CN103755838B - 一种肝素钠的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种肝素钠的制备方法，该制备方法包括粗品肝素钠除杂、胰酶一次酶解、纤维素酶二次酶解、酸性条件除杂、乙醇分级、次氯酸一次氧化、双氧水二次氧化、冻干、粉碎。本发明所述制备方法去除肝素钠中的丝氨酸，改进了现有技术中肝素钠不适宜药物工业化生产的状况，工艺操作简单、产品肝素结构完整、所得产品效价较高的特点。
Description
技术领域
本发明属于生化药物领域，涉及一种肝素钠的制备方法，具体涉及一种包括去除肝素钠中的丝氨酸步骤的肝素钠的制备方法以及该制备方法制得的肝素钠。
背景技术
肝素是一类由糖醛酸和氨基葡萄糖以1-4糖苷键连接起来的重复二糖单元组成的线性粘多糖，其广泛分布于哺乳动物的组织中，由结缔组织型肥大细胞表达产生。肝素同大多数粘多糖一样，其在动物体内多以肝素钠-蛋白复合物的形式存在，提取过程中由于肝素钠解离不完全，使得肝素钠中残留一定数量以共价键结合的蛋白质和以静电结合的带正电蛋白质，需要进一步精制才能应用于临床。
因为肝素在生物体内是以肝素蛋白聚糖的形式进行生物合成的，其合成的第一步是形成由规则交替的丝氨酸和甘氨酸残基组成的serglycine蛋白核心，然后通过连续地增加糖胺和糖醛酸，得到一个四糖连接区，并从四糖发生肝素链的延长。因此也可以说肝素蛋白聚糖是由交替的葡糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺二糖单位组成的糖链通过四糖连接区连接到serglycine核心蛋白的丝氨酸残基上。其中，连接区包含以O-糖苷方式连接丝氨酸的木糖，然后依次是两个乳糖和一个葡萄糖醛酸残基。因为O-糖肽键比较稳定，在肝素精制过程中不会完全断裂，因此市场上的精品肝素都不同程度（0.5%～1.5%）的含有丝氨酸残基，表现在核磁碳谱的56ppm左右处会有一个吸收峰。丝氨酸残基的存在将使肝素在储存过程中容易变色，影响药物的质量。同时由精品肝素作为起始原料制备的低分子和超低分子肝素（如亭扎肝素）也会残留一定量的丝氨酸残基。
目前，国内外发表了许多去除肝素中的丝氨酸的方法，其中KeiichiTakagaki（2002）报道了采用具有β-内切木糖苷酶活性的纤维素酶去除肝素丝氨酸的方法；Yu-kiMatsuno（2007）报道了碱性条件下的β-消除反应去除肝素丝氨酸的方法，但是这两种方法均存在局限性，即需要首先分离出特定分子量的肝素片段，然后去除此特定肝素片段的丝氨酸残基，因此不具备工业化生产的条件。Viskov等（2008）发表的专利（US2008/0318328A1）报道了用高锰酸钾去除肝素丝氨酸的方法，但是此方法不可避免会对肝素的四糖连接区造成破坏，对工业化生产存在不利影响。
发明内容
基于上述现有技术，本发明的目的是提供一种肝素钠的制备方法，该制备方法有效地去除了肝素钠中的丝氨酸，改进了现有技术生产的肝素钠不适宜药物工业化生产要求的状况，而且其工艺操作简单，制得的产品的肝素结构完整、效价更高。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种肝素钠的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
（1）将粗品肝素钠水溶液升温至45～50℃，调节pH至8.0～9.0，加入胰酶反应，再加入氯化钙，溶解后升温至80～85℃，再降温至40℃以下，加入碳酸钠，离心取上清液；
（2）将步骤（1）得到的上清液升温至45～50℃，调节pH至4.5～5.5，加入纤维素酶反应，再加入氯化钙，溶解后升温至80～85℃，再降温至40℃以下，加入碳酸钠，离心取上清液；
（3）向步骤（2）得到的上清液加入乙醇或乙醇水溶液，降温至0～5℃，调节pH至1.0～2.0，离心取上清液并调节pH至6.0～7.0；
（4）向步骤（3）得到的上清液加入乙醇或乙醇水溶液，至20℃下的乙醇浓度为40～45°，静置得到湿沉淀；
（5）将步骤（4）得到的湿沉淀溶解在水中，加入次氯酸水溶液，调节pH至4.5～5.0，20～30℃下静置，调节pH至6.0～7.0，加入氯化钠，加入乙醇或乙醇水溶液至20℃下的乙醇浓度为40～45°，静置得到湿沉淀；
（6）将步骤（5）得到的湿沉淀溶解在水中，调节pH至10.0～10.5，加入过氧化氢水溶液，25～30℃下静置，调节pH至6～7，过滤。
在上述步骤（1）中，优选地，所述粗品肝素钠水溶液为除去杂质的粗品肝素钠的水溶液；更优选地，所述除去杂质包括以下步骤：在25～35℃下，将粗品肝素钠溶解于水中，加入氯化钠，调节pH至10.0～10.5，搅拌3.5～4.0小时，然后升温至80～85℃，调节pH至9.5～10.0，静置10分钟，迅速降温至20℃以下，静置4-5小时后过滤，取滤液。进一步优选地，所述粗品肝素钠的效价≥50IU/mg，其0.01%（g/mL）的溶液在波长为260nm时，光吸收值≤1.0。优选地，粗品肝素钠的浓度为20%（g/mL）；优选地，所述氯化钠的浓度为4-5%（g/mL）。
在上述步骤（1）中，优选地，所述胰酶与粗品肝素钠的重量比为0.4～0.8%；所述氯化钙的浓度为2%（g/mL）；所述碳酸钠的浓度为2%（g/mL）；
在上述步骤（2）中，优选地，所述纤维素酶与粗品肝素钠的重量比为0.2～0.6%；所述氯化钙的浓度为2%（g/mL）；所述氯化钙的浓度为2%（g/mL）；
在上述步骤（3）中，优选地，向步骤（2）得到的上清液加入95%（体积比）的乙醇水溶液；所述步骤（2）得到的上清液与95%（体积比）的乙醇水溶液的体积比为10%；
在上述步骤（4）中，优选地，向步骤（3）得到的上清液加入95%（体积比）的乙醇水溶液；
在上述步骤（5）中，优选地，所述湿沉淀的浓度为30～35%（g/mL）；优选地，所述次氯酸水溶液与湿沉淀水溶液的体积比为0.5～1.5%；优选地，所述氯化钠的浓度为1.5%（g/mL）；
在上述步骤（6）中，优选地，所述湿沉淀的浓度为30～35%（g/mL）；优选地，所述过氧化氢水溶液与湿沉淀水溶液的体积比为0.5～1.5%。
在一个本发明的优选实施方案中，上述制备方法包括以下步骤：
（1）在25～35℃下，以20%（g/mL）浓度将粗品肝素钠溶解于纯化水中，以4～5%（g/mL）的浓度加入氯化钠，待溶解后调节pH至10.0～10.5，搅拌3.5～4.0小时，然后升温至80～85℃，调节pH至9.5～10.0，静置10分钟，迅速降温至20℃以下，静置4～5小时后过滤，取滤液；其中，粗品肝素钠的效价≥50IU/mg，其0.01%（g/mL）的溶液在波长为260nm时，光吸收值≤1.0；
（2）将步骤（1）得到的滤液升温至45～50℃，用18%（g/mL）的盐酸水溶液或20%（g/mL）的氢氧化钠水溶液调节pH至8.0～9.0，加入胰酶反应4～5小时，再以2%（g/mL）的浓度加入氯化钙，搅拌溶解后升温至80～85℃，继续搅拌10分钟再降温至40℃以下，以2%（g/mL）的浓度加入碳酸钠，持续搅拌30分钟，离心取上清液；其中，所述胰酶与粗品肝素钠的重量比为0.4～0.8%；
（3）向步骤（2）得到的上清液补加纯水至步骤（1）中的粗品肝素钠水溶液的初始体积，升温至45～50℃，用18%（g/mL）盐酸水溶液调节pH至4.5～5.5，加入纤维素酶搅拌下反应6～8小时，加入氯化钙，搅拌溶解后升温至80～85℃，搅拌10分钟，再降温至40℃以下，以2%（g/mL）的浓度加入碳酸钠，持续搅拌30分钟后离心取上清液；其中，所述纤维素酶与粗品肝素钠的重量比为0.2～0.6%；
（4）向步骤（3）得到的上清液加入95%（体积比）乙醇水溶液，搅拌均匀，降温至0～5℃，调节pH至1.0～2.0，离心取上清液并迅速调节pH至6.0～7.0；其中，所述步骤（3）得到的上清液与95%（体积比）的乙醇水溶液的体积比为10%；
（5）向步骤（4）得到的上清液加入95%（体积比）乙醇水溶液，至20℃下的乙醇浓度为40～45°，静置12～24小时，抽去上层乙醇得到湿沉淀；
（6）以30～35%（g/mL）的浓度将步骤（5）得到的湿沉淀溶解在纯化水中，加入25%（g/mL）的次氯酸水溶液，用18%（g/mL）的盐酸水溶液调节pH至4.5～5.0，20～30℃下静置6～8小时，调节pH至6.0～7.0，以1.5%（g/mL）的浓度加入氯化钠，搅拌溶解后加入95%（体积比）乙醇水溶液至20℃下的乙醇浓度为40～45°，静置6～8小时，抽去上层乙醇得到湿沉淀；其中，所述次氯酸水溶液与湿沉淀水溶液的体积比为0.5～1.5%；
（7）以30～35%（g/mL）的浓度将步骤（6）得到的湿沉淀溶解在纯化水中，用20%（g/mL）的氢氧化钠水溶液调节pH至10.0～10.5，25～30℃下加入30%（g/mL）的过氧化氢水溶液静置4小时，再加入30%（g/mL）的过氧化氢水溶液静置8小时，再加入30%（g/mL）的过氧化氢水溶液静置12小时，调节pH至6～7，过滤；其中，每次加入的过氧化氢水溶液与湿沉淀水溶液的体积比为0.5～1.5%；
（8）将滤液冻干，粉碎。
本发明还提供了上述制备方法制备的肝素钠。
本发明采用粗品肝素钠为原料，首先去除部分杂质，然后采用两步酶解方法去除部分丝氨酸，然后进一步采用较温和的氧化条件去除酶解条件下不能完全除去的丝氨酸残基，从而达到完全去除丝氨酸的目的，得到的精品肝素钠完全符合USP和EP的检测标准。
具体来说，本发明的制备方法中的酶解步骤是依次采用胰酶一次酶解去除和肝素相连接的较大蛋白及肽链，亦可用其它的酶代替（如链霉蛋白酶）、纤维素酶二次酶解去除和肝素四糖连接区中木糖相连接的丝氨酸残基。采用二次氧化是因为大量实验表明前期的酶解不能完全去除肝素中的丝氨酸残基，需要进一步进行氧化，去除残余的丝氨酸残基。
本发明提供的肝素钠的制备方法具有如下特点：
（1）改进了现有技术中肝素钠不适宜医药工业化生产的状况，工艺操作简单，适合工业化大生产；
（2）产品中肝素结构完整，不含丝氨酸残基，所得效价更高；
（3）产品中肝素性质稳定，储存过程不易变色；
（4）完全符合USP和EP的检测标准。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为现有技术生产的含有丝氨酸残基的肝素钠原料，其中56.44ppm处有丝氨酸吸收峰。
图2为使用本发明制备方法制得的除去丝氨酸残基的肝素钠产品，其中56.44ppm处没有丝氨酸吸收峰。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
其中，丝氨酸残基的检测方法参考M.Iacomini等人1999年于Anal.Biochem.上发表的文献：“LinkageRegion”SequencesofHeparinsandHeparanSulfates:DetectionandQuantificationbyNuclearMagneticResonanceSpectroscopy。
实施例1
（1）除杂：将粗品肝素钠（效价≥50IU/mg，其0.01%（g/mL）水溶液在波长为260nm时，光吸收值≤1.0）按照20%（g/mL）的量添加于纯化水中，升温至30℃，搅拌至完全溶解。然后按照5%（g/mL）的量加入氯化钠，待氯化钠完全溶解后调整溶液pH为10.0～10.5，恒温搅拌4.0小时，然后升温至85℃，维持料液pH在9.5～10.0之间，保持10分钟，然后迅速冷却料液至15℃，静置5小时后用澄清板过滤至料液澄清，取滤液；
（2）一次酶解：将上述料液升温至50℃，然后用18%（g/mL）的盐酸水溶液或20%（g/mL）的氢氧化钠水溶液调整pH至9.0，加入粗品肝素钠重量0.7%（w/w）的胰酶，维持温度和pH反应5小时，反应结束后向料液加入2%（g/mL）的氯化钙，搅拌溶解后升温至85℃，继续搅拌10分钟后迅速将料液温度降至40℃以下，再加入2%（g/mL）碳酸钠，然后持续搅拌30分钟后离心，收集上清液备用；
（3）二次酶解：将一次酶解得到的上清液补加纯化水至步骤（1）中除杂过程开始溶解粗品肝素钠时的溶液体积，升温至50℃后用18%（g/mL）的盐酸水溶液调整料液pH为5.0，加入粗品肝素钠重量0.5%（w/w）的纤维素酶，维持温度和pH搅拌8小时，反应结束后加入2%（g/mL）的氯化钙，搅拌溶解后升温至85℃，搅拌10分钟；继续搅拌10分钟后迅速将料液温度降至40℃以下，再加入2%（g/mL）碳酸钠，持续搅拌料液30分钟后离心，收集上清液备用；
（4）酸性条件除杂：向二次酶解的上清液加入10%（v/v）的95%乙醇水溶液，混合均匀，降温至0～5℃，然后调整料液pH为1.5，离心，收集上清液，迅速调整溶液pH至6.0～7.0；
（5）乙醇分级：向料液中加入95%乙醇水溶液，分级至乙醇浓度为42°（温度为20℃），静置24小时，抽干上层乙醇，得到湿沉淀；
（6）氧化：将上述湿沉淀按照30%（g/mL）的浓度用纯化水溶解，然后加入0.75%（v/v）的次氯酸水溶液，用18%（g/mL）的盐酸水溶液调整料液pH为4.5，控制温度为25℃，静置反应8小时，反应结束后调整料液pH为6.0～7.0，加入1.5%（w/v）氯化钠，搅拌溶解后加入95%乙醇水溶液，分级沉淀至乙醇浓度为43°（温度为20℃），静置6～8小时，抽干上层乙醇，得到湿沉淀；
（7）二次氧化：将上述湿沉淀按照30%（g/mL）溶解于纯化水中，用20%（g/mL）的氢氧化钠水溶液调整pH至10.0～10.5，维持温度为25℃，然后加入该溶液体积的0.5%（v/v）的30%（g/mL）过氧化氢水溶液，静置氧化4小时，待反应结束后补加1.0%（v/v）的30%（g/mL）过氧化氢水溶液静置氧化8小时，待反应结束后再次补加1.5%（v/v）的30%（g/mL）过氧化氢水溶液静置12小时，将料液调整pH至6～7后，用澄清板滤过；
（8）将上述料液冻干、粉碎，得到肝素钠精品原料，所得产品除不含丝氨酸残基外，其余指标均符合USP及EP的检测标准。
本实施例制备的肝素效价（EP7.0方法检测）大于190IU/mg，且不含丝氨酸残基，适用于做肝素类药物制剂及低分子和超低分子肝素的原料药，其主要技术指标符合有关标准的要求。
总之，以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
Claims (22)
1.一种肝素钠的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
(1)将粗品肝素钠水溶液升温至45～50℃，调节pH至8.0～9.0，加入胰酶反应，再加入氯化钙，溶解后升温至80～85℃，再降温至40℃以下，加入碳酸钠，离心取上清液；
(2)将步骤(1)得到的上清液升温至45～50℃，调节pH至4.5～5.5，加入纤维素酶反应，再加入氯化钙，溶解后升温至80～85℃，再降温至40℃以下，加入碳酸钠，离心取上清液；
(3)向步骤(2)得到的上清液加入乙醇或乙醇水溶液，降温至0～5℃，调节pH至1.0～2.0，离心取上清液并调节pH至6.0～7.0；
(4)向步骤(3)得到的上清液加入乙醇或乙醇水溶液，至20℃下的乙醇浓度为40-45％，静置得到湿沉淀；
(5)将步骤(4)得到的湿沉淀溶解在水中，加入次氯酸水溶液，调节pH至4.5～5.0，20～30℃下静置，调节pH至6.0～7.0，加入氯化钠，加入乙醇或乙醇水溶液至20℃下的乙醇浓度为40～45％，静置得到湿沉淀；
(6)将步骤(5)得到的湿沉淀溶解在水中，调节pH至10.0～10.5，加入过氧化氢水溶液，25～30℃下静置，调节pH至6～7，过滤。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述粗品肝素钠水溶液为除去杂质的粗品肝素钠的水溶液。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述除去杂质包括以下步骤：在25～35℃下，将粗品肝素钠溶解于水中，加入氯化钠，调节pH至10.0～10.5，搅拌3.5～4.0小时，然后升温至80～85℃，调节pH至9.5～10.0，静置10分钟，迅速降温至20℃以下，静置4～5小时后过滤，取滤液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述粗品肝素钠的效价≥50IU/mg，其0.01％g/mL的溶液在波长为260nm时，光吸收值≤1.0。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述粗品肝素钠的浓度为20％g/mL。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述氯化钠的浓度为4-5％g/mL。
7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述胰酶与粗品肝素钠的重量比为0.4-0.8％。
8.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述氯化钙的浓度为2％g/mL。
9.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述碳酸钠的浓度为2％g/mL。
10.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述纤维素酶与粗品肝素钠的重量比为0.2-0.6％。
11.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述氯化钙的浓度为2％g/mL。
12.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述碳酸钠的浓度为2％g/mL。
13.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，向步骤(2)得到的上清液加入95％体积比的乙醇水溶液。
14.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述步骤(2)得到的上清液与95％体积比的乙醇水溶液的体积比为10％。
15.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(4)中，向步骤(3)得到的上清液加入95％体积比的乙醇水溶液。
16.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(5)中，所述湿沉淀的浓度为30～35％g/mL。
17.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(5)中，所述次氯酸水溶液与湿沉淀水溶液的体积比为0.5-1.5％。
18.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(5)中，所述氯化钠的浓度为1.5％g/mL。
19.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(6)中，所述湿沉淀的浓度为30～35％g/mL。
20.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(6)中，所述过氧化氢水溶液与湿沉淀水溶液的体积比为0.5-1.5％。
21.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)在25～35℃下，以20％g/mL浓度将粗品肝素钠溶解于纯化水中，以4～5％g/mL的浓度加入氯化钠，待溶解后调节pH至10.0～10.5，搅拌3.5～4.0小时，然后升温至80～85℃，调节pH至9.5～10.0，静置10分钟，迅速降温至20℃以下，静置4～5小时后过滤，取滤液；其中，粗品肝素钠的效价≥50IU/mg，其0.01％g/mL的溶液在波长为260nm时，光吸收值≤1.0；
(2)将步骤(1)得到的滤液升温至45～50℃，用18％g/mL的盐酸水溶液或20％g/mL的氢氧化钠水溶液调节pH至8.0～9.0，加入胰酶反应4～5小时，再以2％g/mL的浓度加入氯化钙，搅拌溶解后升温至80～85℃，继续搅拌10分钟再降温至40℃以下，以2％g/mL的浓度加入碳酸钠，持续搅拌30分钟，离心取上清液；其中，所述胰酶与粗品肝素钠的重量比为0.4～0.8％；
(3)向步骤(2)得到的上清液补加纯水至步骤(1)中的粗品肝素钠水溶液的初始体积，升温至45～50℃，用18％g/mL的盐酸水溶液调节pH至4.5～5.5，加入纤维素酶搅拌下反应6～8小时，加入氯化钙，搅拌溶解后升温至80～85℃，搅拌10分钟，再降温至40℃以下，以2％g/mL的浓度加入碳酸钠，持续搅拌30分钟后离心取上清液；其中，所述纤维素酶与粗品肝素钠的重量比为0.2～0.6％；
(4)向步骤(3)得到的上清液加入95％体积比乙醇水溶液，搅拌均匀，降温至0～5℃，调节pH至1.0～2.0，离心取上清液并迅速调节pH至6.0～7.0；其中，所述步骤(3)得到的上清液与95％体积比的乙醇水溶液的体积比为10％；
(5)向步骤(4)得到的上清液加入95％体积比乙醇水溶液，至20℃下的乙醇浓度为40～45％，静置12～24小时，抽去上层乙醇得到湿沉淀；
(6)以30～35％g/mL的浓度将步骤(5)得到的湿沉淀溶解在纯化水中，加入25％g/mL的次氯酸水溶液，用18％g/mL的盐酸水溶液调节pH至4.5～5.0，20～30℃下静置6～8小时，调节pH至6.0～7.0，以1.5％g/mL的浓度加入氯化钠，搅拌溶解后加入95％体积比乙醇水溶液至20℃下的乙醇浓度为40～45％，静置6～8小时，抽去上层乙醇得到湿沉淀；其中，所述次氯酸水溶液与湿沉淀水溶液的体积比为0.5～1.5％；
(7)以30～35％g/mL的浓度将步骤(6)得到的湿沉淀溶解在纯化水中，用20％g/mL的氢氧化钠水溶液调节pH至10.0～10.5，25～30℃下加入30％g/mL的过氧化氢水溶液静置4小时，再加入30％g/mL的过氧化氢水溶液静置8小时，再加入30％g/mL的过氧化氢水溶液静置12小时，调节pH至6～7，过滤；其中，每次加入的过氧化氢水溶液与湿沉淀水溶液的体积比为0.5-1.5％；
(8)将滤液冻干，粉碎。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的制备方法制备的肝素钠。
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