JP4629664B2 - 新規なバチルス029celセルラーゼ - Google Patents
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Description
本出願は、ここにその全体を引用する、2003年4月29日に出願された米国仮出願60/466,831号(代理人整理番号、GC796P)に基づく優先権を主張するものである。
適用なし。
本発明はここで029celとして言及する新規なセルラーゼに関する。また、セルラーゼをエンコードする核酸、前記セルラーゼを含む組成物、新規なセルラーゼを同定する方法、及び前記組成物を用いる方法についても記載する。好ましくは、当該セルラーゼはバチルス種から単離され、好ましくはB.agaradhaerensである。本発明はさらに、洗剤組成物、セルロース含有繊維処理、パルプ及び紙の処理、及び高フルクトース・コーンシロップまたはエタノールの生成用のデンプン処理に添加剤として、当業界で有利にセルラーゼが添加されるものとして認識される、新規なセルラーゼの組成物中での使用に関する。
セルロース及びヘミセルロースは光合成により最も豊富に生成される植物材料である。これらは高分子基材を単糖類に加水分解できる細胞外酵素を生成する多数の微生物、例えば細菌、酵母及び真菌によりエネルギー源として分解及び使用される(Aro、他、2001)。非再生源の限界が近づいているため、セルロースが主な再生可能エネルギー源となる可能性は非常に大きい(Krishna、他、2001)。生物プロセスを通じたセルロースの効果的な活用は食料、飼料及び燃料不足の克服手段のひとつである(Ohmiya、他、1997)。
本発明の目的は、洗剤、織物処理、バイオマス転換及びパルプ及び紙製造への使用に有益な性質を有する新規なセルラーゼを提供することである。
本発明を以下の定義及び実施例を用いて参照することにより詳細を説明する。ここに参照する全ての特許及び刊行物、及び当該特許及び刊行物内に開示される全ての配列は明示的に引用するものとする。
“セルラーゼ”、“セルロース分解酵素”、または“セルラーゼ酵素”は、ここに記載の本発明の細菌性エンドグルカナーゼを意味する。これらの異なる種類のセルラーゼ酵素はセルロース及びその誘導体をグルコースに変換するために相乗的に作用する。
本発明は組換え遺伝学の分野における一般的な技術に依拠する。本発明で使用する一般的な方法を開示する基本テキストは、Sambrook、他、Molecular Cloning(分子クローニング)、A Laboratory Manual(第2版、1989);Kriegler、Gene Transfer and Expression(遺伝子導入及び発現):A Laboratory Manual(1990);及びAusubel、他、編集。Current Protocols in Molecular Biology(1994)が挙げられる。
バチルス・agaradhaerans(DSM8721)由来のゲノムライブラリーを当業者に公知の標準技術を用いて調製した。この微生物はアルカリ性セルラーゼ(エンド−1,4−ベータ−グルカナーゼ)を生成し、これはグリコシル・ヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ5A、EC3.2.1.4、Swiss−Prot:085465、エントリー名GUN5_BACAG.EBIアクセッション番号(AF067428)のセルラーゼファミリー5に属し、その遺伝子は1203bp長である(Davies、他、1998)。セルラーゼ陽性クローンはプレート分析において発生率1/3000で検出された。本発明の側面に従う遺伝子を単離する方法において、この酵素のコード配列に基づく変性プライマーを用いた。しかしながら、意外なことに、公知のB.agaradhaeransセルラーゼを増幅することが知られるプライマーを用いてもPCR生成物は得られなかった。従って、セルラーゼをコードする挿入の完全な配列はプライマーウォーキングにより測定した。
a)029cel遺伝子を推定上含む遺伝子ライブラリーをプローブとして当該ヌクレオチド配列を用いてスクリーニングする工程。
本発明のタンパク質は、発現がプロモーター配列に制御される本発明のセルラーゼ遺伝子を含む発現ベクターを用いて形質転換された細胞を培養することにより生成される。本発明は特にタンパク質の細胞内及び/または細胞外での生成を高めるために有用である。タンパク質は同種または異種である。
本発明に従う織物処理は、本発明のセルラーゼを含む組成物を用いた織物加工または織物洗浄が考えられる。そのような処理は、限定されないが、ストーンウォッシュ、セルロース含有繊維の生地、手触り及び/または外観の修正、またはセルロース含有繊維の製造または洗浄/修繕時に用いられるその他の技術を含む。さらに、本発明の文脈中の処理とは、セルロース系布または繊維から“未成熟”綿または“死”綿を取除くことも考えられる。未成熟綿は成熟綿よりも著しくアモルファスが多く、例えば不規則な染色を原因とする。本発明の組成物は、汚れた製造時のセルロース含有布を洗浄する際に使用するセルラーゼ成分をさらに含む。例えば、本発明のセルラーゼは洗濯物を洗う洗剤組成物に使用できる。本発明に有用な洗剤組成物は前洗浄用、前含浸用(pre−soak)、及び家庭用色修復組成物などの特定の剤形を含む。そのような処理組成物はここに記載するように、希釈が必要な濃縮形態または希釈溶液形態またはセルロース含有布に直接適用できる形態でもよい。織物をセルラーゼ処理するための一般的な処理技術は例えば、欧州出願第220 016及びGB出願第1,368,599号及び2,095,275号に記載されている。
適当なヒドロラーゼは、エステル結合上に作用するカルボキシレートエステルヒドロラーゼ、チオエステルヒドロラーゼ、ホスフェートモノエステルヒドロラーゼ、及びホスフェートジエステルヒドロラーゼ;グリコシル成分上に作用するグリコシドヒドロラーゼ;N−グリコシル成分を加水分解する酵素;エーテル結合上に作用するチオエーテルヒドロラーゼ;ペプチド結合上に作用するa−アミノ−アシル−ペプチドヒドロラーゼ、ペプチジル−アミノ酸ヒドロラーゼ、アシル−アミノ酸ヒドロラーゼ、ジペプチドヒドロラーゼ及びペプチジル−ペプチドヒドロラーゼが挙げられる。この中で好ましいものは、カルボキシレートエステルヒドロヒドロラーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、及びペプチジル−ペプチドヒドロラーゼである。適当なヒドロラーゼは、(1)ペプチジル−ペプチドヒドロラーゼに属するプロテアーゼ、例えば、ペプシン、ペプシンB、レンニン、トリプシン、キモトリプシンA、キモトリプシンB、エラスターゼ、エンテロキナーゼ、カテプシンC、パパイン、キモパパイン、フィシン、トロンビン、フィブリノリジン、レニン、スブチリシン、アスペルギロペプチダーゼA(aspergillopeptidase A)、コラゲナーゼ、クロストリジオペプチダーゼB(clostridiopeptidase B)、カリクレイン、ガストリシン、カテプシンD、ブロメリン、ケラチナーゼ、キモトリプシンンC、ペプシンC、アスペルギロペプチダーゼB、ウロキナーゼ、カルボキシペプチダーゼA及びB、及びアミノペプチダーゼ;(2)グリコシドヒドロラーゼ(必須成分であるセルラーゼはこの群から除く)α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、リゾチーム、ペクチナーゼ、キチナーゼ及びデキストラナーゼを含む。この中で好ましくは、α−アミラーゼ及びβ−アミラーゼである。これらは酸から中性の系で機能するが、細菌から得られるものはアルカリ性の系において高い活性を示す;(3)カルボキシレートエステルヒドロラーゼ、例えばカルボキシルエステラーゼ、リパーゼ、ペクチンエステラーゼ、及びクロロフィラーゼなど。この中で特に効果的なものはリパーゼである。
当該陽イオン界面活性剤及び長鎖脂肪酸塩は、飽和または不飽和脂肪酸塩、アルキルまたはアルケニルエーテルカルボン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩またはエステル、アミノ酸型界面活性剤、リン酸エステル界面活性剤、4級アンモニウム塩、例えば3〜4のアルキル置換基及び1以下のフェニル置換アルキル置換基を有するものを含む。適当な陽イオン界面活性剤及び長鎖脂肪酸塩は英国特許出願番号第2 094 826Aに開示されており、その開示の内容をここに引用する。本組成物は約1〜約20重量%の当該陽イオン界面活性剤及び長鎖脂肪酸塩を含むことができる。
A.二価金属イオン封鎖剤(sequestering agents)
本組成物は約0〜約50重量%の1以上のビルダー成分を含むことができ、以下の化合物のアルカリ金属塩及びアルカノールアミン塩からなる群より選択される:リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノカルボキシレート、アミノ酸塩、アミノポリアセテート高分子量電解質、非分散ポリマー、ジカルボン酸塩、及びアルミノケイ酸塩。適当な二価金属イオン封鎖剤は米国特許出願番号第2 094 826Aに開示されており、その開示の内容をここに引用する。
本組成物は当該組成物に基づいて、約1〜約50重量%、好ましくは約5〜約30重量%の1以上の以下の化合物のアルカリ金属塩をアルカリまたは無機電解質として含むことができる:ケイ酸塩、炭酸塩及び硫酸塩及び有機アルカリ、例えば、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン及びトリイソプロパノールアミン。
本組成物は約0.1〜約5重量%の1以上の以下の化合物を再付着防止剤として含むことができる:ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、及びカルボキシメチルセルロース。
本発明のセルラーゼと漂白剤とを組み合わせた使用、例えば漂白剤はモノ過硫酸カリウム、過炭酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム/過酸化水素付加化合物及び塩化ナトリウム/過酸化水素付加化合物または/及び光過敏漂白剤、例えば、スルホン化フタロシアニンの亜鉛またはアルミニウム塩は、さらに洗剤効果を改善する。同様に、EP684 304に記載の漂白剤及び漂白触媒も用いることができる。
種々の青味剤及び蛍光染料は必要に応じて本組成物に組み込むことができる。適当な青味剤及び蛍光染料は英国特許出願第2 094 826Aに開示されており、その開示の内容をここに引用する。
以下の凝結防止剤は粉末洗剤中に組み込むことができる:p−トルエンスルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、酢酸塩、スルホ琥珀酸塩、タルク、微細粉末シリカ、アモルファスシリカ、粘土、ケイ酸カルシウム(例えば、Johns Manville Co.のマイクロ−セル(Micro−Cell))、炭酸カルシウム及び酸化マグネシウム。
酸化防止剤は、例えば、tert−ブチル−ヒドロキシトルエン、4,4’−ブチリデンビス(6−tert−ブチル−3−メチルフェノール)、2,2’−ブチリデンビス(6−tert−ブチル−4−メチルフェノール)、モノスチレン化クレゾール、ジスチレン化クレゾール、モノスチレン化フェノール、ジスチレン化フェノール及び1,1−ビス(4−ヒドロキシ−フェニル)シクロヘキサンが挙げられる。
可溶化剤は例えば、低級アルコール、例えば、エタノール、ベンゼンスルホン酸塩、低級アルキルベンゼンスルホン酸塩、例えば、p−トルエンスルホン酸塩、グリコール、例えば、プロピレングリコール、アセチルベンゼン−スルホン酸塩、アセトアミド、ピリジンジカルボン酸アミド、安息香酸塩及び尿素が挙げられる。
以下の実施例を与えるが、本発明を限定するものではない。
この実施例はcDNAライブラリーを作成するために十分なDNAを得るためのサンプルの収集法及び処理法について説明する。
ライブラリー構築
以下の実施例は、大腸菌内の新規な配列のスクリーニング及び検出に使用するためのDNAライブラリーをどのように調製するかについて詳述する。
プールしたDNAをゲノムDNAライブラリーの構築のために用いた。精製DNAをSau3A1を用いて部分的に消化し、約5kbの平均断片サイズを得た。制限DNAを電気泳動法によりTAEにおいて0.5%アガロース上でサイズ分画した(0.04M Tris−アセテート、0.001M EDTA pH8.0)。1.5〜10kb範囲の物質を切り取り、アガロースゲルの未使用部分をカットした同じサイズのウェル中に置き換え、逆電流により狭いバンドに濃縮させた。DNAバンドを切断し、キアゲン(QIAGEN)(Crawley,UK)QIAEXIIゲル抽出キットを用いて、取扱説明書に従ってDNA抽出した。溶出DNAをエタノールを用いて沈殿させ、10mM Tris HCl緩衝液、pH8.5中に再懸濁した。
制限DNAをラムダベクター内に、ZAP−エクスプレス(登録商標)ベクターキット(BamH1で前消化、及びアルカリホスファターゼ処理)及びGigapak(登録商標)IIIゴールド・パッケージング抽出(ストラタジーン(Stratagene)、アムステルダム、オランダ)を用いて製造業者手順に従いクローンした。最初のライブラリーを手順通りに、〜5×104pfuを含むアリコートを宿主大腸菌株XL1−ブルーMRF’で150mmペトリ皿にプレートし、緩衝液中のファージを溶出させることにより増幅させた。液体窒素中で凍結させた後、増幅ライブラリーを7% v/vジメチルスルホキシド中、−80℃で保存した。最初の滴定量の合計は1.8×106pfuであり、増幅後は6.8×109pfu ml−1であった。
ファージミドベクターpBK−CMVをExAssistヘルパーファージ(ストラタジーン)を用いて製造業者の説明書通りにラムダZAPライブラリーから切り取り、大腸菌株XLOLRを感染させるために用いた。プラスミド含有クローンを50μg ml−1カナマイシンを含むルリア栄養(LB)寒天上にプレートすることにより単離した。Xgal[5−ブロモ−4−クロロ−3−インドイル−β−D−ガラクトシド]及びIPTG[イソプロピルチオ−β−D−ガラクトシド]の存在下、青白スクリーニングを用いてクローニング効率を測定した。DNAがラムダベクター内にクローンされなかった場合、β−ガラクトシド遺伝子が誘導因子IPTGの存在下で発現され、基質類似体Xgalの分裂を生じ、コロニー内に青色着色を生じる。しかしながら、ゲノムDNAの断片がうまくラムダベクター内にクローンされた場合、遺伝子が阻害され、従って、酵素は生成されず、コロニーは白色のままである。従って、青色と白色コロニーの比は挿入を含むクローンの割合を計算するために用いることができる。このライブラリーに関して、青白スクリーニングは青7、白286のコロニー比を生じ、97%のコロニーがゲノムDNA挿入を含んでいたことを示した。無作為に24のコロニーを選択し、BamH1クローニング部位に隣接するPst1及びHindIIIを用いるWizard(登録商標)Plus SV Miniprep DNA精製システム(Promega UK、サウサンプトン(Sauthampton))制限分析を用い、続いてアガロースゲル電気泳動法により調製したプラスミドDNAを使用して挿入サイズを測定した。24個の中、1個のクローンは検出可能な挿入を含まなかった。残りは1.5kb〜8.0kbの範囲の挿入を有した。
セルラーゼのためのライブラリースクリーニング
pBK−CMVファージミド中のDNAライブラリーを大腸菌クローンのプレート分析におけるセルラーゼ活性に関して、スクリーニングした。セルラーゼ活性を検出するために、ゲノムライブラリーをカナマイシン、0.5% w/vカルボキシメチルセルロース(低粘度ナトリウム塩;シグマ(Sigma)、Poole,UK)及びIPTG(直径7cmのペトリ皿内で寒天の表面上に広げた15μlの0.5M溶液)を含むLB寒天上にプレートした。37℃で一晩中成長させた後、当該コロニーを水に溶かして50℃まで冷やした3ml溶融0.7% w/vアガロースでかぶせた。これが終わると、当該プレートを0.1% w/v コンゴレッド(Congo Red)溶液で30分間水浸しにし、続いて1M NaClで2回洗浄した。細胞外セルラーゼ活性を示す陽性クローンは赤背景に対してイエロー・ハロ(yellow halo)で囲まれた(R.Teather and P.J.Wood,Applied&Environmental Microbiology,43:770−780,1982)。
セルラーゼ陽性クローンのキャラクタリゼーション
プラスミドDNAを3つのセルラーゼ陽性クローンから単離し、挿入サイズを上述の通り制限消化により測定した。ゲル電気泳動により測定して消化後、3つ全てが同じサイズ(約3.5kb)であり、及び同じサイズの断片を有した。このことは、3つ全ての単離体が同一であり、単一のクローンの増幅により生じたことを示す。これは、プラスミドDNAのシーケンシングの第1ラウンドにより確認された(pBKCMVプラスミド中のプライマー部位を用いて)。これはレスター(Leicester)大学でタンパク質及び核酸化学研究室により、パーキンエルマー(Perkin Elmer)‘BigDye’ターミネーター・ケミストリー及び377モデルABI自動DNAシーケンサーを用いて行われた。配列の完全な範囲が挿入の5’及び3’の両末端から‘プライマーウォーキング’により得られた。当該配列はアプライド・バイオシステムス(Applied Biosystems)マルチ配列編集Seqed(登録商標)バージョン1.0.3を用いて編集した。配列はレスター大学から入手可能なGCGウィスコンシン(Wisconsin)パッケージ、バージョン10.2−UNIXにおけるプログラムを用いて組み立てた。これにより3410ヌクレオチド塩基の環境DNAの挿入を同定した(図1)。
セルラーゼ遺伝子の同定
クローン029celの挿入環境DNAのヌクレオチド配列における可能なオープンリーディングフレーム(ORF)をMapDrawプログラム(DNASTAR、Brighton、マサチューセッツ州、米国)のORF Find設備またはベクターNTI式(Suite)のプログラムからのORFサーチ(InforMax(登録商標、North Bethesda,メリーランド州、米国)を用いて同定した。
酵素キャラクタリゼーション
塩の影響
029cel遺伝子を含む大腸菌pBK−CMV細胞を5ml緩衝液(20mM TRIS−HCl、pH8.0;500mM NaCl;0.1mM EDTA;0.1%Triton X−100)中に懸濁し、氷上で超音波処理することにより分解させる。超音波分解した抽出物をカルボキシメチルセルロース(CMC)上で寒天拡散分析により、種々のNaCl濃度で調べる。超音波分解抽出物(100μL)及び10個中1個の希釈物を種々の量のNaClを含むCMC−寒天プレート中に穴を開けたウェル内に配置する。当該プレートを37℃、16時間で培養し、セルロース加水分解を示す生じた除去(clearing)領域をミリメーターで測定する。セルラーゼ029celは0〜25% w/v NaClの範囲で活性だが、25% w/v NaClでの活性は0% NaClでの活性よりも低い。
セルラーゼ活性におけるpHの影響をGrant&Tindall(Isolation of alkaliphilic bacteria(アルカリ性細菌の単離),In:Microbial Growth and Survival in Extreme Environments,Academic Press,ロンドン、1980、第27〜36頁)に記載のpH勾配プレート法を用いて調査する。CMCを含む寒天培地を四角形ペトリ皿の深さ1cmまで注ぎ、設置する。幅1cmの均一な鉢をプレートの端から切り取り、20% w/v Na2CO3・10H2O及び0.2M NaOHを含む寒天(同体積の殺菌0.4M NaOH/40% w/v Na2CO3・10H2O及び4% w/v寒天を60℃で混合することにより調製したもの)を鉢の中に注ぐ。当該プレートを37℃で一晩中成長させ、均一にpH12〜pH7勾配を形成させる。029celセルラーゼのpH耐性を調べるために、鉢を狭く(寒天)勾配により元の鉢に対して直角に切り取り、1mlの超音波分解した細胞抽出物で満たす。当該プレートを37℃で一晩中成長させた。当該プレートをコンゴレッドで30分間処理し、セルロース加水分解の領域を視覚化する。その結果、029celセルラーゼは約pH11.5まで活性であることを示す。
Claims (28)
- 図3(配列番号3)に示すアミノ酸配列に少なくとも95%配列同一性を有する029celポリペプチドをエンコードする核酸配列、または当該配列に相補的な核酸配列である単離ポリヌクレオチドであって、前記単離ポリヌクレオチドはセルラーゼ生物学的活性を有するポリペプチドをエンコードし、その同一性はMacVectorバージョン6.5のCLUSTAL−Wプログラムにより測定され、オープンギャップ・ペナルティ10.0、伸長ギャップ・ペナルティ0.1を含む初期設定パラメーター、及びBLOSUM 30類似マトリックスを用いて操作される、単離ポリヌクレオチド。
- 配列番号1に示す核酸配列またはその相補体又は
配列番号2に示す核酸配列またはその相補体、からなる選択される単離ポリヌクレオチドであって、前記単離ポリヌクレオチドはセルラーゼ生物学的活性を有するポリペプチドをエンコードし、ハイブリダイゼーションは50%ホルムアミド、6X SSC、5X Denhardt’s溶液、0.5% SDS及び100μg/ml変性キャリアDNA中、42℃で行われ、続いて2X SSPE及び0.5% SDS中、室温で2回洗浄し、及びさらに0.1X SSPE及び0.5% SDS中、42℃で2回洗浄することを特徴とする、単離ポリヌクレオチド。 - ヌクレオチドがmRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNA及びそれらのアンチセンス類似体からなる群より選択される、請求項1の単離ヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドがDNA分子である、請求項3の単離ポリヌクレオチド。
- セルラーゼ活性を有するアミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチド配列を含む発現構築体であって、前記ポリヌクレオチド配列が請求項1又は2に記載の単離ポリヌクレオチドに相補的である発現構築体であり、ここで当該同一性はMacVectorのバージョン6.5におけるCLUSTAL−Wプログラムにより測定され、オープンギャップ・ペナルティ10.0、伸長ギャップ・ペナルティ0.1を含む初期設定パラメーター、及びBLOSUM 30類似マトリックスを用いて操作される。
- 請求項1のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- ベクターにより形質転換された宿主細胞により認識される制御配列に動作可能に連結した、請求項1の単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- アクチノプラネス(Actinoplanes)のグルコースイソメラーゼ遺伝子由来プロモーター配列、ストレプトマイセスセルラーゼ遺伝子由来のシグナル配列、及び029celセルラーゼをエンコードするポリヌクレオチド配列を含む調節ポリヌクレオチド配列を含む、請求項7に従う発現ベクター。
- 請求項6のベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 原核細胞である、請求項9の宿主細胞。
- 真核細胞である、請求項9の宿主細胞。
- セルラーゼ生物学的活性を有する実質的に精製された029celポリペプチドであって、図3(配列番号3)に示すアミノ酸配列に少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、当該同一性はMacVectorバージョン6.5のCLUSTAL−Wプログラムにより測定され、オープンギャップ・ペナルティ10.0、伸長ギャップ・ペナルティ0.1を含む初期設定パラメーター、及びBLOSUM 30類似マトリックスを用いて操作されることを特徴とする、ポリペプチド。
- バチルスから得られる、請求項12に記載の実質的に精製された029celセルラーゼポリペプチドまたは誘導体。
- 以下の工程を含むセルラーゼの生成方法:
(a)セルラーゼを生成する適当な条件下、適した培養基中で請求項9に従う宿主細胞を培養する工程;
(b)前記の生成したセルラーゼを得る工程。 - 宿主細胞が糸状菌または酵母細胞である、請求項14の方法。
- 宿主細胞が細菌である、請求項14の方法。
- 細菌がストレプトマイセスである、請求項16の方法。
- 請求項14の方法により調製したセルラーゼ活性を有する精製酵素。
- 配列番号2で定義される029cel遺伝子内に欠失または挿入またはその他の変異を含み、当該遺伝子が不活性化され、029celポリペプチド生成が阻害された組換え宿主細胞。
- 図3(配列番号3)に示すアミノ酸配列に少なくとも95%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む洗剤組成物であって、
ここで、当該同一性はMacVectorバージョン6.5のCLUSTAL−Wプログラムにより測定され、オープンギャップ・ペナルティ10.0、伸長ギャップ・ペナルティ0.1を含む初期設定パラメーター、及びBLOSUM 30類似マトリックスを用いて操作される、洗剤組成物。 - 界面活性剤及び請求項12のセルラーゼを含む洗剤。
- 前記洗剤が洗濯用洗剤である、請求項20の洗剤。
- 前記洗剤が食器用洗剤である、請求項20の洗剤。
- 請求項12のセルラーゼを含む飼料添加物。
- 木材パルプと請求項12のセルラーゼとを接触させることを含む木材パルプの処理方法。
- バイオマスと請求項12のセルラーゼとを接触させることを含むバイオマスを糖に変換する方法。
- さらに高フルクトース・コーンシロップの生成を含む、請求項26の方法。
- 以下の工程を含むエタノールの生成方法:
(a)バイオマス組成物と請求項14に記載の方法によって得られたセルラーゼを含む酵素組成物とを接触させて糖溶液を得る工程;
(b)前記糖溶液に発酵性微生物を加える工程;及び
(c)エタノールを生成するために十分な条件下で発酵性微生物を培養する工程。
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