ES2930637T3 - Copolímeros de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano y métodos de síntesis de los mismos - Google Patents

Abstract

En el presente documento se describen composiciones que comprenden un copolímero de injerto que tiene (i) un esqueleto que comprende dextrano con un peso molecular de al menos alrededor de 100000 Daltons, y cadenas laterales de polialfa-1,3-glucano que comprenden al menos alrededor del 95 % de alfa-1,3- enlaces glucosídicos. Se describen además reacciones para producir dichos copolímeros de injerto, así como su uso en materiales absorbentes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Copolímeros de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano y métodos de síntesis de los mismos

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE. UU. N.° 62/251.183 (presentada el 5 de noviembre de 2015).

CAMPO

La presente divulgación está en el campo de los polisacáridos. Por ejemplo, la presente divulgación se refiere a la producción de copolímeros de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano, y al uso de los mismos en composiciones que tienen funciones ventajosas de absorción de líquidos acuosos y filtrabilidad.

REFERENCIA AL LISTADO DE SECUENCIAS PRESENTADO ELECTRÓNICAMENTE

La copia oficial del listado de secuencias se presenta electrónicamente por EFS-Web como un listado de secuencias en formato ASCII con un archivo llamado CL6500WOPCT_SequenceListing_ST25.txt creado el 31 de octubre de 2016 y que tiene un tamaño de 79,4 kilobytes y está presentado simultáneamente con la memoria descriptiva. El listado de secuencias contenido en este documento con formato ASCII es parte de la memoria descriptiva.

ANTECEDENTES

Conducido por un deseo de descubrir nuevos polisacáridos estructurales usando síntesis enzimáticas o ingeniería genética de microorganismos u hospedadores vegetales, los investigadores han descubierto polisacáridos que son biodegradables y se pueden preparar económicamente a partir de materias primas de fuentes renovables. Dicho polisacárido es el poli-alfa-1,3-glucano, un polímero de glucano caracterizado por tener enlaces alfa-1,3-glucosídicos. Este polímero ha sido aislado poniendo en contacto una disolución acuosa de sacarosa con una enzima glucosiltransferasa (GTF) aislada de Streptococcus salivarius (Simpson et al., Microbiology 141:1451 -1460, 1995).

La patente de EE. UU. 7000000 desveló la preparación de una fibra de polisacárido usando una enzima gtfJ de S. salivarius. Al menos el 50 % de las unidades de hexosa dentro del polímero de esta fibra se unieron por enlaces alfa-1,3-glucosídicos. La enzima gtfJ de S. salivarius utiliza sacarosa como sustrato en una reacción de polimerización produciendo poli-alfa-1,3-glucano y fructosa como productos finales (Simpson et al., 1995). El polímero desvelado formó una disolución cristalina líquida cuando se disolvió por encima de una concentración crítica en un disolvente o en una mezcla que comprende un disolvente. Se obtuvieron fibras de tipo algodón continuas y fuertes a partir de esta disolución que podrían ser hiladas y usadas en aplicaciones textiles.

Aunque se han hecho avances en la producción de poli-alfa-1,3-glucano, sigue habiendo problemas con respecto al aislamiento de este producto de glucano de una forma económica. Para este fin, en el presente documento se desvela poli-alfa-1,3-glucano en forma de un copolímero de injerto que tiene filtrabilidad y capacidad de absorción de líquido acuoso potenciadas.

SUMARIO

En una realización, la divulgación se refiere a una composición que comprende un copolímero de injerto que comprende:

(i) un esqueleto que comprende dextrano con un peso molecular medio ponderal de al menos 100000 dáltones, y

(ii) cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano que comprenden al menos 95 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos, en donde el peso molecular medio ponderal de una o más de las cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano es al menos 100000 dáltones; en donde el copolímero de injerto es insoluble en condiciones acuosas.

Otra realización se refiere a una reacción enzimática que comprende (i) agua, (ii) sacarosa, (iii) dextrano con un peso molecular medio ponderal de al menos 100000 dáltones y (iv) una enzima glucosiltransferasa que sintetiza poli-alfa-1,3-glucano que comprende al menos 95 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos, en donde la reacción enzimática produce un copolímero de injerto como se desvela actualmente.

Otra realización se refiere a un método de preparación de un copolímero de injerto. Este método comprende: (a) poner en contacto al menos (i) agua, (ii) sacarosa, (iii) dextrano con un peso molecular medio ponderal de al menos 100000 dáltones y (iv) una enzima glucosiltransferasa que sintetiza poli-alfa-1,3-glucano que comprende al menos 95 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos, por el cual se produce un copolímero de injerto como se desvela actualmente; y (b) opcionalmente, aislar el copolímero de injerto producido en la etapa (a).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Y LAS SECUENCIAS

FIG. 1: Ejemplo de una porción de un copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano como se desvela actualmente. En esta ilustración particular, una cadena de poli-alfa-1,3-glucano ("injerto de glucano") se sintetiza por una enzima glucosiltransferasa (GTF) de una glucosa lateral que está unida en alfa-1,4 a un esqueleto de dextrano.

FIG. 2: Representación gráfica de un copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano en algunos aspectos. El esqueleto de dextrano y las cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano se presentan aproximadamente a escala entre sí. Por ejemplo, el esqueleto puede ser aproximadamente 1000 DPw, mientras que cada cadena lateral puede ser aproximadamente 1000 DPw.

FIG. 3. Un gráfico ilustra el efecto de empezar la concentración de dextrano (g/l) en el DPw de copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano producido en reacciones de glucosiltransferasa de 2 h y 24 h. Ver el Ejemplo 2.

La FIG. 4 muestra una fotografía de una muestra de copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano que contiene 10,6 % en peso de dextrano. Ver el Ejemplo 6.

La FIG. 5 muestra una fotografía de una muestra de copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano que contiene 0,9 % en peso de dextrano. Ver el Ejemplo 6.

Tabla 1. Resumen de números de SEQ ID de proteína

DESCRIPCIÓN DETALLADA

A menos que se desvele de otro modo, los términos "un" y "una", como se usan en el presente documento, pretenden englobar uno o más (es decir, al menos una) de una característica referenciada.

Donde esté presente, todos los intervalos son inclusivos y combinables, excepto que se indique de otro modo. Por ejemplo, cuando se cita un intervalo de "1 a 5", el intervalo citado se debe interpretar como que incluye los intervalos "1 a 4", "1 a 3", "1 -2", "1-2 y 4-5", "1 -3 y 5", y similares.

El término "copolímero" en el presente documento se refiere a un polímero que comprende al menos dos tipos diferentes de alfa-glucano, tales como dextrano y poli-alfa-1,3-glucano.

Los términos "copolímero de injerto", "copolímero ramificado" y similares en el presente documento se refieren, en general, a un copolímero que comprende un "esqueleto" (o "cadena principal") y cadenas laterales que se ramifican a partir del esqueleto. Las cadenas laterales son estructuralmente distintas del esqueleto. Los ejemplos de copolímeros de injerto en el presente documento comprenden un esqueleto que comprende dextrano con un Mw de al menos aproximadamente 100000 dáltones, y cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano que comprenden al menos aproximadamente el 95 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos. En algunos aspectos, un esqueleto de dextrano puede tener una extensión de poli-alfa-1,3-glucano, puesto que el extremo no reductor del dextrano puede cebar la síntesis de poli-alfa-1,3-glucano por una enzima glucosiltransferasa. Un esqueleto puede así ser un copolímero lineal de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano en algunos casos. Un esqueleto en algunos aspectos pueden él mismo ser una estructura ramificada como se desvela a continuación; la adición de poli-alfa-1,3-glucano a dicho esqueleto aumenta la ramificación de la estructura ramificada original.

Los términos "cadena lateral de poli-alfa-1,3-glucano" y "rama de poli-alfa-1,3-glucano" se pueden usar indistintamente en el presente documento. Una cadena lateral de poli-alfa-1,3-glucano es normalmente una extensión de una rama de dextrano (por ejemplo, glucosa lateral o cadena corta), puesto que una rama de dextrano tiene un extremo no reductor que puede cebar la síntesis de poli-alfa-1,3-glucano por una enzima glucosiltransferasa.

"Homopolímero de poli-alfa-1,3-glucano" y términos similares, como se usa en el presente documento, se refieren a poli-alfa-1,3-glucano que no es parte de (i) un copolímero de injerto o (ii) parte de un copolímero lineal de dextranopoli-alfa-1,3-glucano.

Los términos "alfa-glucano", "polímero de alfa-glucano" y similares se usan indistintamente en el presente documento. Un alfa-glucano es un polímero que comprende unidades monoméricas de glucosa unidas juntas por enlaces alfaglucosídicos. El dextrano y el poli-alfa-1,3-glucano son ejemplos de alfa-glucanos.

Los términos "enlace glucosídico", "unión glucosídica" y similares se usan indistintamente en el presente documento y se refieren al enlace covalente que une una molécula de hidrato de carbono con otra molécula de hidrato de carbono. Los términos enlace glucosídico", "unión glucosídica" y similares se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un enlace glucosídico entre dos moléculas de glucosa. El término "enlace alfa-1,6-glucosídico", como se usa en el presente documento, se refiere al enlace covalente que une moléculas de alfa-D-glucosa entre sí mediante los carbonos 1 y 6 en anillos adyacentes de alfa-D-glucosa. El término "enlace alfa-1,3-glucosídico" como se usa en el presente documento se refiere al enlace covalente que une moléculas de alfa-D-glucosa entre sí mediante los carbonos 1 y 3 en anillos adyacentes de alfa-D-glucosa. El término "enlace alfa-1,2-glucosídico", como se usa en el presente documento, se refiere al enlace covalente que une moléculas de alfa-D-glucosa entre sí mediante los carbonos 1 y 2 en anillos adyacentes de alfa-D-glucosa. El término "enlace alfa-1,4-glucosídico", como se usa en el presente documento, se refiere al enlace covalente que une moléculas de alfa-D-glucosa entre sí mediante los carbonos 1 y 4 en anillos adyacentes de alfa-D-glucosa. En el presente documento, "alfa-D-glucosa" se denominará "glucosa." Todos los enlaces glucosídicos desvelados en el presente documento son enlaces alfa-glucosídicos, a menos que se indique lo contrario.

Los términos "poli-alfa-1,3-glucano", "polímero de alfa-1,3-glucano" y similares se usan indistintamente en el presente documento. Poli-alfa-1,3-glucano en el presente documento comprende al menos 95 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos. Se espera que el poli-alfa-1,3-glucano que comprende 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos esté principalmente sin ramificar, y el que comprenda 100 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos sea lineal / sin ramificar.

Los términos "dextrano", "polímero de dextrano", "molécula de dextrano" y similares se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un alfa-glucano que comprende, en general, una cadena principal con sustancialmente (principalmente) monómeros de glucosa unidos por alfa-1,6, con ramas periódicas unidas a la cadena principal por enlaces alfa-1,3, alfa-1,2 y/o alfa-1,4.

Una cadena principal de dextrano en el presente documento comprende más de aproximadamente el 90-95 % de todos los monómeros de glucosa de un polímero de dextrano en algunos aspectos. Una cadena principal de dextrano en algunos casos puede comprender sustancialmente [o principalmente] enlaces alfa-1,6, que significa que puede tener al menos aproximadamente 98,0 % de enlaces alfa-1,6. Una cadena principal de dextrano puede comprender una pequeña cantidad de enlaces alfa-1,3 en algunos aspectos, que significa que puede tener menos de aproximadamente 2,0 % de enlaces alfa-1,3.

Las ramas de dextrano son normalmente cortas, siendo de uno (lateral) a tres monómeros de glucosa de longitud, y comprenden menos de aproximadamente el 10 % de todos los monómeros de glucosa de un polímero de dextrano. Dichas ramas cortas pueden comprender enlaces glucosídicos alfa-1,2-, alfa-1,3- y/o alfa-1,4-glucosídicos. El dextrano en algunas realizaciones también puede tener ramas que comprenden principalmente enlaces alfa-1,6. La longitud de dicha rama puede ser similar a la longitud de la cadena de la que se origina la rama.

El perfil de enlaces glucosídicos de un alfa-glucano en el presente documento se pueden determinar usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, se puede determinar un perfil de enlaces usando métodos que usan espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) (por ejemplo, RMN 13C o RMN 1H). Estos y otros métodos que se pueden usar se desvelan en Food Carbohydrates: Chemistry. Physical Properties, and Applications (S. W. Cui, Ed., Capítulo 3, S. W. Cui, Structural Analysis of Polysaccharides, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton, FL, 2005).

El "peso molecular" de dextrano en el presente documento se puede representar como el peso molecular medio numérico (Mn) o como el peso molecular medio ponderal (Mw), cuyas unidades son en dáltones o gramos/mol. Alternativamente, el peso molecular se puede representar como DPw (grado de polimerización promedio en peso) o DPn (grado de polimerización promedio en número). Se conocen en la técnica diversos medios para calcular estas mediciones de peso molecular, tales como con cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC), cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) o cromatografía de exclusión molecular (GPC).

El término "sacarosa" en el presente documento se refiere a un disacárido no reductor compuesto de una molécula de alfa-D-glucosa y una molécula de beta-D-fructosa unida por un enlace alfa-1,2-glucosídico. La sacarosa se conoce comúnmente como azúcar de mesa.

Los términos "enzima glucosiltransferasa", "enzima GTF", "GTF", "glucansucrasa" y similares se usan indistintamente en el presente documento. La actividad de una glucosiltransferasa en el presente documento cataliza la reacción del sustrato sacarosa para producir los productos alfa-glucano y fructosa. Otros productos (subproductos) de una reacción de glucosiltransferasa pueden incluir glucosa y diversos oligosacáridos solubles (DP2-DP7) que incluyen leucrosa. Las formas naturales de las enzimas glucosiltransferasas contienen, en general (en la dirección de aminoterminal a carboxiterminal) un péptido señalizador, un dominio variable, un dominio catalítico y un dominio de unión a glucano. Una glucosiltransferasa en el presente documento se clasifica en la familia 70 de las glucósido hidrolasas (GH70) según la base de datos CAZy (Carbohydrate-Active EnZymes) (Cantarel et al., Nucleic Acids Res. 37:D233-238, 2009). El término "dextransucrasa" se puede usar opcionalmente para caracterizar una enzima glucosiltransferasa que produce dextrano.

El término "dominio catalítico de glucosiltransferasa" en el presente documento se refiere al dominio de una enzima glucosiltransferasa que proporciona actividad de síntesis de alfa-glucano a una enzima glucosiltransferasa. Un dominio catalítico de glucosiltransferasa no requiere preferentemente la presencia de ningún otro dominio que tenga esta actividad.

Los términos "reacción enzimática", "reacción de glucosiltransferasa", "reacción de síntesis de glucano", "disolución de reacción" y similares se usan indistintamente en el presente documento y se refieren, en general, a una reacción que comprende inicialmente agua, sacarosa, al menos una enzima glucosiltransferasa activa, y opcionalmente otros componentes tales como dextrano. Los componentes que pueden estar además presentes en una reacción de glucosiltransferasa normalmente después de que haya comenzado incluyen fructosa, glucosa, oligosacáridos solubles (por ejemplo, DP2-DP7), tales como leucrosa, y producto(s) de alfa-glucano soluble(s) y/o insoluble(s) de DP8 o superiores (por ejemplo, DP100 y superiores). No se cree que una reacción enzimática en el presente documento ocurra en la naturaleza.

El término "absorber", como se usa en el presente documento, se refiere a la acción de tomar (absorber) un líquido acuoso. La absorción por una composición como se desvela actualmente se puede medir en términos del valor de retención de agua (WRV), o como g de líquido acuoso/g de copolímero de injerto (la máxima cantidad de líquido acuoso que puede ser empapada y retenida por una cierta cantidad de copolímero de injerto), por ejemplo. WRV se puede calcular con respecto a cualquier líquido acuoso en el presente documento usando la siguiente fórmula, por ejemplo: ((masa de polímero húmedo - masa de polímero seco) / masa de polímero seco) * 100.

Los términos "líquido acuoso", "fluido acuoso" y similares, como se usan en el presente documento, se pueden referir a agua o una disolución acuosa. Una "disolución acuosa" en el presente documento puede comprender una o más sales disueltas, donde la concentración total máxima de sales puede ser de aproximadamente el 3,5 % en peso en algunas realizaciones. Aunque los líquidos acuosos en el presente documento comprenden normalmente agua como el único disolvente en el líquido, un líquido acuoso puede comprender opcionalmente uno o varios de otros disolventes (por ejemplo, disolvente orgánico polar) que son miscibles en agua. Por lo tanto, una disolución acuosa puede comprender un disolvente que tiene al menos aproximadamente 10 % en peso de agua.

Una "tasa de filtración superior" en el presente documento caracteriza la filtrabilidad de un copolímero de injerto que es al menos aproximadamente el 10 % más rápido que la filtrabilidad de un homopolímero de poli-alfa-1,3-glucano u otro material de control.

Los términos "porcentaje por volumen", "porcentaje en volumen", "% en vol", "% v/v" y similares se usan indistintamente en el presente documento. El porcentaje en volumen de un soluto en una disolución se puede determinar usando la fórmula: [(volumen de soluto)/(volumen de disolución)] x 100 %.

Los términos "porcentaje por peso", "porcentaje en peso (% en peso)", "porcentaje en peso-peso (% p/p)" y similares se usan indistintamente en el presente documento. Porcentaje en peso se refiere al porcentaje de un material en una base en masa como está comprendido en una composición, mezcla o disolución.

Los términos "polinucleótido", "secuencia de polinucleótidos", "secuencia de ácido nucleico", "secuencia de nucleótidos" y similares se usan indistintamente en el presente documento. Un polinucleótido puede ser un polímero de ADN o ARN que es mono- o bicatenario, que opcionalmente contiene bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas. Un polinucleótido puede estar comprendido de uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico, ADN sintético, o mezclas de los mismos. Los nucleótidos (ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos) se pueden denominar por una designación de una única letra del siguiente modo: "A" para adenilato o desoxiadenilato (para ARN o ADN, respectivamente), "C" para citidilato o desoxicitidilato (para ARN o ADN, respectivamente), "G" para guanilato o desoxiguanilato (para ARN o ADN, respectivamente), "U" para uridilato (para ARN), "T" para desoxitimidilato (para ADN), "R" para purinas (A o G), "Y" para pirimidinas (C o T), "K" para G o T, "H" para A o C o T, "I" para inosina, "W" para A o T, y "N" para cualquier nucleótido (por ejemplo, N puede ser A, C, T, o G, si se refiere a una secuencia de ADN; N puede ser A, C, U o G, si se refiere a una secuencia de ARN).

El término "gen", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de polinucleótidos de ADN que expresa un ARN (el ARN se transcribe de la secuencia de polinucleótidos de ADN) de una región codificante, ARN que puede ser un ARN mensajero (que codifica una proteína) o un ARN que no codifica una proteína. Un gen se puede referir a la región codificante sola, o puede incluir secuencias reguladoras aguas arriba y/o aguas abajo con respecto a la región codificante (por ejemplo, promotores, regiones no traducidas de 5', regiones terminadoras de la transcripción en 3'). Una región codificante que codifica una proteína se puede denominar alternativamente en el presente documento un "marco de lectura abierto" (ORF). Un gen que es "nativo" o "endógeno" se refiere a un gen que se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras; dicho gen se localiza en su localización natural en el genoma de una célula hospedadora. Un gen "quimérico" se refiere a cualquier gen que no sea un gen nativo, que comprende secuencias codificantes reguladoras y que no se encuentran juntas en la naturaleza (es decir, las regiones reguladoras y codificantes son heterólogas entre sí). Por consiguiente, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que derivan de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de un modo diferente al encontrado en la naturaleza. Un gen "extraño" o "heterólogo" se refiere a un gen que se introduce en el organismo hospedador por transferencia génica. Los genes extraños/ heterólogos pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo, genes nativos introducidos en una nueva localización dentro del hospedador nativo, o genes quiméricos. Las secuencias de polinucleótidos en ciertas realizaciones en el presente documento son heterólogas. Un "transgén" es un gen que se ha introducido en el genoma por un procedimiento de administración génica (por ejemplo, transformación). Un marco de lectura abierto de "codones optimizados" tiene su frecuencia de uso de codones diseñada para imitar la frecuencia del uso de codones diseñado de la célula hospedadora.

Una secuencia de aminoácidos o secuencia de polinucleótidos "no nativa" en el presente documento comprendida en una célula u organismo en el presente documento no ocurre en un homólogo nativo (natural) de dicha célula u organismo.

"Secuencias reguladoras", como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias de nucleótidos situadas en la dirección 5’ de un sitio de inicio de la transcripción del gen (por ejemplo, promotor), regiones no traducidas de 5', intrones y regiones no codificantes de 3', y que pueden influir en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad, y/o la traducción de un ARN transcrito del gen. Las secuencias reguladoras en el presente documento pueden incluir promotores, potenciadores, silenciadores, secuencias conductoras no traducidas de 5', intrones, secuencias de reconocimiento de la poliadenilación, sitios de procesamiento de ARN, sitios de unión efectores, estructuras tallobucle, y otros elementos implicados en la regulación de la expresión génica. Uno o más elementos reguladores en el presente documento pueden ser heterólogos a una región codificante en el presente documento.

Un "promotor", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la transcripción de ARN de un gen. En general, una secuencia promotora está en la dirección 5’ del sitio de inicio de la transcripción de un gen. Los promotores pueden derivar en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de ADN sintético. Los promotores que hacen que un gen se exprese en una célula la mayoría de las veces en todas las circunstancias se denominan comúnmente "promotores constitutivos". Uno o más promotores en el presente documento pueden ser heterólogos a una región codificante en el presente documento.

Un "promotor fuerte", como se usa en el presente documento, se refiere a un promotor que puede dirigir un número relativamente grande de inicios productivos por unidad de tiempo, y/o es un promotor que conduce a un mayor nivel de transcripción génica que el nivel de transcripción promedio de los genes en una célula.

Los términos "secuencia no codificante de 3'", "terminador de la transcripción", "terminador" y similares, como se usan en el presente documento, se refieren a secuencias de ADN situadas en la dirección 3’ de una secuencia codificante. Esto incluye secuencias de reconocimiento de la poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar el procesamiento o la expresión génica de ARNm.

Como se usa en el presente documento, una primera secuencia de ácido nucleico es "hibridable" con una segunda secuencial de ácido nucleico cuando una forma monocatenaria de la primera secuencia de ácido nucleico se puede hibridar con la segunda secuencia de ácido nucleico en condiciones de hibridación adecuadas (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica de la disolución). Las condiciones de hibridación y de lavado son bien conocidas y se ejemplifican en Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989), particularmente el Capítulo 11 y la Tabla 11.1.

Los términos "casete", "casete de expresión", "casete génico" y similares se usan indistintamente en el presente documento. Un casete se puede referir a un promotor unido operativamente a una secuencia de ADN que codifica un ARN codificante de proteína. Un casete puede estar unido operativamente opcionalmente a una secuencia no codificante de 3'. La estructura de un casete en el presente documento se puede representar opcionalmente por el sistema de notación simple de "X::Y::Z". Específicamente, X describe un promotor, Y describe una secuencia codificante y Z describe un terminador (opcional); X está unido operativamente a Y, e Y está unido operativamente a Z.

Los términos "en la dirección 5’" y "en la dirección 3’", como se usan en el presente documento con respecto a polinucleótidos, se refieren a "5' de" y "3' de", respectivamente.

El término "expresión", como se usa en el presente documento, se refiere a (i) transcripción de ARN (por ejemplo, ARNm o un ARN no codificante de proteína) desde una región codificante, y/o (ii) traducción de un polipéptido desde el ARNm. La expresión de una región codificante de una secuencia de polinucleótidos se puede regular por incremento o regular por disminución en ciertas realizaciones.

El término "unido operativamente", como se usa en el presente documento, se refiere a la asociación de dos o más secuencias del ácido nucleico, de forma que la función de una se afecte por la otra. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente con una secuencia codificante cuando es capaz de afectar la expresión de esa secuencia codificante. Es decir, la secuencia codificante está bajo el control de la transcripción del promotor. Una secuencia codificante puede estar unida operativamente a una secuencia reguladora (por ejemplo, promotora) o a más (por ejemplo, promotora y terminadora), por ejemplo.

El término "recombinante", cuando se usa en el presente documento para caracterizar una secuencia de ADN, tal como un plásmido, vector o construcción, se refiere a una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otro modo, por ejemplo, por síntesis química y/o por manipulación de segmentos de ácidos nucleicos aislados por técnicas de ingeniería genética. Los métodos de preparación de construcciones/vectores recombinantes en el presente documento pueden seguir las técnicas habituales de ADN recombinante y clonación molecular que se describen por J. Sambrook y D. Russell (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001); T.J. Silhavy et al. (Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1984); y F.M. Ausubel et al. (Short Protocols in Molecular Biology, 5a Ed. Current Protocols, John Wiley and Sons, Inc., NY, 2002), por ejemplo.

El término "transformación", como se usa en el presente documento, se refiere a la transferencia de una molécula de ácido nucleico en un organismo hospedador o célula hospedadora por cualquier método. Una molécula de ácido nucleico que ha sido transformada en un organismo/célula puede ser una que se replica autónomamente en el organismo/célula, o que se integra en el genoma del organismo/célula, o que existe transitoriamente en la célula sin replicar o integrar. Los ejemplos no limitantes de moléculas de ácidos nucleicos adecuadas para la transformación se desvelan en el presente documento, tales como plásmidos y moléculas de ADN lineal. Los organismos hospedadores/células en el presente documento que contienen una secuencia de ácido nucleico transformante se pueden denominar "transgénicos", "recombinantes", "transformados", "manipulados", como un "transformante", y/o como que están "modificados por la expresión de genes exógenos", por ejemplo.

Los términos "identidad de secuencia" o "identidad", como se usan en el presente documento con respecto a secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, se refieren a bases de ácido nucleico o restos de aminoácidos en dos secuencias que son las mismas cuando se alinean para la máxima correspondencia en una ventana de comparación especificada. Por lo tanto, el "porcentaje de identidad de secuencia" o "porcentaje de identidad" se refiere al valor determinado comparando dos secuencias alineadas óptimamente en una ventana de comparación, en donde la porción del polinucleótido o secuencia de polipéptidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica o el resto de aminoácido ocurre en ambas secuencias para dar el número de posiciones equiparadas, dividiendo el número de posiciones equiparadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando los resultados por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. Se entendería que, cuando se calcula la identidad de secuencia entre una secuencia de ADN y una secuencia de ARN, los restos de T de la secuencia de ADN se alinean con, y se pueden considerar "idénticos" a, los restos de U de la secuencia de ARN. Para los fines de determinación del "porcentaje de complementariedad" del primer y segundos polinucleótidos, esto se puede obtener determinando (i) el porcentaje de identidad entre el primer polinucleótido y la secuencia del complemento del segundo polinucleótido (o viceversa), por ejemplo, y/o (ii) el porcentaje de bases entre los primeros y segundos polinucleótidos que crearían pares de bases canónicos de Watson y Crick.

El algoritmo Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), que está disponible en línea en la página web del Centro Nacional para Información Biotecnológica (NCBI), se puede usar, por ejemplo, para medir el porcentaje de identidad entre dos o entre dos o más de las secuencias de polinucleótidos (algoritmo BLASTN) o secuencias de polipéptidos (algoritmo BLASTP) desveladas en el presente documento. Alternativamente, el porcentaje de identidad entre secuencias se puede realizar usando un algoritmo de Clustal (por ejemplo, ClustalW, ClustalV o Clustal-Omega). Para múltiples alineamientos usando un método de alineamiento de Clustal, los valores por defecto pueden corresponder a PENALIZACIÓN POR HUECO=10 y PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=10. Los parámetros por defecto para alineamientos por pares y el cálculo de porcentaje de identidad de secuencias de proteínas usando un método de Clustal pueden ser KTUPLE=1, PENALIZACIÓN POR HUECO=3, VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5.

Para ácidos nucleicos, estos parámetros pueden ser KTUPLE=2, PENALIZACIÓN POR HUECO=5, VENTANA=4 y DIAGONALES GUARDADAS=4. Alternativamente todavía, el porcentaje de identidad entre secuencias se puede realizar usando un algoritmo EMBOSS (por ejemplo, needle) con parámetros tales como ABERTURA POR HUECO=10, EXTENSIÓN POR HUECO=0,5, PENALIZACIÓN POR HUECO FINAL=falso, HUECO ABIERTO FINAL=10, EXTENSIÓN POR HUECO FINAL=0,5 usando una matriz de BLOSUM (por ejemplo, BLOSUM62).

Se desvelan diversas secuencias de aminoácidos de polipéptidos en el presente documento como características de ciertas realizaciones. Las variantes de estas secuencias que son al menos aproximadamente 70-85 %, 85-90 % o

90 %-95 % idénticas a las secuencias desveladas en el presente documento se pueden usar o referenciar.

Alternativamente, una secuencia de aminoácidos de variante puede tener al menos 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %,

75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %,

93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con una secuencia desvelada en el presente documento.

La secuencia de aminoácidos de variante tiene la misma función/actividad de la secuencia desvelada, o al menos aproximadamente 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %,

95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la función/actividad de la secuencia desvelada. Cualquier secuencia de aminoácidos de polipéptido desvelada en el presente documento que no empiece con una metionina puede comprender normalmente además al menos una metionina de inicio en el extremo N de la secuencia de aminoácidos.

Cualquier secuencia de aminoácidos de polipéptido desvelada en el presente documento que empiece con una metionina se puede considerar opcionalmente sin este resto de metionina (es decir, una secuencia de polipéptidos se puede denominar con referencia al resto de la posición 2 con respecto al resto carboxiterminal de la secuencia).

El término "aislado", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de polipéptido (por ejemplo, glucosiltransferasa) que se ha purificado completamente o parcialmente de su fuente nativa. En algunos casos, una molécula de polipéptido aislada es parte de una composición mayor, sistema de tampón o mezcla de reactivos. Por ejemplo, una molécula de polipéptido aislada puede estar comprendida dentro de una célula u organismo en un modo heterólogo. También se puede considerar que un copolímero de injerto en el presente documento (y una reacción para su síntesis) está aislado puesto que es sintético/preparado por el hombre, y/o tiene propiedades que no existen de forma natural.

El término "incrementado", como se usa en el presente documento, se puede referir a una cantidad o actividad que es al menos aproximadamente el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %,

16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 50 %, 100 % o 200 % superior a la cantidad o actividad con la que se compara la cantidad o actividad incrementada. Los términos "incrementado", "elevado", "potenciado", "superior a", "mejorado" y similares se usan indistintamente en el presente documento.

Aunque se han hecho avances en la producción de poli-alfa-1,3-glucano, siguen los problemas con respecto al aislamiento de este producto de glucano de una forma económica. Por lo tanto, para tratar esta necesidad, en el presente documento se desvela poli-alfa-1,3-glucano en forma de un copolímero de injerto. Las diversas realizaciones de dicho copolímero tienen características de filtrabilidad y/o de absorción de líquido acuoso potenciadas.

Ciertas realizaciones de la presente divulgación se refieren a una composición que comprende un copolímero de injerto que comprende:

(i) un esqueleto que comprende dextrano con un peso molecular medio ponderal (Mw) de al menos 100000 dáltones, y

(ii) cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano que comprenden al menos 95 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos, en donde el Mw de una o más de las cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano es al menos 100000 dáltones; en donde el copolímero de injerto es insoluble en condiciones acuosas.

Un dextrano que forma el esqueleto de un copolímero de injerto en el presente documento puede comprender, por ejemplo, aproximadamente o al menos aproximadamente 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %,

59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de enlaces alfa-1,6-glucosídicos. Dicho porcentaje de perfil de enlaces alfa-1,6 es teniendo en cuenta el total de todos los enlaces en el dextrano (cadena principal y porciones de rama combinadas).

"Ramas de dextrano" y términos similares en el presente documento se indican para englobar cualquier rama que exista en un polímero de dextrano antes de su uso para preparar un copolímero de injerto como se desvela actualmente. En algunas realizaciones, un dextrano comprende una cadena principal que comprende aproximadamente, o al menos aproximadamente, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o

100 % de enlaces alfa-1,6-glucosídicos.

Un dextrano en el presente documento puede comprender, por ejemplo, aproximadamente o al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %,

18 %, 19 % o 20 % de enlaces alfa-1,4, alfa-1,3 y/o alfa-1,2 glucosídicos. Normalmente, dichos enlaces existen completamente, o casi completamente, en porciones de rama del dextrano, que incluyen puntos de rama. En algunas realizaciones, las ramas del dextrano pueden comprender uno, dos (por ejemplo, alfa-1,4 y alfa-1,3; alfa-1,4 y alfa-1,2; alfa-1,3 y alfa-1,2), o los tres de estos tipos de enlaces. El porcentaje total de enlaces alfa-1,4, alfa-1,3 y/o alfa-1,2 glucosídicos en un dextrano en el presente documento no es normalmente superior al 50 %. En algunos aspectos, tales como con el dextrano que comprende una cadena principal que tiene aproximadamente, o al menos aproximadamente, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de enlaces alfa-1,6-glucosídicos, dicho dextrano comprende aproximadamente, o al menos aproximadamente, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, o 10 % de enlaces alfa-1,4, alfa-1,3 y/o alfa-1,2 glucosídicos.

Un punto de rama de un dextrano en el presente documento puede comprender un enlace alfa-1,4, alfa-1,3 o alfa-1,2 glucosídico (por ejemplo, una rama pueden estar unida en alfa-1,3 a una cadena principal del dextrano). En algunas realizaciones, los tres de estos puntos de rama pueden existir, mientras que en algunas realizaciones solo existen uno o dos (por ejemplo, alfa-1,4 y alfa-1,3; alfa-1,4 y alfa-1,2; alfa-1,3 y alfa-1,2) tipos de estos puntos de rama. Se contempla que un punto de rama ocurre en promedio cada (o al menos cada) 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 10­ 30, 15-25, 20-30 o 20-40 unidades de glucosa de una cadena principal de dextrano, por ejemplo. Las ramas de una molécula de dextrano que comprende enlaces alfa-1,4, alfa-1,3, y/o alfa-1,2 glucosídicos en el presente documento son normalmente de uno a tres monómeros de glucosa de longitud y comprenden menos de aproximadamente el 5­ 10 % de todos los monómeros de glucosa de un polímero de dextrano. Una rama que comprende una unidad de glucosa se puede denominar opcionalmente un grupo de glucosa lateral. En algunas realizaciones, las ramas de una molécula de dextrano pueden comprender menos de aproximadamente el 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % de todos los monómeros de glucosa de una molécula de dextrano. Un dextrano en ciertas realizaciones puede tener aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 % de puntos de rama como un porcentaje de enlaces glucosídicos en el polímero. El perfil de enlaces glucosídicos de una rama en el presente documento se puede caracterizar opcionalmente por incluir el enlace glucosídico por el que la rama se une a otra cadena.

Un esqueleto de un copolímero de injerto en ciertas realizaciones puede estar comprendido completamente de un dextrano como se desvela actualmente. Sin embargo, en algunos aspectos, un esqueleto puede comprender otros elementos. Por ejemplo, un esqueleto de copolímero de injerto puede comprender poli-alfa-1,3-glucano que se origina a partir del lado no reductor de una cadena principal de dextrano, debido a la cadena principal (en su extremo no reductor) que sirve para cebar la síntesis de poli-alfa-1,3-glucano durante la síntesis del copolímero de injerto.

El peso molecular (Mw [peso molecular medio ponderal]) de un dextrano que forma el esqueleto de un copolímero de injerto en el presente documento puede ser al menos aproximadamente 100000 dáltones. El dextrano en ciertas realizaciones puede tener un Mw de aproximadamente, o al menos aproximadamente, 100000, 125000, 150000, 175000, 200000, 240000, 250000, 500000, 750000, o 1000000 dáltones, o be en un intervalo de aproximadamente 100000-200000, 125000-175000, 130000-170000, 135000-165000, 140000-160000 o 145000-155000 dáltones. En algunos aspectos, el dextrano puede tener un Mw de aproximadamente, o al menos aproximadamente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 millones de dáltones, o puede estar en un intervalo de aproximadamente 10-80, 20-70, 30-60, 40-50, 50-200, 60-200, 70-200, 80-200, 90­ 200, 100-200, 110-200, 120-200, 50-180, 60-180, 70-180, 80-180, 90-180, 100-180, 110-180, 120-180, 50-160, 60­ 160, 70-160, 80-160, 90-160, 100-160, 110-160, 120-160, 50-140, 60-140, 70-140, 80-140, 90-140, 100-140, 110-140, 120-140, 50-120, 60-120, 70-120, 80-120, 90-120, 90-110, 100-120, 110-120, 50-110, 60-110, 70-110, 80-110, 90­ 110, 100-110, 50-100, 60-100, 70-100, 80-100, 90-100 o 95-105 millones de dáltones en algunos aspectos. El dextrano con un Mw de al menos aproximadamente 50 millones en el presente documento se puede denominar opcionalmente un "dextrano muy largo". El Mw del dextrano en el presente documento no está por debajo de 100000 dáltones, y así no es dextrano T10 (Mw = 10000), T25 (Mw = 25000) o T40 (Mw = 40000), por ejemplo. Cualquier Mw de dextrano en el presente documento se puede expresar opcionalmente como grado de polimerización promedio en peso (DPw), que es Mw dividido entre 162,14. Cualquiera de los Mw de dextrano anteriores se puede considerar un Mw promedio de todas las moléculas de dextrano en una muestra de dextrano, por ejemplo.

Un dextrano muy largo en algunos aspectos puede comprender (i) aproximadamente 87-93 % en peso de glucosa unida solo en las posiciones 1 y 6; (ii) aproximadamente 0,1 -1,2 % en peso de glucosa unida solo en las posiciones 1 y 3; (iii) aproximadamente 0,1 -0,7 % en peso de glucosa unida solo en las posiciones 1 y 4; (iv) aproximadamente 7,7­ 8,6 % en peso de glucosa unida solo en las posiciones 1,3 y 6; y (v) aproximadamente 0,4-1,7 % en peso de glucosa unida solo en: (a) las posiciones 1, 2 y 6, o (b) las posiciones 1, 4 y 6. En ciertas realizaciones, un dextrano puede comprender (i) aproximadamente 89,5-90,5 % en peso de glucosa unida solo en las posiciones 1 y 6; (ii) aproximadamente 0,4-0,9 % en peso de glucosa unida solo en las posiciones 1 y 3; (iii) aproximadamente 0,3-0,5 % en peso de glucosa unida solo en las posiciones 1 y 4; (iv) aproximadamente 8,0-8,3 % en peso de glucosa unida solo en las posiciones 1,3 y 6; y (v) aproximadamente 0,7-1,4 % en peso de glucosa unida solo en: (a) las posiciones 1,2 y 6, o (b) las posiciones 1,4 y 6.

Un dextrano muy largo en algunos aspectos puede comprender aproximadamente 87, 87,5, 88, 88,5, 89, 89,5, 90, 90,5, 91,91,5, 92, 92,5 o 93 % en peso de glucosa unida solo en las posiciones 1 y 6. Puede haber aproximadamente 87- 92,5, 87-92, 87-91,5, 87-91, 87-90,5, 87-90, 87,5-92,5, 87,5-92, 87,5-91,5, 87,5-91, 87,5-90,5, 87,5-90, 88-92,5, 88- 92, 88-91,5, 88-91,88-90,5, 88-90, 88,5-92,5, 88,5-92, 88,5-91,5, 88,5-91,88,5-90,5, 88,5-90, 89-92,5, 89-92, 8991,5, 89-91, 89-90,5, 89-90, 89,5-92,5, 89,5-92, 89,5-91,5, 89,5-91 o 89,5-90,5 % en peso de glucosa unida solo en las posiciones 1 y 6, en algunos casos.

Un dextrano muy largo en algunos aspectos puede comprender aproximadamente 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1 o 1,2 % en peso de glucosa unida solo en las posiciones 1 y 3. Puede haber aproximadamente 0,1-1,2, 0,1-1,0, 0,1 -0,8, 0,3-1,2, 0,3-1,0, 0,3-0,8, 0,4-1,2, 0,4-1,0, 0,4-0,8, 0,5-1,2, 0,5-1,0, 0,5-0,8, 0,6-1,2, 0,6-1,0, o 0,6-0,8 % en peso de glucosa unida solo en las posiciones 1 y 3, en algunos casos.

Un dextrano muy largo en algunos aspectos puede comprender aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 o 0,7 % en peso de glucosa unida solo en las posiciones 1 y 4. Puede haber aproximadamente 0,1-0,7, 0,1 -0,6, 0,1-0,5, 0,1­ 0,4, 0,2-0,7, 0,2-0,6, 0,2-0,5, 0,2-0,4, 0,3-0,7, 0,3-0,6, 0,3-0,5, o 0,3-0,4 % en peso de glucosa unida solo en las posiciones 1 y 4, en algunos casos.

Un dextrano muy largo en algunos aspectos puede comprender aproximadamente 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1,8,2, 8,3, 8,4, 8,5 o 8,6 % en peso de glucosa unida solo en las posiciones 1,3 y 6. Puede haber aproximadamente 7,7-8,6, 7,7-8,5, 7,7-8,4, 7,7-8,3, 7,7-8,2, 7,8-8,6, 7,8-8,5, 7,8-8,4, 7,8-8,3, 7,8-8,2, 7,9-8,6, 7,9-8,5, 7,9-8,4, 7,9-8,3, 7,9-8,2, 8,0-8,6, 8,0-8,5, 8,0-8,4, 8,0-8,3, 8,0-8,2, 8,1 -8,6, 8,1 -8,5, 8,1 -8,1, 8,1-8,3 o 8,1-8,2 % en peso de glucosa unida solo en las posiciones 1, 3 y 6, en algunos casos.

Un dextrano muy largo en algunos aspectos puede comprender aproximadamente 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6 o 1,7 % en peso de glucosa unida solo en (a) las posiciones 1,2 y 6, o (b) las posiciones 1,4 y 6. Puede haber aproximadamente 0,4-1,7, 0,4-1,6, 0,4-1,5, 0,4-1,4, 0,4-1,3, 0,5-1,7, 0,5-1,6, 0,5-1,5, 0,5-1,4, 0,5-1,3, 0,6-1,7, 0,6-1,6, 0,6-1,5, 0,6-1,4, 0,6-1,3, 0,7-1,7, 0,7-1,6, 0,7-1,5, 0,7-1,4, 0,7-1,3, 0,8-1,7, 0,8-1,6, 0,8-1,5, 0,8-1,4, 0,8-1,3 % en peso de glucosa unida solo en (a) las posiciones 1,2 y 6, o (b) las posiciones 1,4 y 6, en algunos casos.

"Glucosa (monómeros de glucosa) unida en las posiciones 1 y 6" en el presente documento se refiere a un monómero de glucosa de dextrano en el que solo los carbonos 1 y 6 del monómero de glucosa participan en enlaces glucosídicos respectivos con dos monómeros de glucosa adyacentes. Esta definición se aplica asimismo a glucosa (i) "unida en las posiciones 1 y 3", y (ii) "unida en las posiciones 1 y 4", teniendo en cuenta, por consiguiente, las diferentes posiciones de carbono implicadas en cada enlace respectivo.

"Glucosa (monómeros de glucosa) unida en las posiciones 1, 3 y 6" en el presente documento se refiere a un monómero de glucosa de dextrano en el que los carbonos 1,3 y 6 del monómero de glucosa participan en enlaces glucosídicos respectivos con tres monómeros de glucosa adyacentes. Una glucosa unida solo en las posiciones 1,3 y 6 es un punto de rama. Esta definición se aplica asimismo a glucosa unida en (i) las posiciones 1,2 y 6, y (ii) las posiciones 1, 4 y 6, pero teniendo en cuenta, por consiguiente, las diferentes posiciones del carbono implicadas en cada enlace respectivo.

Las posiciones de glucosa (posiciones de carbono de la glucosa) 1, 2, 3, 4 y 6 en el presente documento son como se conoce en la técnica (representada en la siguiente estructura):

El perfil de enlaces glucosídicos de un dextrano muy largo se puede determinar usando dextrano producido siguiendo cualquier protocolo desvelado en el presente documento. Un ejemplo de un protocolo de determinación de enlaces adecuado puede ser similar a, o el mismo que, el protocolo desvelado en el Ejemplo 8. Por ejemplo, una reacción de la enzima 0768 gtf que se ha desactivado calentando la reacción a aproximadamente 70-90 °C (por ejemplo, 80 °C) durante aproximadamente 5-30 minutos (por ejemplo, 10 minutos) se pone en un tubo de diálisis (por ejemplo, hecho de celulosa regenerada) con un MWCO de 12-14 kDa (por ejemplo, tubo de diálisis Spectra/Por® 4, pieza N.° 132706, Spectrum Laboratories, Inc.). La reacción desactivada se dializa entonces contra un gran volumen de agua (por ejemplo, 3-5 l) a aproximadamente 20-25 °C (temperatura ambiente) durante aproximadamente 4-10 días (por ejemplo, 7 días); este agua se puede intercambiar cada día durante la diálisis. El producto de dextrano (i) se precipita mezclando la reacción desactivada dializada con un volumen de reacción de aproximadamente 1-2x (1,5x) del 100 % de metanol, (ii) se lava al menos dos veces con el mismo volumen del 100 % de metanol, y (iii) se seca a aproximadamente 40-50 °C (por ejemplo, 45 °C) (opcionalmente a vacío). Una cantidad disolvible de dextrano seco se disuelve en sulfóxido de dimetilo (DMSO) o Dm So /5 % de LiCI, después de que todos los grupos hidroxilo libres estén metilados (por ejemplo, por adición secuencial de una suspensión de NaOH/DMSO seguida con yodometano). El dextrano metilado se extrae entonces (por ejemplo, en cloruro de metileno) y se hidroliza dando unidades monoméricas usando ácido trifluoroacético (TFA) acuoso a aproximadamente 110-125 °C (por ejemplo, 120 °C). El TFA se evapora entonces y se hace la abertura de anillo reductora usando borodeuteruro de sodio. Los grupos hidroxilo creados hidrolizando los enlaces glucosídicos se acetilan entonces tratando con cloruro de acetilo y TFA a una temperatura de aproximadamente 40-60 °C (por ejemplo, 50 °C). A continuación, se evaporan los reactivos de derivatización y los monómeros metilados/acetilados resultantes se reconstituyen en acetonitrilo; esta preparación se analiza entonces por CG/EM usando una columna apropiada (por ejemplo, biscianopropil cianopropilfenil polisiloxano). La posición relativa de las funcionalidades metilo y acetilo dan especies con distintos índices de tiempo de retención y espectros de masas que se pueden comparar con bases de datos publicadas. De esta forma, los derivados de las unidades monoméricas indican cómo cada monómero estaba unido originalmente en el polímero de dextrano.

Se cree que el dextrano muy largo en el presente documento puede ser una estructura ramificada en la que existen largas cadenas (que contienen principalmente o todos enlaces alfa-1,6) que se ramifican iterativamente entre sí (por ejemplo, una cadena larga puede ser una rama de otra cadena larga, que a su vez puede ella misma ser una rama de otra cadena larga, etc.). La estructura ramificada también puede comprender ramas cortas de las cadenas largas; se cree que estas cadenas cortas comprenden, por ejemplo, enlaces alfa-1,3 y -1,4. Los puntos de rama en el dextrano muy largo, tanto de una cadena larga que se ramifica principalmente de otra cadena larga, como en una cadena corta que se ramifica de una cadena larga, parecen comprender enlaces alfa-1,3, -1,4 o -1,2 de una glucosa implicada en el enlace alfa-1,6. En promedio, aproximadamente el 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 15-35 %, 15-30 %, 15-25 %, 15-20 %, 20-35 %, 20-30 %, 20-25 %, 25-35 % o 25-30 % de todos los puntos de rama del dextrano muy largo en algunas realizaciones se ramifican en cadenas largas. La mayoría (>98 % o 99 %) o todos los otros puntos de rama se ramifican en cadenas cortas.

Las cadenas largas de una estructura de ramificación de dextrano muy largo pueden ser similares en longitud en algunos aspectos. Siendo similares en longitud, se indica que la longitud (DP) de al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % de todas las cadenas largas en una estructura de ramificación están dentro de más/menos 15 % (o 10 %, 5 %) de la longitud media de todas las cadenas largas de la estructura de ramificación. En algunos aspectos, la longitud media (longitud promedio) de las cadenas largas de un dextrano muy largo es aproximadamente 10-50 DP (es decir, 10-50 monómeros de glucosa). Por ejemplo, la longitud individual media de las cadenas largas puede ser aproximadamente 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 10-50, 10-40, 10-30, 10-25, 10-20, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, 15-20, 20-50, 20-40, 20-30 o 20-25 DP.

Las cadenas largas en ciertas realizaciones de dextrano muy largo pueden comprender sustancialmente enlaces alfa-1,6-glucosídicos y una pequeña cantidad (inferior al 2,0 %) de enlaces alfa-1,3- y/o alfa-1,4-glucosídicos. Por ejemplo, las cadenas largas del dextrano muy largo pueden comprender aproximadamente, o al menos aproximadamente, 98 %, 98,25 %, 98,5 %, 98,75 %, 99 %, 99,25 %, 99,5 %, 99,75 % o 99,9 % de enlaces alfa-1,6-glucosídicos. Una cadena larga de dextrano en ciertas realizaciones no comprende enlaces alfa-1,4-glucosídicos (es decir, dicha cadena larga tiene principalmente enlaces alfa-1,6 y una pequeña cantidad de enlaces alfa-1,3). En cambio, una cadena larga de dextrano en algunas realizaciones no comprende enlaces alfa-1,3-glucosídicos (es decir, dicha cadena larga tiene principalmente enlaces alfa-1,6 y una pequeña cantidad de enlaces alfa-1,4). Cualquier cadena larga de dextrano de las realizaciones anteriores puede además no comprender enlaces alfa-1,2-glucosídicos, por ejemplo. Aún en algunos aspectos, una cadena larga de dextrano puede comprender 100 % de enlaces alfa-1,6-glucosídicos (exceptuando el enlace usado por dicha cadena larga hasta la rama de otra cadena).

Las cadenas cortas de una molécula de dextrano muy largo en algunos aspectos son de uno a tres monómeros de glucosa de longitud y comprenden menos de aproximadamente 5-10 % de todos los monómeros de glucosa del polímero de dextrano. Al menos aproximadamente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, de las cadenas cortas, o todas, en el presente documento tienen 1 -3 monómeros de glucosa de longitud. Las cadenas cortas de una molécula de dextrano pueden comprender menos de aproximadamente el 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % de todos los monómeros de glucosa de una molécula de dextrano muy larga, por ejemplo.

Las cadenas cortas de una molécula de dextrano muy largo en algunos aspectos pueden comprender enlaces alfa-1,2-, alfa-1,3-, y/o alfa-1,4-glucosídicos. Las cadenas cortas, cuando se consideran todas juntas (no individualmente), pueden comprender (i) los tres de estos enlaces, o (ii) enlaces alfa-1,3- y alfa-1,4-glucosídicos, por ejemplo.

En realizaciones en las que un dextrano muy largo se usó para crear un copolímero como se desvela actualmente, se contempla que un "esqueleto" es una cadena larga del dextrano muy largo. Una cadena lateral de poli-alfa-1,3-glucano se puede unir a una cadena larga de un dextrano muy largo de un modo como se desvela actualmente en todas partes (por ejemplo, extensión del extremo no reductor de una cadena corta o de una cadena larga).

El Mw de un dextrano muy largo en el presente documento es aproximadamente 50-200 millones, o cualquier Mw como se desvela anteriormente que se encuentre dentro de este intervalo.

El radio de giro promedio z de un dextrano muy largo en el presente documento puede ser aproximadamente 200-280 nm. Por ejemplo, el Rg promedio z puede ser aproximadamente 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275 o 280 nm (o cualquier número entero entre 200-280 nm). Como otros ejemplos, el Rg promedio z puede ser aproximadamente 200-280, 200-270, 200-260, 200-250, 200-240, 200-230, 220-280, 220-270, 220-260, 220-250, 220-240, 220-230, 230-280, 230-270, 230-260, 230-250, 230-240, 240-280, 240-270, 240-260, 240­ 250, 250-280, 250-270 o 250-260 nm.

El término "radio de giro" (Rg) en el presente documento se refiere al radio medio del dextrano, y se calcula como la distancia media cuadrática de los componentes de una molécula de dextrano (átomos) desde el centro de gravedad de la molécula. Rg se puede proporcionar en unidades de Angstrom o nanómetros (nm), por ejemplo. El "radio de giro promedio z" del dextrano en el presente documento se refiere al Rg del dextrano como se mide usando dispersión de la luz (por ejemplo, MALS). Se conocen métodos para medir el Rg promedio z y se pueden usar en el presente documento, por consiguiente. Por ejemplo, el Rg promedio z se puede medir como se desvela en la patente de EE. UU. N.° 7531073, las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2010/0003515 y 2009/0046274, Wyatt (Anal. Chim. Acta 272:1-40) y Mori y Barth (Size Exclusion Chomatography, Springer-Verlag, Berlin, 1999).

El Mw y/o Rg promedio z del dextrano muy largo en algunos aspectos se puede medir siguiendo un protocolo similar a, o el mismo que, el protocolo desvelado en el Ejemplo 8. Por ejemplo, un Mw y/o Rg promedio z en el presente documento se puede medir disolviendo en primer lugar el dextrano producido por una 0768 gtf a 0,4-0,6 mg/ml (por ejemplo, ~0,5 mg/ml) en tampón tris(hidroximetil)aminometano 0,05-1,0 M (por ejemplo, ~0,075 M) con 150-250 ppm (por ejemplo, ~200 ppm) de NaN3. La solvatación del dextrano seco se puede lograr agitando durante 12-18 horas a 45-55 °C (por ejemplo, ~50 °C). La disolución de dextrano resultante puede ser entrada en un aparato de cromatografía por inyección en flujo adecuada que comprende un módulo de separación (por ejemplo, módulo de separación Alliance™ 2695 de Waters Corporation, Milford, MA) acoplado con tres detectores en línea: un refractómetro diferencial (por ejemplo, detector Waters 2414 del índice de refracción), un fotómetro de dispersión de la luz multiángulo (MALS) (por ejemplo, fotómetro MALS multiángulo de 18 ángulos Heleos™-2) equipado con un detector de dispersión de luz cuasielástico (QELS) (por ejemplo, detector QELS de Wyatt Technologies, Santa Barbara, CA) y un viscosímetro capilar diferencial (por ejemplo, viscosímetro capilar diferencial ViscoStar™ de Wyatt). Se pueden usar dos columnas de exclusión de tamaño adecuadas (por ejemplo, columnas AQUAGEL-OH GUARD de Agilent Technologies, Santa Clara, CA) para separar el pico del polímero de dextrano del pico de inyección, donde la fase móvil puede ser la misma que el disolvente de muestra (anteriormente), el caudal puede ser de aproximadamente 0,2 ml/min, los volúmenes de inyección pueden ser de aproximadamente 0,1 ml y la temperatura de la columna puede ser de aproximadamente 30 °C. Se puede usar el software adecuado para la adquisición de datos (por ejemplo, software Empower™ versión 3 de Waters y para la reducción de datos del multidetector (software Astra™ versión 6 de Wyatt). Los datos de MALS pueden proporcionar el peso molecular medio ponderal (Mw) y el radio de giro promedio z (Rg), y los datos de QELS pueden proporcionar el radio hidrodinámico promedio z, por ejemplo

Un dextrano muy largo en el presente documento puede ser un producto de una enzima glucosiltransferasa que comprende, o que consiste en, una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a, o al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7 (y tienen actividad de síntesis de dextrano muy largo). Los ejemplos no limitantes de una enzima glucosiltransferasa que comprende SEQ ID NO:6 (o una secuencia relacionada) incluyen enzimas glucosiltransferasa que comprenden, o que consisten en, una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a, o al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a, SEQ ID NO:7 (y tienen actividad de síntesis de dextrano muy largo). Un dextrano muy largo puede ser un producto de una enzima glucosiltransferasa de Leuconostocpseudomesenteroides, pero no una enzima glucosiltransferasa de Leuconostoc mesenteroides, en ciertas realizaciones.

Una enzima glucosiltransferasa usada para producir dextrano en el presente documento está normalmente en una forma madura que carece de un péptido señalizador aminoterminal. Un sistema de expresión para producir una enzima glucosiltransferasa madura en el presente documento puede emplear un polinucleótido codificante de enzimas que comprende además una secuencia que codifica un péptido señalizador aminoterminal para dirigir la secreción extracelular. El péptido señalizador en dichas realizaciones se escinde de la enzima durante el proceso de secreción. El péptido señalizador puede o ser nativo o heterólogo a la glucosiltransferasa.

SEQ ID NO:6 es un ejemplo de una enzima glucosiltransferasa madura que carece de un péptido señalizador aminoterminal. Puesto que esta secuencia de aminoácidos y secuencias de aminoácidos relacionadas no empiezan con un resto de metionina, se entendería que una metionina de inicio aminoterminal se añadiera preferentemente a la secuencia (directamente o por una secuencia de aminoácidos heteróloga intermedia, tales como un epítope) si se expresa cualquiera de estas enzimas sin usar un péptido señalizador (tal como con un sistema de expresión donde la enzima se expresa intracelularmente y se obtiene de un lisado celular).

Una enzima glucosiltransferasa que produce dextrano en ciertas realizaciones se puede producir mediante cualquier medio conocido en la técnica, tales como los desvelados a continuación para producir enzimas que sintetizan polialfa-1,3-glucano.

Una enzima glucosiltransferasa que produce dextrano en ciertas realizaciones se puede usar en cualquier estado de purificación (por ejemplo, puro o no puro) como se desvela a continuación para producir enzimas que sintetizan polialfa-1,3-glucano.

La actividad de una enzima glucosiltransferasa que produce dextrano se puede determinar usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, dicha actividad enzimática se puede determinar midiendo la producción de azúcares reductores (fructosa y glucosa) en una reacción que contiene sacarosa (~50 g/l), dextrano T10 (~1 mg/ml) y tampón fosfato potásico (~pH 6,5, 50 mM), donde la disolución se mantiene a ~22-25 °C durante ~24-30 horas. Los azúcares reductores se pueden medir añadiendo 0,01 ml de la reacción a una mezcla que contiene NaOH ~1 N y ~0,1 % de cloruro de trifeniltetrazolio y luego monitorizando el aumento en la absorbancia a DÜ480nm durante ~cinco minutos. También, por ejemplo, una unidad de una enzima tal como gtf 0768 (que comprende SEQ ID NO:1) en el presente documento se puede definir como la cantidad de enzima requerida para consumir 1 g de sacarosa en 1 hora a 26 °C, pH 6,5, y con 100 g/l de sacarosa.

Un dextrano muy largo puede ser un producto de una glucosiltransferasa como está comprendido en una reacción de glucosiltransferasa para producir dextrano.

La temperatura de una reacción de glucosiltransferasa para producir dextrano se puede controlar, si se desea. En ciertas realizaciones, la temperatura es entre aproximadamente 5 °C y aproximadamente 50 °C. La temperatura en ciertas otras realizaciones es entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 40 °C. Alternativamente, la temperatura puede ser aproximadamente 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 °C.

La concentración inicial de sacarosa en una reacción de glucosiltransferasa en el presente documento para producir dextrano puede ser aproximadamente 20 g/l a 900 g/l, 20 g/l a 400 g/l, 75 g/l a 175 g/l, o 50 g/l a 150 g/l. La concentración inicial de sacarosa puede ser aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 50-150, 75-125, 90-110, 50-500, 100-500, 200-500, 300-500, 400­ 500, 50-400, 100-400, 200-400, 300-400, 50-300, 100-300, 200-300, 50-200, 100-200 o 50-100 g/l (o cualquier número entero entre 20 y 900 g/l), por ejemplo. La sacarosa puede ser de una pureza como se desvela a continuación para las reacciones que producen poli-alfa-1,3-glucano.

El pH de una reacción de glucosiltransferasa en ciertas realizaciones para producir dextrano puede estar entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 8,0. Alternativamente, el pH puede ser aproximadamente 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 o 8,0. El pH se puede ajustar o controlar mediante la adición o incorporación de un tampón adecuado, que incluye, pero no se limita a: fosfato, tris, citrato, o una combinación de los mismos. La concentración de tampón en una reacción gtf puede ser desde 0 mM hasta aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 10, 20, o 50 mM, por ejemplo.

Una reacción de glucosiltransferasa en el presente documento para producir dextrano se puede agitar opcionalmente mediante agitación o agitación orbital, por ejemplo. Dicha agitación puede ser a aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 50-150, 60-140, 70-130, 80-120 o 90-110 rpm, por ejemplo.

La concentración de enzima glucosiltransferasa en una reacción para producir dextrano puede ser al menos aproximadamente 15, 20, 25, 30, 35 o 40 U/l, por ejemplo. En algunas realizaciones, se pueden usar 15-35, 15-30, 15-25, 20-35, 20-30, 20-25, 25-35, 25-30 o 30-35 U/l de glucosiltransferasa.

Una reacción de glucosiltransferasa en el presente documento para producir dextrano puede necesitar aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 18, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 18-30, 20-28 o 22-26 horas para finalizar. El tiempo de reacción puede depender, por ejemplo, de ciertos parámetros, tales como la cantidad de sacarosa y enzima glucosiltransferasa usada en la reacción.

Por consiguiente, se pueden combinar todas las características en el presente documento que definen una reacción de glucosiltransferasa para producir dextrano. Simplemente como un ejemplo, una reacción que usa una 0768 glucosiltransferasa (que comprende SEQ ID NO:1 o secuencia relacionada de la misma) puede contener inicialmente 90-110 g/l (por ejemplo, ~ 100 g/l) de sacarosa, tampón fosfato de sodio 10-30 mM (por ejemplo, ~20 mM) a pH 6,0­ 7,0 (por ejemplo, ~pH 6,5) y 20-30 U/l (por ejemplo, ~25 U/l) de enzima. Dicha reacción se puede mantener durante aproximadamente 20-28 horas (por ejemplo, ~24 horas) con 50-150 rpm (por ejemplo, ~100 rpm) de agitación a 24­ 28 °C (por ejemplo, ~26 °C).

Un copolímero de injerto en el presente documento comprende un esqueleto de dextrano del que existen cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano que comprenden al menos aproximadamente 95 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos. Estas cadenas laterales resultan normalmente de la reacción de un dextrano como se desvela actualmente en el presente documento con una glucosiltransferasa que puede sintetizar poli-alfa-1,3-glucano. Para fines de claridad, estas cadenas laterales no se deben considerar ramas de dextrano.

Una cadena lateral de poli-alfa-1,3-glucano en ciertos aspectos puede comprender aproximadamente, o al menos aproximadamente, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % de enlaces alfa-1,3 glucosídicos. Dicha cadena lateral se contempla en algunos aspectos por ser sintetizada con una enzima glucosiltransferasa usando una glucosa lateral u otra porción de rama de dextrano (ambas de las cuales presentan extremos no reductores con respecto a la enzima para la extensión) como cebador. Si una cadena lateral se sintetiza a partir de una glucosa lateral que está en sí unida por alfa-1,3 a la cadena principal de dextrano, la cadena lateral resultante puede tener 100 % o un porcentaje muy alto (por ejemplo, 98 % o mayor) de enlaces alfa-1,3-glucosídicos. En algunas realizaciones, el enlace glucosídico entre una cadena principal de dextrano y una lateral de glucosa o rama más larga se considera un enlace de la cadena lateral. En algunas realizaciones, el enlace glucosídico entre una cadena principal de dextrano y una rama, así como los enlaces glucosídicos dentro de una rama a partir de la cual se sintetizó una cadena, se consideran en la determinación del perfil de enlaces de la cadena lateral. Las cadenas laterales en algunas realizaciones no tienen enlaces alfa-1,6 glucosídicos, tales como con copolímeros de injerto en los que el componente de dextrano tiene de 100000 a 200000 dáltones.

El Mw de una cadena lateral de poli-alfa-1,3-glucano en el presente documento es al menos 110000, 110000, 120000, 125000, 130000, 140000, 150000, 160000, 162000 o 165000 dáltones, por ejemplo. Se contempla que las cadenas laterales de un copolímero de injerto en el presente documento son de tamaño relativamente homogéneo. Por ejemplo, las cadenas laterales de un copolímero de injerto pueden tener cada una al menos aproximadamente 100000, 120000, 140000, 160000, 162000 o 165000 dáltones. También por ejemplo, las cadenas laterales de un copolímero de injerto pueden tener cada una un Mw en el intervalo de aproximadamente 150000-165000, 155000-165000 o 160000-165000 dáltones. También se puede hacer referencia al Mw promedio de las cadenas laterales de un copolímero de injerto, si se desea; cualquiera de los Mw de las cadenas laterales anteriores se puede considerar un Mw promedio de todas las cadenas laterales de un copolímero. Cualquiera de los Mw de las cadenas laterales (o cualquier Mw de glucano) desvelados en el presente documento se puede caracterizar opcionalmente en términos de DPw (Mw/162,14).

El número de cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano de un copolímero de injerto en el presente documento puede ser al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30, por ejemplo. En algunas realizaciones, el número de cadenas laterales es 4, 5 o 6, por ejemplo. El número anterior de cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano en algunos aspectos es una característica de las cadenas laterales que tienen al menos aproximadamente 100000, 120000, 140000, 160000, 162000 o 165000 dáltones; cualquier componente de dextrano en el presente documento, tal como un dextrano muy largo o un dextrano de 100000 a 200000 dáltones, puede estar comprendido en dicho copolímero. Aún, en aspectos adicionales, el número anterior de cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano puede caracterizar un copolímero de injerto en el que el componente de dextrano tiene una glucosa lateral y/o rama (de la que se puede cebar/sintetizar una cadena lateral) en promedio una vez cada 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 unidades de glucosa de una cadena principal de dextrano.

Basándose en el tamaño de un componente de dextrano (por ejemplo, 100000-200000 dáltones), la situación de las ramas/glucosas laterales en la cadena principal de dextrano (por ejemplo, aproximadamente una cada 20 unidades de glucosa) y el número de cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano de un copolímero de injerto, se contempla en algunos casos que un copolímero de injerto tiene la mayoría (por ejemplo, al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %) de sus ramas de dextrano originales/glucosas laterales no extendidas en una cadena lateral de poli-alfa-1,3-glucano (es decir, la mayoría de las ramas/glucosas laterales son como existían en el dextrano antes de su uso para sintetizar un copolímero de injerto en el presente documento). Todavía, en algunas otras realizaciones, se cree posible que un copolímero de injerto en el presente documento pueda tener hasta aproximadamente 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 15000 o 20000 cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucanos.

En ciertas realizaciones en las que el componente de dextrano de un copolímero de injerto tiene un peso molecular medio ponderal de al menos aproximadamente 50 millones de dáltones (por ejemplo, cualquier Mw más alto como se desvela anteriormente) y/o comprende (i) aproximadamente 87-93 % en peso de glucosa unida en las posiciones 1 y

6; (ii) aproximadamente 0,1 -1,2 % en peso de glucosa unida en las posiciones 1 y 3; (iii) aproximadamente 0,1-0,7 % en peso de glucosa unida en las posiciones 1 y 4; (iv) aproximadamente 7,7-8,6 % en peso de glucosa unida en las posiciones 1,3 y 6; y (v) aproximadamente 0,4-1,7 % en peso de glucosa unida en (a) las posiciones 1,2 y 6, o (b) las posiciones 1, 4 y 6, las cadenas laterales del copolímero de injerto pueden comprender al menos 30 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos y un porcentaje de enlaces alfa-1,6 que lleva el total de tanto los enlaces alfa-1,3 como -1,6 en las cadenas laterales al 100 %. Por ejemplo, el porcentaje de enlaces alfa-1,3 puede ser al menos del 30 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %,

50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %,

68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %,

86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % o 95 %, mientras que el porcentaje de enlaces alfa-1,6 puede ser aquél que lleve el total de tanto los enlaces alfa-1,3 como -1,6 en las cadenas laterales al 100 %. En ciertas realizaciones, dichas cadenas laterales no comprenden alternano (que alterna enlaces 1,3 y 1,6). Las cadenas laterales en algunas realizaciones tienen un nivel de enlaces alfa-1,3 que hacen que el copolímero de injerto resultante sea insoluble. Las enzimas glucosiltransferasa que se pueden usar en algunos aspectos para sintetizar cadenas laterales que comprenden al menos 30 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos como antes se desvelan en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2015/0232819).

Todos las características desveladas anteriormente (aparte del perfil de enlaces de cadenas) que caracterizan las cadenas laterales que comprenden al menos 95 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos (por ejemplo, Mw, número de cadenas laterales, separación en el esqueleto de dextrano, tipo de punto de rama) pueden asimismo caracterizar cadenas laterales en el presente documento que comprenden al menos 30 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos.

El peso molecular medio ponderal de un copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano en el presente documento (es decir, el Mw combinado de la molécula de dextrano original y las cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano de un copolímero de injerto) puede ser aproximadamente, o al menos aproximadamente, 750000, 800000, 900000, 1000000, 1100000, 1200000, 1300000, 1400000, 1500000, 1600000, 1700000, 1800000, 1900000 o 2000000 dáltones, por ejemplo. Se cree que el peso molecular medio ponderal de un copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano que comprende un componente de dextrano muy largo en algunas realizaciones es similar al peso que se desvela anteriormente para el componente de dextrano muy largo en sí, pero con la adición de aproximadamente 0,5, 0,75, 1, 1,25, 1,5, 1,75 o 2 millones de dáltones (en realizaciones en las que existen algunas cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucanos). En aún algunos aspectos más, el peso molecular medio ponderal de un copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano puede ser la suma de Mw de cualquier molécula de dextrano en el presente documento y Mw de cualquier cadena lateral de poli-alfa-1,3-glucano (teniendo en cuenta el número de cadenas laterales y Mw de cada una) desvelado en el presente documento. Por tanto, el Mw de un copolímero de injerto en el presente documento se puede expresar opcionalmente en términos del Mw del componente de dextrano y el Mw de la cadena lateral de poli-alfa-1,3-glucano. En algunos aspectos, el peso molecular medio ponderal de un copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano no es inferior a 600000, 650000 o 700000 dáltones.

En ciertas realizaciones, un copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano puede comprender aproximadamente, o al menos aproximadamente, 2,0 % en peso de dextrano. El % en peso de dextrano en un copolímero de injerto en algunos aspectos adicionales puede ser aproximadamente, o al menos aproximadamente, 0,5 %, 1,0 %, 1,5 %, 2,0 %, 2,1 %, 2,2 %, 2,3 %, 2,4 %, 2,5 %, 3,0 %, 3,5 %, 4,0 %, 5,5 %, 6,0 %, 6,5 %, 7,0 %, 7,5 %, 8,0 %, 8,5 %, 9,0 %, 9,5 %, 10,0 %, 10,5 %, 11,0 %, 11,5 %, 12,0 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % (o cualquier número entero entre 1 %-99 %). Un copolímero de injerto en algunas realizaciones (por ejemplo, las que comprenden 2 %-50 %, 2 %-11 %, 2,5 %-10,5 % o >2 % de dextrano) puede presentar filtrabilidad potenciada en comparación con un copolímero de injerto que comprende el mismo tipo de dextrano, pero en un menor porcentaje en peso (por ejemplo, inferior al 1,6 %, 1,5 %, 1,4 %, 1,3 %, 1,2 %, 1,1 %, 1,0 %, 0,9 % o 0,8 %). La filtrabilidad potenciada en el presente documento se puede referir opcionalmente a la facilidad por la que el agua y/o una disolución acuosa (por ejemplo, porción líquida de una reacción enzimática usada para producir el copolímero de injerto) se pueden filtrar (por ejemplo, gravedad solo, lavado con desplazamiento, fuerza aplicada) a través de un lecho (por ejemplo, torta húmeda) de partículas de copolímero de injerto. El copolímero de injerto en el presente documento puede presentar filtrabilidad que es aproximadamente, o al menos aproximadamente, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 500 %, 1000 %, 10000 % o 100000 % más rápida que la filtrabilidad de (i) un copolímero de injerto en el presente documento que tiene menos del 1,6 % en peso de dextrano (anteriormente), o (ii) homopolímero de polialfa-1 ,3-glucano de DPw 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 con al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de enlaces alfa-1,3. Las mediciones de filtrabilidad para hacer dicha comparación pueden ser en unidades de resistencia de la torta o cualquier otra medida de filtrabilidad. En algunos casos, el dextrano en las realizaciones anteriores (copolímero de injerto que comprende al menos 2,0 % en peso de dextrano) tiene un Mw de al menos aproximadamente 50 millones o cualquier Mw mayor en el presente documento. Los copolímeros de injerto que comprenden al menos 2,0 % en peso de dextrano en el presente documento pueden aparecer como partículas con un diámetro promedio de aproximadamente 3,5, 3,75, 4,0, 4,25, 4,5, 4,75, 5,0, 5,25 o 5,5 mm, por ejemplo. La filtrabilidad potenciada de copolímeros de injerto en ciertos aspectos en el presente documento representa una ventaja con respecto al homopolímero de poli-alfa-1,3-glucano, que normalmente es difícil de filtrar.

El índice de polidispersidad (Mw/Mn) (PDI) de un copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano en el presente documento puede ser aproximadamente, al menos aproximadamente, o inferior a aproximadamente, 5,0, 4,75, 4,5, 4,25, 4,0, 3,75, 3,5, 3,25, 3,0, 2,75, 2,5, 2,25 o 2,0, por ejemplo. Dicho PDI puede caracterizar alternativamente a todos los productos insolubles (tomados todos juntos) de una reacción de glucosiltransferasa en el presente documento en la que se puede producir tanto el copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano como el homopolímero polialfa-1 ,3-glucano. En general, una reacción de glucosiltransferasa en el presente documento que comprende más dextrano sustrato inicial (por ejemplo, aproximadamente, o al menos aproximadamente 7,5, 10, 12,5, 15, 17,5 o 20 g/l) da producto insoluble de menor PDI que una reacción de glucosiltransferasa que comprende menos dextrano sustrato inicial (por ejemplo, aproximadamente, o inferior a aproximadamente, 5, 4, 3, 2,5 o 2 g/l), siendo todas las otras variables iguales.

Un copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano como se desvela actualmente es normalmente insoluble en condiciones acuosas (acuoso insoluble). Por ejemplo, un copolímero de injerto puede ser insoluble o no disolverse completamente en agua u otra composición acuosa a una temperatura de hasta aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 o 120 °C. Una composición acuosa en el presente documento, tal como una disolución acuosa, puede comprender un disolvente que tiene al menos aproximadamente 10 % en peso de agua. En otras realizaciones, un disolvente tiene al menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % en peso de agua (o cualquier valor entero entre el 10 y el 100 % en peso), por ejemplo.

Un copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano como está comprendido en una composición en el presente documento puede absorber un líquido acuoso. Un líquido acuoso puede ser agua, por ejemplo. Un líquido acuoso en ciertos aspectos puede ser una disolución acuosa, tal como una disolución de sal (solución salina). Una disolución de sal puede comprender opcionalmente aproximadamente, o al menos aproximadamente, 0,01,0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, 1,75, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 0,01-3,5, 0,5-3,5, 0,5-2,5 o 0,5-1,5 % en peso de sal (dichos valores de % en peso normalmente se refieren a la concentración total de una o más sales). Los ejemplos de una sal que se puede usar en una disolución acuosa en el presente documento incluyen una o más sales de sodio (por ejemplo, NaCl, Na2SÜ4). Otros ejemplos no limitantes de sales incluyen las que tienen (i) un catión aluminio, amonio, bario, calcio, cromo (II o III), cobre (I o II), hierro (II o III), hidrógeno, plomo (II), litio, magnesio, manganeso (II o III), mercurio (I o II), potasio, plata, sodio, estroncio, estaño (II o IV) o cinc, y (ii) un anión acetato, borato, bromato, bromuro, carbonato, clorato, cloruro, clorito, cromato, cianamida, cianuro, dicromato, dihidrógeno fosfato, ferricianuro, ferrocianuro, fluoruro, hidrogenocarbonato, hidrógeno fosfato, hidrógeno sulfato, sulfuro de hidrógeno, hidrógeno sulfito, hidruro, hidróxido, hipoclorito, yodato, yoduro, nitrato, nitruro, nitrito, oxalato, óxido, perclorato, permanganato, peróxido, fosfato, fosfuro, fosfito, silicato, estannato, estannito, sulfato, sulfuro, sulfito, tartrato o tiocianato. Por lo tanto, cualquier sal que tenga una forma de catión de (i) anterior y una forma de anión de (ii) anterior puede estar en un líquido acuoso como se desvela actualmente, por ejemplo. El nivel de absorción se puede medir mediante cualquier medio conocido en la técnica, tal como con el protocolo presentemente desvelado en el Ejemplo 7 (más adelante) referente a la medición de WRV (valor de retención de agua).

La absorción de un líquido acuoso por un copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano como está comprendido en una composición en el presente documento puede ser estimada midiendo el WRV de la composición, por ejemplo. El WRV en el presente documento se puede medir mediante cualquier medio conocido en la técnica, tal como con el protocolo actualmente desvelado en el Ejemplo 7 (más adelante). Brevemente, el WRV se puede calcular usando la siguiente fórmula: ((masa de polímero húmedo - masa de polímero seco) / masa de polímero seco) * 100. El WRV se puede medir con respecto a cualquier líquido acuoso como se desvela actualmente, por ejemplo. Por lo tanto, mientras que el término WRV contiene la palabra "agua", se entendería que un WRV de polímero se puede medir con respecto a cualquier tipo de líquido acuoso desvelado en el presente documento, tal como una disolución acuosa.

Un copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano, y/o una composición en la que está comprendido, puede tener un valor de retención de agua (WRV) de aproximadamente, o al menos aproximadamente, 100 en algunas realizaciones. Por ejemplo, el WRV en el presente documento puede ser aproximadamente, o al menos aproximadamente, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 o 4000.

La absorción en el presente documento se puede medir opcionalmente en términos de la máxima cantidad de líquido acuoso que puede ser absorbida y retenida por una cierta cantidad de copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano (g de líquido acuoso/g de copolímero de injerto). El copolímero de injerto con una capacidad de absorción de al menos 15 g de líquido acuoso/g de copolímero de injerto se puede caracterizar por ser superabsorbente en algunos aspectos.

Sin pretender que se sostenga creencia o teoría alguna particular, se cree que el WRV potenciado de copolímeros de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano en el presente documento es atribuible, al menos en parte, al componente de dextrano del mismo. El dextrano también parece que "reticula" (reticulación química no verdadera) componentes de poli-alfa-1,3-glucano de moléculas de copolímero de injerto individuales.

Una composición que comprende un copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano como se desvela actualmente puede estar en forma de, o comprendida dentro de, un producto de cuidado personal, producto doméstico, producto médico o producto industrial, por ejemplo. En este contexto, las composiciones en ciertas realizaciones se pueden usar como materiales absorbentes o superabsorbentes. Los ejemplos de dichos materiales incluyen los que son hipoalergénicos. Un material superabsorbente en el presente documento tiene una capacidad de absorción con respecto a un líquido acuoso en el presente documento de al menos 15 g de líquido acuoso/g de copolímero de injerto, por ejemplo. Un producto de cuidado personal, producto doméstico, producto médico o producto industrial en algunas realizaciones puede comprender un material absorbente o superabsorbente como se desvela actualmente. Una ventaja particular de una composición en el presente documento es que es biodegradable y, por lo tanto, respetuosa con el medioambiente.

Los ejemplos de productos de cuidado personal y/o usos en el presente documento incluyen productos absorbentes de higiene personal, tales como pañales para bebé, pantalones de aprendizaje para ir al baño, productos de incontinencia (por ejemplo, compresas, pañales para adultos) y productos de higiene femenina (por ejemplo, compresas, tampones, productos interlabiales, salvaslips).

Los ejemplos de productos y/o usos industriales en el presente documento incluyen envolturas para cables de telecomunicaciones; almohadillas para alimentos; aplicaciones agrícolas y forestales, tales como la retención de agua en el suelo y/o la liberación de agua para las raíces de las plantas; dispositivos de extinción de incendios; y limpieza de derrames de disoluciones acuosas o básicas.

Los ejemplos de productos y/o usos médicos en el presente documento incluyen apósitos cicatrizantes, tales como vendas y almohadillas quirúrgicas; maniquís para la obtención de imágenes por ultrasonidos; sábanas de hospital; compresas; dispositivos de liberación controlada de fármacos; islotes de inmovilización celular; sustratos de cultivo celular tridimensional; armazones bioactivos para la medicina regenerativa; dispositivos de abultamiento del estómago; y eliminación de medicamentos controlados.

Los productos de cuidado personal, los productos domésticos y/o los productos médicos en algunas realizaciones en el presente documento pueden absorber un líquido corporal, tal como orina, sangre, suero sanguíneo, materia fecal líquida (por ejemplo, diarrea), bilis, ácido/jugo estomacal, vómito, líquido amniótico, leche materna, líquido cefalorraquídeo, exudado, linfa, mucosidad (por ejemplo, drenaje nasal, flema), líquido peritoneal, líquido pleural, pus, secreción catarral, saliva, esputo, líquido sinovial, sudor y/o lágrimas.

Una ventaja particular de una composición en el presente documento es que es biodegradable y, por lo tanto, respetuosa con el medioambiente.

Una composición como se desvela actualmente puede comprender aproximadamente, o al menos aproximadamente,

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80,

81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 97, 98, 99, 99, 99,5 o 99,9 % en peso, por ejemplo, de uno o más copolímeros de injerto de dextrano-poliglucano en el presente documento. Las composiciones secas en ciertos aspectos pueden estar en forma de polvo, gránulos, microcápsulas, copos, o cualquier otra forma de materia en partículas. Otros ejemplos incluyen composiciones más grandes, tales como pellas, pastillas, granos, perlas, tabletas, barras u otros aglomerados. Una composición seca en el presente documento tiene normalmente menos del 3, 2, 1, 0,5 o 0,1 % en peso de agua comprendida en su interior.

Los aspectos adicionales de la presente divulgación se refieren a una reacción enzimática que comprende: (i) agua,

(ii) sacarosa, (iii) dextrano con un peso molecular medio ponderal (Mw) de al menos aproximadamente 100000 dáltones, y (iv) una enzima glucosiltransferasa que sintetiza poli-alfa-1,3-glucano que comprende al menos aproximadamente 95 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos. Dicha reacción enzimática produce un copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano como se desvela en el presente documento.

Cualquier dextrano de al menos 100000 dáltones como se desvela actualmente (por ejemplo, descripción anterior o en los siguientes Ejemplos) se puede usar en una reacción enzimática en el presente documento. El dextrano como

se añade a una reacción enzimática puede estar en forma de un polvo seco o una forma predisuelta, por ejemplo. La concentración inicial de dextrano en una reacción puede ser aproximadamente, o al menos aproximadamente, 0,5 g/l,

1,0 g/l, 1,5 g/l, 2 g/l, 2,5 g/l, 3 g/l, 4 g/l, 5 g/l, 7,5 g/l, 10 g/l, 15 g/l, 20 g/l o 25 g/l, por ejemplo. "Concentración inicial de dextrano" se refiere a la concentración de dextrano en una reacción de glucosiltransferasa justo después de que todos los componentes de reacción se hayan añadido (por ejemplo, al menos agua, sacarosa, dextrano, enzima glucosiltransferasa).

En algunas realizaciones, una reacción enzimática puede comprender una concentración inicial de al menos aproximadamente 2 g/l de dextrano (por ejemplo, cualquier otra mayor concentración como se desvela anteriormente) que es al menos aproximadamente 50 millones de dáltones (por ejemplo, cualquier otro Mw mayor como se desvela anteriormente). Dicha reacción puede dar un copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano con un perfil de filtrabilidad potenciada (cualquier característica de filtrabilidad como se desvela anteriormente). Puesto que se observaron efectos ventajosos sobre la filtrabilidad del producto con concentraciones iniciales de dextrano de tan solo

2-10 g/l (Ejemplo 6), la concentración inicial de dextrano (Mw > 50 millones de dáltones) en ciertas realizaciones puede

ser aproximadamente 2,0 o 2,4 g/l a aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 g/l en algunos casos.

Una reacción enzimática como se desvela actualmente para producir un copolímero de injerto comprende una enzima glucosiltransferasa que sintetiza poli-alfa-1,3-glucano que comprende al menos aproximadamente 95 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos. Dicha enzima puede sintetizar cadenas laterales de poli-alfa-1,3 (como se desvela anteriormente) a partir de primeros sitios de dextrano, formando un copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano en el presente documento. Por lo tanto, por ejemplo, una enzima glucosiltransferasa puede sintetizar poli-alfa-1,3-glucano que (i) comprende al menos aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos, y/o (ii) tiene al menos aproximadamente 16200 dáltones en Mw.

Una enzima glucosiltransferasa en ciertas realizaciones para producir poli-alfa-1,3-glucano puede comprender, o consistir en, una secuencia de aminoácidos como se desvela en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2014/0087431, por ejemplo.

Ejemplos de dichas secuencias incluyen las que son el 100 % idénticas a, o al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %,

95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 % o 99,5 % idénticas a, SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 o 5, y tienen actividad de glucosiltransferasa.

Una enzima glucosiltransferasa en ciertas realizaciones puede comprender, o consistir en, un dominio catalítico de glucosiltransferasa que tiene una secuencia de aminoácidos que es 100 % idéntica a, o al menos 90 %, 91 %, 92 %,

93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, o 99,5 % idéntica a, las posiciones de aminoácidos 54-957 de

SEQ ID NO:1, y tienen actividad de glucosiltransferasa. Una enzima glucosiltransferasa con posiciones de aminoácidos 54-957 de SEQ ID NO:1 puede producir poli-alfa-1,3-glucano con 100 % de enlaces alfa-1,3 y un DPw

de al menos 400 (datos no mostrados, se refiere a la Tabla 6 de la solicitud de patente de EE. UU. N.° 62/180.779), por ejemplo.

SEQ ID NOs:1 (GTF 7527), 2 (GTF 2678), 3 (GTF 6855), 4 (GTF 2919) y 5 (GTF 2765) representan cada una una glucosiltransferasa que, en comparación con su homólogo natural respectivo, carece del dominio de péptido señalizador y toda o una porción sustancial del dominio variable. Por lo tanto, cada una de estas enzimas glucosiltransferasa tiene un dominio catalítico seguido por un dominio de unión a glucano. La localización aproximada de las secuencias del dominio catalítico en estas enzimas es del siguiente modo: 7527 (restos 54-957 de

SEQ ID NO:1), 2678 (restos 55-960 de SEQ ID NO:2), 6855 (restos 55-960 de SEQ ID NO:3), 2919 (restos 55-960 de

SEQ ID NO:4), 2765 (restos 55-960 de SEQ ID NO:5). Las secuencias de aminoácidos de dominios catalíticos de

GTFs 2678, 6855, 2919 y 2765 tienen aproximadamente 94,9 %, 99,0 %, 95,5 % y 96,4 % de identidad, respectivamente, con una secuencia de dominio catalítico de GTF 7527 (es decir, aminoácidos 54-957 de SEQ ID NO:1). Estas enzimas glucosiltransferasa particulares pueden producir poli-alfa-1,3-glucano con 100 % de enlaces alfa-1,3 y un DPw de al menos 400 (datos no mostrados, se refieren a la Tabla 4 de la solicitud de patente de EE. UU. N.° 62/180.779). Por lo tanto, una secuencia de dominio catalítico de glucosiltransferasa en ciertas realizaciones puede ser 100 % idéntica a, o al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 % o 99,5 % idéntica a, la secuencia de aminoácidos de un dominio catalítico de GTF 2678, 6855, 2919 o 2765. En algunas realizaciones alternativas, una secuencia de dominio catalítico de glucosiltransferasa no comprende los restos 54-957 de SEQ ID NO:1, restos 55-960 de SEQ ID NO:2, restos 55-960 de SEQ ID NO:3, restos 55-960 de SEQ ID NO:4 o restos 55-960 de SEQ ID NO:5.

Aunque se cree que una enzima glucosiltransferasa en el presente documento solo necesita tener una secuencia de dominio catalítico, tal como una que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a las posiciones de aminoácidos 54-957 de SEQ ID NO:1 (o posiciones 55-960 de SEQ ID NO:2, posiciones 55-960 de SEQ ID NO:3, posiciones 55-960 de SEQ ID NO:4 o posiciones 55-960 de SEQ ID NO:5), la enzima glucosiltransferasa puede estar comprendida dentro de una secuencia de aminoácidos mayor. Por ejemplo, el dominio catalítico puede estar unido en su extremo C a un dominio de unión a glucano, y/o unido en su extremo N a un dominio variable y/o péptido señalizador.

El dominio catalítico de una enzima glucosiltransferasa en el presente documento puede tener actividad como se presenta por un dominio catalítico de una glucosiltransferasa clasificada en la familia 70 de glucósido hidrolasa (GH70). Dicha glucosiltransferasa GH70 se puede encontrar en la base de datos CAZy (Carbohydrate-Active EnZymes) (Cantarel et al., Nucleic Acids Res. 37:D233-238, 2009), por ejemplo.

Todavía otros ejemplos de enzimas glucosiltransferasa pueden ser cualquiera como se desvela en el presente documento y que incluyen 1 -300 (o cualquier número entero intermedio [por ejemplo, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50]) restos en el extremo N y/o extremo C. Dichos restos adicionales pueden ser de una secuencia natural correspondiente de la que deriva la enzima glucosiltransferasa, o pueden ser una secuencia heteróloga, tal como una marca de epítope (en cualquiera del extremo N o C) o un péptido señalizador heterólogo (en el extremo N), por ejemplo.

Una enzima glucosiltransferasa en el presente documento carece normalmente de un péptido señalizador aminoterminal. Un sistema de expresión para producir una enzima glucosiltransferasa en el presente documento puede emplear un polinucleótido codificante de enzima que comprende además una secuencia que codifica un péptido señalizador aminoterminal para dirigir la secreción extracelular, si se desea. El péptido señalizador en dichas realizaciones se escinde de la enzima durante el proceso de secreción. El péptido señalizador puede o ser nativo o heterólogo a la glucosiltransferasa. Un ejemplo de un péptido señalizador útil en el presente documento es uno de una especie bacteriana (por ejemplo, una especie de Bacillus, tal como B. subtilis) o fúngica. Un ejemplo de un péptido señalizador bacteriano es un péptido señalizador aprE, tal como uno de Bacillus (por ejemplo, B. subtilis, véase Vogtentanz et al., Protein Expr. Purif. 55:40-52, que se incorpora en el presente documento como referencia).

Una enzima glucosiltransferasa en el presente documento puede derivar de cualquier fuente microbiana, tal como una bacteria o hongo. Los ejemplos de enzimas glucosiltransferasa bacterianas son las derivadas de una especie de Streptococcus, especie de Leuconostoc o especie de Lactobacillus. Los ejemplos de especies de Streptococcus incluyen S. salivarius, S. sobrinus, S. dentirousetti, S. downei, S. mutans, S. oralis, S. gallolyticus y S. sanguinis. Los ejemplos de especies de Leuconostoc incluyen L. mesenteroides, L. amelibiosum, L. argentinum, L. carnosum, L. citreum, L. cremoris, L. dextranicum y L. fructosum. Los ejemplos de especies de Lactobacillus incluyen L. acidophilus, L. delbrueckii, L. helveticus, L. salivarius, L. casei, L. curvatus, L. plantarum, L. sakei, L. brevis, L. buchneri, L. fermentum y L. reuteri.

Una enzima glucosiltransferasa en el presente documento se puede producir mediante cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, una enzima glucosiltransferasa se puede producir recombinantemente en un sistema de expresión heterólogo, tal como un sistema de expresión heterólogo microbiano. Los ejemplos de sistemas de expresión heterólogos incluyen sistemas de expresión bacterianos (por ejemplo, E. co lital como TOP10 o MG1655; Bacillus sp.) y eucariotas (por ejemplo, levaduras tales como Pichia sp. y Sacaromyces sp.).

En ciertas realizaciones, un sistema de expresión de gen heterólogo puede ser uno que se diseña para la secreción de proteína. Una enzima glucosiltransferasa comprende normalmente un péptido señalizador (secuencia señalizadora) en dichas realizaciones. El péptido señalizador puede ser o su péptido señalizador nativo o un péptido señalizador heterólogo. Una enzima glucosiltransferasa en algunas realizaciones no ocurre en la naturaleza; por ejemplo, una enzima en el presente documento no se cree que sea una que es naturalmente secretada (es decir, forma madura) de un microbio (del que la enzima glucosiltransferasa en el presente documento podría haber derivado posiblemente).

Una enzima glucosiltransferasa descrita en el presente documento se puede usar en cualquier estado de purificación (por ejemplo, puro o no puro). Por ejemplo, una enzima glucosiltransferasa se puede purificar y/o aislar antes de su uso. Los ejemplos de enzimas glucosiltransferasa que no son puros incluyen aquellos en forma de un lisado celular. Un lisado o extracto celular se puede preparar a partir de una bacteria (por ejemplo, E. coli) usada para expresar de forma heteróloga la enzima. Por ejemplo, las bacterias se pueden someter a alteración usando una celda de presión French. En realizaciones alternativas, las bacterias se pueden homogeneizar con un homogeneizador (por ejemplo, APV, Rannie, Gaulin). Una enzima glucosiltransferasa normalmente es soluble en estos tipos de preparaciones. Un lisado, extracto u homogeneizado de células bacterianas en el presente documento se puede usar en aproximadamente 0,15-0,3 % (v/v), por ejemplo, en una disolución de reacción para producir alfa-glucano ramificado.

La actividad de una enzima glucosiltransferasa en el presente documento se puede determinar usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la actividad de la enzima glucosiltransferasa se puede determinar midiendo la producción de azúcares reductores (fructosa y glucosa) en una disolución de reacción que contiene sacarosa (50 g/l), dextrano T10 (1 mg/ml) y tampón fosfato de potasio (pH 6,5, 50 mM), donde la disolución se mantiene a 22-25 °C durante 24-30 horas. Los azúcares reductores se pueden medir, por ejemplo, añadiendo 0,01 ml de la disolución de reacción a una mezcla que contiene NaOH 1 N y 0,1 % de cloruro de trifeniltetrazolio y entonces monitorizando el aumento en la absorbancia a DO480nm durante cinco minutos.

La temperatura de una reacción enzimática en el presente documento se puede controlar, si se desea. En ciertas realizaciones, la temperatura de la reacción puede estar entre aproximadamente 5 °C y aproximadamente 50 °C. La temperatura en ciertas otras realizaciones puede estar entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 40 °C, o aproximadamente 20 °C y aproximadamente 30 °C (por ejemplo, aproximadamente 22-25 °C).

La concentración inicial de sacarosa en una disolución de reacción en el presente documento puede ser aproximadamente 20 g/l a aproximadamente 400 g/l, por ejemplo. Alternativamente, la concentración inicial de sacarosa puede ser aproximadamente 75 g/l a aproximadamente 175 g/l, o desde aproximadamente 50 g/l hasta aproximadamente 150 g/l. Alternativamente todavía, la concentración inicial de sacarosa puede ser aproximadamente 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 o 160 g/l (o cualquier valor entero entre 40 y 160 g/l), por ejemplo. "Concentración inicial de sacarosa" se refiere a la concentración de sacarosa en una reacción de glucosiltransferasa justo después de que todos los componentes de reacción se hayan añadido (por ejemplo, al menos el agua, la sacarosa, el dextrano, la enzima glucosiltransferasa).

La sacarosa usada en una reacción enzimática en el presente documento puede ser altamente pura (> 99,5 %) o ser de cualquier otra pureza o calidad. Por ejemplo, la sacarosa puede tener una pureza de al menos 99,0 %, o puede ser sacarosa de calidad para reactivo. Como otro ejemplo, se puede usar la sacarosa incompletamente refinada. La sacarosa incompletamente refinada en el presente documento se refiere a sacarosa que no se ha procesado en sacarosa refinada blanca. Por lo tanto, la sacarosa incompletamente refinada puede estar completamente sin refinar o parcialmente refinada. Los ejemplos de sacarosa sin refinar son "sacarosa en bruto" ("azúcar en bruto") y disoluciones de la misma. Los ejemplos de sacarosa parcialmente refinada no han pasado por una, dos, tres o más etapas de cristalización. La ICUMSA (Comisión Internacional de Métodos Uniformes de Análisis del Azúcar) de sacarosa incompletamente refinada en el presente documento puede ser superior a 150, por ejemplo. La sacarosa en el presente documento puede derivar de cualquier fuente de azúcar renovable, tal como caña de azúcar, remolacha azucarera, yuca, sorgo duce o maíz. Las formas adecuadas de sacarosa útiles en el presente documento son forma cristalina o forma no cristalina (por ejemplo, jarabe, jugo de caña, jugo de remolacha), por ejemplo.

Los métodos de determinación de los valores de ICUMSA para la sacarosa se conocen bien en la técnica y se desvelan por la Comisión Internacional de Métodos Uniformes de Análisis del Azúcar en ICUMSA Methods of Sugar Analysis: Official and Tentative Methods Recommended by the International Commission for Uniform Methods of Sugar Analysis (ICUMSA) (Ed. H.C.S. de Whalley, Elsevier Pub. Co., 1964), por ejemplo. ICUMSA se puede medir, por ejemplo, por el método de ICUMSA GS1/3-7 como se describe por R.J. McCowage, R.M. Urquhart y M.L. Burge (Determination of the Solution Colour of Raw Sugars, Brown Sugars and Coloured Syrups at pH 7.0 - Official, Verlag Dr. Albert Bartens, revisión de 2011).

El pH de una reacción enzimática en ciertas realizaciones puede estar entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 8,0, o entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 6,0. Alternativamente, el pH puede ser aproximadamente 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 u 8,0, por ejemplo. El pH se puede ajustar o controlar mediante la adición o incorporación de un tampón adecuado, que incluye, pero no se limita a: fosfato, tris, citrato, o una combinación de los mismos. La concentración de tampón en una reacción de síntesis de glucano puede ser desde 0 mM hasta aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 10, 20 o 50 mM, por ejemplo.

Se pueden usar una o más enzimas glucosiltransferasa diferentes en ciertos aspectos. Una reacción enzimática en el presente documento puede contener una, dos o más enzimas glucosiltransferasa, por ejemplo.

La presente divulgación también se refiere a un método de preparación de un copolímero de injerto de dextrano-polialfa-1,3-glucano, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto al menos (i) agua, (ii) sacarosa, (iii) dextrano con un peso molecular medio ponderal (Mw) de al menos aproximadamente 100000 dáltones, y (iv) una enzima glucosiltransferasa que sintetiza poli-alfa-1,3-glucano que comprende al menos aproximadamente 95 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos, por el cual se produce un copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano; y

(b) opcionalmente, aislar el copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano producido en la etapa (a). La etapa (a) en dicho método implica normalmente la preparación de una reacción enzimática que comprende cada uno de los componentes (i)-(iv). Cualquiera de las condiciones de reacción enzimática anteriores, y/o las desveladas en los Ejemplos que siguen, puede caracterizar la etapa (a). Por tanto, cualquiera de las siguientes condiciones de este método puede caracterizar opcionalmente una reacción enzimática en el presente documento.

Un método de síntesis de copolímero de injerto como se desvela actualmente comprende poner en contacto al menos agua, sacarosa, y ciertos componentes de dextrano y enzima glucosiltransferasa entre sí. Estos y opcionalmente otros reactivos se pueden añadir todos juntos o añadir en cualquier orden como se trata más adelante. Aunque la etapa (a) empieza normalmente con la formación de una disolución de reacción, se entendería que esta disolución se convierte en una mezcla después de la síntesis de producto insoluble de copolímero de injerto. La etapa de poner en contacto en el presente documento se puede realizar en cualquier número de formas. Por ejemplo, la cantidad deseada de sacarosa y/o dextrano se puede disolver primero en agua (opcionalmente, también se pueden añadir otros componentes en esta etapa de preparación, tales como componentes de tampón), seguido de la adición de enzima glucosiltransferasa. Una reacción así preparada se puede mantener quita, o agitar removiendo o por agitación orbital, por ejemplo. Normalmente, una reacción enzimática en el presente documento está libre de células.

La finalización de una reacción en ciertas realizaciones se puede determinar visualmente (por ejemplo, no más acumulación de producto insoluble) y/o midiendo la cantidad de sacarosa que queda en la disolución (sacarosa residual), donde un porcentaje de consumo de sacarosa de más de aproximadamente el 90 % puede indicar la finalización de la reacción, por ejemplo. Normalmente, una reacción del proceso desvelado puede necesitar aproximadamente 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 o 96 horas para completarse, que puede depender de ciertos parámetros tales como la cantidad de sacarosa y/o enzima glucosiltransferasa usada en la reacción. En algunas realizaciones, el tiempo de reacción puede ser 1,2, 3, 4 o 5 horas.

En ciertas realizaciones de un método de síntesis de copolímeros de injerto, en la etapa de poner en contacto (a) está además presente dextrano con un peso molecular medio ponderal inferior a aproximadamente 60000 dáltones, en donde el dextrano con un peso molecular medio ponderal de al menos aproximadamente 100000 dáltones (por ejemplo, cualquier Mw superior como se desvela anteriormente) se usa preferentemente como un sustrato para la síntesis de la cadena lateral por la enzima glucosiltransferasa. Por lo tanto, en ciertos casos en los que se usa un sustrato de dextrano heterogéneo (por ejemplo, PDI más de 4, o PDI de 4-15) en el que hay diversas especies de dextrano y el intervalo de Mw de estas especies abarca desde menos de 60000 dáltones (o menos de 90000, 80000, 70000, 50000 o 40000 dáltones, por ejemplo) a más de 100000 dáltones, la distribución de los productos de copolímero de injerto se inclina más hacia aquellos con un componente de dextrano de 100000 dáltones o más. Por ejemplo, se cree que al menos aproximadamente el 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % o 95 % en peso de los productos de copolímero de injerto comprende un componente de dextrano con un Mw de al menos 100000 dáltones.

Dichas realizaciones de método se pueden caracterizar opcionalmente como un método de reparto, fraccionamiento o separación de dextrano de mayor Mw de dextrano de menor Mw. Mientras que el dextrano de mayor Mw se reparte hacia copolímero de injerto insoluble, el dextrano de menor Mw queda en la fase de disolución de una reacción de glucosiltransferasa en el presente documento. En algunas realizaciones, el tiempo de reacción para que ocurra este efecto de reparto es al menos aproximadamente 12, 15, 18, 21 o 24 horas. El Mw del dextrano que se reparte en el producto insoluble de copolímero de injerto en algunos casos es aproximadamente 100000 o 150000 a aproximadamente 200000, 250000, 500000, 750000 o 1000000 dáltones.

En ciertas realizaciones, el PDI de un copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano se puede controlar en un método de síntesis de copolímeros de injerto modulando la cantidad de sustrato de dextrano que entra en una reacción enzimática (por ejemplo, ver la Tabla 7). En general, el aumentar el nivel de dextrano inicial en una reacción enzimática en el presente documento conduce a la producción de copolímero de injerto con un menor PDI, y viceversa. Por ejemplo, una reducción en el PDI del producto en aproximadamente, o al menos aproximadamente, el 5 %, 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % o 65 % se puede lograr si la concentración inicial de dextrano en una reacción enzimática se incrementa en aproximadamente, o al menos aproximadamente, el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 250 %, 500 %, 750 % o 1000 %.

En ciertas realizaciones, el Mw de un copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano se puede controlar en un método de síntesis de copolímero de injerto modulando la cantidad de sustrato de dextrano que entra en una reacción enzimática (por ejemplo, ver la Tabla 7 y FIG. 3). En general, el aumento del nivel de dextrano inicial en una reacción enzimática en el presente documento conduce a la producción de copolímero de injerto con un menor Mw, y viceversa. Por ejemplo, se puede lograr una reducción en el Mw del producto en aproximadamente, o al menos aproximadamente, el 5 %, 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 % o 50 % si la concentración inicial de dextrano en una reacción enzimática aumenta en aproximadamente, o al menos aproximadamente, el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 250 %, 500 %, 750 % o 1000 %.

El copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano producido en el método de síntesis desvelado se puede aislar opcionalmente. Por ejemplo, el copolímero de injerto insoluble se puede separar por filtración o centrifugación. Como resultado, el copolímero de injerto se separa de la mayor parte de la disolución de reacción, que puede comprender agua, fructosa y ciertos subproductos (por ejemplo, leucrosa, oligosacáridos solubles DP2-DP7, glucosa). Esta disolución también puede comprender sacarosa residual (es decir, sacarosa sin reaccionar). El aislamiento puede comprender opcionalmente además lavar un producto de copolímero de injerto una, dos o más veces con agua u otro líquido acuoso, y/o secar el producto. Dicho lavado puede usar volúmenes de lavado de aproximadamente, o al menos aproximadamente, 0,5, 1, 1,5 o 2 veces el volumen de la reacción original o de una muestra de producto, y/o implicar la filtración y/o centrifugación. El lavado en algunos aspectos, tales como filtración, puede ser por lavado con desplazamiento, en el que un lavado se pasa a través de un producto sin agitación y/o sin fuerza aplicada.

En algunas realizaciones (un "método de filtración potenciado"), el dextrano que entra en la etapa (a) de un método de síntesis de copolímeros de injerto tiene un peso molecular medio ponderal de al menos aproximadamente 50 millones de dáltones y una concentración inicial de al menos aproximadamente 2 g/l. El copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano producido en la etapa (a) en dichas realizaciones se aísla usando una etapa de filtración. El producto de copolímero de injerto en estas realizaciones tiene una mayor tasa de filtración en comparación con la tasa de filtración de un homopolímero de poli alfa-1,3-glucano u otro material de control. El Mw del dextrano de este método de filtración potenciado puede ser aproximadamente 50 millones de dáltones (o cualquier Mw mayor como se desvela en el presente documento), y/o la concentración de dextrano inicial en la reacción enzimática puede ser aproximadamente 2 g/l (o cualquier concentración mayor como se desvela en el presente documento). La filtrabilidad potenciada en el presente documento se puede referir opcionalmente a la facilidad por la que el agua y/o una disolución acuosa (por ejemplo, porción líquida de la etapa [a]) se puede filtrar (por ejemplo, gravedad solo, lavado con desplazamiento, fuerza aplicada) a través de un lecho (por ejemplo, torta húmeda) de producto insoluble de copolímero de injerto.

Un producto de copolímero de injerto en un método de filtración potenciado en el presente documento tiene una mayor tasa de filtración en comparación con la tasa de filtración de un homopolímero de poli-alfa-1,3-glucano u otro material de control. Por ejemplo, un copolímero de injerto en el presente documento puede presentar filtrabilidad que es al menos aproximadamente el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 500 %, 1000 %, 10000 % o 100000 % más rápida que la filtrabilidad del homopolímero de poli-alfa-1,3-glucano u otro material de control, en condiciones de filtración por lo demás las mismas o similares (por ejemplo, espesor de la torta húmeda, aparato de filtración). Las mediciones de filtrabilidad para la preparación de dicha comparación pueden ser en unidades de resistencia de la torta o cualquier otra medida de filtrabilidad. La resistencia de la torta (resistencia de la torta de filtración) se puede medir según Earle, RL (Unit Operations in Food Processing [Capítulo 10: Mechanical Separations], edición web, 2004, Pergamon Commonwealth e International Library) o Teoh et al. (Chem. Eng. Sci. 61:4957-4965), por ejemplo. Un homopolímero de poli-alfa-1,3-glucano en estas realizaciones puede tener DPw de aproximadamente 500, 600, 700, 800, 900 o 1000, y tener al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de enlaces alfa-1,3, por ejemplo. Otro material de control puede ser un copolímero de injerto en el presente documento que tiene el mismo tipo de dextrano que se usa en el método de filtración potenciado, pero a un contenido inferior a aproximadamente el 1,6 %, 1,5 %, 1,4 %, 1,3 %, 1,2 %, 1,1 %, 1,0 %, 0,9 % o 0,8 % en peso del copolímero de injerto.

Un producto de copolímero de injerto en un método de filtración potenciado en el presente documento puede comprender aproximadamente, o al menos aproximadamente, 2 % en peso de dextrano en algunas realizaciones. Por ejemplo, dicho copolímero de injerto puede comprender 2 %-50 %, 2 %-11 % o 2,5 %-10,5 % de dextrano en peso del copolímero. En algunos casos, un producto de copolímero de injerto puede aparecer como partículas con un diámetro promedio de aproximadamente 3,5, 3,75, 4,0, 4,25, 4,5, 4,75, 5,0, 5,25 o 5,5 mm, por ejemplo. La filtrabilidad potenciada de los copolímeros de injerto en ciertos aspectos en el presente documento representa una ventaja con respecto al homopolímero de poli-alfa-1,3-glucano, que normalmente es difícil de filtrar.

Ejemplos no limitantes de composiciones y métodos desvelados en el presente documento incluyen:

1. Una composición que comprende un copolímero de injerto que comprende:

(i) un esqueleto que comprende dextrano con un peso molecular medio ponderal (Mw) de al menos 100000 dáltones, y

(ii) cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano que comprenden al menos 95 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos, en donde el Mw individual de una o más de las cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano es al menos 100000 dáltones; en donde el copolímero de injerto es insoluble en condiciones acuosas.

2. La composición de la realización 1, en donde las cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano comprenden al menos aproximadamente 99 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos.

3. La composición de la realización 1 o 2, en donde el Mw individual de una o más cadenas laterales de polialfa-1 ,3-glucano es al menos aproximadamente 100000 dáltones.

4. La composición de la realización 1, 2 o 3, en donde el copolímero de injerto es insoluble en condiciones acuosas.

5. La composición de la realización 1,2, 3 o 4, en donde el dextrano comprende:

(i) aproximadamente 87-93 % en peso de glucosa unida en las posiciones 1 y 6;

(ii) aproximadamente 0,1-1,2 % en peso de glucosa unida en las posiciones 1 y 3;

(iii) aproximadamente 0,1-0,7 % en peso de glucosa unida en las posiciones 1 y 4;

(iv) aproximadamente 7,7-8,6 % en peso de glucosa unida en las posiciones 1,3 y 6; y

(v) aproximadamente 0,4-1,7 % en peso de glucosa unida en:

(a) las posiciones 1,2 y 6, o (b) las posiciones 1,4 y 6;

en donde el Mw del dextrano es aproximadamente 50-200 millones de dáltones.

6. La composición de la realización 5, en donde el Mw del dextrano es al menos aproximadamente 100 millones de dáltones.

7. La composición de la realización 5 o 6, en donde el dextrano es un producto de una enzima glucosiltransferasa que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7.

8. La composición de la realización 5, 6 o 7, en donde el copolímero de injerto comprende al menos aproximadamente 2,0 % en peso de dextrano.

9. La composición de la realización 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, en donde el injerto polímero tiene un valor de retención de agua (WRV) de al menos aproximadamente 100.

10. La composición de la realización 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9, en donde la composición es un producto de cuidado personal, producto doméstico, producto médico o producto industrial.

11. Una reacción enzimática que comprende (i) agua, (ii) sacarosa, (iii) dextrano con un peso molecular medio ponderal (Mw) de al menos aproximadamente 100000 dáltones, y (iv) una enzima glucosiltransferasa que sintetiza poli-alfa-1,3-glucano que comprende al menos aproximadamente 95 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos, en donde la reacción enzimática produce un copolímero de injerto según la composición de la realización 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9.

12. La reacción enzimática de la realización 11, en donde la concentración inicial de dextrano en la reacción es al menos aproximadamente 2 g/l, y en donde el Mw del dextrano es al menos aproximadamente 50 millones de dáltones.

13. Un método de preparación de un copolímero de injerto, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto al menos (i) agua, (ii) sacarosa, (iii) dextrano con un peso molecular medio ponderal (Mw) de al menos aproximadamente 100000 dáltones, y (iv) una enzima glucosiltransferasa que sintetiza poli-alfa-1,3-glucano que comprende al menos aproximadamente 95 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos, por el cual se produce un copolímero de injerto según la composición de la realización 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9; y

(b) opcionalmente, aislar el copolímero de injerto producido en la etapa (a).

14. El método de la realización 13, en donde en la etapa de poner en contacto (a) está además presente dextrano con un Mw inferior a aproximadamente 60000 dáltones, en donde el dextrano con un Mw de al menos aproximadamente 100000 dáltones se usa preferentemente como un sustrato para la síntesis de cadenas laterales por la enzima glucosiltransferasa.

15. El método de la realización 13 o 14, en donde el dextrano que entra en la etapa (a) tiene un Mw de al menos aproximadamente 50 millones de dáltones y una concentración inicial de al menos aproximadamente 2 g/l, en donde el copolímero de injerto producido en la etapa (a) se aísla, y en donde la etapa de aislamiento comprende una etapa de filtración, en donde el copolímero de injerto tiene una mayor tasa de filtración en comparación con la tasa de filtración de un homopolímero de poli-alfa-1,3-glucano.

EJEMPLOS

La presente divulgación se ejemplifica además en los Ejemplos 1-3 y 5-8. Se debe entender que estos ejemplos, aunque indican ciertos aspectos preferidos en el presente documento, se dan a modo de ilustración solo. A partir de la discusión anterior y estos ejemplos, un experto en la técnica puede determinar las características esenciales de las realizaciones desveladas, y sin apartarse del alcance de las mismas, puede hacer diversos cambios y modificaciones para adaptar las realizaciones desveladas a diversos usos y condiciones.

EJEMPLO 1

Síntesis de poli-alfa-1,3-glucano a partir de un cebador de dextrano de peso molecular alto

Este ejemplo describe la síntesis de poli-alfa-1,3-glucano con una enzima glucosiltransferasa usando dextrano comercialmente disponible con peso molecular medio ponderal alto (promedio 150 kDa) como cebador. Se produjeron copolímeros de injerto que comprendían un esqueleto de dextrano y cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano.

Se realizaron dos polimerizaciones de poli-alfa-1,3-glucano separadas con las reacciones (A y B) que comprendían agua, sacarosa (~ 100 g/l), dextrano y una enzima glucosiltransferasa basada en Streptococcus salivarius que sintetiza poli-alfa-1,3-glucano con todos o casi todos los enlaces alfa-1,3-glucosídicos. Los ejemplos de glucosiltransferasas que se usan en dichas reacciones incluyen los desvelados en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2014/0087431.

Cada una de las reacciones A y B se preparó mezclando 940 g de agua DI (desionizada), 100 g de sacarosa (OmniPur Calbiochem 8550; lote VF20C; FW 342,30) y 1,36 g de monofosfato de potasio (MW 136,09; Sigma P5379). Se midió que el pH era 5,6 usando un medidor de conductividad, y se ajustó a la baja a 5,54 usando algunas gotas de H²SO⁴1 N. Se tomó una muestra de 1 ml para el momento de punto cero de HPL^c (pre-adición de dextrano). Entonces, se añadieron 5 g y 10 g de dextrano de 150 kDa (promedio) (Sigma D4876) a las reacciones A y B, respectivamente. Se cargó 500 ml de cada reacción en matraces individuales.

Después de mezclar cada reacción a aproximadamente 190 rpm para disolver el dextrano añadido, se tomaron muestras de HPLC de 1 ml de cada reacción para el análisis del momento de tiempo cero (post-adición de dextrano). Cada reacción se dispuso en un calentador / enfriador circulante fijado a 25 °C y la agitación comenzó a 150 rpm. Se dejó que las reacciones llegaran a la temperatura (~24,4 °C) y se agitó durante aproximadamente 45 min antes de la adición de enzima. Entonces se añadió 50 U de enzima glucosiltransferasa a cada reacción.

Se tomaron muestras de filtrado (es decir, líquido separado de los productos insolubles) (1 ml) de cada una de las reacciones A y B para HPLC a las 2 h y al final de cada reacción (24 h). Las muestras se desactivaron para HPLC por extinción con calor a 90 °C durante 10 min. Las muestras se filtraron a través de filtros de PTFE de 0,45 pm y se diluyeron para el análisis de HPLC.

Se hicieron dos diluciones idénticas para las muestras de filtrado de todos los momentos de tiempo, con la excepción de las muestras de reacción B de 2 horas y 24 horas. Las muestras A 2 h, B 2 h y B 24 h fueron todas muy difíciles de filtrar a través de los filtros de PTFE de 0,45 pm. Todas las muestras se analizaron por duplicado en diversas columnas de HPLC.

Se tomó una muestra de reacción completa (50 ml) a las 2 h de cada una de las reacciones A y B y se filtró por succión para secar tanto como fuera posible a través de un filtro desechable de plástico. Antes de lavar los productos insolubles dos veces con 50 ml de agua caliente, el filtrado se retiró y se guardó por separado. Se guardaron muestras de polímero insoluble en viales de vidrio y se guardaron a 10 °C antes del análisis por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para determinar el DP (grado de polimerización) aparente, DP verdadero, IV (viscosidad inherente) aparente y IV verdadera. El exceso de polímero insoluble de cada muestra de 2 h se secó en una estufa de vacío a 60 °C bajo nitrógeno durante 3 días, y se pesó para determinar el porcentaje de sólidos.

Sacar el filtrado del polímero sintetizado con succión llevó más tiempo del esperado, y probablemente estuvo relacionado con la producción continua de polímero insoluble en el filtrado, que aún contenía sacarosa y la enzima glucosiltransferasa. Una vez se recogió todo el filtrado, se tomó una muestra de 1 ml y se desactivó para la HPLC (véase más arriba), mientras que el resto se desactivó en un baño de agua a 70-80 °C durante 15 minutos, se dejó enfriar y luego se filtró para eliminar los productos de polímero insoluble.

Entonces se puso el filtrado en tubo de diálisis (corte de peso molecular [MWCO] 14 kDa) y se dializó durante 2 días en agua corriente para retirar monosacáridos (fructosa, glucosa) y oligómeros (DP 2-7). Se formaron algunos sólidos secundarios durante la diálisis, por lo que el contenido se filtró primero y luego se evaporó en un rotovapor (rotoevaporó) dando un concentrado líquido, que se congeló en nitrógeno líquido. El concentrado congelado se liofilizó entonces durante 2-3 días, después de lo cual los sólidos secos se pesaron y se analizaron por SEC.

Después de 24 h, las suspensiones de producto de polímero creadas en cada una de las reacciones A y B se filtraron con succión. Cada filtrado se guardó por separado y se tomó una muestra de HPLC. El polímero se lavó dos veces con 500 ml de agua destilada (temperatura ambiente), después de lo cual el agua total se aspiró dejando una torta húmeda. La torta húmeda se pesó y se tomó una muestra de la misma para el análisis por SEC. Una muestra de torta húmeda (~5-6 g) se secó en el horno (60 °C durante 3 días) y se calculó el rendimiento de polímero insoluble total basándose en el peso inicial de la torta húmeda. La torta húmeda de polímero restante se congeló para después del análisis. El filtrado restante se desactivó en un baño de agua de 90 °C durante 15 min y se dializó durante 2 días en agua corriente como antes. El dializado se filtró, se rotoevaporó hasta ~80 ml, se liofilizó, se pesó y se envió para SEC. Por análisis de HPLC, la generación de monosacáridos y oligómeros (DP 2-7) fue normal y similar entre las polimerizaciones A y B. Se disolvieron las muestras de torta húmeda para análisis de SEC por agitación en DMSO/2 % de LiCI durante 10 min a temperatura ambiente.

Se proporcionan diversos aspectos de los filtrados y productos insolubles de las reacciones A y B en las Tablas 1-4 que siguen.

Tabla 1

Tabla 3

Tabla 4

El análisis de SEC del dextrano inicial usado en cada reacción mostró que estaba ramificado. Se estimó que hubo una glucosa lateral que se ramificó a partir del dextrano inicial aproximadamente cada 20 unidades monoméricas del dextrano. Cada reacción de polimerización (24 h) dio un polímero insoluble en agua con un DPw alto: ~6000 para la reacción A (10 g/l de carga de dextrano) y ~5000 para la reacción B (20 g/l de carga de dextrano) (Tabla 4). Las cadenas de poli-alfa-1,3-glucano crecieron a partir de los puntos de rama del dextrano, formando un copolímero de injerto (ver las FIG. 1 y 2).

Los análisis de degradación de dextranasa indicaron que las cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano tenían cada una un DPw de aproximadamente 1000. Brevemente, los ensayos de dextranasa se realizaron haciendo reaccionar individualmente los productos de copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano con dextranasa en una reacción tamponada (pH 5,3-5,7, temperatura ambiente, nutación) durante aproximadamente 4 días.

Por lo tanto, considerando que el dextrano inicial tenía un DPw medido de aproximadamente 1500 (Tabla 3), y cada cadena lateral tenía aproximadamente 1000 DPw, pudo haber habido en promedio aproximadamente 4-5 cadenas de poli-alfa-1,3-glucano en cada dextrano. Basándose en esta observación, parece que solo una pequeña fracción de las unidades de glucosa laterales del dextrano sirvieron para cebar la cadena lateral de la síntesis de poli-alfa-1,3-glucano (es decir, hubo probablemente solo aproximadamente 4-5 cadenas laterales, mientras que podría haber sido posible haber tenido aproximadamente 75 cadenas laterales dada la presencia de un grupo de glucosa lateral cada 20 unidades monoméricas de dextrano [DPw 1507 dividido entre 20]).

El peso molecular de dextrano recuperado en las muestras de filtrado de reacciones de 24 h fue bajo, en comparación con el peso molecular del dextrano inicial (Tabla 3). Aunque una hipótesis fue que el dextrano puede haber sido degradado por la enzima glucosiltransferasa en la reacción, se encontró que este no era el caso (véase el Ejemplo 3). Por lo tanto, era probable que el dextrano fuera eficazmente fraccionado durante la reacción, siendo usando preferentemente dextrano de mayor peso molecular como sustrato para cebar la cadena lateral de la síntesis de polialfa-1 ,3-glucano. Siguiendo este escenario, las moléculas de dextrano más grandes usadas para cebar la síntesis de copolímero de injerto insoluble se habrían retirado del conjunto soluble, dejando detrás moléculas de dextrano más pequeñas en los filtrados de reacción. Esta observación es intrigante, especialmente dado que otro trabajo (WO15/119859) sugirió que el peso molecular del dextrano no desempeñaba una función en el cebado del dextrano de la síntesis de glucano que comprende enlaces 1,3-glucosídicos por enzimas glucosiltransferasa.

Por lo tanto, se produjeron copolímeros de injerto que comprendían un esqueleto de dextrano y cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano. Es posiblemente de interés que hubo relativamente pocas cadenas laterales (4-5), considerando que, teóricamente, podrían haber sido sintetizadas al menos 10-15 veces más cadenas laterales. Por tanto, en reacciones para preparar este copolímero de injerto, parece que el dextrano de alto peso molecular, a diferencia del dextrano de menor peso molecular, es usado preferentemente como sustrato por las glucosiltransferasas que sintetizan glucano que comprenden principalmente enlaces alfa-1,3-glucosídicos.

EJEMPLO 2

Control del peso molecular y polidispersidad de productos de copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano de una reacción enzimática de glucosiltransferasa

Este ejemplo es además del Ejemplo 1, que juntos demuestran, por ejemplo, que el peso molecular y la polidispersidad del producto de copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano se pueden controlar modificando la concentración de dextrano que entra en una reacción de glucosiltransferasa enzimática.

En general, excepto como se observa más adelante, los procedimientos descritos en el Ejemplo 1 se aplicaron para sintetizar y analizar copolímeros de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano.

Brevemente, se realizaron dos reacciones de síntesis de glucano de 500 ml a aproximadamente 25 °C con 100 g/l de sacarosa y 100 U/l de una enzima glucosiltransferasa basada en S. salivarius que sintetiza poli-alfa-1,3-glucano con todos o casi todos los enlaces alfa-1,3-glucosídicos con agitación a 150 rpm. Para establecer estas reacciones, se disolvieron 100 g de sacarosa (OmniPur Calbiochem 8550) y 1,36 g de monofosfato de potasio (Sigma P5379) en 940 g de agua de grifo y se ajustó a pH 5,5 con NaOH. Se tomó una muestra de 1 ml (t=0) para el análisis de HPLC después de que la disolución se dividiera en dos porciones de 500 ml. Los matraces para las reacciones A y B se cargaron cada uno con 500 ml de la disolución de sacarosa y 1,25 g o 2,5 g, respectivamente, de dextrano de 150 kDa (promedio) (Sigma D4876). Las muestras de HPLC (t=0) se tomaron después de que se añadiera la enzima glucosiltransferasa.

2 h después de la adición de enzima, se tomaron muestras de 50 ml (disolución de reacción y producto insoluble) de cada una de las reacciones A y B y se filtraron con succión. Los filtrados se guardaron; se retiró 1 ml de cada filtrado para HPLC (t=2 h). Los productos de polímero insoluble se lavaron dos veces con 50 ml de agua caliente y se analizaron por SEC. Los filtrados se desactivaron en un baño de agua a 80 °C durante 15 min, se volvieron a filtrar y se dializaron (MWCO 14 kDa) durante 18 días en agua corriente para retirar monosacáridos (fructosa, glucosa) y oligómeros (DP 2-7).

24 h después de la adición de enzima, las suspensiones de producto de polímero creadas en cada una de las reacciones A y B se calentaron hasta 65 °C en un baño de circulación y se agitaron durante 1 h para desactivar la enzima. Las suspensiones se filtraron entonces con succión; se lavó cada filtrado y se tomó una muestra de 1 ml (t=24 h) para análisis de HPLC. El polímero se lavó, después de lo cual el agua total se aspiró dejando una torta húmeda. La torta húmeda se pesó y se tomó una muestra de la misma para el análisis por SEC. Una muestra de torta húmeda se secó en el horno (60 °C durante 3 días) y se calculó el rendimiento de producto de polímero insoluble total basándose en el peso inicial de la torta húmeda. La torta húmeda de polímero restante se congeló para el análisis posterior. El filtrado se dializó durante 17 días en agua corriente como antes. El dializado se filtró, se rotoevaporó hasta ~80 ml, se liofilizó, se pesó y se envió para SEC. Por análisis de HPLC, la generación de monosacárido y oligómero (DP 2-7) fue normal y similar entre las polimerizaciones A y B.

En las Tablas 5-7 que siguen se proporcionan diversos aspectos de los filtrados y productos insolubles de las reacciones A y B de este ejemplo.

Tabla 5

Tabla 6

Tabla 7

Cada reacción de polimerización después de 24 h en este ejemplo produjo un polímero insoluble en agua con un alto DPw de aproximadamente 7500 (Tabla 7). Las polidispersidades (Mw/Mn) de los productos de polímero insoluble fueron relativamente altas, especialmente para reacciones con menos dextrano inicial (Tabla 7), lo que indica que existe un homopolímero de poli-alfa-1,3-glucano presente en los productos insolubles, además de copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano. Dicho resultado era de esperar en un sistema privado de dextrano; de hecho, las reacciones con cantidades más altas de dextrano inicial (Ejemplo 1) dieron productos con menor polidispersidad (Tabla 7). Por lo tanto, parece que la polidispersidad de un copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano producido en el presente documento se puede controlar en función del nivel de dextrano que entra en una reacción de glucosiltransferasa.

La FIG. 3 muestra, para las reacciones de 24 h en las que la mayor parte del dextrano inicial se había consumido, la relación entre concentración de dextrano inicial y DPw del producto de copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano formado. La homopolimerización de poli-alfa-1,3-glucano sola compite con el cebado con dextrano a bajas concentraciones de dextrano, mientras que cada una de las cadenas de dextrano consigue menos injerto de glucanos a mayores concentraciones de dextrano. El peso molecular de copolímero de injerto máximo parece ser producido cuando se usan 5 g/l de dextrano (FIG 3, Tabla 7) en una reacción que tiene 100 g/l de sacarosa y 100 U/l de enzima glucosiltransferasa. Por lo tanto, parece que el peso molecular de un copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano producido en el presente documento se puede controlar en función del nivel de dextrano que entra en una reacción de glucosiltransferasa.

Por lo tanto, se produjeron copolímeros de injerto que comprendían un esqueleto de dextrano y cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano. Por tanto, el peso molecular y la polidispersidad de los productos de copolímero dextrano-poli alfa-1,3-glucano se pueden controlar modificando la concentración de dextrano que entra en una reacción de glucosiltransferasa enzimática.

EJEMPLO 3

La actividad enzimática de la glucosiltransferasa no degrada el dextrano

Este ejemplo demuestra que la glucosiltransferasa usada en los Ejemplos 1 y 2 para sintetizar el copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano no degrada el dextrano. Por lo tanto, el aparente efecto de reparto del dextrano observado en las reacciones anteriores no era debido a la degradación de dextrano de la actividad de glucosiltransferasa.

Como se describe en el Ejemplo 1, cuando la síntesis de poli-alfa-1,3-glucano con una enzima glucosiltransferasa se ceba con dextrano, el dextrano sin reaccionar recuperado tiene un peso molecular significativamente más bajo que el dextrano que se usó inicialmente en la reacción. No se sabía si el dextrano se fraccionó eficazmente en la reacción de glucosiltransferasa - reaccionando preferentemente cadenas de dextrosa más grandes para formar copolímero de dextrano-poli alfa-1,3-glucano insoluble, dejando cadenas de dextrano sin reaccionar más pequeñas en la disolución de reacción - o si la enzima glucosiltransferasa era capaz de degradar el dextrano.

El fin de este experimento era examinar si la exposición del dextrano a la enzima glucosiltransferasa usada en los Ejemplos 1 y 2 en condiciones de reacción normales, pero sin sacarosa, conduciría a una degradación del dextrano. Se disolvieron 2,5 g de dextrano de 150 kDa (promedio) (Sigma D4876) y 0,68 g de monofosfato de potasio (Sigma P5379) en 490 g de agua de grifo para proporcionar una disolución a pH 5,59. Esta disolución se agitó a 25 °C en un reactor después de lo cual se añadieron 50 U de la enzima glucosiltransferasa. Entonces se agitó la disolución a 150 rpm durante 24 h y luego se rotoevaporó de un baño de agua caliente para dejar un sólido húmedo. El sólido se recogió en 20 ml de agua destilada y la disolución turbia resultante se clarificó por succión-filtración; se retiró una cantidad muy pequeña (~0,1 g) de sólidos marrones claros. El filtrado se liofilizó para recuperar 2,87 g de dextrano, que se analizó por SEC y se comparó con el dextrano inicial (Tabla 8).

Tabla 8

Los resultados en la Tabla 8 muestran que la enzima glucosiltransferasa no degrada al dextrano en las condiciones de reacción empleadas en los Ejemplos 1 y 2 (pero sin sacarosa). Este resultado indica que el proceso enzimático de injerto de poli alfa-1,3-glucano en el dextrano actúa eficazmente fraccionando el dextrano basándose en el peso molecular como se ha descrito anteriormente.

EJEMPLO 4

Síntesis de poli-alfa-1.3-alucano a partir de dextrano de menor peso molecular (comparativo)

Este ejemplo describe la síntesis de poli-alfa-1,3-glucano con una enzima glucosiltransferasa usando un cebador de dextrano comercialmente disponible con un peso molecular medio ponderal de aproximadamente 40 kDa.

El fin de este experimento era sintetizar un copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano usando dextrano que tiene un peso molecular menor que el dextrano usado en los Ejemplos 1 y 2. El dextrano usado en este experimento tiene un peso molecular de aproximadamente 35-45 kDa, que es aproximadamente cuatro veces inferior al peso molecular del dextrano empleado en los Ejemplos 1 y 2.

Se realizó una reacción de polimerización de 1000 ml de poli alfa-1,3-glucano del siguiente modo. Se disolvieron sacarosa (100 g; OmniPur Calbiochem 8550), dextrano (10 g, 35-45 kDa, DPw = 220-280, Sigma D1662) y monofosfato de potasio (1,36 g, Sigma P5379) en 940 g de agua de grifo para dar pH 5,67. La agitación a 25 °C/150 rpm comenzó después, tras lo cual se añadieron 100 U de la glucosiltransferasa usada en los ejemplos anteriores; la agitación a 25 °C/150 rpm continuó durante 24 h. Después de 1,5 h, una muestra de producto insoluble de 50 ml se filtró con succión, se lavó y se succionó dando una torta húmeda (8,7 g) y se envió para análisis de SEC. A las 24 h, la suspensión de producto insoluble se filtró con succión y se lavó tres veces con 500 ml de agua caliente de grifo. El agua total se retiró con succión y la torta húmeda se pesó (480 g). Se tomaron muestras de torta húmeda para el análisis de SEC y la determinación del porcentaje de sólidos (7,6 % en peso), lo último se hizo por secado en horno (60 °C durante 3 días). El rendimiento del producto de dextrano-poli alfa-1,3-glucano insoluble total se calculó basándose en el peso inicial de la torta húmeda y el porcentaje de sólidos. Se determinó el perfil de peso molecular de cada producto insoluble a las 1,5 h y 12 h (Tabla 9).

Tabla 9

Basándose en el DPw medido, parece que dos o como máximo tres cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano se sintetizaron en el dextrano. Este resultado parece interesante, puesto que el dextrano (promedio 150-kDa, Ejemplo 1) aproximadamente cuatro veces mayor que el dextrano (40 kDa) usado en este ejemplo tuvo aproximadamente 4-5 cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano sintetizado en él (véase el Ejemplo 1). Si se pudieron sintetizar 2-3 cadenas laterales en un dextrano de 40 kDa, cabría haber esperado que se hubieran sintetizado aproximadamente 8-12 cadenas laterales (en lugar de 4-5) en un dextrano de 150 kDa.

Como se muestra en este ejemplo, el dextrano de aproximadamente 40 kDa se podría usar para cebar la síntesis de la cadena lateral de poli-alfa-1,3-glucano. Este resultado es digno de mención teniendo en cuenta el Ejemplo 1, que muestra que el dextrano de peso molecular similar no cebó dicha síntesis de la cadena lateral en presencia de moléculas de dextrano mayores. El efecto de reparto observado en el Ejemplo 1 (el dextrano mayor usado preferentemente para cebar las síntesis de producto insoluble, mientras que el dextrano más pequeño siguió en disolución) es aún más intrigante, dados los resultados del presente ejemplo que muestran que el dextrano de peso molecular más pequeño, cuando está solo, puede cebar la síntesis de la cadena lateral de poli-alfa-1,3-glucano.

EJEMPLO 5

Polimerización de poli-alfa-1.3-alucano a partir de cebador de dextrano de peso molecular muy alto

Este ejemplo describe la síntesis de poli-alfa-1,3-glucano con una enzima glucosiltransferasa usando dextrano con peso molecular medio ponderal muy alto (al menos 50 millones de dáltones). Se produjeron copolímeros de injerto que comprendían un esqueleto de dextrano muy grande y cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano.

Se preparó en primer lugar el dextrano con un peso molecular medio ponderal muy alto como se describe en el Ejemplo 8 que sigue, pero con una reacción enzimática que comprende 300 g/l de sacarosa. La estructura de este dextrano comprende (i) aproximadamente 87-93 % en peso de glucosa unida en las posiciones 1 y 6; (ii) aproximadamente 0,1­ 1,2 % en peso de glucosa unida en las posiciones 1 y 3; (iii) aproximadamente 0,1-0,7 % en peso de glucosa unida en las posiciones 1 y 4; (iv) aproximadamente 7,7-8,6 % en peso de glucosa unida en las posiciones 1, 3 y 6; y (v) aproximadamente 0,4-1,7 % en peso de glucosa unida en: (a) las posiciones 1, 2 y 6, o (b) las posiciones 1, 4 y 6. Este dextrano se usó en la siguiente reacción enzimática.

Se realizó una reacción de síntesis de poli-alfa-1,3-glucano de 500 ml a 25 °C con agitación a 150 rpm usando 100 g/l de sacarosa, 9,8 g/l de dextrano y 100 U/l de la glucosiltransferasa usada en los ejemplos anteriores. Para establecer esta reacción, se molió dextrano (4,9 g) en un mortero y mano de mortero y se agitó a 50 °C con 470 g de agua de grifo durante 16 h para dar una disolución turbia. Entonces se añadieron sacarosa (50 g, OmniPur Calbiochem 8550) y monofosfato de potasio (0,68 g, Sigma P5379) y se disolvió con agitación dando un pH 5,75. La disolución se agitó a 25 °C en un reactor, después de lo cual se añadió la enzima glucosiltransferasa (50 U). En aproximadamente media hora, la reacción se había convertido en una suspensión de partículas firmes y esponjosas de aproximadamente 5 mm de tamaño.

A las 2 h, se retiró una muestra de 50 ml de la reacción (las partículas de polímero obstruyeron la pipeta, por lo que no se obtuvo mucho producto insoluble). Esta muestra (una suspensión) se dejó reposar durante un par de horas antes de que se filtrara por succión, se lavara y se succionara dando una torta húmeda (1,3 g) y se enviara para análisis de SEC. La muestra no se desactivó para destruir la actividad enzimática, por lo que el poli-alfa-1,3-glucano adicional se formó probablemente antes de que se filtrara por succión. El filtrado se calentó hasta desactivar la enzima en él. La reacción continuó hasta 24 h, después de lo cual la suspensión de producto insoluble se filtró con succión; el filtrado (350 ml) se guardó y se analizó por HPLC.

El filtrado inicial se dializó haciéndolo circular a través de una membrana de flujo cruzado de celulosa regenerada PELLICON 2 PLCTK de Millipore (corte 30 kDa; 0,1 m2) a 100 ml/min y 10 psig. Esta diálisis sirvió para retirar monosacáridos y oligómeros (por el permeado) y dejar el dextrano soluble sin reaccionar en el concentrado. Se añadió continuamente agua desionizada a la alimentación de recirculación para sustituir el agua perdida hacia el permeado; por último lugar, se usaron 3500 ml de agua para lavar los monosacáridos y oligómeros. Entonces se liofilizó el concentrado para recuperar <0,1 g de dextrano sin reaccionar. Estos resultados de solo una pequeña cantidad de dextrano soluble en la reacción enzimática indican que la mayoría del dextrano se usó para cebar la síntesis de polialfa-1,3-glucano, retirando así el dextrano hacia los productos de reacción insolubles. Que no hubo efecto de reparto aparente (a diferencia del Ejemplo 1) estuvo posiblemente relacionado con el dextrano inicial que es de homogeneidad relativamente alta.

El producto insoluble (copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano) de la reacción de glucosiltransferasa se lavó tres veces con 500 ml de agua caliente de grifo; el producto consistió principalmente en partículas de 5 mm y una pequeña cantidad de finos. El agua total se retiró con succión y se pesaron las partículas húmedas (82,8 g; muestra de 24 h); se retiraron las muestras de producto para SEC y determinación del porcentaje de sólidos. Una muestra de torta húmeda (1,105 g) se secó en el horno (60 °C/2 días) para este fin. El copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano aislado comprendió aproximadamente 25 % de dextrano y 75 % de poli-alfa-1,3-glucano.

Los análisis de degradación de dextranasa (realizados como se describe en el Ejemplo 1) indicaron que las cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano del copolímero sintetizado tuvieron cada una un DPw de aproximadamente 1000. Esta estimación del peso molecular de la longitud de la cadena lateral es la misma que la observada para cadenas laterales sintetizadas a partir de dextrano de menor peso molecular (Ejemplo 1 -2).

Por lo tanto, se produjeron copolímeros de injerto que comprenden (i) un esqueleto de dextrano ramificado muy grande y (ii) cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano. Dichos copolímeros tuvieron filtrabilidad potenciada y perfiles de absorción, como se describen en los Ejemplos 6-7 que siguen.

EJEMPLO 6

Filtrabilidad del copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1.3-alucano que comprende dextrano de peso molecular muy alto

Este ejemplo describe the filtrabilidad del producto de copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano. En general, el copolímero que comprende un contenido elevado de dextrano de peso molecular muy alto fue más fácilmente separado por filtración en comparación con el copolímero con un menor contenido de dicho dextrano.

Se establecieron ocho reacciones de glucosiltransferasa (100 U/l) y se realizaron, en general, como se describe en el Ejemplo 5, pero con las siguientes modificaciones. Las reacciones se realizaron a 25 °C en reacciones de 1 l agitadas a 150 rpm usando agitadores de cinta helicoidal. La Tabla 10 enumera la cantidad de dextrano y sacarosa que entra en cada reacción. El pH de las reacciones fue 5,2-5,8 y se dejó sin ajustar. Se tomaron muestras de producto insoluble 24 h después de empezar las reacciones; estas muestras se procesaron filtrando y lavando. Las tortas húmedas resultantes se pesaron y se secó una muestra de las mismas para determinar el porcentaje de sólidos y el rendimiento. Las muestras de producto insoluble se analizaron por SEC y RMN. Los resultados de cada reacción se resumen en la Tabla 10.

Tabla 10

Como se muestra en la Tabla 10, los productos de copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano de las diferentes reacciones se caracterizaron por su filtrabilidad. En general, los copolímeros de injerto con un mayor contenido de dextrano (por ejemplo, 2,4-10,6 % en peso) aparecieron como partículas más grandes y fueron más fácilmente filtradas en comparación con sus homólogos con menor contenido de dextrano (por ejemplo, 0,9-1,4 % en peso). Las FIG. 4 y 5 muestran fotografías de muestras de copolímero de injerto que contienen 10,6 % en peso de dextrano (Tabla 10, fila 1, más filtrable) y 0,9 % en peso de dextrano (Tabla 10, fila 8, menos filtrable), respectivamente.

Resulta intrigante que la filtrabilidad del producto de copolímero de injerto dependiera, al menos en parte, del contenido de dextrano en el copolímero de injerto. Este resultado es de cierta utilidad: ahora se puede observar que incluir un dextrano de peso molecular muy alto (> 50 millones de dáltones) en una reacción de síntesis de poli-alfa-1,3-glucano puede conducir a la síntesis de un producto filtrable que comprende principalmente poli-alfa-1,3-glucano (obsérvese que el mayor contenido de dextrano era 10,6 % en peso, con otros productos filtrables con un contenido de dextrano incluso menor). Esto es una mejora con respecto al homopolímero de poli-alfa-1,3-glucano insoluble, que tiende a presentar malas cualidades de filtración. Por lo tanto, los copolímeros de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano con un contenido de dextrano (peso molecular muy alto) de al menos aproximadamente el 2,4 % en peso (y probablemente al menos aproximadamente el 2,0 % en peso), por ejemplo, pueden ofrecer ventajas económicas con respecto al homopolímero de poli-alfa-1,3-glucano en términos de su síntesis y aislamiento. Además, se puede observar de la Tabla 10 que solo una pequeña cantidad de dextrano de peso molecular muy alto en la reacción de glucosiltransferasa era necesaria para inducir este efecto. Basándose en la Tabla 10, parece que el uso de tan solo 2 g/l, por ejemplo, de dextrano de peso molecular muy alto en una reacción de glucosiltransferasa puede dar producto de copolímero de injerto más filtrable. Finalmente, este efecto sobre la filtrabilidad no se observó fácilmente con copolímeros de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano producidos en una reacción de glucosiltransferasa en la que un dextrano de menor peso molecular (150 kDa [promedio], Sigma D4876) se usó como cebador (datos no mostrados).

Por lo tanto, el copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano que comprende al menos aproximadamente 2 % en peso, por ejemplo, de dextrano de peso molecular muy alto es más filtrable en comparación con el copolímero de injerto con menor contenido de dextrano.

EJEMPLO 7

Absorción de líquido acuoso por copolímeros de injerto de dextrano-poli-alfa-1.3-alucano que comprenden dextrano de peso molecular muy alto

Este ejemplo describe los valores de retención de agua (WRV) de diversos copolímeros de injerto de dextrano-polialfa-1 ,3-glucano. Los WRV medidos con estos copolímeros son mayores que los WRV medidos con homopolímero de poli-alfa-1,3-glucano.

Se establecieron tres reacciones de glucosiltransferasa (100 U/l) y se realizaron, en general, como se describe en el Ejemplo 6, usando 100 g/l de sacarosa y dextrano a 2, 5 o 10 g/l. Estas reacciones (24 h) produjeron copolímeros de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano que comprendían, respectivamente, 95 %, 87,5 % o 75 % de enlaces alfa-1,3 glucosídicos. Este perfil de enlaces de producto está de acuerdo con los productos enumerados en las filas 1 y 3 de la Tabla 10, que se prepararon en condiciones de reacción similares (niveles iniciales de sacarosa y dextrano) (obsérvese que el componente de dextrano en cada producto grande representa enlaces alfa-1,6-glucosídicos).

Se midió el WRV de cada uno de estos productos de copolímero de injerto, y se comparó con el WRV de homopolímero de poli-alfa-1,3-glucano (DPw 800) (Tabla 11). El WRV de cada polímero se midió del siguiente modo. Se sumergió polvo de polímero secado (1 g) en 20 ml de agua DI y se dejó que se equilibrara durante 2 horas (obsérvese que el secado del polímero no implicó etapa de liofilización). El material sólido (apareció como una suspensión) se transfirió entonces a un tubo FALCON de 50 ml que contenía un inserto de filtro de PVDF de 0,45 micrómetros en la mitad superior del tubo. Entonces se centrifugó el tubo FALCON a 4500 rpm durante 20 minutos en una centrifuga EPPENDORF 5804 con rotor fijo. El inserto de filtro permitió la retirada/separación de la masa de líquido en exceso del material húmedo durante la centrifugación. La masa de material húmedo se midió entonces en una balanza, después de lo cual se secó durante la noche en un horno a 60 °C. Entonces se midió la masa seca. El WRV para cada polímero se calculó usando la siguiente fórmula: ((masa de polímero húmedo - masa de polímero seco) / masa de polímero seco) * 100.

Tabla 11

Los resultados en la Tabla 11 indican que los copolímeros de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano, incluso cuando contienen una pequeña cantidad de enlaces alfa-1,6 glucosídicos (<5 %), tienen WRV significativamente mayores en comparación con el WRV del homopolímero de poli-alfa-1,3-glucano.

Se realizaron reacciones adicionales de glucosiltransferasa (100 U/l) (24 h) como se ha descrito anteriormente, pero en las que se usaron 50 g/l de dextrano de peso molecular muy alto y diversas cantidades de sacarosa (20-200 g/l). El WRV de cada copolímero de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano sintetizado producido en estas reacciones se midió como se ha descrito anteriormente, pero con las siguientes modificaciones puesto que los productos se volvieron tipo gel tras la adición de agua (normalmente ocurrió cuando el WRV medido superó ~1000). Esta modificación del protocolo se hizo para evitar la obstrucción del filtro durante la centrifugación. Específicamente, después de añadir agua, el material hinchado se añadió a un tubo FALCON de 50 ml sin un inserto de filtro de PVDF, y se centrifugó a 4500 rpm durante 20 minutos en un EPPENDORF 5804. La fase de gel hinchada se deposita en el fondo del tubo durante esta centrifugación, y el exceso de agua se puede decantar fácilmente. Entonces se midió la masa del material húmedo en una balanza, después de lo cual se secó durante la noche en un horno a 60 °C, y el material seco se pesó. Entonces se determinó el WRV siguiendo la fórmula anterior y se proporciona en la Tabla 12.

Tabla 12

Los resultados en la Tabla 12 indican que los copolímeros de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano producidos en reacciones de glucosiltransferasa que comprenden altas cantidades de dextrano de peso molecular muy alto (50 g/l) tienen WRV potenciados.

Por lo tanto, las composiciones que comprenden copolímeros de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano son capaces de absorber líquido acuoso. Dicha absorbencia indica que es probable que estas composiciones sean adecuadas para su uso en diversos productos de cuidado personal cuyo rendimiento se basa, en parte, en la absorción de líquido acuoso (por ejemplo, pañales, ciertos productos de higiene femenina). Además, es notable que el WRV potenciado de estos materiales se logró sin la necesidad de modificaciones químicas (por ejemplo, reticulación), que de otro modo podrían convertir al material en menos adecuado para ciertas aplicaciones de cuidado personal (por ejemplo, el procesamiento químico puede dejar impurezas que se han asociado a inflamación de la piel).

EJEMPLO 8

Síntesis y análisis de dextrano con peso molecular muy alto

Este ejemplo describe la producción de dextrano con peso molecular muy alto (superior a 50 millones de dáltones). Dicho dextrano se usó en los Ejemplos 5-7 (anteriormente) para producir copolímeros de injerto de dextrano-poli-alfa-1,3-glucano con características potenciadas.

Producción de Gtf 0768

Se identificó una posible hidrolasa que contenía la repetición YG (clasificada en GENBANK con el número de GI 339480768, pero que ahora tiene el número GI 497964659) con 1484 aminoácidos de la cepa KCTC3652 de Leuconostoc pseudomesenteroides por secuenciación indiscriminada del genoma completo. Esta posible glucosiltransferasa (designada en el presente documento gtf 0768) pertenece a la familia GH70 de glicosilhidrolasas que contienen un dominio de unión a glucano. El segmento aminoterminal de 37 aminoácidos de gtf 0768 se dedujo como el péptido señalizador de la enzima por el programa SIGNALP 4.0 (Petersen et al., Nature Methods 8:785-786). La forma madura de gtf 0768 se representa por SEQ ID NO:6.

Para construir un plásmido para la expresión bacteriana de gtf 0768, se sintetizó una secuencia de ADN que codifica una forma madura de gtf sin el péptido señalizador por GenScript USA Inc. (Piscataway, NJ). La secuencia sintetizada se subclonó en los sitios Nhel y Hindlll del vector pET23D+ (NOVAGEN®; Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). 0768 gtf (SEQ ID NO:7) codificada por esta construcción incluyó una metionina de inicio y 3 aminoácidos adicionales (Ala-Ser-Ala) en el extremo N, y 6 restos de histidina en el extremo C, en comparación con la forma madura natural (predicha) de gtf 0768 (SEQ ID NO:6) (es decir, SEQ ID NO:6 está comprendida en SEQ ID NO:7). La construcción de plásmido se confirmó por secuencia y se transformó en células hospedadoras BL21 DE3 de E. coli con selección con ampicilina, dando como resultado la cepa de expresión EC0052.

Se cultivaron células de EC0052 y una cepa de control que contiene solo el vector pET23D+ vacío en medio LB con 100 pg/ml de ampicilina hasta DO600 ~0,5, y luego se indujo con IPTG 1 mM a 37 °C durante 3 horas o alternativamente se indujo a 23 °C durante la noche. Tras este periodo de inducción, las células se recogieron por centrifugación a 4000xg durante 10 min y se resuspendieron en tampón PBS a pH 6,8. Las células se lisaron entonces pasando a través de una prensa francesa a 14.000 psi (~96,53 MPa) dos veces, después de lo cual el residuo celular se sedimentó por centrifugación a 15.000xg durante 20 min. Los sobrenadantes de cada lisado celular en bruto se tomaron en alícuotas y se congelaron a -80 °C.

La actividad del lisado celular en bruto de las células EC0052 se comprobó por reacción con sacarosa. Se estableció una reacción de control similarmente usando el lisado celular preparado a partir de las células que contenían el vector vacío. Cada reacción de sacarosa se estableció usando 10 % de (v/v) de lisado celular con 100 g/l de sacarosa, citrato de sodio 10 mM a pH 5 y CaCl21 mM. Después de la incubación de las reacciones a 37 °C durante algunas horas, se formó un producto de tipo gel, que se creía que era un dextrano, en el tubo en el que el lisado celular EC0052 se había añadido. No se formó producto de tipo gel en la reacción de control. El análisis de HPLC confirmó que la sacarosa se consumió en la reacción que contenía el lisado celular EC0052, y no en la reacción de control. Este resultado sugirió que el lisado celular en bruto de EC0052 expresó la enzima activa gtf 0768, y que esta gtf produjo un producto de dextrano que tenía una alta viscosidad.

Síntesis y análisis de dextrano de peso molecular muy alto

Se establecieron reacciones que comprendían agua, sacarosa y gtf 0768, y los análisis se realizaron para determinar las características estructurales del producto de dextrano.

Reactivos para preparar la reacción de gtf:

- Sacarosa (Sigma Prod. No. S-9378).

- Disolución madre de tampón fosfato de sodio (1 M, pH 6,5, Teknova Cat No: S0276).

- Disolución de enzima Gtf 0768 (que comprende SEQ ID NO:6) (lisado celular como se preparó anteriormente).

Condiciones de reacción de Gtf:

Se preparó una reacción de 50 ml que contenía tampón fosfato de sodio 20 mM (el tampón se diluyó 50 veces con ddH2O a partir de la disolución madre 1 M, pH 6,5), 100 g/l de sacarosa y 0,1 ml de disolución de enzima gtf 0768 (que comprende SEQ ID NO:6). La reacción se agitó a 100 rpm en una estufa de incubación con agitador (Innova, modelo 4000) a 26 °C durante 43 horas; la reacción se volvió viscosa después de aproximadamente 24 horas. También se realizaron otras reacciones (24 horas) que contenían 200, 300 o 800 g/l de sacarosa (datos no mostrados).

La enzima gtf se desactivó calentando la reacción a 80 °C durante 10 minutos. Entonces se mezcló la reacción viscosa desactivada con 75 ml de 100 % de metanol para precipitar el producto viscoso. Se formó un precipitado blanco. Después de decantar cuidadosamente el sobrenadante, el precipitado blanco se lavó dos veces con 75 ml de 100 % de metanol. El producto sólido se secó a 45 °C a vacío en un horno durante 48 horas.

Se tomaron muestras (1 ml) de la reacción a las 0, 0,5, 1,2 y 24 horas, respectivamente. La enzima gtf se desactivó en cada muestra calentando a 80 °C durante 10 minutos. Cada muestra se diluyó entonces 10 veces con agua estéril. Se transfirieron 500 pl de muestra diluida a un filtro de tubo de centrifugadora (SPIN-X, nailon de 0,45 pm, tubo de polipropileno de 2,0 ml, Costar N.° 8170) y se centrifugó a 12.000 rpm en una centrífuga de mesa durante 60 minutos, después de lo cual se usaron 200 pl de flujo continuo para análisis de HPLC para medir el consumo de sacarosa durante la reacción. Se aplicaron las siguientes condiciones de HPLC para analizar cada muestra: columna (columna de hidrato de carbono AMINEX HPX-87C, 300 x 7,8 mm, Bio-Rad, N.° 125-0095), eluyente (agua), caudal (0,6 ml/min), temperatura (85 °C), detector del índice de refracción. El análisis de HPLC de las muestras indicó el consumo sustancial de sacarosa durante la reacción de 0768 gtf.

También se usó HPLC para analizar otros productos de la reacción. El rendimiento del polímero se infirió restando la cantidad de todos los otros sacáridos que quedaron en la reacción de la cantidad de sacarosa de partida. El número inferido estuvo de acuerdo con el análisis en peso seco del producto viscoso. Se cuantificaron por HPLC la sacarosa, la leucrosa, la glucosa y la fructosa con una columna HPX-87C (condiciones de HPLC como se han descrito anteriormente). Los oligosacáridos DP2-7 se cuantificaron por HPLC con las siguientes condiciones: columna (columna de hidrato de carbono AMINEX HPX-42A, 300 x 7,8 mm, Bio-Rad, N.° 125-0097), eluyente (agua), caudal (0,6 ml/min), temperatura (85 °C), detector del índice de refracción. Estos análisis de HPLC indicaron que los productos de sacárido que contenían glucosilo de la reacción de 0768 gtf consistieron en 92,3 % de producto de polímero, 1,3 % de glucosa, 5,0 % de leucrosa y 1,4 % de oligosacáridos de DP2-7.

Se usó una muestra de producto en polvo de dextrano seco (~0,2 g) de la reacción anterior para el análisis del peso molecular. El peso molecular se determinó por un método cromatográfico de inyección en flujo usando un módulo de separación Alliance™ 2695 de Waters Corporation (Milford, MA) acoplado con tres detectores en línea: un refractómetro diferencial 2414 de Waters, un fotómetro de dispersión de la luz multiángulo de 18 ángulos Heleos™-2 (MALS) con detector de dispersión cuasielástica de la luz (QELS) de Wyatt Technologies (Santa Barbara, CA) y un viscosímetro capilar diferencial ViscoStar™ de Wyatt. El polvo de dextrano seco se disolvió a 0,5 mg/ml en tampón acuoso Tris (Tris[hidroximetil]aminometano) (0,075 M) que contenía 200 ppm de NaN3. La disolución de dextrano se logró agitando durante la noche a 50 °C. Se usaron dos columnas AQUAGEL-OH GUARD de Agilent Technologies (Santa Clara, CA) para separar el pico de polímero de dextrano del pico de inyección. La base móvil para este procedimiento fue la misma que el disolvente de dextrano, el caudal fue 0,2 ml/min, el volumen de inyección fue 0,1 ml y la temperatura de la columna fue 30 °C. Se usó el software Empower™ versión 3 de Waters para la adquisición de datos y se usó el software Astra™ versión 6 de Wyatt para la reducción de datos del multidetector. Se determinó de este trabajo que el producto de polímero de dextrano tuvo un peso molecular medio ponderal (Mw) de 1,022 (+/-0,025) x 108 g/mol (es decir, aproximadamente 100 millones de dáltones) (del análisis de MALS), un radio de giro promedio z de 243,33 (+/-0,42) nm (del análisis de MALS) y un radio hidrodinámico promedio z de 215 nm (del análisis de QELS). También se determinó del análisis de QELS que el dextrano tenía una desviación estándar de la distribución del tamaño de partículas (PSD) de aproximadamente 0,259, que indica que el dextrano es probablemente polidisperso en términos de tamaño hidrodinámico.

Para fines de análisis del enlace glucosídico, se preparó una reacción de 50 ml de gtf como se ha descrito anteriormente en este ejemplo (100 g/l de sacarosa), excepto que el tiempo de reacción fue 24 horas (la reacción se volvió viscosa). La enzima gtf se desactivó calentando la reacción a 80 °C durante 10 minutos. La reacción viscosa desactivada se colocó entonces en un tubo de diálisis robusto de celulosa regenerada con un corte de peso molecular (MWCO) de 12-14 kDa (tubo de diálisis Spectra/Por® 4, pieza N.° 132706, Spectrum Laboratories, Inc.) y se dializó contra 4 l de agua filtrada a temperatura ambiente durante una semana. El agua se intercambió cada día durante este diálisis. Entonces se precipitó la reacción viscosa dializada y se secó como se ha descrito anteriormente en este ejemplo. Aproximadamente 0,2 g de polvo seco se enviaron para análisis de enlaces por CG/EM.

Se realizó análisis de enlaces según los métodos descritos por Pettolino et al. (Nature Protocols 7: 1590-1607). Brevemente, se disolvió una muestra de dextrano seco en sulfóxido de dimetilo (DMSO) o 5 % de cloruro de litio en DMSO, entonces todos los grupos hidroxilo libres se metilaron por adición secuencial de una suspensión de hidróxido sódico/DMSO seguido por yodometano. El polímero metilado se extrajo entonces en cloruro de metileno y se hidrolizó dando unidades monoméricas usando ácido trifluoroacético (TFA) acuoso a 120 °C. Entonces se evaporó el TFA de la muestra y se hizo la apertura reductora del anillo usando borodeuteruro de sodio, que también marcó el extremo reductor con un átomo de deuterio. Los grupos hidroxilo creados hidrolizando los enlaces glucosídicos se acetilaron entonces tratando con cloruro de acetilo y TFA a una temperatura de 50 °C. Finalmente, se evaporaron los reactivos derivatizantes y los monómeros metilados/acetilados resultantes se reconstituyeron en acetonitrilo y se analizaron por cromatografía de gases con espectrometría de masas (CG/EM) usando una columna de biscianopropil cianopropilfenil polisiloxano. La posición relativa de las funcionalidades metilo y acetilo, junto con la marca de deuterio, dio especies

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un copolímero de injerto que comprende:

(i) un esqueleto que comprende dextrano con un peso molecular medio ponderal de al menos 100000 dáltones, y

(ii) cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano que comprenden al menos 95 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos, en donde el peso molecular medio ponderal de una o más de las cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano es al menos 100000 dáltones;

en donde el copolímero de injerto es insoluble en condiciones acuosas.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde las cadenas laterales de poli-alfa-1,3-glucano comprenden al menos 99 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos.

3. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el dextrano comprende al menos 85 % de enlaces alfa-1,6-glucosídicos.

4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho dextrano:

(1) es un producto de una enzima glucosiltransferasa que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7; o

(2) comprende;

(i) 87-93 % en peso de glucosa unida en las posiciones 1 y 6;

(ii) 0,1-1,2 % en peso de glucosa unida en las posiciones 1 y 3;

(iii) 0,1-0,7 % en peso de glucosa unida en las posiciones 1 y 4;

(iv) 7,7-8,6 % en peso de glucosa unida en las posiciones 1,3 y 6; y

(v) 0,4-1,7 % en peso de glucosa unida en:

(a) las posiciones 1, 2 y 6, o

(b) las posiciones 1, 4 y 6;

en donde el peso molecular medio ponderal de dicho dextrano es 50-200 millones de dáltones.

5. La composición de la reivindicación 4, en donde el peso molecular medio ponderal de dicho dextrano es al menos 100 millones de dáltones.

6. La composición de la reivindicación 4, en donde dicho dextrano es dicho producto de dicha enzima glucosiltransferasa.

7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde el copolímero de injerto comprende al menos 2,0 % en peso de dextrano.

8. La composición de la reivindicación 7, en donde el copolímero de injerto comprende al menos 2,5 % en peso de dextrano.

9. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, en donde la filtrabilidad del copolímero de injerto es al menos 10 % más rápida que la filtrabilidad de copolímero de injerto que comprende menos del 1,6 % en peso del dextrano.

10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la composición es un producto de cuidado personal, producto doméstico, producto médico o producto industrial.

11. La composición de la reivindicación 10, en donde la composición es un producto para la absorción de líquido acuoso seleccionado del grupo que consiste en pañales para bebé, pantalones de aprendizaje para ir al baño, productos de incontinencia, productos de higiene femenina, apósitos cicatrizantes y compresas.

12. Una reacción enzimática que comprende (i) agua, (ii) sacarosa, (iii) dextrano con un peso molecular medio ponderal de al menos 100000 dáltones, y (iv) una enzima glucosiltransferasa que sintetiza poli-alfa-1,3-glucano que comprende al menos 95 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos,

en donde la reacción enzimática produce un copolímero de injerto según la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

13. Un método de preparación de un copolímero de injerto, comprendiendo dicho método poner en contacto al menos (i) agua, (ii) sacarosa, (iii) dextrano con un peso molecular medio ponderal de al menos 100000 dáltones, y (iv) una enzima glucosiltransferasa que sintetiza poli-alfa-1,3-glucano que comprende al menos 95 % de enlaces alfa-1,3-glucosídicos, por el cual se produce un copolímero de injerto según la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

14. El método de la reivindicación 13, que comprende además aislar el copolímero de injerto producido en la etapa de poner en contacto.

15. El método de la reivindicación 14, en donde el dextrano que entra en la etapa de poner en contacto tiene un peso molecular medio ponderal de al menos 50 millones de dáltones y una concentración de inicio de al menos 2 g/l, y en donde dicha etapa de aislamiento comprende una etapa de filtración, en donde el copolímero de injerto tiene una mayor tasa de filtración en comparación con la tasa de filtración de un homopolímero de poli-alfa-1,3-glucano.