CN102065882A - 包含生长因子/两亲性聚合物复合物、阳离子的可溶性盐和有机支持物的成骨组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由成骨组合物构成的开放植入物，所述成骨组合物至少包含：成骨生长因子/两亲性阴离子多糖复合物，至少二价的阳离子的可溶性盐，和有机支持物，所述有机支持物不包含脱矿质骨基质。在一个实施方案中，所述植入物呈现为冻干物的形式。本发明还涉及其制备方法。

Description

包含生长因子/两亲性聚合物复合物、阳离子的可溶性盐和有机支持物的成骨组合物
本发明涉及成骨制剂领域，更具体地涉及属于骨形态发生蛋白(BMP)家族的成骨蛋白的制剂。
骨形态发生蛋白(BMP)是参与骨诱导机制的生长因子。也称为成骨蛋白(OP)的BMP最初于1965年由Urist进行了表征(Urist MR.Science 1965；150，893)。这些从骨密质分离出的蛋白质具有在许多动物中诱导骨形成的能力(Urist MR.Science 1965；150，893)。
BMP以前肽的形式进行表达，后者在翻译后成熟之后，具有104至139个残基的长度。它们彼此之间具有很大的序列同源性并且具有类似的三维结构。特别地，它们具有6个在形成“半胱氨酸结(cysteine knot)”的分子内二硫键中所牵涉的半胱氨酸残基(Scheufler C.2004J.Mol.Biol.1999；287，103；Schlunegger MP，J.Mol.Biol.1993；231，445)。它们中的某些具有还在导致二聚体形成的分子间二硫键中所牵涉的第7个半胱氨酸(Scheufler C.2004 J.Mol.Biol.1999；287：103)。
在其活性形式下，BMP装配成同二聚体，甚至异二聚体，如Israel等人所描述的那样(Israel DI，Growth Factors.1996；13(3-4)，291)。二聚体BMP与BMPR类型的跨膜受体相互作用(Mundy等人，Growth Factors，2004，22(4)，233)。该识别引发尤其牵涉Smad蛋白的细胞内信号传导级联，如此导致靶基因的激活或抑制。
BMP(除了BMP1和3外)对于间充质细胞的分化起着直接或间接的作用，导致它们分化为成骨细胞(Cheng H.，J.Bone and Joint Surgery，2003，85A 1544-1552)。此外，它们还具有趋化性并且诱导增殖和分化。
某些重组人BMP，尤其是rhBMP-2和rhBMP-7，清楚地显示出在人中于体内诱导骨形成的能力并且已被批准用于某些医学应用。因此，将重组人BMP-2(根据国际通用命名为代勃特明-α)配制在以InFUSE
Figure BPA00001238057800021
的名称(在美国)和以InductOs的名称(在欧洲)进行销售的产品中。该产品被指定用于腰椎的融合和胫骨的骨再生(对于称为骨不连合的骨折)。在用于腰椎融合的InFUSE
Figure BPA00001238057800023
的情况下，外科手术首先在于用rhBMP-2的溶液浸透胶原海绵，然后将海绵放置入预先植入到椎骨之间的空心支架(LT支架)中。
重组人BMP-7(根据国际通用命名为依托特明-α)具有与BMP-2相同的治疗适应症并且构成了两种产品的基础：用于胫骨的开放性骨折的OP-1 Implant和用于腰椎融合的OP-1 Putty。OP-1 Implant由待接纳在0.9％盐水溶液中的包含rhBMP-7和胶原的粉末组成。然后，将所获得的糊状物在外科手术期间应用在骨折处。OP-1 Putty以两种粉末的形式存在：一种包含rhBMP-7和胶原，另一种包含羧甲基纤维素(CMC)。在外科手术过程中，CMC溶液用0.9％盐水溶液来重构并与rhBMP-7和胶原相混合。将如此获得的糊状物应用在待处理的部位上。
从专利申请US2008/014197中可获知骨诱导性植入物，其由下列构成：包含矿物陶瓷的支持物(支架)，完整地粘结在支持物上的固体膜，和成骨试剂。所述支持物优选地为胶原海绵。所述矿物陶瓷包括钙衍生物，优选地水不溶性矿物基质，例如双相磷酸钙([0024]，第2页)。所述完整地粘结在植入物上的固体膜应当是不可渗透的，以便限制来自周围软组织的细胞的进入以及还防止炎性细胞的进入([0030]，第3页)。这些细胞进入植入物中被描述为可能导致骨生长降低和治疗失败([0007]，第1页)。
该发明集中于给植入物添加膜，以便改善骨发生。
专利申请US2007/0254041描述了以薄片形式的装置，所述薄片包含脱矿质骨基质(DBM)、胶原颗粒和经物理交联的多糖基质。此外，这种植入物还可以包含成骨物质例如生长因子。所述经物理交联的多糖用作脱矿质骨颗粒的稳定剂([0026]，第3页)，基于藻酸盐的该多糖通过添加氯化钙而交联。
专利申请WO96/39203描述了具有物理抗性的生物相容的成骨复合材料。这种骨诱导性材料由脱矿质骨组成，根据所述作者所述，在脱矿质骨存在下、或者在脱矿质骨的蛋白质提取物存在下、或者在这两种要素存在下才发生骨诱导(第2页第2-5行)。将钙盐或矿质盐加入到这种材料中。所述矿质盐被描述为可以是氢氧化钠、氯化钠、氯化镁或氢氧化镁(第17页第4-9行)。所述钙盐可以是可溶性的或不溶性的盐(第17页第20-21行)，并且优选地为氢氧化钙。待添加的各种不同阳离子(特别是钙)的氢氧化物的选择通过基质的pH增加这一效应来证实，所述基质的pH增加有利于在该环境中胶原合成的增加(第15页第7-11行)。
该发明涵盖了基于脱矿质骨的新型植入物的形成，其物理和成骨性质通过植入物的pH增加而得到改善。
此外，已证实，特别有利的是，在生长因子和聚合物之间形成复合物，以便使其稳定、增加其溶解度和/或增加其活性。
因此，在以申请人名义的专利申请FR0705536中，可以证实，在BMP-2和两亲性聚合物之间的复合物的形成尤其使得能够增加非常疏水的并且在生理pH下溶解度低的该蛋白质的溶解度。
在专利申请FR0705536中，申请人还证实，在通过疏水取代基进行官能化的葡聚糖衍生物存在下，BMP-2的生物活性增加。在体外，这种BMP-2复合物看起来在各方面均优于单独的BMP-2。
然而，仍必需发现使得能够改善这些生长因子(BMP)的性能的制剂，以便能够例如减少待施用的量。
这个问题是许多生长因子制剂所共有的，因为这些蛋白质通常以超过生理剂量几个数量级的剂量进行使用。
申请人的功劳在于发现了这样的生长因子制剂，其使得能够通过将至少二价的阳离子的可溶性盐的溶液添加到包含所述生长因子的水凝胶中来改善所述生长因子的活性，所述至少二价的阳离子的可溶性盐加强该生长因子的效应。
令人惊讶地，这种新型制剂使得能够以更小量的生长因子产生相同的成骨效应。
本发明涉及由成骨组合物构成的开放植入物，所述成骨组合物至少包含：
●成骨生长因子/两亲性阴离子多糖复合物，
●至少二价的阳离子的可溶性盐，和
●有机支持物，
●所述有机支持物不包含脱矿质骨基质。
“开放植入物”是指既不包含膜也不包含外壳并且在其构成方面基本上均一的植入物，所述膜或外壳可以限制或调节与植入物周围的组织的交换。
“脱矿质骨基质”(DBM)是指通过自体骨的酸提取而获得的基质，所述酸提取导致大多数矿化组分的丧失，但保留了胶原性或非胶原性蛋白质，包括生长因子。此类脱矿质基质还可以以在用离液剂萃取后的灭活形式制备。
“有机支持物”是指由有机基质和/或水凝胶构成的支持物。
“有机基质”是指由交联水凝胶和/或胶原构成的基质。
所述有机基质是通过聚合物链的化学交联而获得的水凝胶。链间共价键确定出了有机基质。可以用于构成有机基质的聚合物在题目为Hydrogels for biomedical applications的Hoffman的综述中进行了描述(Adv.Drug Deliv.Rev，2002，43，3-12)。
在一个实施方案中，基质选自基于经灭菌的、交联的、纯化的天然胶原的基质。
天然聚合物例如胶原是促进细胞附着、迁移和分化的细胞外基质的组分。它们具有为极度生物相容的优点，并且通过酶促消化机制而降解。基于胶原的基质获得自从牛或猪的腱或骨中提取的I或IV型纤维胶原。这些胶原首先进行纯化，然后进行交联并随后灭菌。
根据本发明的有机支持物可以以混合物进行使用，以便获得这样的材料，所述材料可以以具有足以成形甚至模塑的机械性质的材料的形式，或以“油灰(putty)”的形式存在，或者胶原或水凝胶起粘合剂作用。
还可以使用混合材料，例如将胶原和无机颗粒相联合的基质，其可以以具有强化的机械性质的复合材料的形式，或以“油灰”的形式存在，或者胶原起粘合剂作用。
可使用的无机材料主要地包括基于磷酸钙的陶瓷，例如羟基磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)、双相磷酸钙(BCP)或无定形磷酸钙(ACP)，其主要优点是具有非常接近于骨的化学组成的化学组成。这些材料具有良好的机械性质，并且是免疫学上惰性的。这些材料可以以各种形式存在，例如粉末、粒料或块料。依赖于其组成，这些材料具有非常不同的降解速率；因而，羟基磷灰石非常缓慢地(数月)降解，而磷酸三钙更快速地(数周)降解。为此目的，开发出了双相磷酸钙，因为它们具有中等的吸除速率。已知这些无机材料主要为骨传导性的。
“水凝胶”是指能够吸附大量的水或生物学液体的聚合物的亲水性三维网状物(Peppas等人，Eur.J.Pharm.Biopharm.2000，50，27-46)。此类水凝胶由物理相互作用而构成，并因此不通过聚合物链的化学交联来获得。
在这些聚合物中，可以找到合成聚合物以及天然聚合物。形成水凝胶的多糖例如在题目为Polysaccharide hydrogels for modified release formulations的文章中进行了描述(Coviello等人，J.Control.Release，2007，119，5-24)。
在一个实施方案中，形成交联或非交联的水凝胶的聚合物选自合成聚合物的组，其中包括乙二醇和乳酸的共聚物、乙二醇和乙醇酸的共聚物、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚乙烯酸、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸。
在一个实施方案中，形成水凝胶的聚合物选自天然聚合物的组，其中包括透明质酸、角质素、出芽短梗霉聚糖、果胶、葡聚糖、纤维素和纤维素衍生物、藻酸、黄原胶、角叉菜聚糖、壳聚糖、软骨素、胶原、明胶、聚赖氨酸、纤维蛋白以及它们的在生物学上可接受的盐。
在一个实施方案中，天然聚合物选自形成水凝胶的多糖的组，其中包括透明质酸、藻酸、葡聚糖、果胶、纤维素及其衍生物、出芽短梗霉聚糖、黄原胶、角叉菜聚糖、壳聚糖、软骨素以及它们的在生物学上可接受的盐。
在一个实施方案中，天然聚合物选自形成水凝胶的多糖的组，其中包括透明质酸、藻酸以及它们的在生物学上可接受的盐。
“两亲性多糖”是指这样的多糖，其选自通过疏水性衍生物进行官能化的多糖。
这些多糖占多数地由(1，4)和/或(1，3)和/或(1，2)类型的糖苷键构成。它们可以是中性的，即不携带酸官能团，或者是阴离子的且携带酸官能团。
它们通过标注为Trp的至少一个色氨酸衍生物进行官能化：
●所述色氨酸衍生物通过与酸官能团的偶联而嫁接或连接至所述多糖，所述酸官能团可以是阴离子多糖的酸官能团和/或由连接臂R所携带的酸官能团，所述连接臂R通过官能团F而与该多糖相连接，所述官能团F由于连接臂R和该中性或阴离子多糖的-OH官能团之间的偶联而产生，
-F为酯官能团、硫酯官能团、酰胺官能团、碳酸酯官能团、氨基甲酸酯官能团、醚官能团、硫醚官能团或胺官能团，
-R为包含1-18个碳的链，其任选地是支化的和/或不饱和的，包含一个或多个杂原子，例如O、N和/或S，并且具有至少一个酸官能团，
●Trp为L-或D-色氨酸衍生物的残基，其从该色氨酸的胺和由基团R所携带的所述至少一个酸和/或由该阴离子多糖所携带的酸之间的偶联而产生。
根据本发明，占多数地包含(1，4)、(1，3)和/或(1，2)类型的糖苷键并通过至少一个色氨酸衍生物进行官能化的多糖可以符合下述通式I：
●该多糖占多数地由(1，4)和/或(1，3)和/或(1，2)类型的糖苷键构成，
●F由于连接臂R和该中性或阴离子多糖的-OH官能团之间的偶联而产生，为酯官能团、硫酯官能团、酰胺官能团、碳酸酯官能团、氨基甲酸酯官能团、醚官能团、硫醚官能团或胺官能团，
●R为包含1-18个碳的链，其任选地是支化的和/或不饱和的，包含一个或多个杂原子，例如O、N或/和S，并且具有至少一个酸官能团，
●Trp为L-或D-色氨酸衍生物的残基，其从该色氨酸衍生物的胺和由基团R所携带的所述至少一个酸和/或由该阴离子多糖所携带的酸之间的偶联而产生，
n表示被Trp取代的R的摩尔份数，并且为0.05-0.7，
o表示被Trp取代的多糖的酸官能团的摩尔份数，并且为0.05-0.7，
i表示由基团R所携带的酸官能团的摩尔份数/糖单元，并且为0-2，
j表示由该阴离子多糖所携带的酸官能团的摩尔份数/糖单元，并且为0-1，
(i+j)表示酸官能团的摩尔份数/糖单元，并且为0.1-2，
-当R不被Trp取代时，那么基团R的所述酸为阳离子的羧酸盐，所述阳离子为碱金属优选地例如Na或K的阳离子，
-当该多糖为阴离子多糖时，当该多糖的酸官能团不被Trp取代时，那么所述酸官能团与阳离子成盐，所述阳离子为碱金属阳离子，优选地例如Na+或K+，
所述多糖在中性pH下是两亲性的。
在一个实施方案中，F为酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或醚。
在一个实施方案中，该多糖占多数地由(1，4)类型的糖苷键构成。
在一个实施方案中，该占多数地由(1，4)类型的糖苷键构成的多糖选自出芽短梗霉聚糖、藻酸盐、乙酰透明质酸、木聚糖、聚半乳糖醛酸或水溶性纤维素。
在一个实施方案中，该多糖为出芽短梗霉聚糖。
在一个实施方案中，该多糖为藻酸盐。
在一个实施方案中，该多糖为乙酰透明质酸。
在一个实施方案中，该多糖为木聚糖。
在一个实施方案中，该多糖为聚半乳糖醛酸。
在一个实施方案中，该多糖为水溶性纤维素。
在一个实施方案中，该多糖占多数地由(1，3)类型的糖苷键构成。
在一个实施方案中，该占多数地由(1，3)类型的糖苷键构成的多糖为凝乳聚糖。
在一个实施方案中，该多糖占多数地由(1，2)类型的糖苷键构成。
在一个实施方案中，该占多数地由(1，2)类型的糖苷键构成的多糖为菊粉。
在一个实施方案中，该多糖占多数地由(1，4)和(1，3)类型的糖苷键构成。
在一个实施方案中，该占多数地由(1，4)和(1，3)类型的糖苷键构成的多糖为葡聚糖。
在一个实施方案中，该多糖占多数地由(1，4)和(1，3)和(1，2)类型的糖苷键构成。
在一个实施方案中，该占多数地由(1，4)和(1，3)和(1，2)类型的糖苷键构成的多糖为甘露聚糖。
在一个实施方案中，根据本发明的多糖的特征在于，基团R选自下列基团：
Figure BPA00001238057800091
或其碱金属阳离子盐。
在一个实施方案中，根据本发明的多糖的特征在于，所述色氨酸衍生物选自色氨酸、色氨醇(tryptophanol)、色氨酰胺(tryptophanamide)、2-吲哚乙胺以及其碱金属阳离子盐。
在一个实施方案中，根据本发明的多糖的特征在于，所述色氨酸衍生物选自式II的色氨酸的酯：
Figure BPA00001238057800092
其中，
E为可能是下述基团的基团：
●线性或支化的(C1-C8)烷基；
●线性或支化的(C6-C20)烷基芳基或芳基烷基。
所述多糖可以具有10-10000的聚合度m。
在一个实施方案中，它具有10-1000的聚合度m。
在另一个实施方案中，它具有10-500的聚合度m。
在一个实施方案中，所述多糖选自用疏水性氨基酸(例如色氨酸和色氨酸衍生物)进行官能化的葡聚糖，如在申请FR 07/02316中所描述的。
根据本发明，所述经官能化的葡聚糖可以符合下述通式III：
●R为包含1-18个碳的链，其任选地是支化的和/或不饱和的，包含一个或多个杂原子，例如O、N或/和S，并且具有至少一个酸官能团，
●F由于连接臂R和该中性或阴离子多糖的-OH官能团之间的偶联而产生，为酯官能团、硫酯官能团、酰胺官能团、碳酸酯官能团、氨基甲酸酯官能团、醚官能团、硫醚官能团或胺官能团，
●AA为疏水性L-或D-氨基酸残基，其从该氨基酸的胺和由基团R所携带的酸之间的偶联而产生，
t表示取代基F-R-[AA]n的摩尔份数/糖苷单元，并且为0.1-2，
p表示被AA取代的R的摩尔份数，并且为0.05-1，
当R不被AA取代时，那么基团R的所述酸为阳离子的羧酸盐，所述阳离子为碱金属阳离子，优选地例如Na+或K+，
所述葡聚糖在中性pH下是两亲性的。
在一个实施方案中，所述碱金属阳离子为Na+。
在一个实施方案中，F为酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或醚。
在一个实施方案中，根据本发明的多糖为式IV的羧甲基葡聚糖：
Figure BPA00001238057800111
或相应的酸。
在一个实施方案中，根据本发明的多糖为式V的葡聚糖的单琥珀酸酯：
Figure BPA00001238057800112
或相对的酸。
在一个实施方案中，根据本发明的多糖的特征在于，基团R选自下列基团：
Figure BPA00001238057800113
或其碱金属阳离子盐。
在一个实施方案中，根据本发明的葡聚糖的特征在于，所述疏水性氨基酸选自色氨酸衍生物，例如色氨酸、色氨醇、色氨酰胺、2-吲哚乙胺以及其碱金属阳离子盐。
在一个实施方案中，根据本发明的葡聚糖的特征在于，所述色氨酸衍生物选自如上定义的式II的色氨酸的酯。
在一个实施方案中，根据本发明的葡聚糖为式VI的通过色氨酸进行修饰的羧甲基葡聚糖：
Figure BPA00001238057800121
在一个实施方案中，根据本发明的葡聚糖为式VII的通过色氨酸进行修饰的葡聚糖的单琥珀酸酯：
Figure BPA00001238057800122
在一个实施方案中，根据本发明的葡聚糖的特征在于，所述疏水性氨基酸选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸以及其醇、酰胺或脱羧基衍生物。
在一个实施方案中，根据本发明的葡聚糖的特征在于，所述苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的衍生物选自式VIII的这些氨基酸的酯：
Figure BPA00001238057800131
其中，
E如上所定义。
在一个实施方案中，根据本发明的葡聚糖的特征在于，所述疏水性氨基酸为苯丙氨酸，或者其醇、酰胺或脱羧基衍生物。
所述葡聚糖可以具有10-10000的聚合度m。
在一个实施方案中，它具有10-1000的聚合度m。
在另一个实施方案中，它具有10-500的聚合度m。
在一个实施方案中，所述多糖选自包含羧基官能团的多糖，例如在申请FR 08/05506中所描述的那些，所述羧基官能团中的至少一个被标示为Ah的疏水醇的衍生物取代：
●所述疏水性醇(Ah)通过偶联臂R而嫁接或连接至该阴离子多糖，所述偶联臂通过官能团F’而与该阴离子多糖相连接，所述官能团F’由于连接臂R的胺官能团和该阴离子多糖的羧基官能团之间的偶联而产生，并且所述偶联臂通过官能团G而与所述疏水性醇相连接，所述官能团G由于所述偶联臂的羧基、异氰酸酯、硫代酸或醇官能团和所述疏水性醇的官能团之间的偶联而产生，该阴离子多糖的未取代的羧基官能团以阳离子的羧酸盐形式存在，所述阳离子为碱金属阳离子，优选地例如Na+或K+，
-F’为酰胺官能团，
-G为酯官能团、硫酯官能团、碳酸酯官能团、氨基甲酸酯官能团，
-R为包含1-18个碳的链，其任选地是支化的和/或不饱和的，任选地包含一个或多个杂原子，例如O、N或/和S，并且具有至少一个酸官能团，
●Ah为疏水性醇的残基，其从该疏水性醇的羟基官能团和由基团R所携带的至少一个亲电子官能团之间的偶联而产生，
所述包含羧基官能团的多糖在中性pH下是两亲性的。
该包含部分地被疏水性醇取代的羧基官能团的多糖选自通式IX的包含羧基官能团的多糖：
Figure BPA00001238057800141
其中
-q表示被F-R-G-Ah取代的多糖的羧基官能团的摩尔份数，并且为0.01-0.7，
-F’、R、G和Ah符合上文给出的定义，并且当该多糖的羧基官能团不被F’-R-G-Ah取代时，那么该多糖的所述羧基官能团为阳离子的羧酸盐，所述阳离子为碱金属阳离子，优选地例如Na+或K+。
在一个实施方案中，所述包含羧基官能团的多糖为天然地携带羧基官能团的多糖，并且选自藻酸盐、乙酰透明质酸、聚半乳糖醛酸。
在一个实施方案中，所述包含羧基官能团的多糖为通式X的合成多糖，其从天然地包含羧基官能团的多糖获得或者从在其上嫁接有至少15个羧基官能团/100个糖单元的中性多糖获得：
Figure BPA00001238057800151
-所述天然多糖选自占多数地由(1，6)和/或(1，4)和/或(1，3)和/或(1，2)类型的糖苷键构成的多糖，
-L为由于连接臂Q和该多糖的-OH官能团之间的偶联而产生的键，并且为酯官能团、硫酯官能团、碳酸酯官能团、氨基甲酸酯官能团或醚官能团，
-r表示取代基L-Q的摩尔份数/多糖的糖单元，
-Q为包含1-18个碳的链，其任选地是支化的和/或不饱和的，包含一个或多个杂原子，例如O、N或/和S，并且包含至少一个羧基官能团，-CO2H。
在一个实施方案中，该多糖占多数地由(1，6)类型的糖苷键构成。
在一个实施方案中，该占多数地由(1，6)类型的糖苷键构成的多糖为葡聚糖。
在一个实施方案中，该多糖占多数地由(1，4)类型的糖苷键构成。
在一个实施方案中，该占多数地由(1，4)类型的糖苷键构成的多糖选自出芽短梗霉聚糖、藻酸盐、乙酰透明质酸、木聚糖、聚半乳糖醛酸或水溶性纤维素。
在一个实施方案中，该多糖为出芽短梗霉聚糖。
在一个实施方案中，该多糖为藻酸盐。
在一个实施方案中，该多糖为乙酰透明质酸。
在一个实施方案中，该多糖为木聚糖。
在一个实施方案中，该多糖为聚半乳糖醛酸。
在一个实施方案中，该多糖为水溶性纤维素。
在一个实施方案中，该多糖占多数地由(1，3)类型的糖苷键构成。
在一个实施方案中，该占多数地由(1，3)类型的糖苷键构成的多糖为凝乳聚糖。
在一个实施方案中，该多糖占多数地由(1，2)类型的糖苷键构成。
在一个实施方案中，该占多数地由(1，2)类型的糖苷键构成的多糖为菊粉。
在一个实施方案中，该多糖占多数地由(1，4)和(1，3)类型的糖苷键构成。
在一个实施方案中，该占多数地由(1，4)和(1，3)类型的糖苷键构成的多糖为葡聚糖。
在一个实施方案中，该多糖占多数地由(1，4)和(1，3)和(1，2)类型的糖苷键构成。
在一个实施方案中，该占多数地由(1，4)和(1，3)和(1，2)类型的糖苷键构成的多糖为甘露聚糖。
在一个实施方案中，根据本发明的多糖的特征在于，基团Q选自下列基团：
Figure BPA00001238057800161
在一个实施方案中，r为0.1-2。
在一个实施方案中，r为0.2-1.5。
在一个实施方案中，根据本发明的基团R的特征在于，它选自氨基酸。
在一个实施方案中，所述氨基酸选自α-氨基酸。
在一个实施方案中，所述α-氨基酸选自天然α-氨基酸。
在一个实施方案中，所述天然α-氨基酸选自亮氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸。
在一个实施方案中，所述疏水性醇选自脂肪醇。
在一个实施方案中，所述疏水性醇选自由包含4-18个碳的不饱和或饱和的烷基链构成的醇。
在一个实施方案中，所述脂肪醇选自肉豆蔻醇、鲸蜡醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、丁醇、油醇、羊毛脂。
在一个实施方案中，所述疏水性醇选自胆固醇衍生物。
在一个实施方案中，所述胆固醇衍生物为胆固醇。
在一个实施方案中，所述疏水性醇Ah选自生育酚。
在一个实施方案中，所述生育酚为α-生育酚。
在一个实施方案中，所述α-生育酚为α-生育酚的外消旋物。
在一个实施方案中，所述疏水性醇选自携带芳基的醇。
在一个实施方案中，所述携带芳基的醇选自苄醇、苯乙醇。
所述多糖可以具有10-10000的聚合度m。
在一个实施方案中，它具有10-1000的聚合度m。
在另一个实施方案中，它具有10-500的聚合度m。
在一个实施方案中，所述组合物呈现为冻干物的形式。
在一个实施方案中，所述至少二价的阳离子的可溶性盐为二价阳离子(其选自钙、镁或锌阳离子)的可溶性盐。
在一个实施方案中，所述至少二价的阳离子的可溶性盐为钙的可溶性盐。
“至少二价的阳离子的可溶性盐”是指其溶解度等于或大于5mg/mL，优选地10mg/mL，优选地20mg/mL的盐。
在一个实施方案中，所述二价阳离子的可溶性盐为钙盐，其中钙的抗衡离子选自负氯离子、D-葡糖酸根、甲酸根、D-糖二酸根、乙酸根、L-乳酸根、谷氨酸根、天冬氨酸根、丙酸根、富马酸根、山梨酸根、碳酸氢根、负溴离子或抗坏血酸根。
在一个实施方案中，所述二价阳离子的可溶性盐为镁盐，其中镁的抗衡离子选自负氯离子、D-葡糖酸根、甲酸根、D-糖二酸根、乙酸根、L-乳酸根、谷氨酸根、天冬氨酸根、丙酸根、富马酸根、山梨酸根、碳酸氢根、负溴离子或抗坏血酸根。
在一个实施方案中，所述二价阳离子的可溶性盐为锌盐，其中锌的抗衡离子选自负氯离子、D-葡糖酸根、甲酸根、D-糖二酸根、乙酸根、L-乳酸根、谷氨酸根、天冬氨酸根、丙酸根、富马酸根、山梨酸根、碳酸氢根、负溴离子或抗坏血酸根。
在一个实施方案中，所述二价阳离子的可溶性盐为氯化钙。
在一个实施方案中，所述阳离子的可溶性盐为多价阳离子的可溶性盐。
“多价阳离子”是指携带超过2个正电荷的种类，例如铁，铝，阳离子聚合物如聚赖氨酸、精胺、鱼精蛋白、纤维蛋白。
单独的或相组合的“成骨生长因子”或“BMP”是指选自在治疗上有活性的BMPs(骨形态发生蛋白)的BMP。
更具体地，所述成骨蛋白质选自BMP-2(代勃特明-α)、BMP-4、BMP-7(依托特明-α)、BMP-14和GDF-5。
在一个实施方案中，所述成骨蛋白质为BMP-2(代勃特明-α)。
在一个实施方案中，所述成骨蛋白质为GDF-5。
所使用的BMP为重组人BMP，其根据本领域技术人员已知的技术来获得，或者购自供应商例如Research Diagnostic Inc.(USA)公司。
在一个实施方案中，水凝胶可以紧在植入之前制备。
在一个实施方案中，可以制备好水凝胶并保存于预装填的注射器中，以便随后进行植入。
在一个实施方案中，水凝胶可以紧在植入之前通过冻干物的再水化来制备，或者可以以脱水形式进行植入。
冻干是水升华技术，其允许组合物脱水。该技术通常用于蛋白质的保存和稳定化。
冻干物的再水化是非常快速的，并且使得能够容易地获得现用型制剂，所述制剂可以在植入之前再水化，或者以其脱水形式植入，随后在植入之后通过与生物学流体相接触而发生再水化。
此外，还可以向这些成骨生长因子中添加其他蛋白质，特别是血管生成生长因子例如PDGF、VEGF或FGF。
因此，本发明涉及根据本发明的组合物，其特征在于，它还包含选自PDGF、VEGF或FGF的血管生成生长因子。
通过植入来使用根据本发明的成骨组合物，例如用于填补骨质缺损，用于施行脊椎融合或上颌面修补，或者用于治疗骨折愈合缺乏(假关节)。
在这些各种不同的治疗应用中，基质的尺寸和成骨生长因子的量依赖于待填补的部位的体积。
在一个实施方案中，阴离子多糖的溶液具有0.1mg/ml-100mg/ml，优选地1mg/ml-75mg/ml，更优选地5-50mg/ml的浓度。
在一个实施方案中，对于脊椎植入物，成骨生长因子的剂量为0.05mg-8mg，优选地0.1mg-4mg，更优选地0.1mg-2mg，然而在文献中通常接受的剂量为8-12mg。
在一个实施方案中，对于脊椎植入物，血管生成生长因子的剂量为0.05mg-8mg，优选地0.1mg-4mg，更优选地0.1mg-2mg。
关于在上颌面修补中或者在假关节治疗中的应用，例如，所施用的剂量小于1mg。
在一个实施方案中，二价阳离子的溶液具有0.01-1M，优选地0.05-0.2M的浓度。
在一个实施方案中，阴离子多糖的溶液具有0.1mg/ml-100mg/ml，优选地1mg/ml-75mg/ml，更优选地5-50mg/ml的浓度。
本发明还涉及用于制备根据本发明的植入物的方法，其至少包括下列步骤：
a)提供包含成骨生长因子/阴离子多糖复合物的溶液，以及有机基质和/或水凝胶，
b)将所述包含复合物的溶液添加至所述有机基质和/或水凝胶，并且任选地使该混合物均质化，
c)将至少二价的阳离子的可溶性盐的溶液添加至在b)中所获得的植入物，
d)任选地对在步骤c)中所获得的植入物进行冻干。
本发明还涉及用于制备根据本发明的植入物的方法，其至少包括下列步骤：
a)提供包含成骨生长因子/两亲性阴离子多糖复合物的溶液，以及有机基质和/或水凝胶，
b)将至少二价的阳离子的可溶性盐的溶液添加至a)的有机基质和/或水凝胶，
c)将所述包含生长因子的溶液添加至在b)中所获得的有机基质和/或水凝胶，并且任选地使该混合物均质化，
d)任选地对在步骤c)中所获得的植入物进行冻干。
在一个实施方案中，所述有机基质为由交联水凝胶和/或胶原构成的基质。
在一个实施方案中，所述基质选自基于经灭菌的、优选地交联的、纯化的天然胶原的基质。
在一个实施方案中，在步骤a)中，该形成交联或非交联的水凝胶的聚合物选自合成聚合物的组，其中包括乙二醇和乳酸的共聚物、乙二醇和乙醇酸的共聚物、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚乙烯酸、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸。
在一个实施方案中，在步骤a)中，该形成交联或非交联的水凝胶的聚合物选自天然聚合物的组，其中包括透明质酸、角质素、果胶、葡聚糖、纤维素和纤维素衍生物、藻酸、黄原胶、角叉菜聚糖、壳聚糖、软骨素、胶原、明胶、聚赖氨酸、纤维蛋白以及它们的在生物学上可接受的盐。
在一个实施方案中，所述天然聚合物选自形成水凝胶的多糖的组，其中包括透明质酸、藻酸、葡聚糖、果胶、纤维素及其衍生物、出芽短梗霉聚糖、黄原胶、角叉菜聚糖、壳聚糖、软骨素以及它们的在生物学上可接受的盐。
在一个实施方案中，在步骤a)中，所述天然聚合物选自形成水凝胶的多糖的组，其中包括透明质酸、藻酸以及它们的在生物学上可接受的盐。
在一个实施方案中，在步骤b)或c)中，所述至少二价的阳离子的可溶性盐的溶液为二价阳离子的溶液。
在一个实施方案中，所述二价阳离子的可溶性盐为钙盐，其中钙的抗衡离子选自负氯离子、D-葡糖酸根、甲酸根、D-糖二酸根、乙酸根、L-乳酸根、谷氨酸根、天冬氨酸根、丙酸根、富马酸根、山梨酸根、碳酸氢根、负溴离子或抗坏血酸根。
在一个实施方案中，所述二价阳离子的可溶性盐为氯化钙。
在一个实施方案中，所述二价阳离子的可溶性盐为镁盐，其中镁的抗衡离子选自负氯离子、D-葡糖酸根、甲酸根、D-糖二酸根、乙酸根、L-乳酸根、谷氨酸根、天冬氨酸根、丙酸根、富马酸根、山梨酸根、碳酸氢根、负溴离子或抗坏血酸根。
在一个实施方案中，所述二价阳离子的可溶性盐为锌盐，其中锌的抗衡离子选自负氯离子、D-葡糖酸根、甲酸根、D-糖二酸根、乙酸根、L-乳酸根、谷氨酸根、天冬氨酸根、丙酸根、富马酸根、山梨酸根、碳酸氢根、负溴离子或抗坏血酸根。
在一个实施方案中，在步骤b)或c)中，所述至少二价的阳离子的可溶性盐的溶液为多价阳离子的溶液。
在一个实施方案中，所述多价阳离子选自铁多价阳离子，铝多价阳离子，或者阳离子聚合物例如聚赖氨酸、精胺、鱼精蛋白、纤维蛋白。
在一个实施方案中，在步骤a)中，还提供非成骨生长因子的溶液。
本发明还涉及根据本发明的组合物作为骨植入物的用途。
在一个实施方案中，所述组合物可以与脊椎假体或脊椎融合支架类型的修复装置相组合地进行使用。
本发明还涉及治疗和手术方法，其在骨重构中使用所述组合物。
通过下列实施例来举例说明本发明。
实施例1：通过L-色氨酸的钠盐进行修饰的葡聚糖甲基羧酸钠的制备
聚合物1为通过L-色氨酸的钠盐进行修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，其根据专利申请FR07.02316中所描述的方法从具有40kg/mol的重均摩尔质量(即154的聚合度)的葡聚糖(Pharmacosmos)获得。通过色氨酸进行修饰或未进行修饰的甲基羧酸钠的摩尔份数，即在式I中的t，为1.03。通过色氨酸进行修饰的甲基羧酸钠的摩尔份数，即在式III中的p，为0.36。
实施例2：通过L-色氨酸的乙酯进行修饰的葡聚糖甲基羧酸钠的制备
聚合物2为通过L-色氨酸的乙酯进行修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，其根据专利申请FR07.02316中所描述的方法从具有40kg/mol的重均摩尔质量(即154的聚合度)的葡聚糖(Pharmacosmos)获得。通过色氨酸的乙酯进行修饰或未进行修饰的甲基羧酸钠的摩尔份数，即在式III中的t，为1.07。通过色氨酸的乙酯进行修饰的甲基羧酸钠的摩尔份数，即在式III中的p，为0.49。
实施例3：通过L-甘氨酸的癸酯进行修饰的葡聚糖甲基羧酸钠的制备
聚合物3为通过L-甘氨酸的癸酯进行修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，其根据专利申请FR08.05506中所描述的方法从具有40kg/mol的重均摩尔质量(即154的聚合度)的葡聚糖(Pharmacosmos)获得。通过L-甘氨酸的癸酯进行修饰或未进行修饰的甲基羧酸钠的摩尔份数，即在式X中的r，为1.04。通过L-甘氨酸的癸酯进行修饰的甲基羧酸钠的摩尔份数，即在式IX中的q，为0.09。
实施例4：通过L-苯丙氨酸的辛酯进行修饰的葡聚糖甲基羧酸钠的制备
聚合物4为通过L-苯丙氨酸的辛酯进行修饰的葡聚糖甲基羧酸钠，其根据专利申请FR08.05506中所描述的方法从具有40kg/mol的重均摩尔质量(即154的聚合度)的葡聚糖(Pharmacosmos)获得。通过L-苯丙氨酸的辛酯进行修饰或未进行修饰的甲基羧酸钠的摩尔份数，即在式X中的r，为1.07。通过L-苯丙氨酸的辛酯进行修饰的甲基羧酸钠的摩尔份数，即在式IX中的q，为0.08。
实施例5：rhGDF-5/聚合物3复合物的制备
制剂1：将50μl的在5mM HCl中的2.0mg/ml rhGDF-5溶液与50μl的61.1mg/ml聚合物3溶液相混合。该聚合物溶液用20mM磷酸盐(pH 7.2)进行缓冲。GDF-5/聚合物3复合物的溶液处于pH 6.4，并且包含10mM磷酸盐。GDF-5/聚合物3的摩尔比为1/20。最后，使该溶液通过0.22μm进行过滤。终溶液是澄清的，并且通过动态光散射来进行表征。大多数所存在的物体的尺寸小于10nm。
实施例6：rhGDF-5/聚合物4复合物的制备
制剂2：将679μl的在10mM HCl中的3.7mg/ml rhGDF-5溶液与1821μl的42.3mg/ml聚合物4溶液(pH 7.3)相混合。GDF-5/聚合物4复合物的溶液处于pH 6.5，并且包含1mg/ml GDF-5和30.8mg/ml聚合物4。GDF-5/聚合物4的摩尔比为1/20。最后，使该溶液通过0.22μm进行过滤。终溶液是澄清的，并且通过动态光散射来进行表征。大多数所存在的物体的尺寸小于10nm。
实施例7：胶原海绵/rhBMP-2这类植入物的制备
植入物1：将40μl的0.05mg/ml rhBMP-2溶液无菌地引入到Helistat类型的、无菌的、200mm3的交联胶原海绵(Integra LifeSciences，Plainsboro，New Jersey)中。在使用前，使该溶液在胶原海绵中温育30分钟。BMP-2的剂量为2μg。
植入物2：它如同植入物1一样进行制备，其中使用40μl的0.5mg/ml rhBMP-2溶液。BMP-2的剂量为20μg。
实施例8：rhBMP-2/聚合物1复合物的制备
制剂3：将50μl的0.15mg/ml rhBMP-2溶液与100μl的37.5mg/ml聚合物1溶液相混合。将rhBMP-2和聚合物1的溶液缓冲至pH7.4。使该溶液在4℃下温育2小时，并且通过0.22μm无菌过滤。
制剂4：它如同制剂3一样进行制备，其中将50μl的1.5mg/mlrhBMP-2溶液与100μl的37.5mg/ml聚合物1溶液相混合。
实施例9：冻干的‘胶原海绵’/‘在氯化钙存在下的BMP-2/聚合物1复合物’这类植入物的制备
植入物3：将40μl的制剂4引入到Helistat类型的、无菌的、200mm3的交联胶原海绵(Integra LifeSciences，Plainsboro，New Jersey)中。使该溶液在胶原海绵中温育30分钟，然后再添加100μl的浓度为18.3mg/ml的氯化钙溶液。在15分钟后，该海绵即可现用。BMP-2的剂量为20μg。
实施例10：冻干的‘胶原海绵’/‘在氯化钙存在下的BMP-2/聚合物1复合物’这类植入物的制备
植入物4：将40μl的制剂3引入到Helistat类型的、无菌的、200mm3的交联胶原海绵(Integra LifeSciences，Plainsboro，New Jersey)中。使该溶液在胶原海绵中温育30分钟，然后再添加100μl的浓度为18.3mg/ml的氯化钙溶液。然后，将该海绵冷冻，并无菌冻干。BMP-2的剂量为2μg。
植入物5：它如同植入物4一样进行制备，其中使用40μl的制剂4。BMP-2的剂量为20μg。
实施例11：各种不同制剂的骨诱导能力的评价
该研究的目的是在大鼠中的骨异位形成模型之中证实各种不同制剂的骨诱导能力。将150-250g的雄性大鼠(Sprague Dawley OFA-SD，Charles River Laboratories France，B.P.109，69592l’Arbresle)用于该研究。
在外科手术之前，实施镇痛处理(丁丙诺啡，Temgesic
Figure BPA00001238057800251
，Pfizer，France)。通过吸入O2-异氟烷混合物(1-4％)来使大鼠麻醉。通过在宽的背侧区域上剃毛而去除皮毛。用聚维酮碘的溶液(Vetedine溶液，Vetoquinol，France)对该背侧区域的皮肤进行消毒。
实施大约1cm的椎旁切口，以便脱离出右侧和左侧的背侧椎旁肌肉。通过经筋膜的切口来实现对肌肉的接近。将每个植入物以使得在其上不能施加任何压力的方式置于袋中。植入了4个植入物/大鼠(2个植入物/部位)。然后，使用聚丙烯线(Prolene 4/0，Ethicon，France)缝合植入物的开口。使用非吸收性缝线来使皮肤再闭合。然后，将大鼠重新放回其各自的笼中，并且在它们恢复过程中保持处于观察之下。
在21天时，通过注射替来他明-唑拉西泮(ZOLETIL25-50mg/kg，IM，VIRBAC，France)来使动物麻醉。
然后，通过注射一个剂量的戊巴比妥(DOLETHAL
Figure BPA00001238057800254
，VETOQUINOL，France)来使动物安乐死。然后，进行每个部位的肉眼观察，根据下述量表来对局部不耐性的任何征候(炎症、坏死、出血)以及骨和/或软骨组织的存在进行记录和评分：0：不存在，1：弱，2：中等，3：显著，4：重大。
将每个植入物从其植入部位中取出，并获取宏观照片。然后，测定植入物的尺寸和重量。然后，将每个植入物保存在经缓冲的10％福尔马林溶液中。
结果：
通过将植入物置于大鼠背部肌肉中，该体内实验使得能够测量BMP-2的骨诱导效应。该非骨部位被称为“异位的”。
外植体的肉眼观察使得我们能够评价骨组织的存在和植入物的质量。
在胶原海绵中的2μg BMP-2的剂量(植入物1)不具有足够的骨诱导能力以便能够在21天后发现胶原性植入物。
在胶原海绵中的20μg BMP-2的剂量(植入物2)导致在21天后获得平均质量为38mg的骨化植入物。
对于大约20μg的相同的BMP-2剂量，以在胶原海绵中的溶液形式的在CaCl2存在下的BMP-2/聚合物1复合物(植入物3)使得能够增加BMP-2的成骨活性。植入物3的平均质量为植入物2的平均质量的大约3倍。
冻干使得能够扩大成骨活性的该增益，因为在胶原海绵中的、冻干的、包含以在CaCl2存在下的与聚合物1的复合物形式的20μg BMP-2的植入物(植入物5)的平均质量为其中在CaCl2存在下的BMP-2/聚合物1复合物处于溶液中的植入物(植入物3)的平均质量的2倍。
对于低至1/10的BMP-2剂量，在胶原海绵中的、冻干的、在CaCl2存在下的BMP-2复合物(植入物4)使得能够产生质量为两倍的骨化植入物，其具有与使用单独的BMP-2时的植入物等价的骨得分。这种新型制剂使得能够大大地减少待施用的BMP-2的剂量，并同时维持该蛋白质的成骨活性。
实施例12：包含rhBMP-2/聚合物1复合物的制剂的制备
制剂5：将552μl的1.35mg/ml rhBMP-2溶液与619μl的60.0mg/ml聚合物1溶液相混合。通过添加无菌水来将制剂5的体积补足至1300μl。使该溶液在4℃下温育2小时，并且通过0.22μm无菌过滤。在制剂5中rhBMP-2的浓度为0.571mg/ml，和聚合物1的浓度为28.6mg/ml。
制剂6：它如同制剂5一样进行制备，其中将175μl的1.47mg/mlrhBMP-2溶液与1224μl的60.0mg/ml聚合物1溶液相混合。通过添加无菌水来将制剂6的体积补足至1800μl。在制剂6中rhBMP-2的浓度为0.14mg/ml，和聚合物1的浓度为40.8mg/ml。
制剂7：它如同制剂5一样进行制备，其中将26.5μl的1.46mg/mlrhBMP-2溶液与321.7μl的60.0mg/ml聚合物1溶液相混合。通过添加无菌水来将制剂的体积补足至772μl。在制剂7中rhBMP-2的浓度为0.05mg/ml，和聚合物1的浓度为25mg/ml。
实施例13：包含氯化钙的透明质酸钠凝胶的制备
凝胶1：将10.62ml无菌水引入到50ml Falcon中。在剧烈涡旋搅动下，添加0.44g透明质酸钠(药物级别80，Kibun Food Chemifa，LTD)。然后，也在搅动下，将0.14g氯化钙添加到透明质酸钠凝胶中。在该凝胶中氯化钙的浓度为13.1mg/ml。
实施例14：包含rhBMP-2/聚合物1复合物和氯化钙的透明质酸钠凝胶的制备
凝胶2：将1230μl的制剂5转移到10ml无菌注射器中。将5.8ml的包含浓度为13.1mg/ml的氯化钙的4％透明质酸钠的凝胶1转移到10ml无菌注射器中。通过将这两个注射器相联接而将制剂5的溶液添加到凝胶1中，并且通过从一个注射器到另一个注射器的数次经过来使所获得的凝胶均质化。将所获得的不透明的凝胶转移到50mlFalcon中。在凝胶2中rhBMP-2的浓度为0.10mg/ml，和聚合物1的浓度为5.0mg/ml。
注射200μl的凝胶2/植入部位。所植入的rhBMP-2剂量为20μg。
实施例15：包含rhBMP-2/聚合物1复合物和氯化钙的透明质酸钠凝胶的制备
凝胶3：如实施例13中所描述的来制备该凝胶，其中使用1697μl的制剂6和8ml的包含浓度为15.8mg/ml的氯化钙的4％透明质酸钠的凝胶。在凝胶3中rhBMP-2的浓度为0.025mg/ml，和聚合物1的浓度为7.14mg/ml。
注射200μl的凝胶3/植入部位。所植入的rhBMP-2剂量为5μg。
实施例16：包含rhBMP-2/聚合物1复合物和氯化钙的藻酸钠凝胶的制备
凝胶4：通过使用772μl的制剂7和386μl的40mg/ml藻酸钠凝胶来制备该凝胶。将40μl的45.5mg/ml氯化钙溶液添加到60μl的包含rhBMP-2/聚合物1复合物的藻酸钠凝胶中。在凝胶4中rhBMP-2的浓度为0.02mg/ml，和聚合物1的浓度为10.0mg/ml。
注射100μl的凝胶4/植入部位。所植入的rhBMP-2剂量为2μg。
实施例17：包含藻酸钠凝胶的胶原植入物的制备，所述藻酸钠凝胶包含rhBMP-2/聚合物1复合物和氯化钙
植入物6：通过使用645μl的制剂7和323μl的40mg/ml藻酸钠凝胶来制备凝胶5。将60μl的包含rhBMP-2/聚合物1复合物的藻酸钠凝胶添加到Helistat类型的、无菌的、200mm3的交联胶原海绵(Integra LifeSciences，Plainsboro，New Jersey)中。还将40μl的45.5mg/ml氯化钙溶液添加到该海绵中。然后，在30分钟的接触时间后，将该海绵冷冻并冻干。该海绵可以直接植入到大鼠中。
植入物1中rhBMP-2的剂量为2μg，聚合物1的剂量为1mg。
实施例18：各种不同制剂的骨诱导性能力的评价
根据实施例11中所描述的方案来评价骨诱导能力。
结果：
该体内实验使得能够测量置于大鼠背部肌肉中的rhBMP-2的骨诱导效应。该非骨部位被称为“异位的”。各种不同实施例的结果概括在下表中。
在胶原海绵中的2μg rhBMP-2的剂量(植入物1)不具有足够的骨诱导能力以便能够在21天后发现外植体。
在胶原海绵中的20μg rhBMP-2的剂量(植入物2)导致在21天后获得平均质量为38mg的骨化外植体。
对于20μg的相同的rhBMP-2剂量，包含有在氯化钙存在下的rhBMP-2/聚合物1复合物的透明质酸钠凝胶(凝胶2)使得能够增加rhBMP-2的成骨活性。用凝胶2所获得的外植体的平均质量为用包含20μg单独的rhBMP-2的胶原植入物(植入物8)所获得的外植体的平均质量的大约6倍。
对于低至1/4的rhBMP-2剂量，即5μg rhBMP-2，在透明质酸钠凝胶中的在CaCl2存在下的rhBMP-2/聚合物1复合物(凝胶3)使得能够产生质量高至9倍的骨化外植体，其具有与使用包含20μg单独的rhBMP-2的胶原植入物(植入物8)所获得的外植体等价的骨得分。这种新型制剂使得能够大大地减少BMP-2的剂量，并同时维持该蛋白质的成骨活性。
对于低至1/10的rhBMP-2剂量，在包含氯化钙的藻酸钠凝胶中的rhBMP-2/聚合物1复合物(凝胶4)使得能够产生这样的骨化外植体，所述骨化外植体的质量略微大于使用包含20μg单独的rhBMP-2的胶原植入物(植入物8)所获得的外植体。这种新型制剂使得能够大大地减少rhBMP-2的剂量，并同时维持该蛋白质的成骨活性。
也可以将包含rhBMP-2/聚合物1复合物的藻酸盐凝胶置于胶原海绵中，所述胶原海绵用作用于骨细胞生长的支持物。在该情况下，2μgrhBMP-2(植入物6)同样也使得能够获得这样的骨化外植体，所述骨化外植体的质量大于使用包含20μg单独的rhBMP-2的胶原植入物(植入物8)所获得的外植体。

Claims (34)

1.由成骨组合物构成的开放植入物，所述成骨组合物至少包含：
●成骨生长因子，
●至少二价的阳离子的可溶性盐，和
●有机支持物，
●所述有机支持物不包含脱矿质骨基质。
2.根据权利要求1的植入物，其特征在于，所述支持物由有机基质和/或形成水凝胶的聚合物构成。
3.根据前述权利要求中任一项的植入物，其特征在于，所述有机基质为由交联水凝胶和/或胶原构成的基质。
4.根据前述权利要求中任一项的植入物，其特征在于，所述基质选自基于经灭菌的、优选地交联的、纯化的天然胶原的基质。
5.根据前述权利要求中任一项的植入物，其特征在于，该形成交联或非交联的水凝胶的聚合物选自合成聚合物的组，其中包括乙二醇和乳酸的共聚物、乙二醇和乙醇酸的共聚物、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚乙烯酸、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸。
6.根据权利要求1-5中任一项的植入物，其特征在于，该形成交联或非交联的水凝胶的聚合物选自天然聚合物的组，其中包括透明质酸、角质素、出芽短梗霉聚糖、果胶、葡聚糖、纤维素和纤维素衍生物、藻酸、黄原胶、角叉菜聚糖、壳聚糖、软骨素、胶原、明胶、聚赖氨酸、纤维蛋白以及它们的在生物学上可接受的盐。
7.根据权利要求6的植入物，其特征在于，所述天然聚合物选自形成水凝胶的多糖的组，其中包括透明质酸、藻酸、葡聚糖、出芽短梗霉聚糖、果胶、纤维素及其衍生物、黄原胶、角叉菜聚糖、壳聚糖、软骨素以及它们的在生物学上可接受的盐。
8.根据权利要求6的植入物，其特征在于，所述天然聚合物选自形成水凝胶的多糖的组，其中包括透明质酸、藻酸以及它们的在生物学上可接受的盐。
9.根据前述权利要求中任一项的植入物，其特征在于，所述组合物呈现为冻干物的形式。
10.根据前述权利要求中任一项的植入物，其特征在于，所述成骨生长因子选自在治疗上有活性的BMP(骨形态发生蛋白)。
11.根据前述权利要求中任一项的植入物，其特征在于，所述成骨生长因子选自BMP-2(代勃特明-α)、BMP-4、BMP-7(依托特明-α)、BMP-14和GDF-5。
12.根据前述权利要求中任一项的植入物，其特征在于，所述成骨蛋白质为BMP-2(代勃特明-α)。
13.根据前述权利要求中任一项的植入物，其特征在于，所述成骨蛋白质为GDF-5。
14.根据前述权利要求中任一项的植入物，其特征在于，所述植入物还包含选自PDGF、VEGF或FGF的血管生成生长因子。
15.根据前述权利要求中任一项的植入物，其特征在于，所述至少二价的阳离子为选自钙、镁或锌阳离子的二价阳离子。
16.根据前述权利要求中任一项的植入物，其特征在于，所述二价阳离子的可溶性盐为钙盐，其中钙的抗衡离子选自负氯离子、D-葡糖酸根、甲酸根、D-糖二酸根、乙酸根、L-乳酸根、谷氨酸根、天冬氨酸根、丙酸根、富马酸根、山梨酸根、碳酸氢根、负溴离子或抗坏血酸根。
17.根据前述权利要求中任一项的植入物，其特征在于，所述二价阳离子的可溶性盐为氯化钙。
18.根据权利要求1-15中任一项的植入物，其特征在于，所述至少二价的阳离子为选自下列的多价阳离子：铁阳离子，铝阳离子，或选自聚赖氨酸、精胺、鱼精蛋白和纤维蛋白的阳离子聚合物，它们是单独的或相组合的。
19.根据前述权利要求中任一项的植入物，其特征在于，所述两亲性多糖选自通过疏水性衍生物进行官能化的多糖。
20.根据前述权利要求中任一项的植入物，其特征在于，所述两亲性多糖选自阴离子多糖，所述阴离子多糖占多数地包含(1，4)、(1，3)和/或(1，2)类型的糖苷键，通过至少一个色氨酸衍生物进行官能化，并且符合下述通式I：
Figure FPA00001238057700031
●该多糖占多数地由(1，4)和/或(1，3)和/或(1，2)类型的糖苷键构成，
●F由于连接臂R和该中性或阴离子多糖的-OH官能团之间的偶联而产生，为酯官能团、硫酯官能团、酰胺官能团、碳酸酯官能团、氨基甲酸酯官能团、醚官能团、硫醚官能团或胺官能团，
●R为包含1-18个碳的链，其任选地是支化的和/或不饱和的，包含一个或多个杂原子，例如O、N和/或S，并且具有至少一个酸官能团，
●Trp为L-或D-色氨酸衍生物的残基，其从该色氨酸衍生物的胺和由基团R所携带的所述至少一个酸和/或由该阴离子多糖所携带的酸之间的偶联而产生，
n表示被Trp取代的R的摩尔份数，并且为0.05-0.7，
o表示被Trp取代的多糖的酸官能团的摩尔份数，并且为0.05-0.7，
i表示由基团R所携带的酸官能团的摩尔份数/糖单元，并且为0-2，
j表示由该阴离子多糖所携带的酸官能团的摩尔份数/糖单元，并且为0-1，
(i+j)表示酸官能团的摩尔份数/糖单元，并且为0.1-2，
-当R不被Trp取代时，那么基团R的所述酸为阳离子的羧酸盐，所述阳离子为碱金属优选地例如Na或K的阳离子，
-当该多糖为阴离子多糖时，当该多糖的酸官能团不被Trp取代时，那么所述酸官能团与阳离子成盐，所述阳离子为碱金属阳离子，优选地例如Na+或K+，
所述多糖在中性pH下是两亲性的。
21.根据前述权利要求中任一项的植入物，其特征在于，所述两亲性多糖选自下述通式III的经官能化的阴离子多糖：
Figure FPA00001238057700041
●R为包含1-18个碳的链，其任选地是支化的和/或不饱和的，包含一个或多个杂原子，例如O、N或/和S，并且具有至少一个酸官能团，
●F由于连接臂R和该中性或阴离子多糖的-OH官能团之间的偶联而产生，为酯官能团、硫酯官能团、酰胺官能团、碳酸酯官能团、氨基甲酸酯官能团、醚官能团、硫醚官能团或胺官能团，
●AA为疏水性L-或D-氨基酸残基，其从该氨基酸的胺和由基团R所携带的酸之间的偶联而产生，所述疏水性氨基酸选自色氨酸衍生物，例如色氨酸、色氨醇、色氨酰胺、2-吲哚乙胺以及其碱金属阳离子盐，或者选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸以及其醇、酰胺或脱羧基衍生物，
t表示取代基F-R-[AA]n的摩尔份数/糖苷单元，并且为0.1-2，
p表示被AA取代的R的摩尔份数，并且为0.05-1，
当R不被AA取代时，那么基团R的所述酸为阳离子的羧酸盐，所述阳离子为碱金属阳离子，优选地例如Na+或K+，
所述葡聚糖在中性pH下是两亲性的。
22.根据前述权利要求中任一项的植入物，其特征在于，所述两亲性多糖选自通式IX的包含部分地被疏水性醇取代的羧基官能团的多糖：
Figure FPA00001238057700051
其中
-q表示被F-R-G-Ah取代的多糖的羧基官能团的摩尔份数，并且为0.01-0.7，
-F’为酰胺官能团，
-G为酯官能团、硫酯官能团、碳酸酯官能团、氨基甲酸酯官能团，
-R为包含1-18个碳的链，其任选地是支化的和/或不饱和的，任选地包含一个或多个杂原子，例如O、N或/和S，并且具有至少一个酸官能团，
●Ah为疏水性醇的残基，其从该疏水性醇的羟基官能团和由基团R所携带的至少一个亲电子官能团之间的偶联而产生，
-当该多糖的羧基官能团不被F’-R-G-Ah取代时，那么该多糖的所述羧基官能团为阳离子的羧酸盐，所述阳离子为碱金属阳离子，优选地例如Na+或K+，
所述包含羧基官能团的多糖在中性pH下是两亲性的。
23.用于制备根据本发明的植入物的方法，其至少包括下列步骤：
a)提供包含成骨生长因子的溶液，
b)提供有机基质和/或形成水凝胶的聚合物，
c)将所述包含该生长因子的溶液添加至所述有机基质和/或所述水凝胶，并且任选地使该混合物均质化，
d)将至少二价的阳离子的可溶性盐的溶液添加至在c)中所获得的植入物，
e)任选地对在步骤d)中所获得的植入物进行冻干。
24.根据权利要求23的方法，其特征在于，所述有机基质为由交联水凝胶和/或胶原构成的基质。
25.根据权利要求23的方法，其特征在于，所述基质选自基于经灭菌的、优选地交联的、纯化的天然胶原的基质。
26.根据权利要求23的方法，其特征在于，该形成交联或非交联的水凝胶的聚合物选自合成聚合物的组，其中包括乙二醇和乳酸的共聚物、乙二醇和乙醇酸的共聚物、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚乙烯酸、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸。
27.根据权利要求23-26中任一项的方法，其特征在于，该形成交联或非交联的水凝胶的聚合物选自天然聚合物的组，其中包括透明质酸、角质素、果胶、葡聚糖、纤维素和纤维素衍生物、藻酸、黄原胶、角叉菜聚糖、壳聚糖、软骨素、胶原、明胶、聚赖氨酸、纤维蛋白以及它们的在生物学上可接受的盐。
28.根据权利要求23的方法，其特征在于，所述天然聚合物选自形成水凝胶的多糖的组，该组由透明质酸、藻酸、葡聚糖、果胶、纤维素及其衍生物、出芽短梗霉聚糖、黄原胶、角叉菜聚糖、壳聚糖、软骨素以及它们的在生物学上可接受的盐构成。
29.根据权利要求23的方法，其特征在于，所述天然聚合物选自形成水凝胶的多糖的组，该组由透明质酸、藻酸以及它们的在生物学上可接受的盐构成。
30.根据权利要求23-29中任一项的方法，其特征在于，所述至少二价的阳离子的可溶性盐的溶液为二价阳离子的溶液。
31.根据权利要求30的方法，其特征在于，所述二价阳离子的可溶性盐选自镁盐，其中镁的抗衡离子为负氯离子、D-葡糖酸根、甲酸根、D-糖二酸根、乙酸根、L-乳酸根、谷氨酸根、天冬氨酸根、丙酸根、富马酸根、山梨酸根、碳酸氢根、负溴离子或抗坏血酸根。
32.根据权利要求31的方法，其特征在于，所述二价阳离子的可溶性盐选自氯化物、D-葡糖酸盐、甲酸盐、D-糖二酸盐、乙酸盐、L-乳酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐、丙酸盐、富马酸盐、山梨酸盐、碳酸氢盐、溴化物或抗坏血酸盐。
33.根据权利要求31的方法，其特征在于，在步骤d)中，所述二价阳离子的可溶性盐为氯化钙。
34.根据权利要求23-35中任一项的方法，其特征在于，在步骤a)中，还提供非成骨生长因子的溶液。
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