CN111566128B - 独特形态的多糖 - Google Patents

Abstract

本文公开了包含具有α‑1，3‑糖苷键的不溶性α‑葡聚糖的聚集体的组合物。这些聚集体的平均流体动力学半径为约50nm至约300nm，并且分形维数为约1.6至约2.4。在一些公开的方面，不溶的α‑葡聚糖聚集体是树状的。还公开了制备这些组合物的方法。

Description

独特形态的多糖

本申请要求美国临时申请号62/584,150(2017年11月10日提交的)的权益，所述申请通过引用以其全文结合在此。

技术领域

本公开属于多糖材料领域。例如，本公开涉及包含具有独特形态的不溶性α-葡聚糖的聚集体的组合物。

以电子方式提交的序列表的引用

所述序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为20181106_CL6617WOPCT_SequenceListing.txt，创建于2018年11月6日，且具有约315千字节的大小，并与本说明书同时提交。包含在所述ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用并入本文。

背景技术

受到在多种应用中使用多糖的期望所驱动，研究人员已经探索了可生物降解的并且可以从可再生来源的原料经济地制造的多糖。一种这样的多糖是α-1，3-葡聚糖，其是特征在于具有α-1，3-糖苷键的不溶性葡聚糖聚合物。例如，已经使用从唾液链球菌(Streptococcus salivarius)分离的葡糖基转移酶制备了这种聚合物(Simpson等人，Microbiology[微生物学]141：1451-1460，1995)。还例如，美国专利号7000000公开了由酶促生产的α-1，3-葡聚糖制备纺成纤维。还研究了多种其他葡聚糖材料以用于开发新应用或增强的应用。例如，美国专利申请公开号2015/0232819公开了几种具有混合的α-1，3和α-1，6键的不溶性葡聚糖的酶促合成。

尽管进行了这些工作，但仍需要新形式的不溶性α-葡聚糖来提高这种材料在各种应用中的经济价值和性能特征。当前公开了包含具有独特形态特征的不溶性α-葡聚糖聚集体的组合物以解决该需求。

发明内容

在一个实施例中，本公开涉及包含不溶性α-葡聚糖的聚集体的组合物，其中所述聚集体的平均流体动力学半径为约50-300nm，并且分形维数为约1.6-2.4，并且所述不溶性α-葡聚糖包含α-1，3-糖苷键。

在另一个实施例中，本公开涉及产生本文的不溶性α-葡聚糖的聚集体的方法，所述方法包括：(a)使至少水、蔗糖和葡糖基转移酶接触，所述葡糖基转移酶以至少约40％的产率合成不溶性α-葡聚糖；和(b)制备步骤(a)中产生的不溶性α-葡聚糖的分散体。本公开还涉及包含根据该方法产生的不溶性α-葡聚糖的聚集体的组合物。

附图说明

图1：计算机模拟的由初级球形颗粒扩散形成的聚集体的典型树状结构。提供了每个结构的分形维数。在一些方面，预期此类结构至少部分地由初级棒状颗粒的聚集体形成。

表1.核酸和蛋白质SEQ ID号的汇总 ^b

^a将该DNA编码序列进行密码子优化用于在大肠杆菌(E.coli)中表达，并且仅公开为合适编码序列的实例。

^bSEQ ID NO：21-24、31、32、35-58和68-70有意不包括在本表中，并且仅作为占位符。

具体实施方式

所有引用的专利和非专利文献的公开内容通过引用以其全文并入本文。

除非另外公开，否则如本文所使用的术语“一个/一种”旨在涵盖一个/一种或多个/多种(即至少一个/一种)所引用的特征。

如果存在，所有范围是包含性的和可组合的，除非另有说明。例如，当列举“1至5”(即，1-5)的范围时，所列举的范围应解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1-2”、“1-2和4-5”、“1-3和5”等。

术语“α-葡聚糖”、“α-葡聚糖聚合物”等在本文中可互换地使用。α-葡聚糖是包含通过α-糖苷键连接在一起的葡萄糖单体单元的聚合物。在典型的实施例中，本文的α-葡聚糖包含至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的α-糖苷键。本文的α-葡聚糖聚合物的实例包括α-1，3-葡聚糖。

术语“聚α-1，3-葡聚糖”、“α-1，3-葡聚糖”、“α-1，3-葡聚糖聚合物”等在本文中可互换地使用。α-1，3-葡聚糖是包含通过糖苷键连接在一起的葡萄糖单体单元的聚合物，其中至少约30％的糖苷键是α-1，3。在某些实施例中，α-1，3-葡聚糖包含至少约90％或95％的α-1，3糖苷键。本文的α-1，3-葡聚糖中的大部分或全部其他键典型地是α-1，6，尽管一些键还可以是α-1，2和/或α-1，4。

术语“糖苷键(glycosidic linkage和glycosidic bond)”、“键(linkage)”等在本文中可互换地使用，并且是指将碳水化合物(糖)分子连接到另一基团(例如另一种碳水化合物)的共价键。如本文所使用的术语“α-1，3-糖苷键”是指通过相邻的α-D-葡萄糖环上的碳1和3将α-D-葡萄糖分子彼此连接的共价键的类型。如本文所使用的术语“α-1，6-糖苷键”是指通过相邻的α-D-葡萄糖环上的碳1和6将α-D-葡萄糖分子彼此连接的共价键。本文的葡聚糖聚合物的糖苷键(glycosidic linkage)也可以称为“糖苷键(glucosidic linkage)”。本文中，“α-D-葡萄糖”被称为“葡萄糖”。

本文的α-葡聚糖的糖苷键谱图可以使用本领域已知的任何方法确定。例如，可以使用采用核磁共振(NMR)波谱法(例如，¹³C NMR或¹H NMR)的方法确定键谱图。可以使用的这些和其他方法公开于例如，Food Carbohydrates：Chemistry，Physical Properties，and Applications[食品碳水化合物：化学、物理特性和应用](S.W.Cui编辑，第3章，S.W.Cui，Structural Analysis of Polysaccharides[多糖的结构分析]，美国佛罗里达州波卡拉顿泰勒弗朗西斯集团有限公司(Taylor&Francis Group LLC，Boca Raton，FL)，2005)，将所述文献通过引用并入本文。

本文的大α-葡聚糖聚合物的“分子量”可以表示为重均分子量(Mw)或数均分子量(Mn)，其单位为道尔顿或克/摩尔。可替代地，大α-葡聚糖聚合物的分子量可以被表示为DP_w(重均聚合度)或DP_n(数均聚合度)。较小α-葡聚糖聚合物(如寡糖)的分子量可以典型地以“DP”(聚合度)提供，所述分子量仅指α-葡聚糖内包含的葡萄糖的数量。用于计算这些不同分子量测量值的各种手段在本领域中是已知的，例如采用高压液相色谱法(HPLC)、尺寸排阻色谱法(SEC)或凝胶渗透色谱法(GPC)。

本文中，术语“蔗糖”是指由α-1，2-糖苷键连接的α-D-葡萄糖分子和β-D-果糖分子构成的非还原性二糖。通常，蔗糖被称为食用糖。蔗糖可替代地可以称为“α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-果糖呋喃糖苷”。“α-D-吡喃葡糖基”和“葡糖基”在本文可互换使用。

术语“颗粒”、“初级颗粒”等在本文可互换使用。使用以下实例中使用的技术(或类似技术)，颗粒是颗粒系统中最小的可识别单元，并且是聚集体的子单元。本文颗粒的平均尺寸为约5-25nm(纳米)。在一些方面，尺寸可指粒径和/或最长颗粒维度的长度(例如，棒状颗粒的长度)。例如，平均尺寸可以是基于至少50、100、500、1000、2500、5000或10000或更多颗粒的直径和/或最长维度的平均值。

术语“聚集体”、“颗粒聚集体”、“颗粒簇”等在本文可互换使用。聚集体是包含颗粒的物体或物质，并且通常是由颗粒在水或水溶液中的聚结/聚集(聚在一起)形成的。例如，本文的聚集体可以在颗粒在水或水溶液中分散之后形成。聚集体可包含在团聚物中。本文的聚集体的平均流体动力学半径(R_h)为约50-300nm。在一些方面，尺寸可以指聚集体的流体动力学直径(D_h)、最长的聚集体维度的直径和/或长度。例如，可以使用至少50、100、500、1000、2500、5000或10000或更多的聚集体获得任何前述平均测量值。

当前公开的聚集体的“流体动力学半径”(R_h)可以例如按照以下实例和/或美国专利申请公开号2017/0055540或2010/0056361(将其通过引用并入本文)中所述的方法通过动态光散射(DLS)来测量。DLS也可以称为光子相关光谱(PCS)或准弹性光散射。聚集体的流体动力学半径是假想的硬球的半径，其以与聚集体相同的方式扩散。由于所公开的聚集体通常是非球形的并且在运动中是动态的(翻滚)，所以进行这种测量。如果需要的话，聚集体的尺寸也可以用流体动力学直径(D_h)来表示，所述直径是其R_h值的两倍。

如本文所使用的术语“分形维数”描述聚集体结构的开放性。为了说明聚集体的分形维数如何表征其开放度，例如，考虑包含10nm颗粒的100nm聚集体是有指导意义的。如果在此实例中聚集体的分形维数为3，则聚集体中心的密度将与聚集体外围的密度相同。3的分形维数描述空间填充物体，并在内表面积方面表示封闭的结构。如果聚集体的分形维数为2，则聚集体外围的密度将比其中心的密度小十倍。如果聚集体的分形维数为1，则聚集体外围的密度将比其中心的密度小100倍。本公开的聚集体具有有高内表面积的开放结构；它们的分形维数为1.6-2.4，表明从聚集体中心到外围的密度降低。例如，平均分形维数可以基于至少50、100、500、1000、2500、5000或10000或更多聚集体的分形维数的平均值。

术语“树状”和类似术语在本文中可以任选地用于表征不溶性α-葡聚糖聚集体的树状/分支性质/结构。

在某些方面，术语“棒状”、“棒形”和类似术语可用于表征初级颗粒。棒状颗粒具有圆柱形状，其长度通常大于(例如，至少10％)其横截面直径。

如本文所使用的术语“团聚物”是指聚集体的簇。本文的团聚物的平均尺寸为约1-200微米。在一些方面，尺寸可指团聚物直径和/或最长团聚物维度的长度。例如，平均尺寸可以基于至少50、100、500、1000、2500、5000或10000或更多团聚物的直径和/或最长维度的平均值。

术语“葡糖基转移酶(glucosyltransferase)”、“葡糖基转移酶(glucosyltransferase enzyme)”、“GTF”、“葡聚糖蔗糖酶”等在本文中可互换地使用。本文的葡糖基转移酶的活性催化底物蔗糖的反应以制成产物α-葡聚糖和果糖。GTF反应的其他产物(副产物)可以包括葡萄糖、各种可溶性葡萄糖-寡糖、和明串珠菌二糖。葡糖基转移酶的野生型形式通常含有(在N-末端至C-末端方向上)信号肽(典型地被裂解过程除去)、可变结构域、催化结构域和葡聚糖-结合结构域。根据CAZy(碳水化合物活性酶)数据库(Cantarel等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]37：D233-238，2009)，将本文的葡糖基转移酶分类在糖苷水解酶家族70(GH70)下。

本文的术语“葡糖基转移酶催化结构域”是指为葡糖基转移酶提供α-葡聚糖合成活性的葡糖基转移酶的结构域。优选地，葡糖基转移酶催化结构域不需要存在任何其他的结构域以具有此活性。

术语“酶促反应”、“葡糖基转移酶反应”、“葡聚糖合成反应”、“反应组合物”、“反应制剂”等在本文中可互换地使用，并且通常指最初包含水、蔗糖、至少一种活性葡糖基转移酶和任选的其他组分的反应。典型地在葡糖基转移酶反应开始后可以进一步存在于所述反应中的组分包括果糖、葡萄糖、明串珠菌二糖、可溶性葡萄糖-寡糖(例如，DP2-DP7)(这类糖可以被认为是基于使用的葡糖基转移酶的产物或副产物)、和/或DP8或更高(例如，DP100和更高)的一种或多种不溶性α-葡聚糖产物。应当理解的是，具有聚合度(DP)为至少8或9的某些葡聚糖产物(如α-1，3-葡聚糖)是水不溶性的，并因此不溶解于葡聚糖合成反应，而是可能存在于溶液之外(例如，由于从反应中沉淀出来)。在葡聚糖合成反应中，进行了使水、蔗糖和葡糖基转移酶接触的步骤。如本文所使用的术语“在合适的反应条件下”是指通过葡糖基转移酶活性支持将蔗糖转化为一种或多种α-葡聚糖产物的反应条件。正是在这种反应过程中，最初源自输入蔗糖的葡糖基被酶促转移并用于α-葡聚糖聚合物的合成；因此，该方法中涉及的葡糖基可以任选地指葡糖基转移酶反应的葡糖基组分或部分(或类似术语)。

在本文的一些方面中，葡糖基转移酶反应中不溶性α-葡聚糖产物的“产率”表示基于转化的蔗糖的摩尔产率。可以基于不溶性α-葡聚糖产物的摩尔数除以转化的蔗糖的摩尔数来计算α-葡聚糖产物的摩尔产率。转化的蔗糖的摩尔数可以如下来计算：(初始蔗糖的质量-最终蔗糖的质量)/蔗糖的分子量[342g/mol]。该摩尔产率计算可以被认为是所述反应对α-葡聚糖的选择性的量度。在一些方面，葡糖基转移酶反应中不溶性α-葡聚糖产物的“产率”可以基于所述反应的葡糖基组分。可以使用以下公式测量这样的产率(基于葡糖基的产率)：

不溶性α-葡聚糖产率＝((IS/2-(FS/2+LE/2+GL+SO))/(IS/2-FS/2))x 100％。

可以测量葡糖基转移酶反应的果糖平衡以确保HPLC数据(如果适用)不超出范围(90％-110％被认为是可接受的)。可以使用以下公式测量果糖平衡：

果糖平衡＝((180/342x(FS+LE)+FR)/(180/342x IS))x 100％。

在上述两个公式中，IS是[初始蔗糖]，FS是[最终蔗糖]，LE是[明串珠菌二糖]，GL是[葡萄糖]，SO是[可溶性寡聚物](葡萄糖-寡糖)以及FR是[果糖]；双括号中提供的每种上述底物/产品的浓度以克/L为单位，并且如例如通过HPLC所测量的。

本文的不溶性α-葡聚糖的“饼”是指浓缩、压实、包装、挤压和/或压缩形式的制剂，其至少包含(i)约50重量％-90重量％的水或水性溶液，和(ii)约10重量％-50重量％的不溶性α-葡聚糖。在一些方面，饼可以被称为“滤饼”或“湿饼”。本文的饼通常具有软的、固体状的稠度。

术语“按体积计百分比(percent by volume)”、“体积百分比(volume percent)”、“体积％(vol％)”、“体积/体积％(v/v％)”等在本文中可互换地使用。溶质在溶液中的按体积计百分比可以使用以下公式确定：[(溶质体积)/(溶液体积)]×100％。

术语“按重量计百分比(percent by weight)”、“重量百分比(weightpercentage，wt％)”、“重量-重量百分比(weight-weight percentage，％w/w)”等在本文中可互换地使用。按重量计百分比是指当材料包含在组合物、混合物、或溶液中时，所述材料在质量基础上的百分比。

如本文所使用的术语“水性液体”、“水性流体”等可以是指水或水性溶液。本文的“水性溶液”可以包含一种或多种溶解的盐，其中在一些实施例中最大总盐浓度可以是约3.5wt％。虽然本文的水性液体通常包含水作为液体中的唯一溶剂，但水性液体可以任选地包含一种或多种可混溶于水中的其他溶剂(例如极性有机溶剂)。因此，水性溶液可以包含具有至少约10重量％的水的溶剂。

本文的“水性组合物”具有例如包含至少约10wt％水的液体组分。水性组合物的实例包括例如混合物、溶液、分散体(例如胶体分散体)、悬浮液和乳液。在某些实施例中，水性组合物可以包含本文公开的不溶性α-葡聚糖的聚集体，在这种情况下，考虑到聚集体的不溶性，可以任选地将水性组合物表征为液体中的固体组合物。

如本文中所使用的，术语“胶体分散体”是指具有分散相和分散介质的异相系统，即微观上分散的不溶性颗粒悬浮在另一种物质(例如诸如水或水性溶液水性组合物)中。本文中胶体分散体的实例是水胶体。诸如水胶体的胶体分散体的全部或一部分颗粒可以包含本公开的聚集体。术语“分散剂(dispersant)”和“分散药剂(dispersion agent)”在本文可互换地使用，是指促进分散体的形成和/或稳定的材料。

“不溶性的”、“水性不溶性的”、“水-不溶性的”葡聚糖(和相似的术语)(例如，不溶性α-1，3-葡聚糖)在水中或其他水性条件下不溶解(或不明显地溶解)，任选地其中所述水性条件的进一步特征是具有4-9(例如，pH 6-8)的pH和/或约1℃至85℃(例如，20℃-25℃)的温度。相比之下，本文的“可溶性的”、“水性可溶性的”、“水可溶性的”葡聚糖如某些寡糖等(例如，具有小于8的DP的α-1，3-葡聚糖)在这些条件下明显地溶解。

如本文中所使用的术语“粘度”是指流体(水性或非水性)抵抗趋于导致其流动的力的程度的测量值。本文可以使用的各种粘度单位包括例如厘泊(cP、cps)和帕斯卡秒(Pa·s)。一厘泊是一泊的百分之一；一泊等于0.100kg·m^-1·s^-1。

如本文所使用的关于多肽氨基酸序列的术语“序列同一性”、“同一性”等是如美国专利申请公开号2017/0002336中，将其通过引用并入本文。

作为某些实施例的特征，本文公开了各种多肽氨基酸序列和多核苷酸序列。可以使用或引用与本文公开的序列具有至少约70％-85％、85％-90％、或90％-95％同一性的这些序列的变体。可替代地，变体氨基酸序列或多核苷酸序列可以与本文公开的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。变体氨基酸序列或多核苷酸序列具有所公开的序列的相同功能/活性，或具有所公开的序列的功能/活性的至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的功能/活性。典型地，本文公开的不以甲硫氨酸开始的任何多肽氨基酸序列可以在氨基酸序列的N-末端进一步包含至少一个起始甲硫氨酸。相反，本文公开的以甲硫氨酸开始的任何多肽氨基酸序列可以任选地缺少这种甲硫氨酸残基。

术语“与……比对”、“对应于”等在本文中可互换地使用。本文的一些实施例涉及在与SEQ ID NO：62的至少一个特定氨基酸残基相对应的位置处包含至少一个氨基酸取代的葡糖基转移酶。葡糖基转移酶的氨基酸位置或其子序列(例如，催化结构域或催化结构域加葡聚糖-结合结构域)(可以将这样的氨基酸位置或序列称为“查询”位置或序列)可以被表征为与SEQ ID NO：62的特定氨基酸残基(可以将这样的氨基酸位置或序列称为“主题”位置或序列)相对应，如果(1)可以将所述查询序列与所述主题序列比对(例如，其中比对表明所述查询序列和所述主题序列【或主题序列的子序列]具有至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％同一性)，并且(2)如果直接将所述查询氨基酸位置与在(1)的比对下的主题氨基酸位置进行比对(直接排列对比)。通常，可以使用本文公开所述的任何比对算法、工具和/或软件(例如，BLASTP、ClustalW、ClustalV、Clustal-Omega、EMBOSS)将查询氨基酸序列与主题序列(SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：62的子序列)进行比对以确定百分比同一性。仅用于另外的实例，可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48：443-453，1970)将查询序列与本文的主题序列进行比对，如在欧洲分子生物学开放软件包(European Molecular Biology Open Software Suite，EMBOSS[例如，版本5.0.0或更新]，Rice等人，Trends Genet.[遗传学趋势]16：276-277，2000)的Needle程序中所执行的。这种EMBOSS比对的参数可以包含，例如：空位开放罚分10、空位扩展罚分0.5、EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。

本文中SEQ ID NO：62的特定氨基酸残基的编号是相对于SEQ ID NO：62的全长氨基酸序列而言的。SEQ ID NO：62的第一个氨基酸(即，位置1，Met-1)位于信号肽的起始处。除非另有公开，否则本文的取代是相对于SEQ ID NO：62的全长氨基酸序列而言的。

本文的“非天然葡糖基转移酶”(可替代地，“突变体”、“变体”、“经修饰的”等术语同样可用于描述这样的葡糖基转移酶)在与SEQ ID NO：62的特定氨基酸残基相对应的位置处具有至少一个氨基酸取代。在大多数情况下，这样的至少一个氨基酸取代代替正常地(天然地)存在于非天然葡糖基转移酶的天然对应物(亲本)中相同位置处的一个或多个氨基酸残基。正常地出现在天然对应物葡糖基转移酶的相关位点的氨基酸通常与进行比对的SEQID NO：62的特定氨基酸残基相同(或与之保持一致)。相对于其天然对应物序列，非天然葡糖基转移酶任选地可以具有其他氨基酸变化(突变、缺失和/或插入)。

在本文中阐明取代/比对可能是有益的。SEQ ID NO：12(GTF 0544)是表兄链球菌葡糖基转移酶的截短形式。应注意，SEQ ID NO：12的Leu-193与SEQ ID NO：62的Leu-373相对应(比对未显示)。例如，如果SEQ ID NO：12在位置193处突变以用不同的残基(例如，Gln)取代Leu残基，那么可以这样说SEQ ID NO：12的位置193突变的版本表示在与SEQ ID NO：62的Leu-373相对应的位置处具有氨基酸取代的非天然葡糖基转移酶。

术语“分离的”意指呈自然界中不存在的形式或在自然界中不存在的环境中的物质(或过程)。分离的物质的非限制性实例包括任何非天然存在的物质，如本文的不溶性α-葡聚糖的聚集体或颗粒(以及用于制备任何这些材料的酶促反应和其他过程)。据信本文公开的实施例是合成的/人造的(除了人为干预/参与之外不可能制造)，和/或具有非天然存在的特性。

如本文所使用的术语“增加的”可以是指比所述增加的数量或活性与之进行比较的数量或活性多至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、50％、100％或200％的量或活性。术语“增加的”、“提高的”、“增强的”、“大于”、“改进的”等在本文中可互换地使用。

需要新形式的不溶性α-葡聚糖来提高这种材料在各种应用中的经济价值和性能特征。当前公开了包含具有独特形态特征的不溶性α-葡聚糖聚集体的组合物以解决该需求。

本公开的一些实施例涉及包含不溶性α-葡聚糖的聚集体的组合物，其中所述聚集体的平均流体动力学半径为约50-300nm(纳米)，并且分形维数为约1.6-2.4，并且其中所述不溶性α-葡聚糖包含α-1，3-糖苷键。所公开的聚集体的分形维数范围表明它们具有高的内表面积，这反过来表明所公开的聚集体可用于例如利用高内表面积的应用。

本文中聚集体的平均流体动力学半径为约50-300nm。在一些方面，聚集体的平均流体动力学半径为约50、60、70、80、90、95、100、105、110、115、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、50-300、50-250、50-200、50-150、60-140、60-130、60-120、60-115、60-110、60-105、60-100、70-130、70-120、70-115、70-110、70-105、70-100、80-130、80-120、80-115、80-110、80-105、80-100、90-130、90-120、90-115、90-110、90-105、90-100、100-130、100-120、100-115、100-110或100-105nm。然而在一些方面，聚集体的平均流体动力学半径可以为约或高达约300、350、400、450或500nm(即流体动力学直径分别为600、700、800、900或1000nm)(或介于两者之间的任何范围)。平均流体动力学半径可以例如按照以下实例所述和/或如美国专利申请公开号2017/0055540或2010/0056361(将其通过引用并入本文)中所述的方法通过动态光散射(DLS)来测量。在一些方面，聚集体的流体动力学半径可以通过施加剪切力(例如，使用超声仪)破坏不溶性α-葡聚糖的分散体(例如，约0.05-0.15或0.1mg/mL)后测量，所述剪切力的比能为约(或至少约)8、9、10、11或12kJ/kg(例如，约30-50、35-45或40分钟)。可以在结束施加剪切力后立即(例如，在1-5或1-10分钟内)，或例如在约1、3、6、12、18、24、30、36、42或48小时内进行此测量。可以使用本领域已知的任何合适技术来测量一些其他或替代方面的聚集体的尺寸，例如电子显微镜(透射电镜[TEM]或扫描电镜[SEM])、原子力显微镜(AFM)、小角度X射线散射(SAXS)、小角中子散射(SANS)、光散射和/或通过采用以下实例中公开的技术。

本文的不溶性α-葡聚糖的聚集体的分形维数为约1.6-2.4。在一些方面，分形维数可以为约1.6、1.7、1.8。1.9、1.95、2.0、2.05、2.1、2.2、2.3、2.4、1.6-2.4、1.7-2.4、1.8-2.4、1.9-2.4、1.95-2.4、2.0-2.4、1.6-2.3、1.7-2.3、1.8-2.3、1.9-2.3、1.95-2.3、2.0-2.3、1.6-2.2、1.7-2.2、1.8-2.2、1.9-2.2、1.95-2.2、2.0-2.2、1.6-2.1、1.7-2.1、1.8-2.1、1.9-2.1、1.95-2.1、2.0-2.1、1.6-2.05、1.7-2.05、1.8-2.05、1.9-2.05、1.95-2.05、或2.0-2.05。分形维数可以使用本领域已知的任何合适技术来测量，例如散射(光散射，X射线散射[例如，SAXS]或中子散射[例如，SANS])和/或通过采用下面的实例中公开的技术来测量。本文的聚集体可以任选地被表征为形状/形态平坦；通常，分形维数越接近2.0(从2.0以上开始接近)，形状越平坦。在一些方面，可以关于流体动力学半径为约10-150、10-125、10-110或10-100nm的聚集体来测量分形维数；然而，如果需要的话，也可以测量上述列出的任何流体动力学半径(或其范围)(例如，至多500nm)的聚集体的分形维数。

在一些方面，聚集体是树状的，因此具有树状或分支结构。例如，聚集体的树状性质可以如图1所描绘。预期该树状是由形成聚集体的不溶性α-葡聚糖颗粒的分形组织产生的。例如，可以通过显微镜(例如，透射电子显微镜[TEM]，如低温TEM[a.k.a.cryo-TEM])和/或通过采用以下实例中公开的技术来检测本文的聚集体的树状。

本文的聚集体具有高表面积。可以预期，在一些方面，聚集体的表面积为约或至少约为100、125、150、175、200、225、250、275、300、150-250、150-225、175-250或175-225m²/g。在一些特定方面，表面积表征包含平均尺寸为约13-17nm(例如约15nm)的颗粒的聚集体。

本文的聚集体包含不溶性α-葡聚糖的颗粒(初级颗粒)。例如，这些颗粒的平均尺寸可以为约5-25nm。在一些方面，不溶性α-葡聚糖颗粒的平均尺寸可以为约5、10、15、20、25、10-20、10-18、10-16、12-20、12-18、12-16、14-20、14-18或14-16nm。可以使用本领域中已知的任何合适的技术(例如，如上述用于测量聚集体尺寸的技术，如SAXS)和/或通过采用以下实例中公开的技术来测量粒度。在一些方面，聚集体由不溶的α-葡聚糖颗粒组成。颗粒可以是例如球形和/或棒状的。在一些方面，可以预期，约0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的本文的聚集体颗粒是(i)球形，(ii)棒状或，加起来为约80％、85％、90％、95％或100％的(i)和(ii)的组合。在一些方面，初级粒度(例如，直径)可以使用小角度散射来测量(例如，具有经受普遍拟合的数据，如根据Beaucage[1995，J.Appl.Cryst.[应用晶体学杂志]28：717-728，将其通过引用并入本文])计算颗粒的回转半径(R_g)，然后将其用于以下方程式以计算粒径(D)：

在目前公开的任何水性环境中，当经受具有高达数MJ/kg(例如，预期高达3、4、5、6、7或8MJ/kg)的比能的剪切力时(例如，长达30-40分钟)，聚集体通常难以被破坏(通常抗撕裂)；例如，可以预期的是，当经受本文的剪切力时，高达80％、85％、90％或95％的聚集体不被破坏成为初级颗粒。

本文颗粒中的不溶性α-葡聚糖的单个分子的重均聚合度(DPw)均为约或至少为约，例如100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、200-1200、400-1200、600-1200、200-1000、400-1000或600-1000。在一些方面，颗粒中可以存在约6、7、8、9、10、11、12、6-12或8-12个不溶性α-葡聚糖单个分子；该分子数通常取决于单个分子DPw和粒子的尺寸(例如，14-16nm的粒子可以有10个分子，每个分子为800DPw)。

在某些实施例中，组合物可包含目前公开的聚集体的团聚物。团聚物的平均尺寸可以为约1、5、10、25、50、75、90、100、110、125、150、200、250、300、350、400、1-200、2.5-200、5-200、7.5-200、1-150、2.5-150、5-150、7.5-150、1-125、2.5-125、5-125、7.5-125、1-110、2.5-110、5-110、7.5-110、1-100、2.5-100、5-100、7.5-100、1-90、2.5-90、5-90、7.5-90、1-50、5-50、10-50或25-50微米。在目前公开的任何水性环境中，本文的团聚物通常可通过例如比能为约(或至少约)8、9、10、11或12kJ/kg的剪切力进行破碎/破坏/撕碎(例如，约3、4、5、6、8或10分钟)来产生较小的团聚物或组成的聚集体。反过来，去除这种剪切力后，聚集体可以重新组装成团聚物。在一些方面，本文公开的团聚物尺寸值表示使用合适的粒度分析仪(例如，基于光散射)(例如

(Malvern))所测量的和/或在以下实例中所述的粒度分布的中值直径(D50)。在一些方面，团聚物尺寸是针对未破怀的(例如，未超声处理的)团聚物测量的。

本公开的聚集体包含具有α-1，3-糖苷键的不溶性α-葡聚糖。在一些方面，不溶性α-葡聚糖的组成糖苷键的至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、或100％(或在50％与100％之间的任意整数)是α-1，3键。在一些方面，因此，不溶性α-葡聚糖具有小于约50％、40％、30％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、或0％(或在0％与50％之间的任意整数值)的不是α-1，3的糖苷键。典型地，不是α-1，3的糖苷键大部分是或全部是α-1，6。应当理解的是，在α-葡聚糖中存在的α-1，3键的百分比越高，α-葡聚糖是线性的可能性就越大，因为在聚合物中形成分支点的某些键发生率较低。因此，具有100％的α-1，3键的不溶性α-葡聚糖据信是完全线性的。在某些实施例中，作为聚合物中糖苷键的百分比，不溶性α-葡聚糖不具有分支点或具有小于约5％、4％、3％、2％、或1％的分支点。分支点的实例包括源自α-1，3-连接的主链的α-1，6、-1，2和-1，4分支点。

在一些方面，本文的不溶性α-葡聚糖可具有DPw或DPn为约或至少约100的分子量。在一些实施例中，DPw或DPn可以是约或至少约100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、或1200(或在100与1200之间的任意整数)。α-葡聚糖的DPw或DPn可以任选地表示为这些值中的任意两个之间的范围(例如，100-1200、400-1200、700-1200、100-1000、400-1000、700-1000)。

本文的α-葡聚糖在非苛性水性系统中是不溶性的，例如本文的葡糖基转移酶反应的那些条件(例如，pH 4-8，参见以下)。通常，在本文的水性环境中葡聚糖聚合物的溶解度与其键谱图、分子量、和/或支化度相关。例如，在DPw为8及以上，在水性条件下，在20℃下，具有≥95％的1，3键的α-1，3-葡聚糖通常是不溶性的。通常，随着分子量增加，α-1，3-葡聚糖不溶性要求的α-1，3键的百分比降低。

在一些实施例中，不溶性α-葡聚糖可以包含至少约30％的α-1，3-键和一定百分比的α-1，6-键，这使得α-1，3键和α-1，6键两者在α-葡聚糖中的总和达到100％。例如，α-1，3键和α-1，6键的百分比可以分别是约30％-40％和60％-70％。在一些方面，包含至少约30％的α-1，3键的不溶性α-葡聚糖是线性的。用于生产包含至少约30％的α-1，3键的不溶性α-葡聚糖的葡糖基转移酶公开于美国专利申请公开号2015/0232819中，将其通过引用并入本文。

在一些实施例中，不溶性α-葡聚糖可以呈共聚物(例如，接枝共聚物)的形式，所述共聚物具有(i)包含右旋糖酐的主链(例如，具有至少约95％、96％、97％、98％、99％、或100％的α-1，6键)，其分子量为至少约100000道尔顿，和(ii)α-1，3-葡聚糖侧链，其包含至少约95％、96％、97％、98％、99％、或100％的α-1，3-糖苷键。此类共聚物可以如国际专利申请公开号WO 2017/079595中所公开的，将其通过引用并入本文。

例如，可以将前述键谱图和/或分子量谱图中的任一种在本文中进行合并以适当地表征本文的不溶性α-葡聚糖。在一些方面，此类α-葡聚糖的键和/或分子量谱图可以是如在以下出版物中的任一个中公开的，将这些出版物全部通过引用并入本文：美国专利号7000000和8871474，美国专利申请公开号2015/0232819，国际专利申请公开号WO 2017/079595。前述实施例的不溶性α-葡聚糖可以是例如以下公开的任何葡聚糖合成反应和后反应过程的产物。

本文的不溶性α-葡聚糖不包含水可溶性的交替糖(alternan)(交替的1，3键和1，6键)。本文的不溶性α-葡聚糖典型地是在惰性器皿中酶促衍生的(典型地在无细胞条件下)，并且未衍生自细胞壁(例如，真菌细胞壁)。

本公开的某些实施例涉及产生(制备)如本文所述的不溶性α-葡聚糖的聚集体的方法。这样的方法包括：(a)使至少水、蔗糖和葡糖基转移酶接触，所述葡糖基转移酶以至少约40％的产率合成不溶性α-葡聚糖；和(b)制备步骤(a)中产生的不溶性α-葡聚糖的分散体。步骤(a)可以任选地表征为包括制备/提供葡糖基转移酶反应或反应组合物。步骤(a)可以使用葡糖基转移酶，其产生如上所公开的任何不溶性α-葡聚糖分子(例如，≥90％或≥95％的α-1，3-键)。分散步骤(b)产生在步骤(a)中合成的不溶性α-葡聚糖的聚集体。

如目前公开的葡糖基转移酶反应包括至少使水、蔗糖以及产生不溶性α-葡聚糖的本文的葡糖基转移酶接触。如下文的讨论，可以将这些和任选地其他试剂一起添加或按任何顺序添加。本文的接触步骤能以任何数目的方式进行。例如，可以首先将所希望的量的蔗糖溶解在水中(任选地，也可以在这个制备阶段添加其他组分，例如缓冲液组分)，接着添加葡糖基转移酶。溶液可以保持静止，或经由例如搅拌或轨道振摇而搅动。葡糖基转移酶反应可以通过分批、补料分批、连续模式或通过这些模式的任何变化来进行。

在某些实施例中，反应的完成可以目视地确定(例如，无更多的不溶性α-葡聚糖积累)，和/或通过测量溶液中剩余的蔗糖的量(残余的蔗糖)来确定，其中至少约90％、95％或99％的蔗糖消耗百分比可以表示反应完成。在一些方面，当其蔗糖含量是或低于约2-5g/L时，反应可被视为完成。例如，可以将所公开方法的反应进行约1小时至约2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、48、60、72、96、120、144或168小时。可将反应任选地终止和/或以其他方式处理以中止葡糖基转移酶活性，例如，通过将其加热到至少约65℃持续至少约30-60分钟。

如果需要，可以控制本文的反应组合物的温度，并且可以是例如约5℃-50℃、20℃-40℃、30℃-40℃、20℃-30℃、20℃-25℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃。

本文的反应组合物中的蔗糖的初始浓度可以是例如约20-400g/L、75-175g/L或50-150g/L。在一些方面，初始蔗糖浓度是至少约50、75、100、150或200g/L，或是约50-600g/L、100-500g/L、50-100g/L、100-200g/L、150-450g/L、200-450g/L或250-600g/L。“蔗糖的初始浓度”是指在反应组合物中刚刚在已经添加/合并所有反应组分(例如，至少水、蔗糖、葡糖基转移酶)之后的蔗糖浓度。

在某些实施例中，反应组合物的pH可以是约4.0-9.0、4.0-8.5、4.0-8.0、5.0-8.0、5.5-7.5、或5.5-6.5。在一些方面，pH可以是约4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0。可以通过添加或掺入适合的缓冲液来调节或控制pH，所述缓冲液包括但不限于：磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸盐、或其组合。在本文的反应组合物中的缓冲液浓度可以是例如约0.1-300mM、0.1-100mM、10-100mM、10mM、20mM或50mM。

葡糖基转移酶反应可以包含在适合用于应用本文公开的反应条件中的一种或多种的任何器皿(例如，惰性器皿/容器)中。在一些方面，惰性器皿可以是不锈钢、塑料、或玻璃的(或包含这些组分中的两种或更多种)并且具有适合于容纳特定反应的尺寸。例如，惰性器皿的体积/容量(和/或本文的反应组合物的体积)可以是约或至少约1、10、50、100、500、1000、2500、5000、10000、12500、15000、或20000升。惰性器皿可以任选地配备有搅拌装置。例如，任何前述特征可用于表征本文的分离反应。

本文的反应组合物可以含有例如一种、两种、或更多种不同葡糖基转移酶。在一些实施例中，仅一种或两种葡糖基转移酶包含在反应组合物中。本文的葡糖基转移酶反应可以是并且典型地是不含细胞的(例如，无全细胞存在)。

适用于合成本文的不溶性α-葡聚糖的其他条件和/或组分的实例公开于美国专利申请公开号2014/0087431、2017/0166938和2017/0002335中，将其通过引用并入本文。

本文的葡糖基转移酶以至少约40％的产率合成不溶性α-葡聚糖。在一些方面，葡糖基转移酶的不溶性α-葡聚糖的产率可以为约或至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或96％。在一些方面，可以基于所述反应中的葡糖基组分测量产率。因此，步骤(a)可以任选地表征为使用葡糖基转移酶，所述酶以基于反应组合物的葡糖基组分的至少约40％的产率合成不溶性α-葡聚糖。在一些方面，产率可以使用HPLC或NIR光谱法测量。例如，可以在进行约16-24小时(例如约20小时)的反应中获得产率。

本文以至少约40％的产率合成不溶性α-葡聚糖的葡糖基转移酶的实例包括如下所述的某些非天然葡糖基转移酶。例如，非天然葡糖基转移酶可以(i)包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、26、28、30、34或59具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的氨基酸序列，或由其组成，并且(ii)具有至少一个氨基酸取代，其使非天然葡糖基转移酶具有以至少40％的产率产生不溶性α-葡聚糖的能力(合适取代的实例如下所述)。下表2中提供了有关具有上述氨基酸序列的葡糖基转移酶的不溶性α-葡聚糖产物的某些信息。本文的非天然葡糖基转移酶通常具有亲本对应物(例如天然和/或未取代的)，其不溶性α-葡聚糖产率例如小于约33％、32％、31％、30％、29％、28％或27％。

表2.GTF酶和相关的α-葡聚糖产物 ^a

^a如下进行GTF反应和产物分析。制备包含蔗糖(50g/L)、磷酸钾缓冲液(pH 6.5，20mM)和GTF酶(2.5体积百分比％细菌细胞提取物；按与美国专利号8871474中公开的程序类似的方式，根据美国申请公开号2017/0002335制备的提取物)的反应。在22℃-25℃24-30小时后，通过离心收获不溶性产物，用水洗涤三次，用乙醇洗涤一次，并在50℃干燥24-30小时。示出了每种不溶性产物的大致的键和DP_n。分别通过¹³C NMR和SEC确定键和DP_n。

在一些方面，非天然葡糖基转移酶包含至少一个对应于表3中的取代(以下，实例1)的氨基酸取代，其与至少40％的不溶性α-葡聚糖产率相关(这样的至少一个取代的位置编号与SEQ ID NO：62的位置编号相对应)。在一些方面，非天然葡糖基转移酶包含一组与表4或表5中的取代相对应的氨基酸取代(下文，实例1)，其与至少40％的不溶性α-葡聚糖产率相关(这组取代的位置编号与SEQ ID NO：62的位置编号相对应)。

在一些方面，非天然葡糖基转移酶(i)包含至少一个氨基酸取代或一组氨基酸取代(如上所述)，并且(ii)包含与SEQ ID NO：4的氨基酸残基55-960、SEQ ID NO：65的残基54-957、SEQ ID NO：30的残基55-960、SEQ ID NO：28的残基55-960、或SEQ ID NO：20的残基55-960具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的葡糖基转移酶催化结构域，或由其组成。例如，据信这种非天然葡糖基转移酶能够产生水不溶性的α-葡聚糖，并且包含至少约50％(例如，≥90％或≥95％)的α-1，3键，并且任选地进一步具有至少100的DP_w。例如，应注意具有SEQ ID NO：65的氨基酸位置54-957的葡糖基转移酶可以产生具有100％α-1，3键和DP_w为至少400的α-1，3-葡聚糖(数据未显示，参考美国专利申请公开号2017/0002335的表6，将这些申请通过引用并入本文)。进一步注意到SEQ ID NO：65(GTF 7527)、30(GTF 2678)、4(GTF 6855)、28(GTF 2919)和20(GTF 2765)各自表示一种葡糖基转移酶，所述葡糖基转移酶与其各自的野生型对应物相比缺少信号肽结构域以及全部或大部分的可变结构域。因此，这些葡糖基转移酶中的每一个具有催化结构域，之后是葡聚糖结合结构域。催化结构域序列在这些酶中的大致位置如下：7527(SEQ IDNO：65的残基54-957)、2678(SEQ ID NO：30的残基55-960)、6855(SEQ ID NO：4的残基55-960)、2919(SEQ ID NO：28的残基55-960)、2765(SEQ ID NO：20的残基55-960)。GTF 2678、6855、2919和2765的催化结构域(大致)的氨基酸序列分别与GTF 7527的大致催化结构域序列(即，SEQ ID NO：65的氨基酸54-957)具有约94.9％、99.0％、95.5％和96.4％的同一性。这些具体的葡糖基转移酶(GTF 2678、6855、2919和2765)中的每一个可以产生具有100％α-1，3键和DP_w为至少400的α-1，3-葡聚糖(数据未显示，参考美国专利申请公开号2017/0002335的表4)。基于前述催化结构域的活性和关联性(高百分比同一性)，预期具有前述催化结构域之一的本文的非天然葡糖基转移酶可以产生包含至少约50％(例如，≥90％或≥95％)α-1，3键和DP_w为至少100的α-葡聚糖，这些催化结构域进一步具有如目前公开的至少一个氨基酸取代。

在一些方面，非天然葡糖基转移酶(i)包含至少一个氨基酸取代或一组氨基酸取代(如上所述)，并且(ii)包含与SEQ ID NO：62或其子序列，如SEQ ID NO：4(无其起始甲硫氨酸)或SEQ ID NO：4的位置55-960(大致催化结构域)具有至少约40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、69％、70％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的氨基酸序列，或由其组成。

本文的非天然葡糖基转移酶可以衍生自微生物来源，如细菌。细菌葡糖基转移酶的实例是衍生自链球菌属物种、明串珠菌属(Leuconostoc)物种或乳杆菌属(Lactobacillus)物种的那些。链球菌属物种的实例包括唾液链球菌、表兄链球菌、牙链球菌、汗毛链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)和血链球菌。明串珠菌属物种的实例包括肠膜明串珠菌(L.mesenteroides)、阿米巴氏明串珠菌(L.amelibiosum)、阿根廷明串珠菌(L.argentinum)、肉明串珠菌(L.carnosum)、柠檬明串珠菌(L.citreum)、乳脂明串珠菌(L.cremoris)、葡聚糖明串珠菌(L.dextranicum)和果糖明串珠菌(L.fructosum)。乳杆菌属物种的实例包括嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、干酪乳杆菌(L.casei)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、植物乳杆菌(L.plantarum)、清酒乳杆菌(L.sakei)、短乳杆菌(L.brevis)、布赫内氏乳杆菌(L.buchneri)、发酵乳杆菌(L.fermentum)和罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)。

本文的聚集体的产生方法的步骤(b)包括制备步骤(a)中产生的不溶性α-葡聚糖的分散体。该分散体例如可以是胶体分散体。由步骤(a)的葡糖基转移酶反应产生的不溶性α-葡聚糖可以例如从反应中除去，然后使用任何合适的方法分散在水或水溶液中。在一些方面，可以通过使用任何合适的方法施加高剪切来进行这种分散。高剪切可以为约或至少约8、9、10、11或12kJ/kμ比能的剪切，和/或可以包括以约或高达约3000、4000、6000、8000、10000、12000、14000或15000rpm混合。例如，可以施加约3、4、5、6、8或10分钟的高剪切。施加高剪切的合适方法包括，例如，使用合适的分散工具，例如分散器、超声仪(例如超声发生仪)、均质混合器、均质器(例如转子或活塞、旋转定子)、微流化器、行星式混合器、胶体磨、喷射磨、涡旋、和/或以下实例和/或国际专利申请公开号WO 2016/126685或WO 2016/030234，美国专利号5767176、6139875或8722092，或美国专利申请公开号2017/0055540或2018/0021238中所述的任何方法，将这些出版物全部通过引用并入本文。

通常分离在本公开方法的步骤(a)中产生的不溶性α-葡聚糖，然后将不溶性α-葡聚糖分散在步骤(b)中以获得聚集体。在某些实施例中，分离不溶性α-葡聚糖至少可包括进行离心和/或过滤的步骤。分离可以任选地进一步包括用水或其他水性液体(例如，使用本文的水溶液)洗涤不溶性α-葡聚糖一次、两次或多次。例如，洗涤体积可任选地是用于产生不溶性α-葡聚糖的葡糖基转移酶反应体积的至少约10％-100％。根据期望，可以通过各种方式进行洗涤，如通过置换或再制浆洗涤。本文的分离不包括干燥不溶性α-葡聚糖。

在一些方面，制备不溶性α-葡聚糖的分散体可以包括：制备在步骤(a)的葡糖基转移酶反应中产生的不溶性α-葡聚糖的湿饼，并将所述湿饼分散在水或水溶液中。分离用于湿饼制备的不溶性α-葡聚糖可以至少包括进行离心(即湿饼是沉淀的(pelleted)葡聚糖)和/或过滤(即湿饼是过滤的葡聚糖)的步骤。例如，可以使用漏斗、过滤器(例如，表面过滤器如转筒真空过滤机、错流过滤器、筛滤器、带式过滤器、螺旋压力机、或具有或不具有膜挤压能力的压滤机；或深度过滤器如砂滤器)和/或离心获得本文的湿饼；例如，可以通过重力、真空或压滤进行过滤。湿饼分离可以任选地进一步包括如上所述的洗涤。本文的湿饼可包含例如至少(i)约50重量％-90重量％的水或水性溶液，和(ii)约10重量％-50重量％的不溶性α-葡聚糖。在一些方面，湿饼可包含例如约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、10-50、10-40、10-30、10-20、20-50、20-40、20-30、30-50、30-40、40-50、30-45、35-45、37.5-42.5、35-40或40-45wt％的不溶性α-葡聚糖(水或水溶液的加起来为100wt％)。在一些方面，湿饼的水性部分具有如本文针对水溶液所述的溶质和/或pH分布。

例如，本公开的组合物可以包含如上述方法产生的不溶性α-1，3-葡聚糖的聚集体。

例如，本文的不溶性α-葡聚糖的聚集体可以以约或至少约0.01wt％、0.05wt％、0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1.0wt％、1.2wt％、1.4wt％、1.6wt％、1.8wt％、2.0wt％、2.5wt％、3.0wt％、3.5wt％、4.0wt％、4.5wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％、11wt％、12wt％、13wt％、14wt％、15wt％、16wt％、17wt％、18wt％、19wt％、20wt％、21wt％、22wt％、23wt％、24wt％、25wt％、26wt％、27wt％、28wt％、29wt％、30wt％、31wt％、32wt％、33wt％、34wt％、35wt％、36wt％、37wt％、38wt％、39wt％、40wt％、41wt％、42wt％、43wt％、44wt％、45wt％、46wt％、47wt％、48wt％、49wt％、50wt％、51wt％、52wt％、53wt％、55wt％、56wt％、57wt％、58wt％、59wt％、60wt％、61wt％、62wt％、63wt％、64wt％、65wt％、66wt％、67wt％、68wt％、69wt％、70wt％、71wt％、72wt％、73wt％、74wt％、75wt％、76wt％、77wt％、78wt％、79wt％、80wt％、81wt％、82wt％、83wt％、84wt％、85wt％、86wt％、87wt％、88wt％、89wt％、或90wt％的wt％存在于组合物，如水性组合物(例如，胶体分散体)中。水性组合物的液体组分可以是例如水或水溶液。水溶液的溶剂通常是水，或者可以包含例如约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、95或98wt％的水。

在一些方面，水溶液不具有(可检测出的)溶解糖，或具有约0.1-1.5、0.1-1.25、0.1-1.0、0.1-.75、0.1-0.5、0.2-0.6、0.3-0.5、0.2、0.3、0.4、0.5或0.6wt％的溶解糖。此类溶解糖可以包括例如蔗糖、果糖、明串珠菌二糖和/或可溶性葡萄糖-寡糖。在一些方面，水溶液可以具有一种或多种盐/缓冲液(例如，Na⁺、Cl^-、NaCl，磷酸盐、tris、柠檬酸盐)(例如，≤0.1、0.5、1.0、2.0或3.0wt％)和/或pH约为例如4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、4.0-9.0、4.0-8.5、4.0-8.0、5.0-9.0、5.0-8.5、5.0-8.0、6.0-9.0、6.0-8.5或6.0-8.0。

包含本公开的聚集体的组合物可以具有为约或至少约10、25、50、100、250、500、750、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、250000、500000或1000000厘泊(cP)的粘度。粘度可以使用粘度计或流变仪或使用本领域已知的任何其他手段来测量。当测量本文的组合物的粘度时，可以施加例如约或至少约10、60、150、250、600、800、1000或10-1000rpm(分钟转数)的旋转剪切速率。粘度可以在任何合适的温度(例如，4℃-30℃、20℃-30℃、20℃-25℃或3℃-110℃)和/或在任何合适的压力(例如，大气压，约760托)下测量。

在一些方面，包含本公开的聚集体的组合物可以是非水性的(例如，干燥的组合物)。这样的实施例的实例包括粉末、颗粒、微胶囊、薄片或任何其他形式的颗粒物质。其他实例包括更大的组合物，诸如球粒、棒、核、珠粒、片剂、条棍、或其他团聚物。非水性组合物或干组合物典型地在其中包含有少于3wt％、2wt％、1wt％、0.5wt％、或0.1wt％的水。

包含本文的聚集体的组合物(例如水性组合物或非水性组合物(上述))可以是家用护理产品、个人护理产品、工业产品、药品或食品的形式，例如美国专利申请公开号2016/0311935、2016/0304629、2015/0232785、2015/0368594、2015/0368595和2016/0122445，以及国际专利申请公开号WO 2016/160737、WO 2016/160738、WO 2016/133734和WO 2016/160740中任何一个所述，将其全部通过引用并入本文。在一些方面，包含聚集体的组合物可以包含如任何前述出版物中所公开的家用护理产品、个人护理产品、工业产品、药品或食品的至少一种组分/成分。

本文的包含聚集体的组合物可任选地包含一种或多种活性酶。合适的酶的非限制性实例包括蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、过氧化物酶、脂肪分解酶(例如金属脂肪分解酶)、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶(例如芳基酯酶、聚酯酶)、过氧水解酶、角质酶、果胶酶、果胶裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶(例如胆碱氧化酶、酚氧化酶)、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、苹果酸酶(malanase)、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、金属蛋白酶(metalloproteinase)、阿马多里酶(amadoriase)、半乳糖苷酶、半乳聚糖酶、过氧化氢酶、角叉菜碱酶(carageenase)、乳糖酶、磷酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、转谷氨酰胺酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、金属蛋白酶(metalloprotease)、阿拉伯呋喃糖苷酶、植酸酶、异构酶、转移酶、葡糖基转移酶(例如，如本文所公开)、淀粉酶(例如，葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶)或其组合。如果包括一种或多种酶，则其能以例如约0.0001wt％至0.1wt％(例如0.01wt％至0.03wt％)的活性酶(例如，以纯酶蛋白质计算)包含在本文的组合物中。

至少一种、两种或更多种纤维素酶可以包括在本文的组合物中。本文的纤维素酶可以具有内切纤维素酶活性(EC 3.2.1.4)、外切纤维素酶活性(EC 3.2.1.91)或纤维二糖酶活性(EC 3.2.1.21)。本文的纤维素酶是在合适的条件下具有维持纤维素酶活性的活性的“活性纤维素酶”；确定此类合适的条件在本领域技术范围内。

本文的纤维素酶可以衍生自任何微生物来源，例如细菌或真菌。包括化学改性的纤维素酶或蛋白质工程化的突变纤维素酶。合适的纤维素酶包括但不限于来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、链霉菌属、木霉属、腐质霉属、镰胞菌属、梭孢壳属(Thielavia)和枝顶孢属的纤维素酶。作为其他实例，纤维素酶可以衍生自特异腐质霉(Humicola insolens)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)或尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)；这些和其他纤维素酶被公开在美国专利号4435307、5648263、5691178、5776757和7604974中，将其全部均通过引用并入本文。示例性里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶公开于美国专利号4689297、5814501、5324649和国际专利申请公开号WO 92/06221和WO 92/06165号，将其全部通过引用并入本文。示例性芽孢杆菌属(Bacillus)纤维素酶公开于美国专利号6562612中，将其通过引用并入本文。纤维素酶，例如前述任何一种，优选为缺乏N-末端信号肽的成熟形式。可用于本文的可商购的纤维素酶包括纤维素酶

和护理酶

(诺维信公司(Novozymes A/S))；

和

HA(杜邦工业生物科学公司(DuPont Industrial Biosciences))和

(花王公司(Kao Corporation))。

当制备本文公开的组合物时，可以直接添加一种或多种纤维素酶作为成分。可替代地，可以在所披露的组合物中间接地(非故意地)提供一种或多种纤维素酶。例如，可以通过存在于用于制备组合物的非纤维素酶制剂中而在本文的组合物中提供纤维素酶。间接地向其中提供纤维素酶的组合物中的纤维素酶能以例如约0.1ppm至10ppm(例如，少于1ppm)存在。

纤维素酶在处理织物的水性组合物中的有效浓度可以由本领域技术人员容易地确定。在织物护理过程中，例如，纤维素酶可以以最小约0.01-0.1ppm的总纤维素酶蛋白质的浓度、或约0.1-10ppb的总纤维素酶蛋白质的浓度(例如，少于1ppm)至最大约100ppm、200ppm、500ppm、1000ppm、2000ppm、3000ppm、4000ppm、或5000ppm的总纤维素酶蛋白质的浓度存在于处理织物的水性组合物(例如洗涤液)中。

本文公开的组合物和方法的非限制性实例包括：

1.一种组合物，所述组合物包含不溶性α-葡聚糖的聚集体，其中所述聚集体的平均流体动力学半径为约50-300nm，并且分形维数为约1.6-2.4，并且所述不溶性α-葡聚糖包含α-1，3-糖苷键。

2.如实施例1所述的组合物，其中所述聚集体是树状的。

3.如实施例1或2所述的组合物，其中所述聚集体的平均流体动力学半径为约50-150nm。

4.如实施例1、2或3所述的组合物，其中所述聚集体的平均流体动力学半径为约60-120nm。

5.如实施例1、2、3或4所述的组合物，其中所述聚集体的分形维数为约1.9-2.1。

6.如实施例1、2、3、4或5所述的组合物，其中所述聚集体包含平均尺寸为约5-25nm的不溶性α-葡聚糖的颗粒。

7.如实施例1、2、3、4、5或6所述的组合物，其中所述不溶性α-葡聚糖的单个分子各自的重均聚合度(DPw)为至少约600。

8.如实施例1、2、3、4、5、6或7所述的组合物，所述组合物包含所述聚集体的团聚物，其中所述团聚物的平均尺寸为约1-200微米。

9.如实施例8所述的组合物，其中所述团聚物的平均尺寸为约1-110微米。

10.如实施例1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的组合物，其中所述不溶性α-葡聚糖具有至少50％的α-1，3-糖苷键。

11.如实施例10所述的组合物，其中所述不溶性α-葡聚糖具有至少90％的α-1，3-糖苷键。

12.如实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11所述的组合物，其中所述组合物呈家用产品、个人护理产品、药物产品、工业产品或食品产品的形式。

13.一种生产如实施例1-11中任一项所述的不溶性α-葡聚糖的聚集体的方法，所述方法包括：(a)使至少水、蔗糖和葡糖基转移酶接触，所述葡糖基转移酶以至少约40％的产率合成不溶性α-葡聚糖；和(b)制备步骤(a)中产生的不溶性α-葡聚糖的分散体。

14.如实施例13所述的方法，其中所述步骤(b)包括制备所述步骤(a)中产生的不溶性α-葡聚糖的湿饼，并将所述湿饼分散在水或水溶液中。

15.一种组合物，所述组合物包含如实施例13或14所述的方法生产的不溶性α-葡聚糖的聚集体。

实例

本公开在以下实例中进一步举例说明。应当理解，尽管这些实例说明了本文的某些优选方面，但仅是以例证的方式给出的。从上述论述和这些实例中，本领域的技术人员可确定所公开的实施例的本质特征，并且在不脱离所公开的实施例的精神和范围的情况下，可进行各种变化和修改以使所公开的实施例适应多种用途和条件。

实例1

以高产率产生不溶性的α-1，3-葡聚糖的非天然的葡糖基转移酶

该实例描述了鉴定以至少40％的产率合成不溶性α-葡聚糖的非天然葡糖基转移酶。

在所述实例中用于制备氨基酸取代的葡糖基转移酶的氨基酸序列是SEQ ID NO：4(GTF 6855)，所述序列本质上是来自唾液链球菌SK126(参见表1)的全长野生型葡糖基转移酶(由SEQ ID NO：62表示)的N-末端截短(去除信号肽和可变区)形式。SEQ ID NO：4中做出的取代可以被表征为取代天然氨基酸残基，因为SEQ ID NO：4的每个氨基酸残基/位置(除了SEQ ID NO：4的Met-1残基)与SEQ ID NO：62中的氨基酸残基/位置相对应。在至少包含蔗糖和水的反应中，具有SEQ ID NO：4的葡糖基转移酶典型地产生具有约100％α-1，3键和DP_w为400或更高的α-葡聚糖(例如，参考美国专利号8871474和9169506，和美国专利申请公开号2017/0002336，将这些文献通过引用并入本文)。例如，可以在酶催化合成后经由过滤分离该不溶性的α-葡聚糖产物。

单个氨基酸取代

将来自位点评价文库(SEL)的GTF 6855变体(每个具有表3所示的单个氨基酸取代)分别进行细菌表达、纯化并将其标准化至100ppm的浓度。然后使用蔗糖作为α-1，3-葡聚糖合成反应中的底物来筛选每种酶配制品(一式三份)。在约20小时的孵育后，除了确定在每个反应中产生的α-1，3-葡聚糖聚合物的量，还通过HPLC分析每个反应的可溶性糖产物(果糖、葡萄糖、明串珠菌二糖、葡萄糖-寡糖)和残余蔗糖。

将每种GTF(GTF 6855及其每种变体)添加到具有蔗糖的反应中来确定产率和选择性。如下进行每个反应：将37.5μL的100ppm酶样品(基于BSA校准曲线的ppm)添加至在20mMNa₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 5.7)中的262.5μL 86g/L蔗糖(最终75g/L)中并在30℃下孵育过夜(约20小时)。该孵育后，通过在80℃孵育1小时将每个反应淬灭。将200-μL等分试样的每个淬灭的反应经0.45-μm过滤板(密理博公司(Millipore)，0.45-μm，亲水性)在真空中过滤，并且将每种滤液稀释5x(10μL样品+40μL 20mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄)制备以用于HPLC糖分析。表3中提供了这些反应(约20小时)的谱图。

表3.GTF 6855(SEQ ID NO：4)及其单个氨基酸取代的变体的产物谱图

^a以微量滴定板形式(两个板)运行葡聚糖合成反应。

^bGTF 6855，SEQ ID NO：4。以一式四份/板运行用该GTF进行的反应。

^c列出的每种具有取代的GTF是在各自位置处包含取代的GTF 6855的一个版本，其中所述位置编号与SEQ ID NO：62的残基编号相对应。首先列出的是野生型残基(残基位置编号之前)，第二列出的是取代的残基(残基位置编号之后)(贯穿本公开应用该“野生型残基-位置编号-变体残基”标注形式)。

^d测量如存在于反应后制备的滤液中的蔗糖、明串珠菌二糖、葡萄糖、果糖和寡聚物。

^e“寡聚物”，葡萄糖-寡糖(被认为全部或大部分地是具有DP≤7或8)。

^f不溶性α-1，3-葡聚糖产物。

^g将具有被破坏的活性的GTF加入到所述反应中。

^h无GTF添加至所述反应。

ⁱ基于葡糖基的α-葡聚糖产率。

表3表明了可用于产生非天然葡糖基转移酶的氦基酸取代的实例，所述非天然葡糖基转移酶可用于本文以至少40％的产率合成不溶性α-葡聚糖。

多种氨基酸取代

简而言之，对SEQ ID NO：4(GTF 6855)进行了氨基酸取代的某些组合。这些取代在下表4和5中列出。

将表4的每种变体酶加入葡聚糖合成反应中，所述反应具有与以下相同或相似的参数：容器，以120rpm摇动的250-mL带凹槽的摇瓶；初始pH，5.7；反应体积，50mL；蔗糖，75g/L；GTF，异源表达酶的大肠杆菌细胞的1.5mL裂解物；KH₂PO4，20mM；温度，30℃；时间，约20-24小时。

将表5的每种变体酶加入葡聚糖合成反应中，所述反应具有与以下相同或相似的参数：容器，在玻璃搅拌棒上具有

斜叶涡轮(45度角)的500-mL夹套反应器，并以50-200rpm搅拌；初始pH，5.5；反应体积，500mL；蔗糖，108g/L；KH₂PO₄，1mM；温度，39℃；时间，约18-24小时；来自先前α-1，3-葡聚糖合成反应的滤液，50vol％。

表4和表5提供了这些反应的α-1，3-葡聚糖产率(与上述方法类似地测量)。

表4.具有多种氨基酸取代的GTF 6855(SEQ ID NO：4)变体的α-1，3葡聚糖产率

^a列出的每种GTF是在各自的位置处包含取代的GTF 6855(SEQ ID NO：4)的一个版本，其中每个位置编号与SEQ ID NO：62的残基编号相对应。

^b不溶性α-1，3-葡聚糖产物。

^c基于葡糖基的α-1，3-葡聚糖产率。

表4和表5表明了可用于产生非天然葡糖基转移酶的氨基酸取代组的实例，所述非天然葡糖基转移酶可用于本文以至少40％的产率合成不溶性α-葡聚糖。

因此，鉴定了以至少40％的产率合成不溶性α-葡聚糖的非天然葡糖基转移酶。这些酶可用于例如合成不溶性α-葡聚糖以产生本文的聚集体，如以下实例2所示。

实例2

不溶性α-葡聚糖的聚集体和团聚物的制备与分析

该实例描述了制备和分析不溶性α-葡聚糖聚集体。通过分散不溶的α-1，3-葡聚糖制备这些聚集体，所述α-1，3-葡聚糖在由如实例1所述的非天然葡糖基转移酶催化的反应中合成。

使用如实例1所述的葡糖基转移酶制备葡聚糖合成反应，其以50％-95％的产率产生不溶性α-1，3-葡聚糖(基于反应的葡糖基组分)。以类似于实例1中所述的方式进行反应。每次反应后，将每种α-1，3-葡聚糖产物(不溶性的，约100％的α-1，3键)的样品过滤，洗涤以除去大部分果糖和其他残留糖，并使用过滤设备处理至约10-40wt％固体。所得的葡聚糖滤饼(“湿饼”)含有约90-75wt％的水，并且未干燥。在一些情况下，发现滤饼含有约0.4wt％的糖。

通过将已经用水(100∶1的水：样品)稀释的湿饼涡旋来制备单个α-1，3-葡聚糖产物的分散液。然后将每种分散体进行如下处理和分析。

将分散体(20μL)沉积在新鲜裂解的云母上，静置30秒，然后以5000rpm离剥离30秒。然后使用原子力显微镜(AFM)对沉积的聚集结构进行成像。尽管该成像最初看起来显示出高度聚集的球形颗粒，但是通过进一步分析可以理解，聚集的颗粒包括延伸的棒状颗粒。初级粒子可以通过使用一系列凸块作为高度轮廓对图像进行线扫描来测量。据该轮廓，可以测量横向粒度为约30nm。由于此测量结果因探头的横向宽度而复杂，因此很可能过高了。AFM图像还显示出颗粒尺寸均匀。

类似地在透射电子显微镜(TEM)网格上制备第二样品，通过干燥分散体来沉积颗粒。TEM图像显示球形和棒状颗粒的聚集体。这些颗粒的尺寸看起来相当均匀。从图像估计球形颗粒的直径约为6.5nm。明确的测量是困难的，因为在仪器的真空中过度干燥会导致颗粒高度聚集。毫无疑问，由于制备条件的原因，如此聚合的(as-polymerized)葡聚糖的原始高表面积和非常开放的结构塌陷而形成高度聚集的结构，然后将其记录在图像中。该TEM结果可用于显示一些初级颗粒是球形的、尺寸均匀、并且直径为约10nm。但是，值得注意的是由于结构崩溃，很难精确地测量尺寸，这掩盖了颗粒之间的界限，很可能会改变单个颗粒的尺寸。

将聚集的α-1，3-葡聚糖的TEM图像与炭黑和气相二氧化硅的TEM图像进行了比较。二氧化硅颗粒显示出严重的聚集，看起来比葡聚糖的颗粒更大(约15nm)，并且显示出更大的多分散性。α-1，3-葡聚糖与炭黑之间的比较证明了它们在粒度上的相似性，但是炭黑样品的直径约为30nm，具有更高的多分散性。通过比较α-1，3-葡聚糖、炭黑和二氧化硅的TEM图像，可以得出的最强结论是这三种材料的颗粒形状均为球形。尽管有这些观察结果，但自那时以来已经意识到，聚集体的α-1，3-葡聚糖颗粒也可以是棒状的。

将α-1，3-葡聚糖、炭黑和二氧化硅的球形颗粒的TEM图像与通过酶促聚合的纤维素形成的血小板颗粒进行了比较，所述血小板颗粒是按照美国专利申请公开号2017/0327857和国际专利申请公开号WO 2016106011所公开的方法产生(两个参考文献均通过引用并入本文)。纤维素链的聚合度低(约15DPw)。通过干燥纤维素的分散体进行样品制备的类似程序(如上所述)。在平坦的云母表面上干燥后，酶促聚合的纤维素形成了血小板。血小板平放在表面，并看起来呈多面状。血小板的平坦表面较大且不对称，尺寸约为100nm，并且长宽比大于2∶1。这些扁平颗粒无疑是非球形的。虽然酶促聚合的纤维素材料的膜是透明的，但由α-1，3-葡聚糖形成的膜却是不透明的。这种差异是由于α-1，3-葡聚糖的聚集体和团聚物，它们会散射光并导致观察到的不透明性。然而，纤维素膜的透明性是由于在膜形成期间发生的血小板堆叠的完善。根据上面提供的信息，毫无疑问，α-1，3葡聚糖的初级颗粒的形状是球形。尽管有这些观察结果，但自那时以来已经意识到，聚集体的α-1，3-葡聚糖颗粒也可以是棒状的。

小角度X射线和中子散射(SAXS、SANS)是可用于测量初级颗粒和聚集体的尺寸的分析技术。与显微镜不同，与高分辨率显微镜测量中取样小得多的体积(约10^-9mm³)相比，散射法取样的平均体积大(约1mm³)。尽管显微术可用于识别颗粒形状，但散射法可用于测量平均粒度。使用正则化和最大熵方法来从SAXS数据测量粒度的方法已得到充分证明(Ilavsky和Jemian，2009，J.Appl.Cryst.[应用晶体学杂志]42：347-353；Jemian等人，1991，Acta Metall.Mater.[冶金学报]39：2477-2487；两者均通过引用并入本文)。从按照上述方法制备的α-1，3-葡聚糖的2wt％的分散体收集SAXS数据。对于波长为λ入射角为2θ的入射X射线辐射，制备了散射强度相对于散射矢量幅度

的双对数图。表6列出了本研究中包含的样品。对于所有这些样品，观察到相似的散射图谱。最大q处的数据对应于材料中最小特征的散射。在

范围内观察到定义明确的Porod范围，其末端依赖性为I至q^-4。这种依赖性是由于存在具有尖锐界面的颗粒。由于如下更详细所述的直径约为15nm的初级粒度，在

范围内观察到定义明确的Guinier区域(曲折部(knee))。在

范围内，观察到I至q^-2的依赖性，这对应于长度范围为10至100nm的聚集体的散射。将最大熵方法(Ilavsky和Jemian，2009；Jemian等人，1991)应用于这些数据。

范围内的数据包括在此分析中，括在前面指定的Guinier范围内。从该程序获得的体积粒度分布函数近似为对数正态形状，其在体积分布与粒径的线性对数图中具有高斯分布。表6中列出了每个样品的中值。所有列表中值的平均值为12.3nm。初级粒度的这种测量介于30nm的AFM值和6.5nm的TEM值(如上)。这些分布的半高全宽约为14nm，可估算出±7nm的分散度。±7nm的分散度是由傅立叶变换程序引起的高估。尺寸和分散度的值在下面使用替代方法生成。

表6.聚集的α-1，3-葡聚糖的粒度

^a不溶性α-1，3-葡聚糖产物。

^b考虑到使用的非天然葡糖基转移酶，估计的α-1，3葡聚糖产率(基于葡糖基)范围。使用来自表4的非天然葡萄糖基转移酶获得75％-90％的产率。使用来自表5的非天然葡萄糖基转移酶获得90％-95％的产率。

^c使用从较早的反应分离出的滤液，将较早的α-1，3-葡聚糖合成反应产生的寡糖(低聚物)副产物输入各自的反应中。

在散射矢量幅度

的较宽范围内收集数据，所述范围对应于从1nm到10μm的长度范围。使用X射线或中子源操作的小角度和超小角度仪器来收集这些数据(SAXS、USAXS、SANS、USANS)。这些仪器分别位于伊利诺伊州芝加哥附近的先进光子源的同步加速器、马里兰州盖瑟斯堡的NIST中子散射中心、和特拉华州威尔明顿的实验站。最大q处的数据对应于材料中最小特征的散射。在

范围内观察到定义明确的Porod范围，其末端依赖性为I至q^-4。这种依赖性是由于存在具有尖锐界面的颗粒。由于直径约为15nm的初级粒度，在

范围内观察到定义明确的Guinier区域(曲折部)。在

范围内，观察到I至q^-2的依赖性，这对应于长度范围为10至100nm的聚集体的散射。在

范围内，观察到I至q^-3的依赖性，这对应于尺寸范围为100nm至10μm的团聚物的散射。聚集体和团聚物的内部结构可以从双对数图的斜率推导得出，所述斜率被确定为这些散射物体的分形维数。虽然长度范围在10到100nm内的聚集体实际上是树状的，但团聚物却是空间填充的。

根据Beaucage的通用拟合方法对表7中列出的样品数据进行拟合(1995，J.Appl.Cryst.[应用晶体学杂志]28：717-728；通过引用并入本文)。初级颗粒的回转半径(Rg1)是拟合的参数之一。分形维数FD2也由该程序确定，该参数的结果在下面讨论。这些参数列于表7。

表7.聚集的α-1，3-葡聚糖的分形维数(FD2)

^a不溶性α-1，3-葡聚糖产物。

^b考虑到使用的非天然葡糖基转移酶，估计的α-1，3葡聚糖产率(基于葡糖基)范围。

^c聚集体的分形维数在10至100nm的长度范围内。

进行了几次数据拟合，并且由拟合值的均方根偏差确定了表7中针对拟合参数所引用的误差。Rg1的箱形图显示两个中央四分位数位于5.5至6.5nm，因此显示Rg1狭窄地分布在6nm附近。假设颗粒形状为球形，则初级颗粒的直径D为15.5±1.5nm；引用的误差对应于列表值的±标准偏差。对于球形颗粒，回转半径与直径的关系为：

如果假设单个α-1，3-葡聚糖链的聚合度为800DPw，则每个初级颗粒的链数约为10±3，如表8所示。对于15.5nm的粒度，每个初级颗粒的800DPw链的数量可能多达约13；或者对于12.3nm的粒度，每个初级颗粒的800DPw链的数量可能低至6条链，这是根据最大熵方法确定的直径。对于14.3nm的中间直径，每个小球800DPw链的计算数量为10。在计算每个初级颗粒的链数时，假设所述颗粒是球形小球，其密度为1.4g/cc，这是基于1.6g/cc的晶体密度的无定形α-1，3-葡聚糖密度的估计值(约85％)。尽管有这些计算结果，但是自那时以来已经意识到，聚集体的α-1，3-葡聚糖颗粒也可以是棒状的。

表8.不同直径(D)的α-1，3-葡聚糖的初级颗粒中的聚合物链数

D(nm)	800DPw链的数量
		15.5	12.7
12.3	6.3
		14.3	10.0

表7列出了FD2的值(长度范围在10至100nm的聚集体的分形维数)。构造了参数FD2的频率图。总分形维数大致均匀地分布在2以上，但没有记录到低于2的值。图1显示了计算机模拟的由初级球形颗粒扩散形成的聚集体的典型树状结构。结构取决于聚集过程是受扩散限制还是受聚集过程限制而略有不同。它们的典型分形维数分别为1.71和2.3，但这些值内的变化取决于模拟的假设而发生。这些模拟结果的树状结构和分形维数是胶体聚集(例如气相二氧化硅或炭黑)中观察到的典型特征。因此，通过基于胶体聚集结果的类似推理，可以推断出没有观察到低于2的值(表7)，因为约为2的极限值是由葡聚糖聚集体的结构决定的。聚集体的尺寸分布很可能是高度多分散的。分形维数的拟合值高于2，可能是由于长度在10至100nm内的小聚集体的团聚物所致，从而使拟合趋向于较大的FD2值。

将高剪切力(微流化器剪切速率为约10⁷s^-1)施加到团聚物区域内具有较大强度的分散的α-1，3-葡聚糖样品。在剪切之前，在

范围内观察到I至q^-2的依赖性，在

范围内观察到I至q^-4的依赖性。剪切后，在

的整个范围内观察到I至q^-2的依赖性，而I至q^-4的依赖性消失。剪切具有降低团聚物强度的作用，而由聚集体引起的散射范围(取决于I至q^-2)至少可以扩展到降低q达十年之久。这些结果表明，团聚物相对于聚集体相对不稳定。剪切具有分散团聚物的作用，而聚集体在施加剪切后仍然存在。

2000(莫尔文公司(Malvern))的光散射结果也支持α-1，3-葡聚糖结构的层次模型，如表9所示。在15mL去离子水中超声处理3分钟(9kJ/kg)后，未超声处理的葡聚糖样品的团聚物的粒度(约20μm)减小了大约一个数量级(约3μm)。

表9.超声处理前后α-1，3-葡聚糖^a的光散射分析

^a与表7中的样品相同的葡聚糖，Rg1为58.2+/-0.4。

如通过光散射测量的，通常超声处理具有减小絮凝物和团聚物尺寸的作用。如上所述制备并超声处理的α-1，3-葡聚糖分散体(在9kJ/kg下进行3分钟)产生中值直径(D50)约为4.3μm的团聚物；超声处理前，D50为21.1μm。团聚物尺寸随超声强度的变化表明，可能需要至少约10kJ/kg的最小比能来破碎非常大的α-1，3-葡聚糖团聚物，所述团聚物在超声处理前的D50约为25μm。在功率设置大于1MJ/kg时，随着超声比能的增加，从大约10kJ/kg开始，测得的团聚物D50降低并稳定在约5μm。较高的超声频率对测得的团聚物尺寸影响较大。总体而言，这些结果表明，α-1，3-葡聚糖团聚物具有高度的多分散性和不稳定性，并且其尺寸会受到剪切和超声处理的影响。

如表10所示，通过各种检测器分析了α-1，3-葡聚糖分散体的内部结构，这些检测器要么偶联到液相色谱系统(在线)，要么不使用柱(离线)。

表10.检测系统规格

M-摩尔质量

R_g-回转半径

R_h-流体动力学半径

PSD-葡聚糖分散体的粒度分布

c_n-颗粒质量浓度

c_c-聚合物质量浓度

在线-用于注入柱的技术

离线-不使用柱的技术

色谱系统配备了硅基整体柱，可在流体动力的色谱模式下将尺寸分离至1微米。这样的整体柱包括双峰多孔结构，所述双峰多孔结构在一个柱中同时实现了高渗透率(直径为2-3μm)和高表面积(直径最大为50Bm)。

将0.1mg/ml的α-1，3-葡聚糖分散体超声处理(9kJ/kg)40分钟。超声处理0、360和1440分钟后，通过DLS离线测量团聚体的尺寸分布(PSD)。测得的PSD较窄(分散度约为±15％)，分别分布在111、180和271nm的平均粒度值附近(以R_h计)。通过1.2μm Acrodick^TM膜将这种分散体过滤到焦油铝板上，显示仅损失了10％的材料。

将R_h＝180nm(每个DLS)的多糖分散体注入配备有整体柱和三个表10中列出的在线检测器的三重检测色谱系统中。为了进行比较，还以0.1mg/m的浓度制备了两种粒径(300nm和400nm)不同的聚苯乙烯球分散体，并将其注入相同的色谱系统中。对于直径为D的实心球，

和

因此，直径为400nm和300nm的球的R_h分别＝194nm和145nm。观察到较小的聚苯乙烯颗粒(300nm)随后从柱中洗脱出来，然后是葡聚糖分散体和更大的颗粒(400nm)，这证实了在流体动力色谱模式下的尺寸分离。

用结构参数表征超声处理(40分钟)的α-1，3-葡聚糖分散体的内部结构(分形维数)

其与分形维数成反比。如表11所示，对于具有较低分形维数的更多开放结构，ρ增大。另外，静态光散射强度的角度依赖性也可以用于表征分散物体的构象。

表11.结构参数ρ

作为通过结构参数ρ和散射强度的角度依赖性进行构象分析的实例，比较了两个非常不同的散射对象。制备直径为60nm的聚苯乙烯(PS)球的分散体，浓度为0.1mg/mL。将该硬球的分散体与0.1mg/mL的400kDa普鲁兰链的分散体进行了比较。这些分散体(包含分形维数差异很大的物体)通过整体柱技术(上文)进行了分离。从在洗脱曲线的顶点处收集的MALS数据中，以角度夕散射的光制备了散射强度除以浓度对

的图。在固体球情况下，顶点发生在洗脱时间为18.6分钟，而普鲁兰链的顶点发生在19.4分钟。因此，如预期的那样，对于PS球的情况(实心球模型)和对于普鲁兰的情况(随机线圈模型)很好地拟合了散射曲线(ASTRA^TM软件，怀雅特技术公司(Wyatt Technologies)，加利福尼亚州(圣芭芭拉)。两种拟合的测定系数均高于R²＝0.99。由MALS(DLS)测得的聚苯乙烯球的R_g(R_h)为26.4(34)nm，得出ρ＝0.78，与表9的预期值0.8一致。对于24(14)nm的普鲁兰R_g(R_h)值，得出ρ＝1.7，描述了开放结构并与表11中的随机线圈对应的值一致。

通过与PS球和普鲁兰的分散体相同的方法(上文)测试超声处理过的α-1，3-葡聚糖分散体的整体分离。在超声处理(9kJ/kg)40分钟的六小后，分析以0.1mg/mL制备的α-1，3-葡聚糖分散体。测量从MALS(DLS)得到356(201.3)nm的R_g(R_h)平均值，并且ρ＝1.77。PSD非常窄，并且对于随机线圈的功能形式，散射曲线拟合的非常好(R²＝0.99)，并且根本不适合实体球的功能形式。这些发现表明，本文的α-1，3-葡聚糖聚集体具有低的分形维数，结构非常开放。

Claims (16)

1.一种组合物，所述组合物包含不溶性α-葡聚糖的聚集体，其中所述聚集体的平均流体动力学半径为50-300nm，并且分形维数为1.6-2.4，并且所述不溶性α-葡聚糖包含α-1,3-糖苷键。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚集体是树状的。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚集体的平均流体动力学半径为50-150nm。

4.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚集体的平均流体动力学半径为60-120nm。

5.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚集体的分形维数为1.9-2.1。

6.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚集体包含平均尺寸为5-25nm的不溶性α-葡聚糖的颗粒。

7.如权利要求6所述的组合物，其中所述不溶性α-葡聚糖的单个分子各自的重均聚合度(DPw)为至少600。

8.如权利要求1所述的组合物，所述组合物包含所述聚集体的团聚物，其中所述团聚物的平均尺寸为1-200微米。

9.如权利要求8所述的组合物，其中所述团聚物的平均尺寸为1-110微米。

10.如权利要求1所述的组合物，其中所述不溶性α-葡聚糖具有至少50％的α-1,3-糖苷键。

11.如权利要求10所述的组合物，其中所述不溶性α-葡聚糖具有至少90％的α-1,3-糖苷键。

12.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物呈家用产品的形式。

13.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物呈个人护理产品的形式。

14.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物呈药物产品的形式。

15.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物呈工业产品的形式。

16.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物呈食物产品的形式。

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