JP2018198570A - 櫛形構造のグルカンを含むゲル組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】環境低負荷な酵素触媒法を用いて新規な特性を有する高分子多糖類の提供。【解決手段】櫛形構造のグルカンを含むゲル組成物であって、前記櫛形構造のグルカンが、α−１，６−グリコシド結合によりグルコース単位が直鎖状に重合したα−１，６−グルカン構造の主鎖；及び、当該主鎖から分岐した１又は複数の側鎖であって、α−１，３−グリコシド結合によりグルコース単位が直鎖状に重合したα−１，３−グルカン構造の側鎖を有する、該ゲル組成物。【選択図】なし

Description

本発明は、α−１，６−グルカン構造の主鎖にα−１，３−グルカン構造の側鎖を有する櫛形構造のグルカンを含むゲル組成物、及びその製造方法に関する。

プラスチック樹脂はその軽さや強度、加工性の高さから社会に浸透し、今や生活に欠かすことができない存在となっており、用途もフィルム・容器を始め、建材、雑貨、衣類などに幅広く利用されている。しかし、これらは主に有限資源である石油由来のナフサを原料としており、環境面から再生可能資源であるバイオマスを使ったバイオベースプラスチックの研究が進んでいる。

高分子多糖類は自然界に存在するバイオマスの代表であり、例えば、木材由来のセルロース（β−１，４−グルカン）、糸状菌の一種がつくるプルラン（α−１，４−１，４−１，６−グルカン）、バクテリアが生成するカードラン（β−１，３−グルカン）やデキストラン（α−１，６−グルカン）などが知られ、特にセルロースは古くから様々な誘導体化が試みられてきた。

高分子多糖類は、糖ユニットの種類、結合部位、アノマーの違いにより、高分子としての物性が大きく異なることから、かかる高分子多糖類を化学的に合成することによって新規な物性を有する人工合成物の開発が期待されている。しかし、化学合成では、高分子多糖類の構造と分子量を制御できるものの、合成経路が複雑であり、有機溶媒を用い高温・高圧下で反応が行われるといった環境負荷の問題がある。

これに対し、酵素触媒反応は生体内に近い常温・常圧下の水系で反応が進行するため、化学合成と比べて省エネルギーかつ環境にやさしい方法である。例えば、虫歯菌由来の多糖類であるムタンは、グルコースがα−１，３−グリコシド結合により重合結合した高分子（α−１，３−グルカン）であるが（非特許文献１）、菌体が細胞外へ分泌するグルコシルトランスフェラーゼ（Ｇｔｆ）の中のＧｔｆＪと呼ばれる合成酵素により、スクロースを基質として菌体外で合成されることが知られている。本発明者らは、ＧｔｆＪを利用することで、安価なショ糖からα−１，３−グルカンを人工的に合成し、さらにエステル化することで高耐熱性バイオプラスチックの開発に成功している（特許文献１）。

かかる酵素触媒反応を用いることで、新規な物性を有する高分子多糖類に基づくバイオベースプラスチック材料の開発が期待されている。

Ｌｏｅｓｃｈｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、５０、３５３−３８０、１９８６年

特願２０１６−２５３９２２

そこで、本発明は、環境低負荷な酵素触媒法を用いて新規な特性を有する高分子多糖類を提供することを課題とするものである。

本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、酵素触媒を用いてα−１，６−グルカン（デキストラン）の主鎖にα−１，３−グルカンの分岐構造を付加することによって、水溶性と不溶性のグルカン部位が共存した新規なαグルカン（櫛形構造のグルカン）を合成することができ、また、かかる櫛形構造のグルカンがゲルとしての物性を示すことを新たに見出し、本発明を完成するに至ったものである。

すなわち、本発明は、一態様において、
＜１＞櫛形構造のグルカンを含むゲル組成物であって、
前記櫛形構造のグルカンが、α−１，６−グリコシド結合によりグルコース単位が直鎖状に重合したα−１，６−グルカン構造の主鎖；及び、当該主鎖から分岐した１又は複数の側鎖であって、α−１，３−グリコシド結合によりグルコース単位が直鎖状に重合したα−１，３−グルカン構造の側鎖を有する、
該ゲル組成物；
＜２＞前記α−１，６−グルカン構造とα−１，３−グルカン構造の割合が、グルコースユニット換算のモル比で５０：５０〜８０：２０の範囲である、上記＜１＞に記載のゲル組成物；
＜３＞α−１，６−グルカン構造の主鎖が、１０×１０^４以上の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する、上記＜１＞又は＜２＞に記載のゲル組成物；
＜４＞α−１，３−グルカン構造の側鎖が、それぞれ２×１０^４〜５×１０^４の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する、上記＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のゲル組成物；及び
＜５＞前記櫛形構造のグルカンが、２０×１０^４〜１００×１０^４の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する、上記＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載のゲル組成物；
＜６＞前記α−１，３−グルカン構造の側鎖の重量平均分子量の大きさが、前記α−１，６−グルカン構造の主鎖の重量平均分子量の大きさによって制御可能である、上記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載のゲル組成物
を提供するものである。

また、別の態様において、本発明は、上記ゲル組成物の製造方法にも関し
＜７＞上記＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載のゲル組成物の製造方法であって、
原料であるα−１，６−グルカンに、スクロース及びα−１，３−グルカン合成酵素を添加して反応させる工程、及び
前記反応により、α−１，６−グルカン構造の主鎖上にα−１，３−グルカン構造の側鎖を有する櫛形構造のグルカンを得る工程
を含む該製造方法；
＜８＞前記α−１，３−グルカン構造の側鎖の重量平均分子量の大きさを、原料である前記α−１，６−グルカンの重量平均分子量の大きさによって変化させることを含む、上記＜７＞に記載の製造方法。
＜９＞前記α−１，３−グルカン合成酵素が、虫歯菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）由来の酵素である、上記＜７＞又は＜８＞に記載の製造方法；及び
＜１０＞前記α−１，３−グルカン合成酵素が、虫歯菌のα−１，３−グルカン合成酵素遺伝子をクローニングして得られた組み換え酵素である、上記＜７＞又は＜８＞に記載の製造方法。
を提供するものである。

本発明によれば、環境低負荷な酵素触媒法を用いて、水に溶けやすく非晶性であるα−１，６−グルカン（主鎖）と、水に溶けず結晶性であるα−１，３−グルカン（側鎖）の２種類の部位を有する、櫛形構造の新規グルカンを人工合成することができる。そして、かかる２種類の部位を分子内に併せ持つことによって、ゲル化し得るという特性を有する新規な多糖類高分子材料を提供することができる。当該特性は従来のデキストラン（α−１，６−グルカン）材料では得ることができなかったものである。また、原料であるα−１，６−グルカンの分子量や濃度によって、生成物である櫛形構造グルカンの嵩高さやゲル化能を制御できることから、種々の用途に応じた材料を提供することが可能となる。

図１は、本発明の櫛形構造グルカンの構造を示す模式図である。 図２は、本発明の櫛形構造グルカンの合成における反応工程を示すスキーム図である。 図３は、α-１，３-グルカン(デキストラン無添加)、ＩＧ−５．０、ＩＧ−２３、及びＩＧ−３７の各種反応溶液の画像である。 図４は、櫛形構造グルカンゲル（ＩＧ−３７）の画像である。 図５は、各種反応生成物の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。 図６は、各種反応生成物のＧＰＣクロマトグラムである。 図７は、原料として用いたデキストランの分子量に対する生成物の分子量をプロットしたグラフである。 図８は、スミス分解物の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルスペクトルである。 図９は、生成物（分解前）とスミス分解後の物質のＧＰＣクロマトグラフの比較である。

以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。

本発明のゲル組成物は、以下の構造を有する櫛形構造のグルカンを含むことを特徴とする。
ａ）α−１，６−グリコシド結合によりグルコース単位が直鎖状に重合したα−１，６−グルカン構造の主鎖；及び
ｂ）当該主鎖から分岐した１又は複数の側鎖であって、α−１，３−グリコシド結合によりグルコース単位が直鎖状に重合したα−１，３−グルカン構造の側鎖。

１．櫛形構造グルカンの構造
当該櫛形構造グルカンの模式図を図１に示す。櫛形構造グルカンは、α−１，６−グルカン構造（デキストラン）を主鎖とし、これを構成するグルコース単位のＣ３位からα−１，３−グルカン構造が分岐して側鎖を構成する構造を有している。主鎖を構成するα−１，６−グルカンは、水溶性及び非晶性の性質を有し、一方、側鎖を構成するα−１，３−グルカンは、水に不溶性であり、結晶性の性質を有している。すなわち、当該櫛形構造グルカンは、分子内に、水に溶けやすく非晶性主鎖と、水に溶けず結晶性の特性を持つ側鎖という、２種類の異なる特性の部位を有することにより、従来のα−グルカンには見られなかった新規な特性を奏することができる。具体的には、当該櫛形構造グルカンは、水の存在下でゲル化する特性を有し、ゲル組成物を提供することができる。

本発明の櫛形構造のグルカンにおける主鎖は、グルコース単位がα−１，６−グリコシド結合によって直鎖状に重合したα−１，６−グルカン構造を有するものである。ただし、主鎖中にα−１，６−グリコシド結合以外の結合様式による重合部位を含むものであってもよい。当該主鎖は、水への溶解性が高いことが望ましく、８０％以上がα−１，６−グリコシド結合で連結されていることが好ましい。

同様に、本発明の櫛形構造のグルカンにおける側鎖は、グルコース単位がα−１，３−グリコシド結合によって直鎖状に重合したα−１，３−グルカン構造を有するものである。好ましくは、α−１，３−グルカン構造は、完全直鎖状の構造を有する。ここで、「完全直鎖状」とは、α−１，３−グルカン構造を構成するグルコース単位がα−１，３−グリコシド結合以外の分岐（グルコース及び他の糖による分岐）を有しないことを意味する。

櫛形構造グルカン中における主鎖のα−１，６−グルカン構造と側鎖のα−１，３−グルカン構造の割合（［α−１，６−グルカン］：［α−１，３−グルカン］）は、好ましくは、グルコースユニット換算のモル比で５０：５０〜８０：２０の範囲である。より好ましくは、６０：４０〜７５：２５の範囲である。これにより、櫛形構造グルカンの水溶性や結晶性等の特性のバランスを制御することができる。

α−１，６−グルカン構造の主鎖は、好ましくは１０×１０^４以上の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する。より好ましくは、１０×１０^４〜５０×１０^４の範囲の重量平均分子量、さらに好ましくは２０×１０^４〜４０×１０^４の範囲の重量平均分子量を有する。主鎖の分子量をこれらの範囲とすることで、櫛形構造グルカンがゲル化し易い構造とすることができる。当該主鎖の分子量は、後述のように、原料として用いるα−１，６−グルカンの分子量によって制御することができる。

α−１，３−グルカン構造の側鎖は、好ましくは、それぞれ２×１０^４〜５×１０^４の範囲、より好ましくは、それぞれ３×１０^４〜４×１０^４の範囲の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する。側鎖の分子量をこれらの範囲とすることで、櫛形構造グルカンがゲル化し易い構造とすることができる。当該側鎖の分子量は、後述のように、原料として用いるα−１，６−グルカンの分子量、反応時間、反応温度等によって制御することができる。なお、側鎖の数は、１又は複数であることができ、特に限定されるものではないが、櫛形構造グルカンの分子内における［α−１，６−グルカン］：［α−１，３−グルカン］の比率がグルコースユニット換算の比率で上記の範囲内となるような側鎖数となることが好ましい。

櫛形構造のグルカン全体の分子量としては、好ましくは２０×１０^４〜１００×１０^４の範囲、より好ましくは２５×１０^４〜８０×１０^４の範囲の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する。当該分子量は、原料として用いるα−１，６−グルカンの分子量、反応時間、反応温度等によって制御することができる。

重量平均分子量（Ｍｗ）及び数平均分子量（Ｍｎ）の測定には、当該技術分野における公知の手法を用いることができ、例えば、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、またはゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）などの手段を用いることができる。

本発明の櫛形構造のグルカンは、上述のとおりゲル化することができ、水等の溶媒とともにゲル組成物を構成することができる。ここで、「ゲル」とは、一般に、高粘度で流動性を失った分散系をいう。当該ゲル組成物は、ハイドロゲル等として生体親和性が求められる材料等の用途に用いることができる。その他、食品添加物、本発明の櫛形構造グルカンは生分解性を有することから農薬や肥料の徐放材等の用途においても用いることができる。また、当該ゲル組成物の硬度は、主鎖の長さを規定することにより側鎖の長さが変わることから、全体の分子量が大きくなることを用いて、任意に変更させることが可能である。

本発明者らは、人工的に合成したα−１，３−グルカンをエステル化することで高耐熱性バイオプラスチックの開発に成功している（特許文献１）。同様に櫛形グルカンについてもエステル化することでバイオプラスチックとすることが可能であり、非晶構造であるα−１，６−グルカンと結晶構造であるα−１，３−グルカン構造が混在する新規なバイオプラスチックとなりうる。この新規なプラスチックに関しては、α−１，６−グルカンとα−１，３−グルカンの比率及び主鎖であるα−１，６−グルカンと側鎖であるα−１，３−グルカンの長さにより、強度・柔軟性・伸縮性などの物性が変化するため、これらを制御することにより目的に応じた強度・柔軟性・伸縮性を持つバイオプラスチックの創製が可能である。

２．櫛形構造グルカンの製造
本発明の櫛形構造グルカンは、α−１，６−グルカン（デキストラン）を原料として、当該α−１，６−グルカン中のグルコース単位のＣ３位からα−１，３−グルカン側鎖を付加・伸長させることで得ることができる。当該側鎖の付加・伸長反応は、スクロースの酵素反応によって行われ、水を溶媒として用いてスクロースとα−１，３−グルカン合成酵素とを反応させる反応工程によるワンポット合成で行うことができる。当該反応工程のスキームを図２に示す（図中の「ＧｔｆＪ」が、α−１，３−グルカン合成酵素である）。

図２に示すように、スクロースは、α−Ｄ−グルコースとβ−Ｄ−フルクトースがα−１，２−グリコシド結合によって結合した構造を有する非還元二糖類である。当該スクロースとα−１，３−グルカン合成酵素の反応により、スクロースがグルコースとフルクトースに分解され、グルコース単位がα−１，３−グリコシド結合により直鎖状に重合したポリマーであるα−１，３−グルカン側鎖が、主鎖であるα−１，６−グルカン上に生成する。一方、フルクトースは反応の副産物として放出される。

原料として添加されるα−１，６−グルカン（デキストラン）は、好ましくは１０×１０^４以上の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する。より好ましくは、１０×１０^４〜５０×１０^４の範囲の重量平均分子量、さらに好ましくは２０×１０^４〜４０×１０^４の範囲の重量平均分子量を有する。原料として用いるα−１，６−グルカンの分子量をこれらの範囲とすることで、櫛形構造グルカンにおける主鎖を制御し、ゲル化し易い構造とすることができる。理論に拘束されるものではないが、原料のα−１，６−グルカンとして分子量の大きいものを用いると、側鎖の長さ（分子量）が増加する傾向にあることを見出した。すなわち、本発明の製造方法は、好ましくは、前記α−１，３−グルカン構造の側鎖の重量平均分子量の大きさを、原料である前記α−１，６−グルカンの重量平均分子量の大きさによって変化させることをさらに含むことができる。

原料として添加されるα−１，６−グルカン（デキストラン）の濃度は、例えば、０．５〜５０ｍｇ／ｍＬの範囲とすることができ、好ましくは、３．５〜３０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは５．０〜１５ｍｇ／ｍＬの範囲とすることができる。理論に拘束されるものではないが、原料のα−１，６−グルカンの濃度を低くすると、生成物である櫛形構造グルカンの分子量が増加する傾向にあることを見出した。

スクロースとα−１，３−グルカン合成酵素との反応工程は、スクロース水溶液にα−１，３−グルカン合成酵素を含む水溶液を添加する等の方法により行うことができる。水溶液中のスクロース濃度は、例えば０．０１Ｍ〜５．０Ｍ、好ましくは、０．２５Ｍ〜２．０Ｍであることができる。原料となるスクロースは、市販の食品用途及びその他用途のものを用いることができる。

本発明の製造方法で用いられるα−１，３−グルカン合成酵素は、スクロースを分解しながらグルコースをα−１，３−グリコシド結合で重合させることができる酵素であり、一般に、グルカンスクラーゼまたはグルコシルトランスフェラーゼ（「Ｇｔｆ」又は「ＧｔｆＪ」）とも呼ばれる。当該α−１，３−グルカン合成酵素は、虫歯菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）由来の酵素であることが好ましい。例えば、当該酵素は、虫歯菌のα−１，３−グルカン合成酵素遺伝子をクローニングし、大腸菌等のプラスミドベクターに組み込み、これを宿主として発現させることで得られる組み換え酵素である。かかる手法により、α−１，３−グルカン合成酵素を大量生産することができる。当該組み換え酵素の作成に用いられる遺伝子は、典型的には、本願の実施例で用いられているＧｔｆＪ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ２６８９６）であることができる。後述のように、本発明の製造方法の目的物である直鎖状で、かつ大きな分子量を有するα−１，３−グルカンを得るためには、かかる特定のＧｔｆＪ遺伝子を用いて発現させた組み換え酵素が重要である可能性があるが、必ずしも当該遺伝子の使用に限定されるものではない。

α−１，３−グルカン合成酵素は、その活性を奏するアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。その活性が維持される限り、Ｎ末端および／またはＣ末端上に、１〜３００個の残基をさらに含むものであってもよく、そのような追加的な残基は、例えば、α−１，３−グルカン合成酵素に対応する野性型配列に由来するものであってもよく、または（ＮまたはＣ末端のいずれかにおける）エピトープタグなどの別の配列であってもよく、または（Ｎ末端の）異種シグナルペプチドであってもよい。

また、当該組み換え酵素は、ヒスチジンタグを有することができる。かかるヒスチジンタグを付加することにより、高度精製が可能となり、また、α−１，３−グルカン構造の側鎖の長さを制御することができ、宿主由来の阻害物質（スクロースや合成物の代謝に影響するような他の酵素）の影響を抑制することができる。

反応溶液に添加されるα−１，３−グルカン合成酵素は、スクロース濃度に応じて適宜調整することができるが、好ましくは、０．００５〜０．１０Ｕ／ｍＬの濃度であることができ、より好ましくは、０．０１〜０．０６Ｕ／ｍＬの濃度である。

本発明におけるスクロースとα−１，３−グルカン合成酵素との反応工程は、典型的には、当該反応工程は３０℃以下の温度条件下で行われる。より好ましくは２０℃以下、さらに好ましくは１５℃以下の温度条件下で行われる。温度範囲として表すと、当該反応工程は、好ましくは５〜２０℃、より好ましくは５〜１５℃の温度範囲で行うことができる。

また、本発明におけるスクロースとα−１，３−グルカン合成酵素との反応工程は、好ましくは、反応溶液にｐＨが５．０以上、６．０未満の条件で行われる。より好ましくは、ｐＨ５．２以上、５．９未満、さらに好ましくは、ｐＨ５．３〜５．８の範囲である。かかるｐＨ条件とするために、当該技術分野において公知の緩衝剤（バッファー）を用いることができる。特に、ｐＨ５．５近傍が好ましく、その場合、クエン酸バッファーを用いることが好ましい。

本発明におけるスクロースとα−１，３−グルカン合成酵素との反応工程のける反応時間は、目的とする分子量や多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）によって適宜変更可能であるが、好ましくは１日〜３０日であり、より好ましくは１日〜５日であることができる。

本発明におけるスクロースとα−１，３−グルカン合成酵素との反応工程では、その他の添加剤として、ＮａＮ_３、６〜８％のエタノール等の ＧｔｆＪ酵素の働きを阻害しない抗菌剤を添加することもできる。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

１．α−１，３−グルカン合成酵素（ＧｔｆＪ）の調製

（ａ）大腸菌培養
ペプトン（Ｇｉｂｃｏ）１０ｇ 、酵母エキス（Ｇｉｂｃｏ） ５ｇ 、ＮａＣｌ １０ｇ 、５Ｎ ＮａＯＨ ０．２ｍＬを水で１Ｌにメスアップしてよく溶かしオートクレーブ（１２１℃、２０分）で滅菌した。滅菌したＬＢ培地２５０ｍＬにアンピシリン（１００ｍｇ／ｍＬ， Ｗａｋｏ）２５０μＬ、遺伝子組換え大腸菌５０μＬ加え、３７℃で一晩振盪させた。用いた遺伝子組換え大腸菌は、ＧｔｆＪ遺伝子（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ；ＡＴＣＣ２５９７５からクローニング）をプラスミドベクターｐＥＴ−２１ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）を用いて組換えたものである。

ＬＢ培地 ９Ｌに消泡剤 （Ｗａｋｏ） ５ｍＬ、アンピシリン（１００ ｍｇ／ｍＬ） ９ｍＬを加え、ジャーファーメンテーター（ＭＤＮ Ｂ．Ｅ． ＭＡＲＵＢＡＳＨＩ）にセットした。温度 ３０℃、撹拌 ２００ｒｐｍ、通気 ５Ｌ／ｍｉｎの条件で予備培養、引き続き、ＩＴＰＧ（１００ ｍｇ／ｍＬ，Ｗａｋｏ） を４５ｍＬ加え、ＧｔｆＪ酵素を生産させた。

（ｂ）酵素の抽出及び精製
培養で得た菌体を遠心分離（６，０００×ｇ，２０分）で集菌し、５倍量のｌｙｓｉｓ バッファーでよく懸濁した。氷浴中で３０分〜１時間ほど超音破破砕を行った。遠心分離（５，０００ｒｐｍ、３０分、４℃）で細胞残渣を落とし、上清をＮｉ^＋-ＮＴＡ-アガロース （ＢＩＯ-ＲＡＤ）に吸着させた。引き続き、Ｎｉ^＋-ＮＴＡ-アガロースをＩＭＡＣ２０で３回洗浄後、ＩＭＡＣ ２００で目的タンパク質を溶出し、酵素を精製した。
ＩＭＡＣ５（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ イミダゾール）。
ＩＭＡＣ２０（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール）。
ＩＭＡＣ２００（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ イミダゾール）。
ｌｙｓｉｓバッファー（ＩＭＡＣ５を１００ｍＬあたりプロテアーゼインヒビターカクテル１錠添加）。

（ｃ）酵素活性テスト
スクロース溶液６２．５μＬ（５０ｍＭ）、クエン酸塩緩衝剤２５μＬ（ｐＨ５．５、１００ｍＭ）、水１３７．５μＬをマイクロチューブに入れ、十分混合した。精製した酵素２５μＬを加えたのち全量２５０μＬの反応液から手早く５０μＬを別のマイクロチューブに測り取り、９５℃で５分間温めて酵素を失活させた。残りの反応液は３０ ℃の恒温槽で保管した。酵素を加えてから１０分後、２０分後、３０分後にも同様の処理を行なった。酵素反応時間が０分、１０分、２０分、３０分の４つの試料についてそれぞれ３０μＬ測りとりマイクロチューブに入れた。次に水４２０μＬ を加えてサンプルを１５倍に希釈した。その後Ｆ-キット（Ｒｏｃｈｅ／Ｒ-Ｂｉｏｐｈａｒｍ社）を用いて３４０ｎｍでＵＶ測定を行なった。酵素活性は、ＧｔｆＪの１単位（Ｕｎｉｔ，Ｕ）は、反応の初期状態（最初の３０分間）で１分間に１μＭのフルクトースをスクロースから遊離させることができる酵素の量として定義した。

２．櫛形構造グルカンの合成

α−１，３−グルカン合成酵素（ＧｔｆＪ）は、上記で得られたものを用いた。また、原料のデキストラン（α−１，６−グルカン）はＳＩＧＭＡ-ＡＲＤＲＩＣＨ社のＴ-１０、Ｔ-４０、Ｔ-７０、Ｔ-５００、Ｔ-２０００および和光純薬社のデキストラン１５０，０００を用いた。ＧＰＣ測定の結果、それぞれ重量平均分子量（Ｍｗ）は以下の表１のとおりであった。実測の分子量の結果をもとに、Ｄｅｘ−０．８８のように記載した。

メディウム瓶にスクロース（１Ｍ）、クエン酸緩衝液 ｐＨ５．５（１００ｍＭ）、ＮａＮ_３（０．１％）を用意し、各デキストランを表２に示す濃度（０．５ｍｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬ）で加えて全量２００ｍＬになるよう調製した。最後にＧｔｆＪ（０．１Ｕ／ｍＬ）を加え３０℃の恒温槽中に静置し反応させた。１日後に１００ ｍＬ、２日後、３日後にそれぞれ５０ｍＬ回収した。サンプル溶液は１０，０００ｒｐｍ、２５℃で２０分遠心分離を行い、上清をビーカーに移して得られたペレットをイオン交換水で４，５回洗浄することで残留したスクロースとデキストランを除去した。以下、得られた不溶生成物 （Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｌｕｃａｎ） をデキストランの分子量に応じてそれぞれＩＧ-０．８８等と呼ぶこととした。いずれのサンプルも凍結乾燥を３晩以上行い、乾燥サンプルを得た。

デキストランの分子量や濃度及び反応時間が異なる各サンプルについて、反応溶液 ５０ｍＬから得られた不溶性グルカンの収量を表２に示す。反応時間が長くなるに従い収量が増加することが分かった。

１日静止した後のデキストラン無添加の反応溶液と分子量の異なるデキストランを濃度１０ｍｇ／ｍＬで添加した反応溶液の様子を図３に示す。左の無添加で生成された純粋なα−１，３−グルカンが完全に沈殿していたのに対し、右の生成物ではデキストランの分子量が大きくなるほど沈みにくくなった様子が観察された（図３左図）。これは、生成物中のα−１，６−グルカン部分が水溶性であることに起因すると考えられる。

また、図３の右図に示すように、試験官を逆さにしても状態を維持することから、ＩＧ-２３とＩＧ-３７ではゲル化していることが確認された。添加したデキストランが高分子量では生成物が嵩高くなり、反応溶液の粘度は高くなったことを示すものである。添加するデキストランの分子量が大きくなるとゲルの強度も高くなり、図４に示すようにＩＧ-３７では自立するゲルが形成された。

３．櫛形構造グルカンのＮＭＲ解析
また、得られた櫛形構造グルカンについて^１３Ｃ−ＮＭＲによる解析を行った。結果を図５に示す。生成物にはα−１，６−グルカン由来とα−１，３−グルカン由来のそれぞれのピークが確認された。α−１，６−結合のＣ３位のピークより左に移動していたが、この化学シフトの移動は分岐構造による影響であると考えられる。積分値からは、ＩＧ-３７、ＩＧ-２３、ＩＧ-５（１４ｍｇ／ｍＬ， １ｄａｙ）の生成物中のα−１，３−グルカン側鎖の割合（グルコース換算のモル比）が、櫛形構造グルカン全体に対して、それぞれ２５％、３３％、６０％であることがわかった。

４．櫛形構造グルカンの分子量
ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて、生成物である櫛形構造グルカンの分子量を測定した。生成した各不溶性グルカンを５．０ｍｇ測りとり、８％ ＬｉＣｌ／ＤＭＡｃ ５００μＬを加えて８０ ℃のオーブンで一晩放置し十分溶解させた。ＤＭＡｃで８倍希釈して１ ％ ＬｉＣｌ／ＤＭＡｃとした。測定にはＤＭＡｃを溶媒として用い、カラムはＬＦ-８０４（Ｓｈｏｄｅｘ、排除限界分子量 ２．０×１０^６ｇ／ｍｏｌ）を用いた。ＧＰＣサンプルを作成した。流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ、４０ ℃で測定を行い、示差屈折率検出器（ＲＩＤ-２０Ａ，ＳＨＩＭＡＤＺＵ）にて検出した。スタンダードにはプルラン（Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐ８２ ５９００-７６８００， Ｓｈｏｄｅｘ）を用いた。

ＧＰＣクロマトグラムの結果を図６に示す。図中の実線は生成物の櫛形構造グルカン、点線は原料として用いたデキストランの溶出曲線を表している。デキストラン無添加で生成したα−１，３−グルカンは分子量が８．７万だった。デキストランを添加した系では、Ｄｅｘ-５．０を添加すると分子量が５万から２２万、Ｄｅｘ-２３を添加すると２３万から４７万、Ｄｅｘ-３７を添加すると３７万から５２万へと大きく増加していた。α−１，３−グルカンとの混合物であった場合、分子量分布にα−１，３−グルカンと目的物の２つのピークが見られると考えたが、実際はデキストランを含むグルカンに由来する１つのピークしか見られず、生成物は混合物ではなく分子内にα−１，６−グルカン構造とα−１，３−グルカン構造を有する櫛形構造のグルカンであることがわかった。

図７は、横軸に添加したデキストラン分子量、縦軸に生成物の分子量をとり、３つの濃度で得られた結果をプロットしたものである。同じ分子量でみると、添加するデキストランが低濃度ほど高分子量の生成物が合成されていたが、これは、ショ糖と酵素が同量に存在しているとき、デキストランの分子鎖の本数が少ない低濃度の方が１本当たりに重合するグルカン量が多くなるためと考えられた。

５．スミス分解による解析
次いで、スミス分解による解析を用いて、側鎖であるα−１，３−グルカンの構造解析を行った。スミス分解は、過ヨウ素酸で酸化する際に隣接した水酸基間のＣ-Ｃ部分が選択的に開裂されることを利用した分解方法である。本実験ではα-（１→６／１→３）-グルカンの主鎖のα−１，６−結合部分を優先的に加水分解する一方で側鎖のα−１，３結合部分は残存させることにより、側鎖であるα−１，３−グルカンの分子量を測定した。

ＩＧ-５、ＩＧ-２３、ＩＧ-３７（１４ｍｇ／ｍＬ， １ｄａｙ）を各々１００ｍｇずつ測りとり、サンプル瓶に入れ水を適量加えて膨潤させた。ＮａＩＯ_４ 水溶液を最終濃度０．１Ｍ、全量１５ｍＬになるように加え、サンプル瓶をアルミ箔で覆い２５℃下で４８時間反応させた。比較としてα−１，３−グルカンも同様に反応させた。反応中、一定時間ごとに反応溶液を取り、１００倍希釈して２６０ｎｍでＵＶ測定を行い、時間経過に伴うＮａＩＯ_４の消費量を観察した。反応物は１７，０００ｒｐｍ、２０分で遠心分離をして回収した。洗浄は蒸留水で一度行った。ＮａＢＨ_４を各３００ｍｇ加え一晩放置した。１５，０００ｒｐｍ、２０分で回収し、洗浄を一度行った。その後、凍結乾燥で３晩放置した。凍結乾燥後の試料２０ｍｇに対し０．０２ Ｍ ＨＣｌを１ｍＬ加えて１００℃で２０分放置し加水分解を行った。

スミス分解後の残留物のＮＭＲスペクトル及びＧＰＣクロマトグラフの結果をそれぞれ図８及び９に示す。その結果、残留物は、α−１，３-結合のみをもつ物質であり、α−１，３−グルカン構造の側鎖に由来することが分かった。

また、上記ＧＰＣクロマトグラフの結果から得られたＭｎとＭｗ及び分散度を表３に示す。α−１，３−グルカン側鎖部分の長さは主鎖の分子量が大きくなるにつれ長くなる傾向が見られた。

Claims (10)

1. 櫛形構造のグルカンを含むゲル組成物であって、
   前記櫛形構造のグルカンが、α−１，６−グリコシド結合によりグルコース単位が直鎖状に重合したα−１，６−グルカン構造の主鎖；及び、当該主鎖から分岐した１又は複数の側鎖であって、α−１，３−グリコシド結合によりグルコース単位が直鎖状に重合したα−１，３−グルカン構造の側鎖を有する、
   該ゲル組成物。
2. 前記α−１，６−グルカン構造とα−１，３−グルカン構造の割合が、グルコースユニット換算のモル比で５０：５０〜８０：２０の範囲である、請求項１に記載のゲル組成物。
3. α−１，６−グルカン構造の主鎖が、１０×１０^４以上の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する、請求項１又は２に記載のゲル組成物。
4. α−１，３−グルカン構造の側鎖が、それぞれ２×１０^４〜５×１０^４の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のゲル組成物。
5. 前記櫛形構造のグルカンが、２０×１０^４〜１００×１０^４の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する、請求項１〜４のいずれかに記載のゲル組成物。
6. 前記α−１，３−グルカン構造の側鎖の重量平均分子量の大きさが、前記α−１，６−グルカン構造の主鎖の重量平均分子量の大きさによって制御可能である、請求項１〜５のいずれかに記載のゲル組成物。
7. 請求項１〜６のいずれかに記載のゲル組成物の製造方法であって、
   原料であるα−１，６−グルカンに、スクロース及びα−１，３−グルカン合成酵素を添加して反応させる工程、及び
   前記反応により、α−１，６−グルカン構造の主鎖上にα−１，３−グルカン構造の側鎖を有する櫛形構造のグルカンを得る工程
   を含む該製造方法。
8. 前記α−１，３−グルカン構造の側鎖の重量平均分子量の大きさを、原料である前記α−１，６−グルカンの重量平均分子量の大きさによって変化させることを含む、請求項７に記載の製造方法。
9. 前記α−１，３−グルカン合成酵素が、虫歯菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）由来の酵素である、請求項７又は８に記載の製造方法。
10. 前記α−１，３−グルカン合成酵素が、虫歯菌のα−１，３−グルカン合成酵素遺伝子をクローニングして得られた組み換え酵素である、請求項７又は８に記載の製造方法。

Images