JP2012503643A - 多糖類とｈｂｐとからなる複合体 - Google Patents

多糖類とｈｂｐとからなる複合体 Download PDF

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Abstract

【課題】多糖類とＨＢＰとから成る複合体を提供する。
【解決手段】本発明は、多糖類とＨＢＰとから成る複合体に関し、前記多糖類は、（１，６）型及び／又は（１，４）型及び／又は（１，３）型及び／又は（１，２）型のグリコシド結合から成るとともに、塩化し得る又は塩化された少なくとも１種のトリプトファン誘導体により官能化されている。本発明はまた、本発明に従う複合体を含有する医薬組成物に、並びに、安定なＨＢＰの医薬製剤の製造のための、（１，６）型及び／又は（１，４）型及び／又は（１，３）型及び／又は（１，２）型のグリコシド結合から成るとともに、塩化し得る又は塩化された少なくとも１種のトリプトファン誘導体により官能化された多糖類の使用にも関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、治療用タンパク質の製剤に、そしてより特に、生体内で複合体の形態にてヘパリンと会合し、それらを安定化し、そしてそれらの生体内活性を維持する、ヘパリン−結合タンパク質（Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）である、ＨＢＰとして既知の、ヘパリンに結合するタンパク質の製剤に関する。
ヘパリンは、カルボキシレート及びスルフェート官能基を有する天然多糖類であり、その全体としての電荷はアニオンである。しかしながら、この多糖類は、トロンビンと抗トロンビンＩＩＩとの間の複合体の形成に干渉するために、その抗凝結活性のために既知であり、そして、この抗凝結活性は、治療用途、例えば、瘢痕形成、成長調節又は骨再生治療と相容れない。
これらＨＢＰの幾つかは、医薬開発の対象となっている。しかしながら、これらタンパク質は、物理学的に不安定であること（凝集）、及び化学的に不安定であること（酵素分解又は化学分解）が既知である。この不安定性は、製剤中において、及び／又は投与部位において現れる。それはまた、免疫学的反応又は効能の損失を引き起こし得る。活性の損失を補うために、投与量又は投与回数の増加といったような解決法が採られる。それら解決法は、特にこれらタンパク質の高コストという理由により不満足である。
ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）社は、糖尿病患者の足部潰瘍を治すためのＶＥＧＦ製剤を開発した。治療投与が２日毎に行われる最初の臨床研究が行われた。２日毎の適用では不足過ぎるというＶＥＧＦの作用の持続性の問題に対して明らかに回答するため、第二の研究が毎日投与により行われた。
成長因子を安定化させ、その溶解度を高め、及び／又はその活性を高める目的のために、成長因子とポリマーとの間で複合体を形成することが可能であることがさらに示された。
それ故、本出願人による特許文献１において、短い形態にあるＰＤＧＦ−ＢＢとポリマーとの間の複合体の形成が、特にこの高疎水性タンパク質の溶解度を高め得ることが示された。
しかしながら、短い形態にあるＰＤＧＦ−ＢＢは、ＰＤＧＦ−ＡＡと比べ１００分の１しかヘパリンに対して結合せず（非特許文献１）；それ故、ＨＢＰファミリーに属する成長因子としては考えられ得ない。
比較的親水性のものとして既知であるＦＧＦの場合には、ポリマーとの複合体の形成は、その細胞活性を促進し得ることが示されたが（非特許文献２）、用いられるポリマーは、ベンジルアミンスルフェートによって官能化されるために、硫酸化され、そしてそのために医薬製剤とは相容れない抗凝結活性を有する。
Ｌｏｇｅａｒｔ−Ａｖｒａｍｏｇｌｏｕ Ｄ．他は、また、非特許文献３において、ベンジルアミン及び／又はスルフェートにより変性されたデキストランを記載している。ゲル電気泳動による相互作用の試験において示されるように、溶液中のこれらポリマーは、ＴＧＦベータ１と複合体を形成する。しかしながら、硫酸化されていないポリマーは、２００よりも高い比率であっても、いかなる現実の相互作用をも示さない。硫酸化されたポリマーの場合には、相互作用は、抗凝結特性を有する高硫酸化されたポリマーについて示され得る。
さらには、ベンジルアミンはある水準の毒性を有しており、前述の２特許において記載されるポリマーの生体適合性に害を及ぼし得ることがまた、既知である。
治療用タンパク質のガレン製剤は、賦形剤の無害性に関する要件に必ず合致していなければならず、そしてこれら要件を満足するためには、生体適合性である化合物を用いることが必須であるが、活性原理に対してそれらの量を制限することもまた必須である。
ＨＢＰはタンパク質の８つのファミリーに属し、それらは非常に種々の寸法、生化学的特性及び活性を有しているが、それらは全て複合体の形態でヘパリンと結合し得る（非特許文献４）。
これらタンパク質は、特に以下のファミリー：
−ホルモン
−成長因子
に属する。
これら種々のファミリーは、下記のとおり定義され得る。
用語“ホルモン”とは、内分泌系によって生成されるメッセンジャータンパク質を意味する。これらタンパク質はその後、血液又はリンパ液により、又はその外部へと全身を通して運搬された後に、遠く離れて作用する。ホルモンは、成長ホルモン（ｈＧＨ：ヒト成長ホルモン）及び副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）である。
用語“成長因子”とは、細胞の増殖又は分化を刺激する、体内で通常に生成されるタンパク質を意味する。これらは、形質転換成長因子β１及び２（ＴＧＦ−β）、インシュリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）１ないし１４、ケラチン生成細胞成長因子（ＫＧＦ）、神経成長因子β（ＮＧＦ−β）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、Ｒ−スポンジン（ｓｐｏｎｄｉｎ）１ないし４及び血管内皮成長因子Ａ及びＢ（ＶＥＧＦ）のようなタンパク質である。
記載される全ての複合体は、構造上又は生物学的にヘパリンと類似性を有するポリマーを用いて調製されている。
仏国特許第０５／０９８０３号明細書
Ｌｕｓｔｉｇ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，１９９９，１２，１１２−１２０ Ｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，７８Ａ，７９２−７９７ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２００２，６３，１２９−１３７ Ｂｅｒｎｆｉｅｌｄ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９９，６８，７２９−７７７
本発明によって解決される課題は、とりわけ、ヘパリンの抗凝結生物活性を有するこのポリマーなしに、ＨＢＰを安定化させるために、そしてそれらの溶解度を高めるために、ＨＢＰとの複合体を形成し得る、非常に限定されたファミリーの生体適合性多糖類を同定することである。
さらには、特許文献１に開示される解決法とは対照的に、タンパク質に対する多糖類の親和性、及びＨＢＰに対するその選択性を高めるために、ポリマーの両親媒性をさらに向上させる必要の無いことが、観察された。
さらには、過度の疎水性を相殺するために、上記の文献１に開示される解決法は、親水基の他に、親水基Ｘ又はＹを多糖類鎖上にグラフトしたことから成る。
これらの結果は、開始多糖類中のカルボキシル官能基数を低下させることなく、酸官能基を有する、トリプトファン残基のような塩化し得るか又は塩化された疎水基をグラフトしたことによって、タンパク質に対する多糖類の親和性及びＨＢＰに対する選択性が向上したために、尚更驚くべきことである。
これら置換基の選択によって、ＨＢＰに対する選択性が大幅に向上する。
このように本発明は、ＨＢＰの安定化のための、トリプトファン又はトリプトファン誘導体により置換された多糖類の使用であって、前記トリプトファン又はトリプトファン誘導体は塩化し得るか又は塩化されている、使用に関する。
本発明はより特に、安定なＨＢＰの医薬製剤の製造のための前記多糖類の使用に関する。
本発明はまた、多糖類とＨＢＰとから成る複合体にも関する。
本発明に従う多糖類は、（１，６）型及び／又は（１，４）型及び／又は（１，３）型及び／又は（１，２）型のグリコシド結合から成る。それらは、中性であり得、即ち酸性官能基又はアニオン官能基を有していない、即ち酸官能基を有していない。
それらは、少なくとも１つのトリプトファン残基又は少なくとも１つのトリプトファン誘導体（Ｔｒｐと記す)により官能化されており：
前記トリプトファン誘導体は、酸官能基とのカップリングを介して前記多糖類にグラフト又は結合しており、前記酸官能基は、アニオン性多糖類の酸官能基及び／又は官能基Ｆを介して多糖類に結合したリンカーＲにより生じた酸官能基であってもよく、前記官能基Ｆは、前記リンカーＲと、中性又はアニオン性多糖類の−ＯＨ官能基との間のカップリング由来のものであり、
Ｆは、エステル、チオエステル、アミド、カルボネート、カルバメート、エーテル、チオエーテル又はアミン官能基を表し、
Ｒは、枝分れ状であっても、及び／又は不飽和であっても、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有していてもよく、そして少なくとも１つの酸官能基を有する１ないし１８個の炭素原子を含有する鎖を表し、
Ｔｒｐは、トリプトファンのアミンと、基Ｒにより生じた少なくとも１つの酸及び／又はアニオン性多糖類により生じた酸との間のカップリングにより生成した、トリプトファン残基又はトリプトファン誘導体のＬ体又はＤ体を表し、前記トリプトファン又はトリプトファン誘導体は、塩化し得るか又は塩化されている。
一の態様において、Ｔｒｐは、Ｄ体のトリプトファン残基又はトリプトファン誘導体である。
一の態様において、Ｔｒｐは、Ｌ体のトリプトファン残基又はトリプトファン誘導体である。
ＨＰＢは、
ホルモン、例えば、成長ホルモン（ｈＧＨ：ヒト成長ホルモン)又は副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ)、
成長因子、例えば、形質転換成長因子β１及び２（ＴＧＦ−β）、インシュリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）１ないし１４、ケラチン生成細胞成長因子（ＫＧＦ）、神経成長因子β（ＮＧＦ−β）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、Ｒ−スポンジン（ｓｐｏｎｄｉｎ）１ないし４及び血管内皮成長因子Ａ及びＢ（ＶＥＧＦ）のようなタンパク質
からなる群より選択される。
本発明に従うと、官能化された多糖類は、以下の一般式：
Figure 2012503643
［式中、
Ｆは、リンカーＲと、中性又はアニオン性多糖類の−ＯＨ官能基との間のカップリングにより生じたものであって、エステル、チオエステル、アミド、カーボネート、カルバメート、エーテル、チオエーテル又はアミン官能基を表し、
Ｒは、枝分れ状であっても、及び／又は不飽和であっても、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有していてもよく、そして少なくとも１つの酸官能基を有する１ないし１８個の炭素原子を含有する鎖を表し、
Ｔｒｐは、トリプトファンのアミン又はトリプトファンをベースとしたアミンと、基Ｒにより生じた少なくとも１つの酸及び／又はアニオン性多糖類により生じた酸との間のカップリングにより生成した、トリプトファンをベースとした残基のＬ体又はＤ体を表し、
ｎは、Ｔｒｐにより置換されたＲのモル分率を表すものであって、０．２ないし０．７であり、
ｏは、Ｔｒｐにより置換された多糖類の酸官能基のモル分率であって、０．２ないし０．７であり、
ｉは、糖単位当りの、基Ｒにより生じた酸官能基のモル分率を表すものであって、０ないし２であり、
ｊは、糖単位当りの、アニオン性多糖類により生じた酸官能基のモル分率であって、０ないし１であり、
（ｉ＋ｊ）は、糖単位当りの酸官能基のモル分率であって、０．５ないし２であり、
ＲがＴｒｐによって置換されていない場合には、基Ｒの酸（群）は、カチオン、好ましくは、Ｎａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンのカルボン酸塩であり、
前記多糖類がアニオン性多糖類である場合において、該多糖類の１つ以上の酸基がＴｒｐにより置換されていない場合には、それら多糖類は、カチオンにより、好ましくはＮａ又はＫのようなアルカリ金属カチオンにより塩化されており、
前記多糖類は中性ｐＨにある］
に相当し得る。
一の態様において、Ｆは、エステル、カルボネート、カルバメート又はエーテルである。
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，６）型のグリコシド結合から成るものである。
一の態様において、前記大部分が（１，６）型のグリコシド結合から成る多糖類は、デキストランである。
一の態様において、多糖類は、大部分が（１，４）型のグリコシド結合から成るものである。
一の態様において、前記大部分が（１，４）型のグリコシド結合から成る多糖類は、プルラン、アルギネート、ヒアルロナン、キシラン、ガラクツロナン及び水溶性セルロースから成る群より選択されるものである。
一の態様において、前記多糖類は、プルランである。
一の態様において、前記多糖類は、アルギネートである。
一の態様において、前記多糖類は、ヒアルロナンである。
一の態様において、前記多糖類は、キシランである。
一の態様において、前記多糖類は、ガラクツロナンである。
一の態様において、前記多糖類は、水溶性セルロースである。
一の態様において、前記多糖類は大部分が（１，３）型のグリコシド結合から成るものである。
一の態様において、前記大部分が（１，３）型のグリコシド結合から成る多糖類は、カードランである。
一の態様において、前記多糖類は、大部分が（１，２）型のグリコシド結合から成るものである。
一の態様において、前記部分が（１，２）型のグリコシド結合から成る多糖類は、イヌリンである。
一の態様において、前記多糖類は、大部分が（１，４）型及び（１，３）型のグリコシド結合から成るものである。
一の態様において、前記大部分が（１，４）型及び（１，３）型のグリコシド結合から成る多糖類は、グルカンである。
一の態様において、前記多糖類は、大部分が（１，４）型、（１，３）型及び（１，２）型のグリコシド結合から成るものである。
一の態様において、前記大部分が（１，４）型、（１，３）型及び（１，２）型のグリコシド結合から成る多糖類は、マンナンである。
一の態様において、本発明に従う多糖類は、基Ｒが下記の基：
Figure 2012503643
或いはそれらのアルカリ金属カチオン塩より選択されることを特徴とする。
一の態様において、本発明に従う多糖類は、前記トリプトファン又はトリプトファン誘導体が、トリプトファン、トリプトファノール、トリプトファンアミド及び２−インドールエチルアミン、並びにそれらのアルカリ金属カチオン塩からなる群より選択されることを特徴とする。
このトリプトファン置換基又はトリプトファン誘導体置換基は、塩化し得るか又は塩化された置換基であり、即ち、それは少なくとも１つのアニオン性又はカチオン性親水性官能基、即ちカルボキシレート、アルコキシド又はアミン塩を与え得る酸、アルコール又はアミンを有している。
前記多糖類は、１０ないし１００００の重合度ｍを有し得る。
一の態様において、前記多糖類は、１０ないし１０００の重合度ｍを有する。
別の態様において、１０ないし５００の重合度ｍを有する。
一の態様において、本発明に従う複合体は、多糖類／ＨＢＰ質量比が０．５ないし５００であり、好ましくは１ないし３００であることを特徴とする。
一の態様において、本発明に従う複合体は、多糖類／ＨＢＰ質量比が０．５ないし１００であり、好ましくは１ないし１０であることを特徴とする。
一の態様において、本発明に従う複合体は、前記ＨＢＰが、成長ホルモン（ｈＧＨ：ヒト成長ホルモン)又は副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）のようなホルモン群より選択されることを特徴とする。
一の態様において、本発明に従う複合体は、前記ＨＢＰが、成長因子の群、例えば形質転換成長因子β１及び２（ＴＧＦ−β）、インシュリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子１ないし１４（ＦＧＦ）、ケラチン生成細胞成長因子（ＫＧＦ）、神経成長因子β（ＮＧＦ−β）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、Ｒ−スポンジン１ないし４及び血管内皮成長因子Ａ及びＢ（ＶＥＧＦ）のようなタンパク質より選択されることを特徴とする。
本発明はまた、式中のｊが０である式Ｉの多糖類を得るための、トリプトファン又はトリプトファン誘導体のアミン官能基と、上記定義した少なくとも１つの酸官能基を有する基Ｒを前記多糖類のアルコール官能基にグラフトすることにより得られた酸官能基との間のカップリングによって、上記定義したトリプトファン誘導体を中性多糖類にグラフトすることによる、本発明に係る多糖類を製造する方法にも関する。
一の態様において、本発明に従う多糖類は、式中のｉが０である式Ｉの多糖類を得るための、トリプトファン又はトリプトファン誘導体のアミン官能基と、アニオン性多糖類が有する酸官能基との間のカップリングにより、上記定義したトリプトファン誘導体をアニオン性多糖類の酸官能基にグラフトすることによって、得られる。
一の態様において、前記多糖類がアニオン性多糖類である場合、基Ｒは前記多糖類のアルコール官能基にグラフトされ得、そして、トリプトファン又はトリプトファン誘導体のグラフトは：
当業者に既知の保護及び脱保護反応を介して、基Ｒの酸官能基上で行われて、式中のｏが０である式Ｉの多糖類を得るか、
或いは、
２種の酸官能基上で組み合わせて行われて、式中ｎ＞０及びｏ＞０である式Ｉの多糖類を得ることにより実施される。
上記全ての態様において、アルカリ金属カチオン、好ましくはＮａ又はＫの塩を得るために、カップリング反応に続いて、当業者に既知である方法の一を介した塩化により、トリプトファン誘導体と反応しなかった酸官能基の中和が行われる。
本発明はまた、上記の本発明に従う複合体を含有する医薬組成物にも関する。
本発明はまた、乾燥及び／又は凍結乾燥により得られる、上記発明に従う医薬組成物にも関する。
ＨＢＰは、外因性であり得、即ちそれは、本発明に従う組成物により提供される。それはまた、内因性の、例えば瘢痕形成の初期段階中の創傷内に分泌され、そして創傷内で生体内にて本発明に従う複合体の形成を介して安定化され得る成長因子であり得る。
標的となる病理学に従うと、それは局所的な又は全身性の治療に意図される。
局所的な及び全身性の放出の場合には、想定される投与形式は、静脈、皮下、皮内、経皮、筋肉、経口、鼻腔、膣、眼球、口腔、肺等の経由である。
本発明に従う医薬組成物は、水溶液のような液体形態にあるか、又は粉末、インプラント又はフィルム形態にある。それらはまた、当業者に既知である標準的な医薬用賦形剤を含有する。
病理学及び投与形式に応じて、本医薬組成物はまた、それらをゲル、スポンジ、注射剤、飲用液、リオック（ｌｙｏｃ）等の形態で処方され得る賦形剤を有利に含有し得る。
本発明はまた、ステント、フィルム又は移植可能な生体材料の“コーティング”、又はインプラントの形態で投与され得る、上記の本発明に従う医薬組成物にも関する。
実施例：
Ａ−ポリマーの合成
実施例１：トリプトファンのナトリウム塩にて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート，ポリマー１の合成
およそ４０ｋｇ／ｍｏｌの質量平均分子量を有するデキストラン（フルカ（Ｆｌｕｋａ）社）７０ｇ（即ち、ヒドロキシル官能基１２９５ｍｍｏｌ）を水中に溶解して、４２ｇ／Ｌとした。１０Ｎ ＮａＯＨの１３０ｍＬ（１２９５ｍｍｏｌのＮａＯＨ）を、かかる溶液に添加した。該混合物を３５℃に上げ、そしてクロロ酢酸ナトリウムの２０１ｇ（１７２７ｍｍｏｌ）をその後添加した。反応媒体の温度を、０．５℃／分にて６０℃まで上げ、そしてその後、６０℃にて１００分間維持した。該反応媒体を２００ｍＬの水で希釈し、酢酸で中和し、そして６倍量の水に対する５ｋＤ ＰＥＳメンブラン上で限外濾過によって精製した。乾燥抽出物により最終溶液をアッセイして、ポリマー濃度を決定し、そしてその後、５０／５０（Ｖ／Ｖ）の水／アセトン中の酸／塩基アッセイによってアッセイして、メチルカルボキシレートによる置換度を決定した。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー］＝５１．５ｍｇ／ｇ
酸／塩基アッセイに従うと：メチルカルボキシレート官能基によるヒドロキシル官能基の置換度は、糖単位当り１．０４であった。
ナトリウムデキストランメチルカルボキシレートの溶液を、プロライト（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ）樹脂（アニオン性）に通して、デキストランメチルカルボン酸を得、それをその後、１８時間凍結乾燥した。
デキストランメチルカルボン酸の１４．５ｇ（即ち、メチルカルボン酸官能基の６６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中に溶解して、５７ｇ／Ｌとし、そしてその後、０℃に冷却した。ＮＭＭ６．６７ｇ（６６ｍｍｏｌ）及びＥｔＯＣＯＣｌの７．１５ｇ（６６ｍｍｏｌ）をその後添加した。１０分間の反応後、ＴｒｐＯＨの６．０６ｇ（３０ｍｍｏｌ）を添加した。該媒体をその後、１０℃に加温し、そしてかかる温度にて３０分間維持した。３４０ｇ／Ｌのイミダゾール水溶液（８．９７ｇ，１３２ｍｍｏｌ）を添加し、反応媒体を短時間で３０℃に加熱した。そして反応媒体をその後、７０ｍＬの水で希釈し、そしてその後、空隙率１の焼結漏斗に通し、そしてその後、空隙率３の焼結漏斗を通して濾過し、その後、反応媒体は清澄となった。該溶液を、０．９％ＮａＣｌ溶液の１０倍容量、そしてその後の６倍容量の水に対する１０ｋＤのＰＥＳメンブランを通して限外濾過した。そしてその後、ポリマー１溶液の濃度を、乾燥抽出物にて決定した。溶液のフラクションを凍結乾燥し、そしてＤ２Ｏでの１ＨＮＭＲにより解析して、グラフトされたトリプトファンのＤＳを決定した。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー］＝５４ｍｇ／ｇであり、
１ＨＮＭＲに従うと：トリプトファンで変性された酸のモル分率は０．３８であった。
実施例２：トリプトファンのナトリウム塩にて変性されたナトリウムプルランメチルカルボキシレート，ポリマー２の合成
およそ１００ｋｇ／ｍｏｌの質量平均分子量を有するプルラン（フルカ社）８ｇ（即ち、ヒドロキシル官能基１４８ｍｍｏｌ）を水中に溶解して、４２ｇ／Ｌとした。１０Ｎ ＮａＯＨの１５ｍＬ（１４８ｍｍｏｌのＮａＯＨ）を、かかる溶液に添加した。該混合物を３５℃に上げ、そしてクロロ酢酸ナトリウムの２３ｇ（１９８ｍｍｏｌ）をその後添加した。反応媒体の温度を、０．５℃／分にて６０℃まで上げ、そしてその後、６０℃にて１００分間維持した。該反応媒体を２００ｍＬの水で希釈し、酢酸で中和し、そして６倍量の水に対する５ｋＤ ＰＥＳメンブラン上で限外濾過によって精製した。乾燥抽出物により最終溶液をアッセイして、ポリマー濃度を決定し、そしてその後、５０／５０（Ｖ／Ｖ）の水／アセトン中の酸／塩基アッセイによってアッセイして、メチルカルボキシレートによる置換度を決定した。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー］＝３１．５ｍｇ／ｇ
酸／塩基アッセイに従うと：メチルカルボキシレート官能基によるヒドロキシル官能基の置換度は、糖単位当り１．１７であった。
ナトリウムプルランメチルカルボキシレート溶液を、プロライト樹脂（アニオン性）に通して、プルランメチルカルボン酸を得、それをその後、１８時間凍結乾燥した。
プルランメチルカルボン酸の３．５１ｇ（即ち、メチルカルボン酸官能基の１８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中に溶解して、５７ｇ／Ｌとし、そしてその後、０℃に冷却した。ＮＭＭ１．８１ｇ（１８ｍｍｏｌ）及びＥｔＯＣＯＣｌの１．９４ｇ（１８ｍｍｏｌ）をその後添加した。１０分間の反応後、ＴｒｐＯＨの１．４０ｇ（７ｍｍｏｌ）を添加した。該媒体をその後、１０℃に加温し、そしてかかる温度にて３０分間維持した。３４０ｇ／Ｌのイミダゾール水溶液（２．４３ｇ，３６ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応媒体を短時間で３０℃に加熱した。該反応媒体をその後、７０ｍＬの水で希釈し、そしてその後、空隙率１の焼結漏斗に通し、そしてその後、空隙率３の焼結漏斗を通して濾過し、その後、反応媒体は清澄となった。該溶液を、０．９％ＮａＣｌ溶液の１０倍容量、そしてその後の６倍容量の水に対する１０ｋＤのＰＥＳメンブランに通して限外濾過した。ポリマー２溶液の濃度を、乾燥抽出物にて決定した。溶液のフラクションを凍結乾燥し、そしてＤ２Ｏでの１ＨＮＭＲにより解析して、グラフトされたトリプトファンのＤＳを決定した。
乾燥抽出物に従うと：［ポリマー］＝１７．２ｍｇ／ｇであり、
１ＨＮＭＲに従うと：トリプトファンで変性された酸のモル分率は０．４０であった。
実施例３：トリプトファンのエチルエステルにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレート，ポリマー３の合成
ポリマー３は、Ｌ−トリプトファンのナトリウム塩に代えてＬ−トリプトファンのエチルエステルを用いて、実施例１に記載される方法に従い、４０ｋｇ／ｍｏｌの質量平均分子量を有するデキストラン（ファルマコスモス社（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ））から得られた、Ｌ−トリプトファンのエチルエステルにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートである。
実施例４：フェニルアラニンのエチルエステルにて変性されたナトリウムデキストランカルボキシレート，ポリマー４の合成
ポリマー３は、Ｌ−トリプトファンのナトリウム塩に代えてＬ−フェニルアラニンのエチルエステルを用いて、実施例１に記載される方法に従い、４０ｋｇ／ｍｏｌの質量平均分子量を有するデキストラン（ファルマコスモス社）から得られたＬ−フェニルアラニンのエチルエステルにて変性されたナトリウムデキストランメチルカルボキシレートである。
Ｂ−共電気泳動（ｃｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）による、ヘパリン結合タンパク質に対するポリマーの親和性の証明
実施例３：タンパク質／ポリマー比が１／５００
１／５００の比のタンパク質／ポリマー複合体の調製
１．５μｇのタンパク質を、７５０μｇのポリマー及び１５μＬの１０×泳動緩衝液（ｐＨ７のトリス酢酸）に添加した。該溶液を、Ｈ２Ｏを用いて１５０μＬとした。かかる溶液を室温にて２０分間インキュベートした。５０ｎｇのタンパク質及び２５μｇのポリマーを含有するかかる第二溶液の５μＬを、１×泳動緩衝液５μＬ中に希釈した。タンパク質のみ又はポリマーのみを含有する同様の溶液を、対照として調製した。
タンパク質とポリマーとの複合体の証明
タンパク質／ポリマー溶液（１０μＬ）を、３μＬの充填緩衝液（グリセロール、トリス酢酸及びブロモフェノールブルーの水溶液）と混合した。５０ｎｇのタンパク質及び２５μｇのポリマーを含有するこの１３μＬを、０．８％アガロースゲルのウェルに入れた。対照溶液（タンパク質又はポリマー単独）を同様の手法で沈積した。電気泳動容器を閉じ、そして発電機を３０Ｖに設定した。泳動を１時間続けた。
泳動後、アペレックスシステム（Ａｐｅｌｅｘ ｓｙｓｔｅｍ）を用いた毛細管作用により、ＰＶＤＦメンブラン上に、室温にて２時間、ゲルを転移させた。メンブランをその後、室温にて１時間、脱脂粉乳を用いて飽和し、そしてその後、該タンパク質に対するウサギ第一抗体とともにインキュベートし（４℃にて一晩）、そして最後に抗ヤギＨＲＰウサギ第二抗体とともにインキュベートした（室温にて１時間）。検出は、ＨＲＰをＯｐｔｉ−４ＣＮと反応させることによって行った。反応生成物は可視領域で吸収されるため、着色が十分となったときに、水で洗浄することによって検出を停止した。
タンパク質が単独であるか又はポリマーと複合体を形成していない場合には、アニオン性であれば泳動し得るし、或いはカチオン性であれば沈積位置のままであり得る。タンパク質はその後、充填ウェルにおいて、又は沈積位置からおよそ０．３ないし０．４ｃｍの単一スポットの形態で、検出された。タンパク質がポリマーと複合体を形成している場合、該複合体は、ポリマーの電荷によってより強力に引かれ、そしてアノードに向かって泳動する。それは、沈積位置から０．７ｃｍの単一スポットの形態で検出された。
実施例１において得られたポリマー１、実施例２において得られたポリマー２、細胞付着タンパク質群より選択されたタンパク質、ホルモン、凝固性タンパク質、ヘパリン結合成長因子、成長因子結合タンパク質、サイトカイン及び脂肪代謝タンパク質を用いて得られた結果を、下記表Ｉに並べた。
ヘパリン（ＩＧＦ−１）及び実施例１及び実施例２で得られたポリマー１及び２に結合しなかったタンパク質を用いて得られた結果、並びに、上記ヘパリン結合タンパク質及びトリプトファンにより置換されなかったポリマーを用いて得られた結果もまた、反例として下記表Ｉに並べた。
Figure 2012503643
得られた結果は、トリプトファンで置換されたデキストランメチルカルボキシレートポリマー１（実施例１）又はトリプトファンで置換されたプルランメチルカルボキシレートポリマー２（実施例２）が、ヘパリン結合タンパク質との複合体を形成させ得るが、置換されていないデキストランメチルカルボキシレート（反例１）はそうではなかったことを示している。
得られた結果はまた、トリプトファンにより置換されたか又はされていないデキストランメチルカルボキシレート（実施例１及び反例１）が、ヘパリンに結合しない成長因子との複合体を形成するものではないことを示している。
実施例４：１／１のタンパク質／ポリマー比
１／１の比にあるタンパク質／ポリマー複合体の調製
１．５μｇのタンパク質を、１．５μｇのポリマー及び３μＬの１０×泳動緩衝液（ｐＨ７のトリス酢酸）に添加した。該溶液を、Ｈ２Ｏを用いて６０μＬとした。かかる溶液を室温にて２０分間インキュベートした。５０ｎｇのタンパク質及び５０ｎｇのポリマーを含有するかかる第二溶液の２μＬを、１×泳動緩衝液８μＬ中に希釈した。
タンパク質とポリマーとの間の複合体の証明
タンパク質／ポリマー溶液（１０μＬ）を、３μＬの充填緩衝液（グリセロール、トリス酢酸及びブロモフェノールブルーの水溶液）と混合した。５０ｎｇのタンパク質及び５０ｎｇのポリマーを含有するこの１３μＬを、０．８％アガロースゲルのウェルに入れた。電気泳動容器を閉じ、そして発電機を３０Ｖに設定した。泳動を１時間続けた。
泳動後、アペレックスシステムを用いた毛細管作用により、ＰＶＤＦメンブラン上に、室温にて２時間、ゲルを転移させた。メンブランをその後、室温にて１時間、脱脂粉乳を用いて飽和し、そしてその後、該タンパク質に対するウサギ第一抗体とともにインキュベートし（４℃にて一晩）、そして最後に抗ヤギＨＲＰウサギ第二抗体とともにインキュベートした（室温にて１時間）。検出は、ＨＲＰをＯｐｔｉ−４ＣＮと反応させることによって行った。反応生成物は可視領域を吸収するため、着色が十分となったときに、水で洗浄することによって検出を停止した。
タンパク質が単独であるか又はポリマーと複合体を形成していない場合には、アニオン性であれば泳動し得るし、或いはカチオン性であれば沈積位置のままであり得る。タンパク質はその後、充填セルにおいて、又は沈積位置からおよそ０．３ないし０．４ｃｍの単一スポットの形態で検出された。タンパク質がポリマーと複合体を形成している場合、該複合体は、ポリマーの電荷によってより強力に引かれ、そしてアノードに向かって泳動する。それは、沈積位置から０．７ｃｍの単一スポットの形態で検出された。
ポリマー１、３及び４、並びに、２種の成長因子であるＦＧＦ−２及びＮＧＦ-βを用いて得られた結果を下記表ＩＩに並べた。
全てのタンパク質／ポリマー複合体は、１／１質量比で実験された。
Figure 2012503643
かかる試験は、医薬開発の目的として好都合である、ポリマー１とＨＢＰとの間の相互作用がポリマー量を低減させるのに十分に強力であることを証明し得る。ポリマー３及び４は、１／１比にある複合体を得るために試験された２種のＨＢＰとの間に十分強力な相互作用を有していなかった。
Ｃ−ＩＴＣによるヘパリン結合タンパク質に対するポリマーの親和性の証明
実施例５：ＰＴＨ（１−３４）とヘパリン及びポリマー１との相互作用
文献（Ｋａｍｅｒｚｅｌｌ，２００７）においては、ＩＴＣ試験（等温滴定熱量測定（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ））において、３００ｎＭのＫｄにてＰＴＨ（１−８４）がヘパリンに結合することが示されている。同一条件の下で、我々は、２２７ｎＭのＫｄにてＰＴＨ（１−３４）がヘパリンと相互作用することを証明した。
ヘパリンを、４．８ｍＭクエン酸ｐＨ５．３及び４２ｍＭ ＮａＣl緩衝液中の２μＭの濃度でセル中に入れた。２０８．６μＭの濃度でＰＴＨ（１−３４）をシリンジ中に入れた。５０回の５μＬの注入を行い、そして結果をｎ個の独立部位のモデルに調節し、２２７ｎＭのＫｄを算出した。
同様の条件下で、ポリマー１を、４．８ｍＭクエン酸ｐＨ５．３及び４２ｍＭ ＮａＣl緩衝液中の０．５μＭの濃度でセル中に入れた。１９１μＭの濃度でＰＴＨ（１−３４）をシリンジ中に入れた。５０回の５μＬの注入を行い、そして結果をｎ個の独立部位のモデルに調節し、ポリマー１とＰＴＨとの相互作用を示す６．９μＭのＫｄを算出した。この相互作用はヘパリンのそれに近似していた。
Ｄ−製剤例
実施例６：ポリマー／ヘパリン結合タンパク質複合体の生成
以下の操作は、クリーンルーム内で行われた。実施例１において記載されたポリマー１の凍結乾燥物の５ｇを、５０ｍＬの水に溶解して、溶液１を得た（ポリマー１濃度１００ｍｇ／ｍＬ）。並行して、ＶＥＧＦの凍結乾燥物の１０μｇを５μＬの水に溶解して、溶液２を得た（ＶＥＧＦ濃度２ｍｇ／ｍＬ）。室温にて５μＬの溶液１を５μＬの溶液２と混合して、５０ｍｇ／ｍＬ濃度でポリマー１及び１ｍｇ／ｍＬの濃度でＶＥＧＦを含有する溶液３を作製した。０．２２μｍのメンブランに通して溶液３を濾過して、滅菌溶液を生成した。溶液３中の複合体の形成は、共電気泳動によって示され得た。
結論として、本発明に従うポリマーとヘパリン結合タンパク質との複合体は、有機溶媒を添加することなく、室温における水溶液の単純な混合によって形成する。
実施例７：ポリマー／ヘパリン結合タンパク質複合体の生成
１／１０の比にあるポリマー１／ＶＥＧＦ複合体を得るために、水で５μＬとした溶液１の１μＬ及び溶液２の５μＬを用いて、実施例６に記載される操作を行った。１０ｍｇ／ｍＬの濃度でポリマー１及び１ｍｇ／ｍＬの濃度でＶＥＧＦを含有する溶液４の１０μＬを得た。
実施例８：ポリマー／ヘパリン結合タンパク質複合体の生成
１／２の比にあるポリマー１／ＶＥＧＦ複合体を得るために、水で５μＬとした溶液１の０．２μＬ及び溶液２の５μＬを用いて、実施例６に記載される操作を行った。２ｍｇ／ｍＬの濃度でポリマー１及び１ｍｇ／ｍＬの濃度でＶＥＧＦを含有する溶液５の１０μＬを得た。
実施例９：ポリマー／ヘパリン結合タンパク質複合体の生成
実施例２に記載されるポリマー２及びヘパリン結合タンパク質としてＦＧＦ−２を用いて、実施例６に記載される操作を行った。ポリマー２／ＦＧＦ−２比が１ないし１００の範囲にあるポリマー２／ＦＧＦ−２複合体の種々の水溶液が得られた。
実施例１０：ポリマー／ヘパリン結合タンパク質複合体の生成
以下の操作をクリーンルーム内で行った。実施例２に記載されるポリマー２の凍結乾燥物の５ｇを１００ｍＬの水に溶解して、溶液１を得た（ポリマー１濃度５０ｍｇ／ｍＬ）。かかる溶液の１０μＬを５０μＬフラスコに入れた。続いて、ＶＥＧＦの凍結乾燥物の１０μｇを、室温にてかかる溶液に添加した。得られた溶液は、５０ｍｇ／ｍＬの濃度にてポリマー２及び１ｍｇ／ｍＬの濃度でＶＥＧＦを包含していた。かかる溶液を、１５分間の穏やかな攪拌後に清澄とし、０．２２μｍのメンブランに通して濾過して、滅菌溶液を生成した。最終溶液中の複合体の形成は、共電気泳動によって示され得た。
反対に、凍結乾燥したポリマー２の５００μｇを、１ｍｇ／ｍＬのＶＥＧＦの１０μＬに添加したことによって、同様の溶液を得た。
結果的に、本発明に従うポリマーとヘパリン結合タンパク質との複合体は、有機溶媒を添加することなく、室温にてタンパク質又はポリマー水溶液への、ポリマーの又はタンパク質の凍結乾燥物の単純な添加によって形成され得た。

Claims (24)

  1. トリプトファン又はトリプトファン誘導体により置換された多糖類とＨＢＰとから成る複合体であって、
    前記多糖類は、大部分が（１，６）型及び／又は（１，４）型及び／又は（１，３）型及び／又は（１，２）型のグリコシド結合から成り、中性又はアニオン性であり得、少なくともトリプトファン又はトリプトファン誘導体（Ｔｒｐと記す）により官能化された多糖類群より選択され：
    前記トリプトファン又はトリプトファン誘導体は、酸官能基とのカップリングを介して前記多糖類にグラフトするか又は結合しており、前記酸官能基は、アニオン性多糖類の酸官能基及び／又は官能基Ｆを介して前記多糖類に結合したリンカーＲにより生じた酸官能基であってもよく、前記官能基Ｆは、前記リンカーＲと、中性又はアニオン性多糖類の−ＯＨ官能基との間のカップリング由来のものであり、
    Ｆは、エステル、チオエステル、アミド、カーボネート、カルバメート、エーテル、チオエーテル又はアミン官能基を表し、
    Ｒは、枝分れ状であっても、及び／又は不飽和であっても、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有していてもよく、そして少なくとも１つの酸官能基を有する１ないし１８個の炭素原子を含有する鎖を表し、
    Ｔｒｐは、トリプトファンのアミンと、基Ｒにより生じた少なくとも１つの酸及び／又はアニオン性多糖類により生じた酸との間のカップリングにより生じた、トリプトファンの、又はトリプトファン誘導体の残基のＬ体又はＤ体を表し、
    前記トリプトファン又はトリプトファン誘導体は、塩化し得るものか又は塩化されており、且つ、トリプトファン、トリプトファノール、トリプトファンアミド、２−インドールエチルアミン、及びそれらの塩から成る群より選択され、
    前記ＨＰＢは、ホルモン、例えば成長ホルモン（ｈＧＨ：ヒト成長ホルモン)又は副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ)、成長因子、例えば形質転換成長因子β１及び２（ＴＧＦ−β）、インシュリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、１ないし１４型の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ケラチン生成細胞成長因子（ＫＧＦ）、神経成長因子β（ＮＧＦ−β）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、Ｒ−スポンジン１ないし４及び血管内皮成長因子Ａ及びＢ（ＶＥＧＦ）のようなタンパク質から成る群より選択される、
    前記複合体。
  2. 前記多糖類は、一般式Ｉ：
    Figure 2012503643
    ［式中、
    Ｆは、リンカーＲと、中性又はアニオン性多糖類の−ＯＨ官能基との間のカップリングにより生じたものであって、エステル、チオエステル、アミド、カーボネート、カルバメート、エーテル、チオエーテル又はアミン官能基を表し、
    Ｒは、枝分れ状であっても、及び／又は不飽和であっても、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有していてもよく、そして少なくとも１つの酸官能基を有する１ないし１８個の炭素原子を含有する鎖を表し、
    Ｔｒｐは、トリプトファンのアミン又はトリプトファンをベースとしたアミンと、基Ｒにより生じた少なくとも１つの酸及び／又はアニオン性多糖類により生じた酸との間のカップリングにより生じた、トリプトファンをベースとした残基のＬ体又はＤ体を表し、
    ｎは、Ｔｒｐにより置換されたＲのモル分率を表すものであって、０．２ないし０．７であり、
    ｏは、Ｔｒｐにより置換された多糖類の酸官能基のモル分率であって、０．２ないし０．７であり、
    ｉは、糖単位当りの、基Ｒにより生じた酸官能基のモル分率を表すものであって、０ないし２であり、
    ｊは、糖単位当りの、アニオン性多糖類により生じた酸官能基のモル分率であって、０ないし１であり、
    （ｉ＋ｊ）は、糖単位当りの酸官能基のモル分率であって、０．５ないし２であり、
    ＲがＴｒｐによって置換されていない場合には、基Ｒの酸（群）は、カチオン、好ましくは、Ｎａ＋又はＫ＋のようなアルカリ金属カチオンのカルボン酸塩であり、
    前記多糖類がアニオン性多糖類である場合において、該多糖類の１つ以上の酸基がＴｒｐにより置換されていない場合には、それら多糖類は、カチオン、好ましくはＮａ又はＫのようなアルカリ金属のカチオンにより塩化されており、
    前記多糖類は中性ｐＨにある］
    で表される多糖類から成る群より選択される、請求項１に記載の複合体。
  3. Ｆは、エステル、カーボネート、カルバメート又はエーテルである、請求項１又は２に記載の複合体。
  4. 前記多糖類は、大部分が（１，６）型のグリコシド結合から成るものである、請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載の複合体。
  5. 前記大部分が（１，６）型のグリコシド結合から成る多糖類は、デキストランである、請求項４に記載の複合体。
  6. 前記多糖類は、大部分が（１，４）型のグリコシド結合から成るものである、請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載の複合体。
  7. 前記大部分が（１，４）型のグリコシド結合から成る多糖類は、プルラン、アルギネート、ヒアルロナン、キシラン、ガラクツロナン及び水溶性セルロースから成る群より選択される、請求項６に記載の複合体。
  8. 前記多糖類は、大部分が（１，３）型のグリコシド結合から成るものである、請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載の複合体。
  9. 前記大部分が（１，３）型のグリコシド結合から成る多糖類は、カードランである、請求項８に記載の複合体。
  10. 前記多糖類は、大部分が（１，２）型のグリコシド結合から成るものである、請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載の複合体。
  11. 前記部分が（１，２）型のグリコシド結合から成る多糖類は、イヌリンである、請求項１０に記載の複合体。
  12. 前記多糖類は、大部分が（１，４）型及び（１，３）型のグリコシド結合から成るものである、請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載の複合体。
  13. 前記大部分が（１，４）型及び（１，３）型のグリコシド結合から成る多糖類は、グルカンである、請求項１２に記載の複合体。
  14. 前記多糖類は、大部分が（１，４）型、（１，３）型及び（１，２）型のグリコシド結合から成るものである、請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載の複合体。
  15. 前記大部分が（１，４）型、（１，３）型及び（１，２）型のグリコシド結合から成る多糖類は、マンナンである、請求項１４に記載の複合体。
  16. 基Ｒは、下記の基：
    Figure 2012503643
    或いはそれらのアルカリ金属カチオン塩より選択されるものである、請求項１ないし１５のうちいずれか１項に記載の複合体。
  17. 多糖類／ＨＢＰ比は、０．５ないし５００であり、好ましくは１ないし３００である、請求項１ないし１６のうちいずれか１項に記載の複合体。
  18. 多糖類／ＨＢＰ比は、０．５ないし１００であり、好ましくは１ないし１０である、請求項１ないし１７のうちいずれか１項に記載の複合体。
  19. 前記ＨＢＰは、成長ホルモン（ｈＧＨ：ヒト成長ホルモン)又は副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ)のようなホルモン群より選択される、請求項１ないし１８のうちいずれか１項に記載の錯体。
  20. 前記ＨＢＰは、成長因子の群、例えば形質転換成長因子β１及び２（ＴＧＦ−β）、インシュリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子１ないし１４（ＦＧＦ）、ケラチン生成細胞成長因子（ＫＧＦ）、神経成長因子β（ＮＧＦ−β）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、Ｒ−スポンジン１ないし４及び血管内皮成長因子Ａ及びＢ（ＶＥＧＦ）のようなタンパク質より選択される、請求項１ないし１８のうちいずれか１項に記載の複合体。
  21. 請求項１ないし２０のうちいずれか１項に記載の複合体を含有する、医薬組成物。
  22. 乾燥により及び／又は凍結乾燥により得られる、請求項１ないし２１のうちいずれか１項に記載の医薬組成物。
  23. ＨＢＰを安定化させるための、トリプトファン又はトリプトファン誘導体により置換された多糖類の使用であって、
    前記多糖類は、大部分が（１，６）型及び／又は（１，４）型及び／又は（１，３）型及び／又は（１，２）型のグリコシド結合から成り、中性又はアニオン性であり得、少なくともトリプトファン又はトリプトファン誘導体（Ｔｒｐと記す）により官能化された多糖類群より選択され、
    前記トリプトファン又はトリプトファン誘導体は、酸官能基とのカップリングによって前記多糖類にグラフトするか又は結合しており、前記酸官能基は、アニオン性多糖類の酸官能基及び／又は官能基Ｆを介して前記多糖類に結合したリンカーＲにより生じた酸官能基であってもよく、前記官能基Ｆは、前記リンカーＲと、中性又はアニオン性多糖類の−ＯＨ官能基との間のカップリング由来のものであり、
    Ｆは、エステル、チオエステル、アミド、カーボネート、カルバメート、エーテル、チオエーテル又はアミン官能基を表し、
    Ｒは、枝分れ状であっても、及び／又は不飽和であっても、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有していてもよく、そして少なくとも１つの酸官能基を有する１ないし１８個の炭素原子を含有する鎖を表し、
    Ｔｒｐは、トリプトファンのアミンと、基Ｒにより生じた少なくとも１つの酸及び／又はアニオン性多糖類により生じた酸との間のカップリングにより生じた、トリプトファンの、又はトリプトファン誘導体の残基のＬ体又はＤ体を表し、
    前記トリプトファン又はトリプトファン誘導体は、塩化し得るものか又は塩化されており、且つ、トリプトファン、トリプトファノール、トリプトファンアミド、２−インドールエチルアミン、及びそれらの塩から成る群より選択される、
    前記使用。
  24. 安定なＨＢＰの医薬製剤の製造のための多糖類の使用であって、
    前記多糖類は、大部分が（１，６）型及び／又は（１，４）型及び／又は（１，３）型及び／又は（１，２）型のグリコシド結合から成り、中性又はアニオン性であり得、少なくともトリプトファン又はトリプトファン誘導体（Ｔｒｐと記す）により官能化された多糖類群より選択される、トリプトファン又はトリプトファン誘導体により置換された多糖類であって、
    前記トリプトファン又はトリプトファン誘導体は、酸官能基とのカップリングによって前記多糖類にグラフトするか又は結合しており、前記酸官能基は、アニオン性多糖類の酸官能基及び／又は官能基Ｆを介して前記多糖類に結合したリンカーＲにより生じた酸官能基であってもよく、前記官能基Ｆは、前記リンカーＲと、中性又はアニオン性多糖類の−ＯＨ官能基との間のカップリング由来のものであり、
    Ｆは、エステル、チオエステル、アミド、カーボネート、カルバメート、エーテル、チオエーテル又はアミン官能基を表し、
    Ｒは、枝分れ状であっても、及び／又は不飽和であっても、Ｏ、Ｎ及び／又はＳのような１つ以上のヘテロ原子を含有していてもよく、そして少なくとも１つの酸官能基を有する１ないし１８個の炭素原子を含有する鎖を表し、
    Ｔｒｐは、トリプトファンのアミンと、基Ｒにより生じた少なくとも１つの酸及び／又はアニオン性多糖類により生じた酸との間のカップリングにより生じた、トリプトファンの、又はトリプトファン誘導体の残基のＬ体又はＤ体を表し、
    前記トリプトファン又はトリプトファン誘導体は、塩化し得るものか又は塩化されており、且つ、トリプトファン、トリプトファノール、トリプトファンアミド、２−インドールエチルアミン、及びそれらの塩から成る群より選択されることを特徴とする、
    前記使用。
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