth factors type 1 to 14 (FGF: fibroblast growth factors), keratinocyte growth factor (KGF: Keratinocyte Growth Factor), ⁇ nerve growth factor (NGF- ⁇ : Nerve Growth Factor ⁇ ), Connective Tissue Growth Factor (CTGF), Placental Growth Factor (PIGF), R-spondines 1 to 4, and Growth Factors vascular endothelium e A and B (VEGF: Vascular Endothelial Growth Factors).
  • TGF- ⁇ transforming growth factor beta
  • IGF-2 insulin-like growth factor
  • HB-EGF Heparin Binding EGF-
  • the polysaccharides according to the invention are obtained by grafting a tryptophan derivative as defined above on an acid function of an anionic polysaccharide, by coupling between the amine function of tryptophan or a tryptophan derivative.
  • R groups may be grafted onto the polysaccharide alcohol functions and the grafting of tryptophan or a tryptophan derivative may be carried out:
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition comprising a complex according to the invention as described above.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition according to the invention as described above, characterized in that it is obtained by drying and / or lyophilization.
  • BPH can be exogenous, that is to say that it is provided by the composition according to the invention. It may also be endogenous, for example the growth factors that will be secreted in a wound during the first phase of healing and which may be stabilized by the formation of the complex according to the invention in vivo in the wound. [00066]. According to the targeted pathologies, it is intended for local or systemic treatment. [00067].
  • the proposed modes of administration are intravenous, subcutaneous, intradermal, transdermal, intramuscular, oral, nasal, vaginal, ocular, oral, pulmonary etc. [00068].
  • the pharmaceutical compositions according to the invention are either in liquid form, in aqueous solution, or in powder, implant or film form. They further comprise conventional pharmaceutical excipients well known to those skilled in the art. [00069].
  • the pharmaceutical compositions may advantageously comprise, in addition, excipients for formulating them in the form of gel, sponges, injectable solution, oral solution, lyoc, etc. [00070].
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition according to the invention as described above, characterized in that it is administrable in stent form, film or "coating" of implantable biomaterials implant.
  • Example 1 Synthesis of a sodium dextranemethylcarboxylate modified with the sodium salt of tryptophan, polymer 1.
  • the reaction medium is diluted with 200 ml of water, neutralized with acetic acid and purified by ultrafiltration on PES membrane 5 kD against 6 volumes of water.
  • the sodium dextranmethylcarboxylate solution is passed through a Purolite (anionic) resin to obtain the acidic dextranethylcarboxylic acid which is then lyophilized for 18 hours.
  • the reaction medium is then diluted with 70 ml of water. , then filtered on sintered glass porosity 1 then on glass frjtté porosity 3, it is then clear.
  • the solution is ultrafiltered on a 10 kD PES membrane against 10 volumes of 0.9% NaCl solution and then 6 volumes of water.
  • the concentration of the polymer solution 1 is determined by dry extract.
  • Example 2 Synthesis of sodium tryptophan sodium salt modified sodium tripulanemethylcarboxylate, polymer 2.
  • 8 g (148 mmol of hydroxyl functional groups) of Pullulane with a weight average molar mass of approximately 100 kg / mol (Fluka) are solubilized in water at 42 g / l.
  • 15 ml of 10 N NaOH 148 mmol NaOH
  • the mixture is brought to 35 ° C and then 23 g (198 mmol) of sodium chloroacetate are added.
  • the temperature of the reaction medium is brought to 60 ° C. at 0.5 ° C./min and then maintained at 60 ° C. for 100 minutes.
  • the reaction medium is diluted with 200 ml of water, neutralized with acetic acid and purified by ultrafiltration on PES membrane 5 kD against 6 volumes of water.
  • the sodium pullulanemethylcarboxylate solution is passed through a Purolite resin (anionic) to obtain the acidic pullulanemethylcarboxylic acid which is then lyophilized for 18 hours.
  • the reaction medium is then diluted with 70 ml of water, then filtered on sintered glass porosity 1 then on sintered glass porosity 3, it is then clear.
  • the solution is ultrafiltered on a 10 kD PES membrane against 10 volumes of 0.9% NaCl solution and then 6 volumes of water.
  • the concentration of the polymer solution 2 is determined by dry extract.
  • a solution fraction is lyophilized and analyzed by 1 H NMR in D 2 O to determine the DS grafted tryptophan.
  • Polymer 3 is a sodium dextranethyl carboxylate modified with ethyl ester of L-tryptophan obtained from a dextran of average molecular weight by weight of 40 kg / mol (Pharmacosmos) according to the process described in Example 1 using the ethyl ester of L-tryptophan instead of the sodium salt of L-tryptophan.
  • EXAMPLE 4 Synthesis of a Sodium Dextran Methylcarboxylate Modified by Phenylalanine Ethyl Ester, Polymer 4
  • Polymer 3 is a sodium dextranethyl carboxylate modified with ethyl ester of L-phenylalanine obtained from a dextran with a weight average molar mass of 40 kg / mol (Pharmacosmos) according to the process described in Example 1 in employing the ethyl ester of L-phenylalanine instead of the sodium salt of L-tryptophan.
  • the protein / polymer solution (10 ⁇ l) is mixed with 3 ⁇ l of loading buffer (glycerol, tris-acetate and bromophenol blue in water). These 13 .mu.l containing 50 ng of protein and 25 .mu.g of polymer are deposited in a well of a 0.8% agarose gel. Control solutions (protein or polymer alone) are deposited in a similar manner.
  • the electrophoresis tank is closed and the generator is set at 30V. The migration lasts 1 hour. [00087]. After migration, the gel is transferred to a PVDF membrane by capillarity with an Apelex system for 2 hours at room temperature.
  • the membrane is then saturated with skimmed milk for 1 hour at room temperature and then incubated with primary rabbit antibodies directed against the protein (overnight at 4 ° C) and finally incubated with secondary antibodies, rabbit anti goat HRP (1 hour). at room temperature).
  • the revelation is by reaction of HRP on Opti-4CN.
  • the Revelation is stopped by rinsing in water when the staining is sufficient since the product of the reaction absorbs in the visible. [00088].
  • the protein is alone or does not form a complex with the polymer, it can migrate if it is anionic or remain at the point of the deposit if it is cationic.
  • the protein is then detected either at the loading wells or in the form of a single spot 0.3-0.4 cm from the deposit.
  • the complex is driven more strongly by the charges of the polymer and moves towards the anode. It is detected as a single spot at 0.7 cm
  • polymer 1, obtained in example 1 polymer 2, obtained in example 2, and proteins selected from the groups of cell adhesion molecules, hormones, coagulation proteins, factors Heparin-binding growth, proteins are
  • 1.5 ⁇ g of protein are added to 1.5 ⁇ g of polymer, to 3 ⁇ l of 10X migration buffer (tris acetate pH 7).
  • the solution is completed at 60 ⁇ l with I ⁇ 20. This solution is incubated at room temperature for 20 minutes. 2 ⁇ l of this second solution containing 50 ng of protein and 50 ng of polymer are diluted in 8 ⁇ l of migration buffer IX.
  • the protein / polymer solution (10 ⁇ l) is mixed with 3 ⁇ l of loading buffer (glycerol, tris-acetate and bromophenol blue in water). These 13 .mu.l containing 50 ng of protein and 50 ng of polymer are deposited in a well of a 0.8% agarose gel.
  • the electrophoresis tank is closed and the generator is set at 30V.
  • the migration lasts 1 hour. [00095].
  • the gel is transferred to a PVDF membrane by capillarity with an Apelex system for 2 hours at room temperature.
  • the membrane is then saturated with skimmed milk for 1 hour at room temperature and then incubated with primary rabbit antibodies directed against the protein (overnight at 4 ° C) and finally incubated with secondary antibodies, rabbit anti goat HRP (1 hour). at room temperature).
  • the revelation is by reaction of HRP on Opti-4CN. The revelation is stopped by rinsing in water when the coloration is sufficient since the reaction product absorbs in the visible. [00096].
  • the protein is alone or does not complex with the polymer, it can migrate if it is anionic or remain at the deposition site if it is cationic.
  • the protein is then detected either at the loading wells or in the form of a single spot 0.3-0.4 cm from the deposit.
  • the complex is driven more strongly by the charges of the polymer and moves towards the anode. It is detected as a single spot 0.7 cm from the deposit.
  • Solution 3 is filtered through a 0.22 ⁇ m filter to obtain a sterile solution.
  • the formation of the complex in solution 3 can be demonstrated by co-electrophoresis. [000103].
  • the complex between a polymer according to the invention and a heparin binding protein is formed by simply mixing aqueous solutions at room temperature without addition of organic solvent.
  • Example 7 Obtaining a Polymer / Protein Complex Binding to Heparin
  • Example 6 The operations described in Example 6 are carried out in such a way as to obtain a 1/10 ratio 1 / VEGF polymer complex, by using 1 ⁇ l of solution 1 supplemented with 5 ⁇ l of water and 5 ⁇ l of solution 2. 10 ⁇ l of a solution 4 containing polymer 1 at a concentration of 10 mg / ml and VEGF at a concentration of 1 mg / ml are obtained.
  • Example 8 Obtaining a Heparin-binding Polymer / Protein Complex
  • Example 6 The operations described in Example 6 are carried out so as to obtain a 1 / VEGF polymer complex of ratio 1/2, by using 0.2 ⁇ l of solution 1 supplemented with 5 ⁇ l of water and 5 ⁇ l of water. solution 2. 10 ⁇ l of a solution containing polymer 1 at a concentration of 2 mg / ml and VEGF at a concentration of 1 mg / ml are obtained.
  • Example 9 Obtaining a Polymer / Protein Complex Binding to Heparin [000106] The operations described in Example 6 are carried out with the polymer described in Example 2, Polymer 2, and FGF-2 as heparin-binding protein. Different aqueous solutions of Polymer 2 / FGF-2 complex are obtained whose Polymer 2 / FGF-2 ratios vary from 1 to 100.
  • the complex between a polymer according to the invention and a heparin-binding protein can be formed by simply adding a lyophilizate of polymer or protein to an aqueous solution of protein or polymer at room temperature without adding of organic solvent.

Abstract

L'invention concerne un complexe constitué d'un polysaccharide et d'une HBP, ledit polysaccharide étant constitué de liaisons glycosidiques de type (1,6), et/ou (1,4), et/ou (1,3) et/ou (1,2) et fonctionnalisé par au moins un dérivé du tryptophane salifiable ou salifié. Elle concerne également une composition pharmaceutique comprenant un complexe selon l'invention et l'utilisation d'un polysaccharide constitué de liaisons glycosidiques de type (1,6), et/ou (1,4), et/ou (1,3) et/ou (1,2) et fonctionnalisé par au moins un dérivé du tryptophane salifiable ou salifié pour la préparation d'une formulation pharmaceutique de HBPs stables.

Description

Complexe constitué d'un polysaccharide et d'une HBP
[0001]. La présente invention concerne la formulation de protéines thérapeutiques et plus particulièrement la formulation de protéines se liant à l'héparine dites Heparin-Binding Proteins, HBPs, qui sont associées, in vivo, à l'héparine sous forme de complexe, ce qui permet leur stabilisation et le maintien de leur activité in vivo. [0002]. L'héparine est un polysaccharide naturel porteur de fonctions carboxylates et sulfates dont la charge globale est anionique. Mais ce polysaccharide est connu pour son activité anti-coagulante puisqu'il intervient dans la formation d'un complexe entre la thrombine et l'anti- thrombine III et cette activité anti-coagulante n'est pas compatible avec une utilisation thérapeutique, par exemple, dans des traitements de cicatrisation, de régulation de la croissance, de reconstruction osseuse.
[0003]. Certaines de ces HBPs ont fait l'objet d'un développement pharmaceutique. Cependant ces protéines sont connues pour être instables physiquement (aggrégation) et chimiquement (dégradation enzymatique ou chimique). Cette instabilité peut se manifester dans les formulations et/ou sur le site d'administration. Elle peut provoquer des réactions immunoglogiques ou une perte d'efficacité. Pour compenser la perte d'activité, des solutions comme l'augmentation des doses ou de la fréquence des administrations sont employées. Elles ne sont pas satisfaisantes, notamment en raison du prix élevé de ces protéines. [0004]. Par exemple, la société Genentech a développé une formulation de VEGF pour la cicatrisation de l'ulcère du pied diabétique. Une première étude clinique dans laquelle l'administration du traitement se faisait tous les deux jours a eu lieu. La seconde étude a été réalisée avec une administration quotidienne, sans doute pour répondre au problème d'une durée d'action du VEGF trop courte pour une application tous les deux jours.
[0005]. Il a été par ailleurs démontré qu'il était possible de former des complexes entre un facteur de croissance et un polymère dans le but de le stabiliser, d'augmenter sa solubilité et/ou d'augmenter son activité. [0006]. Ainsi, dans le brevet FR0509803 de la demanderesse, il a pu être démontré que la formation de complexe entre le PDGF-BB sous sa forme courte et un polymère permettait notamment d'augmenter la solubilité de cette protéine très hydrophobe. Cependant, le PDGF-BB sous sa forme courte se fixe 100 fois moins que le PDGF-AA à l'héparine, Lustig F et al, Journal of molecular récognition, 1999, 12,112-120, il ne peut donc pas être considéré comme un facteur de croissance appartenant à la famille des HBPs. [0007]. Dans le cas du FGF, connu pour être relativement hydrophile, il a pu être démontré que la formation d'un complexe avec un polymère pouvait favoriser son activité cellulaire Rouet et al, Journal of biomédical materials research, 2006, 78A, 792-797 ', mais les polymères utilisés étaient sulfatés puisque fonctionnalisés par de la benzylamine sulfate et donc présentaient une activité anti-coagulante incompatible avec une formulation pharmaceutique.
[0008]. Logeart-Avramoglou D et al. décrivent également des dextrans modifiés par de la benzylamine et/ou des sulfates dans l'article de Biomédical Pharmacology 2002, 63, 129-137. Ces polymères en solution forment des complexes avec le TGF béta 1 comme démontré dans un essai d'interaction par électrophorèse sur gel. Cependant, les polymères non sulfatés ne présentent pas de réelle interaction même à des ratio supérieurs à 2000. Dans le cas des polymères sulfatés, une interaction a pu être démontrée pour des polymères fortement sulfatés qui présentent des propriétés anti-coagulantes. [0009]. En outre, il est également connu que la benzylamine peut présenter une certaine toxicité et peut nuire à la biocompatibilité des polymères décrits dans les deux brevets cités précédemment. [00010]. La formulation galénique de protéines à visée thérapeutique doit obligatoirement répondre à des impératifs d'innocuité des excipients et pour atteindre ces impératifs, il est indispensable d'utiliser des composés qui soient biocompatibles mais également d'en limiter la quantité par rapport au principe actif.
[00011]. Les HBPs appartiennent à huit familles de protéines elles ont des tailles, des propriétés biochimiques et des activités très différentes, elles sont cependant toutes susceptibles de s'associer à l'héparine sous forme de complexe, Bernfield M. et al., Annu. Rev. Biochem., 1999, 68, 729-777.
[00012]. Parmi celles-ci, on trouve des protéines appartenant notamment aux familles suivantes : - les hormones,
- les facteurs de croissance,
[00013]. Ces différentes familles peuvent être définies comme suit. [00014]. Par hormones, on entend des protéines messagères produites par le système endocrinien. Ces protéines agissent ensuite à distance après avoir été véhiculées dans l'ensemble de l'organisme par le sang ou la lymphe ou à l'extérieur de celui-ci. Parmi les hormones, on trouve l'hormone de croissance (hGH : human growth hormone) et l'hormone parathyroïdienne (PTH : parathyroid hormone). [00015]. Par facteurs de croissance, on entend les protéines normalement produites dans l'organisme stimulant la prolifération des cellules ou leur différenciation. Parmi ceux-ci, on trouve des protéines telles que les facteurs de croissance transformants βl et 2 (TGF-β: transforming growth factor bêta), le facteur de croissance analogue à l'insuline de type 2 (IGF-2 : Insulin-like growth factor 2), le facteur de croissance liant l'héparine et analogue au facteur de croissance épidermique (HB-EGF : Heparin Binding EGF-like Growth Factor), les facteurs de - croissance fibroblastiques de type 1 à 14 (FGF : fibroblast growth factors), le facteur de croissance des kératinocytes (KGF : Keratinocyte Growth Factor), le facteur de croissance du nerf beta (NGF-beta : Nerve Growth Factor beta ), le facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF : Connective Tissue Growth Factor), le facteur de croissance placentaire (PIGF : Placental Growth Factor), les R-spondines 1 à 4 et les facteurs de croissance de l'endothélium vasculaire A et B (VEGF : Vascular Endothelial Growth Factors). [00016]. Tous les complexes décrits ont été réalisés avec des polymères qui ont une similitude stucturale ou biologique avec l'héparine. [00017]. Le problème résolu par la présente invention est d'avoir identifié une famille très restreinte de polysaccharides biocompatibles capables de former des complexes avec les HBPs afin entre autre, de les stabiliser et d'augmenter leur solubilité, sans que ce polymère ne présente l'activité biologique d'anti-coagulation de l'héparine. [00018]. De plus il a été observé que pour augmenter l'affinité du polysaccharide pour les protéines et sa sélectivité vis-à-vis des HBPs, il n'était pas nécessaire d'augmenter encore l'amphililie du polymère contrairement à la solution exposée dans la demande FR0509803. [00019]. De plus pour contrebalancer une hydrophobicité trop importante une solution exposée dans la demande ci-dessus citée consistait à greffer des groupements hydrophiles X ou Y sur les chaînes polysaccharidiques en plus des groupements hydrophobes. [00020]. Ces résultats sont d'autant plus surprenants que par greffage d'un groupement hydrophobe salifiable ou salifié comme un reste tryptophane qui possède une fonction acide on augmente l'affinité du polysaccharide pour la protéine et la sélectivité vis-à-vis des HBPs, sans diminuer le nombre de fonctions carboxyles du polysaccharide de départ. [00021]. Par le choix de ces substituants la sélectivité vis-à-vis des HBPs est considérablement accrue.
[00022]. L'invention concerne donc l'utilisation d'un polysaccharide susbstitué par un tryptophane ou un dérivé de tryptophane, ledit trytophane ou dérivé du tryptophane étant salifiable ou salifié pour la stabilisation des HBPs. [00023]. Elle concerne plus particulièrement l'utilisation dudit polysaccharide pour la préparation d'une formulation pharmaceutique de HBPs stables.
[00024]. Elle concerne également un complexe constitué d'un polysaccharide et d'une HBP.
[00025]. Les polysaccharides selon l'invention sont constitués de liaisons glycosidiques de type (1,6), et/ou (1,4), et/ou (1,3) et/ou (1,2). Ils peuvent être neutres, c'est-à-dire ne pas être porteurs de fonctions acides ou, anioniques c'est-à-dire porteurs de fonctions acides. Ils sont fonctionnalisés par au moins un reste du tryptophane ou un dérivé du tryptophane, noté Trp :
- ledit dérivé du tryptophane étant greffé ou lié aux polysaccharides par couplage avec une fonction acide, ladite fonction acide pouvant être une fonction acide d'un polysaccharide anionique et/ou une fonction acide portée par un bras de liaison R lié au polysaccharide par une fonction F, ladite fonction F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide neutre ou anionique,
- F étant soit une fonction ester, thioester, amide, . carbonate, carbamate, éther, thioéther ou aminé, - R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide,
- Trp étant un reste du tryptophane ou d'un dérivé du tryptophane, L ou D, produit du couplage entre l'aminé du tryptophane et au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide anionique, ledit trytophane ou dérivé du tryptophane étant salifiable ou salifié.
[00026] . Dans un mode de réalisation Trp est un reste du tryptophane ou d'un dérivé du tryptophane, de configuration D.
[00027] . Dans un mode de réalisation Trp est un reste du tryptophane ou d'un dérivé du tryptophane, de configuration L.
[00028] . La HPB est choisie dans le groupe constitué par : - les hormones comme l'hormone de croissance (hGH : human growth hormone) ou l'hormone parathyroïdienne (PTH : parathyroid hormone). les facteurs de croissance comme les protéines telles que les facteurs de croissance transformants βl et 2 (TGF-β: transforming growth factor bêta), le facteur de croissance analogue à l'insuline de type 2 (IGF-2 : Insulin-like growth factor 2), le facteur de croissance liant l'héparine et analogue au facteur de croissance épidermique
(HB-EGF : Heparin Binding EGF-like Growth Factor), les facteurs de croissance fibroblastiques de type 1 à 14 (FGF : fibroblast growth factors), le facteur de croissance des kératinocytes (KGF :
Keratinocyte Growth Factor), le facteur de croissance du nerf β (NGF- β : Nerve Growth Factor β ), le facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF : Connective Tissue Growth Factor), le facteur de croissance placentaire (PIGF : Placental Growth Factor), les R- spondines 1 à 4 et les facteurs de croissance de l'endothélium vasculaire A et B (VEGF : Vascular Endothelial Growth Factors). [00029]. Selon l'invention, les polysaccharïdes fonctionnalisés peuvent répondre aux formules générales suivantes :
Polysaccharide
F [ Trp 1 R [ Trp ] n
Formule I
F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide neutre ou anionique, étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou aminé,
R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18. carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide, - Trp étant un reste d'un dérivé du tryptophane, L ou D, produit du couplage entre l'aminé du tryptophane ou d'un dérivédu tryptophane et au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide anionique, ledit trytophane ou dérivé du tryptophane étant salifiable ou salifié. - n représente la fraction molaire des R substitués par Trp et est comprise entre 0,2 et 0,7,
0 représente la fraction molaire des fonctions acides des polysaccharides substituées par Trp et est comprise entre 0,2- et 0,7,
1 représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le groupement R par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 2, j représente la fraction molaire de fonctions acides portées par le polysaccharide anionique par unité saccharidique et est comprise entre 0 et l,
(i + j) représente la fraction molaire de fonctions acides par unité saccharidique et est comprise entre 0,5 et 2, lorsque R n'est pas substitué par Trp, alors le ou les acides du groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de . préférence comme Na+ ou K+, lorsque le polysaccharide est un polysaccharide anionique, lorsqu'une ou des fonctions acides du polysaccharide ne sont pas substituées par Trp, alors elles sont salifiées par un cation, alcalin de préférence comme Na ou K, lesdits polysaccharides étant à pH neutre.
[00030]. Dans un mode de réalisation, F est soit un ester, un carbonate, un carbamate ou un éther.
[00031]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,6).
[00032]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,6) est un dextrane.
[00033]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4).
[00034]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) est choisi dans le groupe constitué par le pullulane, l'alginate, le hyaluronane, le xylane, le galacturonane ou une cellulose soluble dans l'eau.
[00035]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un pullulane.
[00036]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un alginate.
[00037]. Dans un mode de réalisation, le polysacchaπde est un hyaluronane.
[00038]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un xylane.
[00039]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est un galacturonane.
[00040]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est une cellulose soluble dans l'eau.
[00041]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,3). [00042]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,3) est un curdlane. [00043]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,2).
[00044]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,2) est une inuline. [00045]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1,3) [00046]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1,3) est un glucane. [00047]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4), et (1,3) et (1,2).
[00048]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4), et (1,3) et (1,2) est le mannane.
[00049]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le groupe R est choisi dans les groupes suivants :
ou leurs sels de cations alcalins.
[00050]. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le tryptophane ou dérivé du tryptophane est choisi dans le groupe constitué par le tryptophane, le tryptophanol, le tryptophanamide, le 2-indole éthylamine et leurs sels de cation alcalin.
[00051]. Ce substituant tryptophane ou dérivé du tryptophane est un substituant salifiable ou salifié, c'est-à-dire qu'il possède au moins une fonction hydrophile, anionique ou cationique , à savoir acide, alcool ou aminé susceptible de donner des carboxylates, des alcoolates ou des sels d'aminés.
[00052]. Le polysaccharide peut avoir un degré de polymérisation m compris entre 10 et 10000.
[00053]. Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 1000. [00054]. Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation m compris entre 10 et 500.
[00055]. Dans un mode de réalisation, le complexe selon l'invention est caractérisé en ce que le ratio massique polysaccharide/HBP est compris entre 0,5 et 500, de préférence entre 1 et 300.
[00056]. Dans un mode de réalisation, le complexe selon l'invention est caractérisé en ce que le ratio massique polysaccharide/HBP est compris entre 0,5 et 100, de préférence entre 1 et 10. [00057]. Dans un mode de réalisation, le complexe selon l'invention est caractérisé en ce que l'HBP est choisie dans le groupe des hormones comme l'hormone de croissance (hGH : human growth hormone) ou l'hormone parathyroïdienne (PTH : parathyroid hormone). [00058]. Dans un mode de réalisation, le complexe selon l'invention est caractérisé en ce que l'HBP est choisie dans le groupe des facteurs de croissance comme les protéines telles que les facteurs de croissance transformants βl et 2 (TGF-β: transforming growth factor bêta), le facteur de croissance analogue à l'insuline de type 2 (IGF-2 : Insulin-like growth factor 2), le facteur de croissance liant l'héparine et analogue au facteur de croissance épidermique (HB-EGF : Heparin Binding EGF-like Growth Factor), les facteurs de croissance fibroblastiques de type 1 à 14 (FGF : fibroblast growth factors), le facteur de croissance des kératinocytes (KGF : Keratinocyte Growth Factor), le facteur de croissance du nerf β (NGF-β : Nerve Growth Factor β ), le facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF : Connective Tissue Growth Factor), le facteur de croissance placentaire (PIGF : Placental Growth Factor), les R-spondines 1 à 4 et les facteurs de croissance de l'endothélium vasculaire A et B (VEGF : Vascular Endothelial Growth Factors).
[00059]. L'invention concerne également un procédé de préparation desdits polysaccharides par greffage d'un dérivé du tryptophane tel que précédemment défini sur un polysaccharide neutre, par couplage entre la fonction aminé du tryptophane ou d'un dérivédu tryptophane et une fonction acide obtenue par greffage d'un groupement R portant au moins une fonction acide tel que précédemment défini sur une fonction alcool du polysaccharide, pour obtenir des polysaccharides de formule I, dans laquelle j=0. [00060]. Dans un mode de réalisation, les polysaccharides selon l'invention sont obtenus par greffage d'un dérivé du tryptophane tel que précédemment défini sur une fonction acide d'un polysaccharide anionique, par couplage entre la fonction aminé du tryptophane ou d'un dérivédu tryptophane et une fonction acide portée par le polysaccharide anionique, pour obtenir des polysaccharides de formule I, dans laquelle i=0. [00061]. Dans un mode de réalisation, lorsque le polysaccharide est un polysaccharide anionique, des groupements R, peuvent être greffés sur les fonctions alcools du polysaccharide et le greffage du tryptophane ou d'un dérivédu tryptophane peut être effectué :
- soit sélectivement sur les fonctions acides des groupements R, pour obtenir des polysaccharides de formule I, dans laquelle o=0, par des réactions de protection déprotection bien connues de l'homme de l'art ou - conjointement sur les deux types de fonctions acides, pour obtenir des polysaccharides de formule I, dans laquelle n>0 et o>0. [00062]. Dans tous les modes de réalisation ci-dessus décrits, les réactions de couplage sont suivies de la neutralisation des fonctions acides n'ayant pas réagi avec un dérivé du tryptophane par salification par une des méthodes bien connues de l'homme de l'art, pour obtenir un sel de cation alcalin de préférence Na ou K.
[00063]. L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un complexe selon l'invention tel que décrit précédemment.
[00064]. L'invention concerne également une composition pharmaceutique selon l'invention telle que décrite précédemment, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par séchage et/ou lyophilisation. [00065]. L'HBP peut être exogène c'est à dire qu'elle est apportée par la composition selon l'invention. Elle peut également être endogène, par exemple les facteurs de croissance qui vont être sécrétés dans une plaie pendant la première phase de cicatrisation et qui pourront être stabilisés par la formation du complexe selon l'invention in vivo dans la plaie. [00066]. Selon les pathologies visées elle est destinée à un traitement local ou systémique. [00067]. Dans le cas des libérations locale et systémique, les modes d'administration envisagés sont par voie intraveineuse, sous-cutanée, intradermique, transdermique, intramusculaire, orale, nasale, vaginale, oculaire, buccale, pulmonaire etc. [00068]. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont soit sous forme liquide, en solution aqueuse, soit sous forme de poudre, d'implant ou de film. Elles comportent en outre les excipients pharmaceutiques classiques bien connus de l'homme de l'art. [00069]. En fonction des pathologies et des modes d'administration les compositions pharmaceutiques pourront avantageusement comporter, en outre, des excipients permettant de les formuler sous forme de gel, d'épongé, de solution injectable, de solution buvable, de lyoc etc. [00070]. L'invention concerne également une composition pharmaceutique selon l'invention telle que décrite précédemment, caractérisée en ce qu'elle est administrable sous forme de stent, de film ou « coating » de biomatériaux implantables, d'implant.
Exemples :
A - Synthèse des polymères Exemple 1 : synthèse d'un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par le sel de sodium du tryptophane, polymère 1.
[00071]. 70 g (soit 1295 mmol de fonctions hydroxyles) de dextrane de masse molaire moyenne en poids d'environ 40 kg/mol (Fluka) sont solubilisés dans de l'eau à 42 g/L. A cette solution sont ajoutés 130 mL de NaOH 10 N (1295 mmol NaOH). Le mélange est porté à 35°C puis 201 g (1727 mmol) de chloroacétate de sodium sont ajoutés. La température du milieu réactionnel est portée à 600C à 0.5°C/min puis maintenue à 600C pendant 100 minutes. Le milieu réactionnel est dilué avec 200 mL d'eau, neutralisé à l'acide acétique et purifié par ultrafiltration sur membrane PES de 5 kD contre 6 volumes d'eau. La solution finale est dosée par extrait sec pour déterminer la concentration en polymère ; puis dosée . par dosage acide/base dans de l'eau/acétone 50 / 50 (V/V) pour déterminer le degré de substitution en méthylcarboxylates. [00072]. D'après l'extrait sec : [polymère] = 51,5 mg/g [00073]. D'après le dosage acide/base : Le degré de substitution des fonctions hydroxyles par des fonctions méthylcarboxylates est de 1.04 par motif saccharidique.
[00074]. La solution de dextraneméthylcarboxylate de sodium est passée sur une résine Purolite (anionique) pour obtenir le dextraneméthylcarboxylique acide qui est ensuite lyophilisé pendant 18 heures.
[00075]. 14,5 g de dextraneméthylcarboxylique acide (soit 66 mmol fonctions acide méthylcarboxylique acide) sont solubilisés dans le DMF à 57 g/L puis refroidis à 00C. 6,67 g (66 mmol) de NMM et 7,15 g (66 mmol) de EtOCOCI sont ensuite ajoutés. Après 10 min de réaction, 6,06 g (30 mmol) de TrpOH sont ajoutés. Le milieu est ensuite chauffé à 100C et maintenu à cette température pendant 30 minutes. Une solution d'imidazole à 340 g/L (8,97 g, 132 mmol) dans l'eau est ensuite ajoutée, le milieu réactionnel est brièvement chauffé à 300C. Le milieu réactionnel est ensuite dilué avec 70 mL d'eau, puis filtré sur verre fritte porosité 1 puis sur verre frjtté porosité 3, il est alors limpide. La solution est ultrafiltrée sur membrane PES 10 kD contre 10 volumes de solution NaCI 0.9% puis 6 volumes d'eau. La concentration de la solution de polymère 1 est déterminée par extrait sec. Une fraction de solution est lyophilisée et analysée par RMN 1H dans D2O pour déterminer le DS en tryptophane greffé. [00076]. D'après l'extrait sec : [polymère] = 54 mg/g [00077]. D'après la RMN 1H : La fraction molaire des acides modifiés par le tryptophane est de 0,38.
Exemple 2 : synthèse d'un pullulaneméthylcarboxylate de sodium modifié par le sel de sodium du tryptophane, polymère 2. [00078]. 8 g (soit 148 mmol de fonctions hydroxyles) de Pullulane de masse molaire moyenne en poids d'environ 100 kg/mol (Fluka) sont solubilisés dans de l'eau à 42 g/L. A cette solution sont ajoutés 15 mL de NaOH 10 N (148 mmol NaOH). Le mélange est porté à 35°C puis 23 g (198 mmol) de chloroacétate de sodium sont ajoutés. La température du milieu réactionnel est portée à 600C à 0.5°C/min puis maintenue à 600C pendant 100 minutes. Le milieu réactionnel est dilué avec 200 mL d'eau, neutralisé à l'acide acétique et purifié par ultrafiltration sur membrane PES de 5 kD contre 6 volumes d'eau. La solution finale est dosée par extrait sec pour déterminer la concentration en polymère ; puis dosée par dosage acide/base dans de l'eau/acétone 50 / 50 (V/V) pour déterminer le degré de substitution en méthylcarboxylates. [00079]. D'après l'extrait sec : [polymère] = 31.5 mg/g [00080]. D'après le dosage acide/base : Le degré de substitution des fonctions hydroxyles par des fonctions méthylcarboxylates est de 1.17 par motif saccharidique.
[00081]. La solution de pullulaneméthylcarboxylate de sodium est passée sur une résine Purolite (anionique) pour obtenir le pullulaneméthylcarboxylique acide qui est ensuite lyophilisé pendant 18 heures.
[00082]. 3.51 g de pullulaneméthylcarboxylique acide (soit 18 mmol fonctions acide carboxyméthyl) sont solubilisés dans le DMF à 57 g/L puis refroidis à 00C. 1.81 g (18 mmol) de NMM et 1.94 g (18 mmol) de EtOCOCI sont ensuite ajoutés. Après 10 min de réaction, 1.40 g (7 mmol) de TrpOH sont ajoutés. Le milieu est ensuite chauffé à 100C et maintenu à cette température pendant 30 minutes. Une solution d'imidazole (2.43 g, 36 mmol) à 340 g/L dans l'eau est ensuite ajoutée, le milieu réactionnel est brièvement chauffé à 3O0C. Le milieu réactionnel est ensuite dilué avec 70 mL d'eau, puis filtré sur verre fritte porosité 1 puis sur verre fritte porosité 3, il est alors limpide. La solution est ultrafiltrée sur membrane PES 10 kD contre 10 volumes de solution NaCI 0.9% puis 6 volumes d'eau. La concentration de la solution de polymère 2 est déterminée par extrait sec. Une fraction de solution est lyophilisée et analysée par RMN 1H dans D2O pour déterminer le DS en tryptophane greffé.
[00083]. D'après l'extrait sec : [polymère] = 17,2 mg/g
[00084]. D'après la RMN 1H : La fraction molaire des acides modifiés par le tryptophane est de 0,40.
Exemple 3 : synthèse d'un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'ester éthylique du tryptophane, polymère 3.
Le polymère 3 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'ester éthylique du L-tryptophane obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans l'exemple 1 en employant l'ester éthylique du L- tryptophane à la place du sel de sodium du L-tryptophane. Exemple 4 : synthèse d'un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'ester éthylique de la phénylalanine, polymère 4.
Le polymère 3 est un dextraneméthylcarboxylate de sodium modifié par l'ester éthylique de la L-phénylalanine obtenu à partir d'un dextrane de masse molaire moyenne en poids de 40 kg/mol (Pharmacosmos) selon le procédé décrit dans l'exemple 1 en employant l'ester éthylique de la L-phénylalanine à la place du sel de sodium du L- tryptophane.
B - Mise en évidence de l'affinité d'un polymère pour une protéine se liant à l'héparine par co-électrophorèse Exemple 3 : ratio protéine/polymère 1/500
Préparation du complexe protéine/polymère au ratio 1/500
[00085]. 1,5 μg de protéine sont ajoutés à 750 μg de polymère, à 15 μl de tampon de migration 10X (tris acétate pH 7). La solution est complétée à 150μl par de l'H2O. Cette solution est incubée à température ambiante pendant 20 minutes. 5 μl de cette seconde solution contenant 50 ng de protéine et 25 μg de polymère sont dilués dans 5 μl de tampon de migration IX. Des solutions similaires contenant uniquement la protéine ou le polymère sont préparées à titre de contrôle.
Mise en évidence du complexe entre la protéine et le polymère
[00086]. La solution de protéine/polymère (10 μl) est mélangée à 3 μl de tampon de charge (glycérol, tris-acétate et bleu de bromophénol dans de l'eau). Ces 13 μl contenant 50 ng de protéine et 25 μg de polymère sont déposés dans un puits d'un gel d'agarose 0.8%. Les solutions de contrôle (protéine ou polymère seuls) sont déposées de façon similaire. La cuve d'électrophorèse est fermée et le générateur est réglé à 30V. La migration dure 1 heure. [00087]. Après migration, le gel est transféré sur une membrane de PVDF par capillarité avec un système Apelex pendant 2h à température ambiante. La membrane est ensuite saturée avec du lait écrémé pendant 1 heure à température ambiante puis incubée avec des anticorps primaires de lapin dirigés contre la protéine (une nuit à 4°C) et enfin incubée avec des anticorps secondaires, rabbit anti goat HRP (1 heure à température ambiante). La révélation se fait par réaction de l'HRP sur le Opti-4CN. La révélation est stoppée par rinçage dans de l'eau lorsque la coloration est suffisante puisque le produit de la réaction absorbe dans le visible. [00088]. Lorsque la protéine est seule ou ne forme pas de complexe avec le polymère, elle peut migrer si elle est anionique ou rester à l'endroit 5 du dépôt si elle est cationique. La protéine est alors détectée soit au niveau des puits de chargement, soit sous la forme d'un spot unique vers 0,3-0,4 cm du dépôt. Lorsque la protéine forme un complexe avec le polymère, le complexe est entraîné plus fortement par les charges du polymère et se déplace vers l'anode. Il est détecté sous forme d'un spot unique à 0,7 cm
10 du dépôt.
[00089]. Les résultats obtenus avec le polymère 1, obtenu à l'exemple 1, le polymère 2, obtenu à l'exemple 2, et des protéines choisies dans les groupes des molécules d'adhésion cellulaire, des hormones, des protéines de coagulation, des facteurs de croissance liant l'héparine, des protéines se
15 liant aux facteurs de croissance, des cytokines et des protéines du métabolisme des lipides sont rassemblés dans le tableau I, ci-dessous. [00090]. Les résultats obtenus avec une protéine ne liant pas l'héparine (IGF-I) et les polymères 1 et 2, obtenus à l'exemple 1 et à l'exemple 2 et les résultats obtenus avec les protéines liant l'héparine citées ci-dessus et
20 un polymère non substitué avec un tryptophane sont également rassemblés dans le tableau I ci-dessous à titre de contre-exemples. TABLEAU I
[00091]. Les résultats obtenus montrent que le dextranméthylcarboxylate substitué par du tryptophane polymère 1 (exemple 1) ou le pullulaneméthylcarboxylate substitué par du tryptophane polymère 2 (exemple 2) permettent de former un complexe avec des protéines qui lient l'héparine alors que le dextranméthylcarboxylate non substitué (contre exemple 1) ne le permet pas.
[00092]. Les résultats obtenus montrent également que le dextrahméthylcarboxylate substitué ou non par le tryptophane (exemple 1 et contre exemple 1) ne forment pas de complexe avec des facteurs de croissance ne fixant pas l'héparine.
Exemple 4 : ratio protéine/ polymère 1/1
Préparation du complexe protéine/polymère au ratio 1/1 [00093]. 1,5 μg de protéine sont ajoutés à 1,5 μg de polymère, à 3 μl de tampon de migration 10X (tris acétate pH 7). La solution est complétée à 60μl par de IΗ20. Cette solution est incubée à température ambiante pendant 20 minutes. 2 μl de cette seconde solution contenant 50 ng de protéine et 50 ng de polymère sont dilués dans 8 μl de tampon de migration IX.
Mise en évidence du complexe entre la protéine et le polymère
[00094]. La solution de protéine/polymère (10 μl) est mélangée à 3 μl de tampon de charge (glycérol, tris-acétate et bleu de bromophénol dans de l'eau). Ces 13 μl contenant 50 ng de protéine et 50 ng de polymère sont déposés dans un puits d'un gel d'agarose 0.8%. La cuve d'électrophorèse est fermée et le générateur est réglé à 30V. La migration dure 1 heure. [00095]. Après migration, le gel est transféré sur une membrane de PVDF par capillarité avec un système Apelex pendant 2h à température ambiante. La membrane est ensuite saturée avec du lait écrémé pendant 1 heure à température ambiante puis incubée avec des anticorps primaires de lapin dirigés contre la protéine (une nuit à 4°C) et enfin incubée avec des anticorps secondaires, rabbit anti goat HRP (1 heure à température ambiante). La révélation se fait par réaction de l'HRP sur le Opti-4CN. La révélation est stoppée par rinçage dans de l'eau lorsque la coloration est suffisante puisque le produit de la réaction absorbe dans le visible. [00096]. Lorsque la protéine est seule ou ne forme pas de complexe avec le polymère, elle peut migrer si elle est anionique ou rester à l'endroit du dépôt si elle est cationique. La protéine est alors détectée soit au niveau des puits de chargement, soit sous la forme d'un spot unique vers 0,3-0,4 cm du dépôt. Lorsque la protéine forme un complexe avec le polymère, le complexe est entraîné plus fortement par les charges du polymère et se déplace vers l'anode. Il est détecté sous forme d'un spot unique à 0,7 cm du dépôt.
[00097]. Les résultats obtenus avec les polymères 1, 3 et 4 et deux facteurs de croissance, le FGF-2 et le NGF-beta sont rassemblés dans le tableau II, ci-dessous.
Tous les complexes Polymère/Protéine sont étudiés au ratio massique 1/1. TABLEAU II
[00098]. Ce test permet de mettre en évidence que l'interaction entre le polymère 1 et les HBPs est suffisamment forte pour permettre la réduction de la " quantité de polymère ce qui est favorable dans un but de développement pharmaceutique. Les polymères 3 et 4 n'ont pas une interaction suffisamment forte avec les deux HBPs testées pour obtenir un complexe au ratio 1/1.
C - Mise en évidence de l'affinité d'un polymère pour une protéine se liant à l'héparine par ITC
Exemple 5 : interaction de la PTH (1 -34) avec l'héparine et le polymère 1.
[00099]. Il a été démontré dans la littérature (Kamerzell 2007) que la PTH(l-84) se liait à l'héparine avec un Kd de 300 nM lors d'une expérience d'ITC (Isothermal Tiration Calorimetry, Titration par Calorimétrie Isotherme). Dans des conditions identiques, nous avons démontré que la PTH (1-34) interagissait avec l'héparine avec un Kd de 227 nM. [000100]. L'héparine est placée dans la cellule à une concentration de 2 μM en tampon 4,8 mM citrate pH=5,3, 42 mM NaCI. La PTH(l-34) est placée dans la seringue à une concentration de 208,6 μM. 50 injections de 5 μl ont été réalisées et les résultats ont été ajustés à un modèle de n sites indépendants qui ont permis de calculer un Kd de 227 nM. [000101]. Dans des conditions similaires, le polymère 1 a été placé dans la cellule à une concentration de 0,5 μM en tampon 4,8 mM citrate pH=5,3, 42 mM NaCI. La PTH(l-34) est placée dans la seringue à une concentration de 191 μM. 50 injections de 5 μl ont été réalisées et les résultats ont été ajustés à un modèle de n sites indépendants qui ont permis de calculer un Kd de 6,9 μM démontrant l'interaction du polymère 1 avec la PTH, cette interaction est proche de celle de l'héparine.
D - Exemples de formulations
Exemple 6: Obtention d'un complexe Polymère/ Protéine se liant à l'héparine
[000102]. Les opérations suivantes sont menées en zone propre. 5 g de lyophilisât du polymère décrit à l'exemple 1, Polymère 1, sont solubilisés dans 50 mL d'eau pour conduire à la solution 1 (concentration en Polymère 1 de 100 mg/mL). En parallèle, 10 μg de lyophilisât de VEGF sont solubilisés dans 5 μL d'eau pour conduire à la solution 2 (concentration en VEGF de 2 mg/mL). 5 μL de la solution 1 sont mélangés à 5 μL de la solution 2 à température ambiante pour former une solution 3 contenant le polymère 1 à la concentration de 50 mg/mL et le VEGF à la concentration de 1 mg/mL. La solution 3 est filtrée sur filtre 0,22 μm pour conduire à l'obten.tion d'une solution stérile. La formation du complexe dans la solution 3 peut être mise en évidence par co-électrophorèse. [000103]. En conclusion, le complexe entre un polymère selon l'invention et une protéine se liant à l'héparine est formé par simple mélange de solutions aqueuses à température ambiante sans ajout de solvant organique. Exemple 7: Obtention d'un complexe Polymère/ Protéine' se liant à l'héparine
[000104]. Les opérations décrites dans l'exemple 6 sont conduites de façon à obtenir un complexe polymère 1 / VEGF de ratio 1/10, en employant 1 μL de la solution 1 complétés à 5 μl_ par de l'eau et 5 μl_ de la solution 2. 10 μL d'une solution 4 contenant le polymère 1 à la concentration de 10 mg/mL et le VEGF à la concentration de 1 mg/mL sont obtenus.
Exemple 8 : Obtention d'un complexe Polymère / Protéine se liant à l'héparine
[000105]. Les opérations décrites dans l'exemple 6 sont conduites de façon à obtenir un complexe polymère 1 / VEGF de ratio 1/2, en employant 0,2 μL de la solution 1 complétés à 5 μL par de l'eau et 5 μL de la solution 2. 10 μL d'une solution 5 contenant le polymère 1 à la concentration de 2 mg/mL et le VEGF à la concentration de 1 mg/mL sont obtenus.
Exemple 9 : Obtention d'un complexe Polymère / Protéine se liant à l'héparine [000106]. Les opérations décrites dans l'exemple 6 sont conduites avec le polymère décrit à l'exemple 2, Polymère 2, et le FGF-2 comme Protéine se liant à l'héparine. Différentes solutions aqueuses de complexe Polymère 2 / FGF-2 sont obtenues dont les ratios Polymère 2 / FGF-2 varient de 1 à 100.
Exemple 10 : Obtention d'un complexe Polymère / Protéine se liant à l'héparine
[000107]. Les opérations suivantes sont menées en zone propre. 5 g de lyophilisât du polymère décrit à l'exemple 2, Polymère 2, sont solubilisés dans 100 mL d'eau pour conduire à la solution 1 (concentration en polymère 1 de 50 mg/mL). 10 μL de cette solution sont introduits dans un flacon de 50 μL. Puis, 10 μg de lyophilisât de VEGF sont ajoutés à cette solution à température ambiante. La solution obtenue contient le polymère 2 à la concentration de 50 mg/mL et le VEGF à la concentration de 1 mg/mL. Cette solution est limpide après 15 minutes d'agitation douce et peut être filtrée sur filtre 0,22 μm pour conduire à l'obtention d'une solution stérile. La formation du complexe dans la solution finale peut être mise en évidence par co-électrophorèse.
[000108]. A l'inverse, la même solution finale est obtenue par ajout de 500 μg de polymère 2 lyophilisé à 10 μL d'une solution de VEGF à 1 mg/mL.
[000109]. En conclusion, le complexe entre un polymère selon l'invention et une protéine se liant à l'héparine peut être formé par simple ajout d'un lyophilisât de polymère ou de protéine à une solution aqueuse de protéine ou de polymère à température ambiante sans ajout de solvant organique.

Claims

Revendications
1. Complexe constitué d'un polysaccharide susbstitué par un tryptophane ou un dérivé de tryptophane, et d'une HBPs caractérisé en ce que le polysaccharide est choisi dans le groupe des polysaccharides constitués en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,6), et/ou (1,4), et/ou (1,3) et/ou (1,2), neutres ou anioniques, fonctionnalisés par au moins le tryptophane ou un dérivé du tryptophane, noté Trp :
- ledit tryptophane ou dérivé du tryptophane étant greffé ou lié aux polysaccharides par couplage avec une fonction acide, ladite
• fonction acide pouvant être une fonction acide d'un polysaccharide anionique et/ou une fonction acide portée par un bras de liaison R lié au polysaccharide par une fonction F, ladite fonction F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide neutre ou anionique,
- F étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou aminé, - R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide,
- ' Trp étant un reste du tryptophane ou d'un dérivé du tryptophane, L ou D, produit du couplage entre l'aminé du tryptophane et au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide anionique,
- ledit tryptophane ou dérivé du tryptophane étant salifiable ou salifié, et choisi dans le groupe constitué par le tryptophane, le tryptophanol, le tryptophanamide, le 2-indole éthylamine et leurs sels ,
- ladite HPB étant choisie dans le groupe constitué par : les hormones comme l'hormone de croissance (hGH : human growth hormone) ou l'hormone parathyroïdienne (PTH : parathyroid hormone). les facteurs de croissance comme les protéines telles que les facteurs de croissance transformants βl et 2 (TGF-β: transforming growth factor bêta), le facteur de croissance analogue à l'insuline de type 2 (IGF-2 : Insulin-like growth factor 2), le facteur de croissance liant l'héparine et analogue au facteur de croissance épidermique (HB-EGF : Heparin Binding EGF-like Growth Factor), les facteurs de croissance fibroblastiques de type 1 à 14 (FGF : fibroblast growth factors), le facteur de croissance des kératinocytes (KGF : Keratinocyte Growth Factor), le facteur de croissance du nerf β (NGF-β : Nerve Growth Factor β ), le facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF : Connective Tissue Growth Factor), le facteur de croissance placentaire (PIGF : Placental Growth Factor), les R-spondines 1 à 4 et les facteurs de croissance de l'endothélium vasculaire A et B (VEGF : Vascular Endothelial Growth Factors).
2. Complexe selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polysaccharide est choisi dans le groupe constitué des polysaccharides de formule générale I:
Polysaccharide
F
[ Trp 1 R [ Trp ] n
Formule I
F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction - OH du polysaccharide neutre ou anionique, étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou aminé,
- R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide,
- Trp étant un reste d'un dérivé du tryptophane, L ou D, produit du couplage entre l'aminé du tryptophane ou d'un dérivé du tryptophane et au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide anionique,
- n représente la fraction molaire des R substitués par Trp et est comprise entre 0,2 et 0,7,
- o représente la fraction molaire des fonctions acides des polysaccharides substituées par Trp et est comprise entre 0,2 et 0,7,
- i représente la fraction molaire de fonctions acides" portées par le groupement R par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 2,
- j représente la fraction molaire de fonctions acides portées par • le polysaccharide anionique par unité saccharidique et est comprise entre 0 et 1,
- (i + j) représente la fraction molaire de fonctions acides par unité saccharidique et est comprise entre 0,5 et 2,
- lorsque R n'est pas substitué par Trp, alors le ou les acides du groupement R sont des carboxylates de cation, alcalin de préférence comme Na+ ou K+,
- lorsque le polysaccharide est un polysaccharide anionique, lorsqu'une ou des fonctions acides du polysaccharide ne sont pas substituées par Trp, alors elles sont salifiées par un cation, alcalin de préférence comme Na ou K, fesdits polysaccharides étant à pH neutre.
3. Complexe selon la revendication précédente, caractérisé en ce que F est soit un ester, un carbonate, un carbamate ou un éther.
4. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,6).
5. Complexe selon la revendication 4, caractérisé en ce que le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,6) est un dextrane.
6. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4).
7. Complexe selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) est choisi dans le groupe constitué par le pullulane, l'alginate, le hyaluronane, le xylane, le galacturonane ou une cellulose soluble dans l'eau.
8. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,3).
9. Complexe selon la revendication 8, caractérisé en ce que le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,3) est un curdlane.
10. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,2).
11. Complexe selon la revendication 10, caractérisé en ce que le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,2) est une inuline.
12. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1,3)
13. Complexe selon la revendication 12, caractérisé en ce que le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4) et (1,3) est un glucane.
14. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le polysaccharide est constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4), et (1,3) et (1,2).
15. Complexe selon la revendication 14, caractérisé en ce que le polysaccharide constitué en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,4), et (1,3) et (1,2) est le mannane.
16. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le groupe R est choisi dans les groupes suivants :
ou leurs sels de cations alcalins.
17. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le ratio polysaccharide/HBP est compris entre 0,5 et 500, de préférence entre 1 et 300.
18. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le ratio polysaccharide/HBP est compris entre 0,5 et 100, de préférence entre 1 et 10.
19. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 caractérisé en ce que l'HBP est choisie dans le groupe des hormones comme l'hormone de croissance (hGH : human growth hormone) ou l'hormone parathyroïdienne (PTH : parathyroid hormone).
20. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 caractérisé en ce que l'HBP est choisie dans le groupe des facteurs de croissance comme les protéines telles que les facteurs de croissance transformants βl et 2 (TGF-β: transforming growth factor bêta), le facteur de croissance analogue à l'insuline de type 2 (IGF-2 : Insulin-like growth factor 2), le facteur de croissance liant l'héparine et analogue au facteur de croissance épidermique (HB-EGF : Heparin Binding EGF-like Growth Factor), les facteurs de croissance fibroblastiques de type 1 à 14 (FGF : fibroblast growth factors), le facteur de croissance des kératinocytes (KGF : Keratinocyte Growth Factor), le facteur de croissance du nerf β (NGF-β : Nerve Growth Factor β ), le facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF : Connective Tissue Growth Factor), le facteur de croissance placentaire (PIGF : Placental Growth Factor), les R-spondines 1 à 4 et les facteurs de croissance de l'endothélium vasculaire A et B (VEGF : Vascular Endothelial Growth Factors).
21. Composition pharmaceutique comprenant un complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes.
22. Composition pharmaceutique selon la revendication précédente, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par séchage et/ou lyophilisation.
23. Utilisation pour la stabilisation des HPBs d'un polysaccharide susbstitué par un tryptophane ou un dérivé de tryptophane, choisi dans le groupe des polysaccharides constitués en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,6), et/ou (1,4), et/ou (1,3) et/ou (1,2), neutres ou anioniques, fonctionnalisés par au moins le tryptophane ou un dérivé du tryptophane, noté Tr p : - ledit tryptophane ou dérivé du tryptophane étant greffé ou lié aux polysaccharides par couplage avec une fonction acide, ladite fonction acide pouvant être une fonction acide d'un polysaccharïde anionique et/ou une fonction acide portée par un bras de liaison R lié au polysaccharide par une fonction F, ladite fonction F résultant du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide neutre ou anionique,
- F étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou aminé,
- R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide,
- Trp étant un reste du tryptophane ou d'un dérivé du tryptophane, L ou D, produit du couplage entre l'aminé du tryptophane et au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide anionique,
- ledit tryptophane ou dérivé du tryptophane étant salifiable ou salifié, et choisi dans le groupe constitué par le tryptophane, le tryptophanol, le tryptophanamide, le 2-indole éthylamine et leurs sels ,
24- Utilisation d'un polysaccharide pour la préparation d'une formulation pharmaceutique de HBPs stables, lesdit polysaccharide susbstitué par un tryptophane ou un dérivé de tryptophane caractérisé en ce que le polysaccharide est choisi dans le groupe des polysaccharides constitués en majorité de liaisons glycosidiques de type (1,6), et/ou (1,4), et/ou (1,3) et/ou (1,2), neutres ou anioniques, fonctionnalisés par au moins le tryptophane ou un dérivé du tryptophane, noté Trp :
- ledit tryptophane ou dérivé du tryptophane étant greffé ou lié aux polysaccharides par couplage avec une fonction acide, ladite fonction acide pouvant être une fonction acide d'un polysaccharide anionique et/ou une fonction acide portée par un bras de liaison R lié au polysaccharide par une fonction F, ladite fonction F résultant
• du couplage entre le bras de liaison R et une fonction -OH du polysaccharide neutre ou anionique, - F étant soit une fonction ester, thioester, amide, carbonate, carbamate, éther, thioéther ou aminé,
- R étant une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée, comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, et ayant au moins une fonction acide,
- Trp étant un reste du tryptophane ou d'un dérivé du tryptophane, L ou D, produit du couplage entre l'aminé du tryptophane et au moins un acide porté par le groupement R et/ou un acide porté par le polysaccharide anionique,
- ledit tryptophane ou dérivé du tryptophane étant salifiable ou salifié, et choisi dans le groupe constitué par le tryptophane, le tryptophanol, le tryptophanamide, le 2-indole éthylamine et leurs
" sels.
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