JP6325661B2 - 感熱性ヒアルロン酸複合体とその調製方法 - Google Patents

Description

本発明は、感熱性ヒアルロン酸複合体とその調製方法に関するものである。

ヒアルロン酸（ＨＡ）又はヒアルロン酸塩は、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの残基が交互に連結する天然由来の非分岐バイオポリマーで、細胞外マトリックスの主要な構成要素の１つである。

ヒアルロン酸は、分子量が５０ｋＤａ〜１００００ｋＤａの範囲にあり、医学用に移植可能な材料として使用される場合は、必要に応じて厳密な仕様に従い、組織からの抽出又は特定の微生物による発酵を経て調製することができる。

ヒアルロン酸は、流動学的、物理化学的及び生物学的に調整された特性を有する半合成誘導体を産生するために、化学的又は酵素的に修飾することができ、また修飾されてきた。

ヒアルロン酸は広い範囲で存在する非免疫原性の、創傷治癒と組織の再生において主要な機能を果たすさまざまな結合組織の細胞外マトリックスの主要な構成要素である。

上述の特徴のために、ヒアルロン酸は３０年以上にわたり、眼科手術、変形性関節炎治療、創傷管理、整容外科又は組織増大用の充填剤、癒着防止バリア、組織工学用の足場製品とヒドロゲルを含むさまざまな生医学的応用に使用されてきた。

研究におけるヒアルロン酸の用途は、さらに広範囲である。ヒアルロン酸は、周囲の空間を充填する傾向を有する極めて親水性の高い分子である。このため、ヒアルロン酸は多くの結合組織の細胞外マトリックスを充填する。興味深いことに、ヒアルロン酸が細胞遊走を調節するということが知られている。さらに興味深いことに、ＣＤ４４、ＣＤ５４（別名ＩＣＡＭ−１）とＣＤ１６８（別名ＲＨＡＭＭ）などの細胞表面受容体を能動的に標的とすることも知られている。多くの固形がんに発現しているＣＤ４４との相互作用を利用して、抗腫瘍薬の能動的な標的に利用されている。このように、現在研究されているヒアルロン酸の応用は、ドラッグデリバリーシステム及び刺激応答性ヒドロゲルの調製のための用途も含む。

その天然型において極めて親水性であるが、ヒアルロン酸の水溶特性は化学修飾によって調節することができる。そのような誘導体は、異なる物理化学、流動学、分解性、宿主組織応答の諸特性を示しつつも、化学修飾しても細胞がヒアルロン酸として認識するため極めて興味深いものである。

そのような誘導体の例として、ヒアルロン酸エステル類（ＥＰ ２１６４５３に開示）、ヒアルロン酸アミド類（ＥＰ １０９５０６４に開示）及びヒアルロン酸ベースの人工細胞外マトリックスが挙げられる（Ａｄｖ Ｍａｔｅｒ．２０１１ Ｍａｒ ２５；２３（１２）：Ｈ４１−５６）。

ヒアルロン酸の修飾について、さらに発展させて、一つ又は複数の外部刺激を適用することによってヒアルロン酸の溶解性を可逆的に修飾する可能性が考えられる。そのような「刺激応答性」材料は、このような反応性を本来有している分子をヒアルロン酸に接合することで獲得することが可能である（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ９０（２０１２）１３７８−１３８５，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１０，１１，１２６１−１２７２，ＷＯ２０１００９９８１８）。

「刺激応答性」材料の優れた例が、熱応答性ポリマー（ＴＰｓ）である。熱応答性ポリマーの化学構造は、水素結合ができるだけでなく、疎水的相互作用することもできる異なる官能基を有することを特徴とする。このような結合様式間の熱力学的平衡は温度依存性を有する。その結果、熱応答性ポリマーは、下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）より低い温度では膨張して完全に水和性であるが、下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）より高い温度では収縮して不溶性となる。

生医学的応用の分野では、卓越した熱応答性ポリマーとしてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ｐＮＩＰＡＭ）が挙げられ、３２℃の下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）において、水中で溶媒化とゲル化との間に急激な転移が起こることを特徴とし、この温度は生理学的には室温と体温との間の温度に相当する点である（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ９０（２０１２）１３７８−１３８５，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１０，１１，１２６１−１２７２，ＷＯ２０１００９９８１８）。

ＷＯ２０１００９９８１８において、「クリックケミストリー」によってそのような複合体を調製する方法と共に、ヒアルロン酸とｐＮＩＰＡＭの感熱性ヒアルロン酸複合体が開示されている。それらの下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）より高い温度に昇温すると、こうした複合体にヒドロゲル構造が生じる。形成されたヒドロゲル内の分子相互作用は非共有結合性であることから、転移は可逆的であり、それはその温度を下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）より下に低下させることによってもたらすことが可能であり、複合体は再び自由流動性を有する溶液になる。

ヒアルロン酸系の「刺激応答性」材料の調製のための他の適切な方法は、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ９０（２０１２）１３７８−１３８５に記載されており、ヒアルロン酸及びｐＮＩＰＡＭの感熱性ヒアルロン酸複合体あるいはジェファミン（登録商標）は、１，１’−カルボニルジイミダゾールの活性化による直接のアミド化を介して得られる。上記の出版物による方法が置換の方法として満足のいく程度の結果を得る一方、上記の方法によるそのような複合体の製剤を調製するには、実際のアミド化が起こる前に、市販のヒアルロン酸ナトリウム塩を陽イオン交換によって対応するテトラブチルアンモニウム塩に長時間かけて転換しなければならない。また有機溶媒すなわちＤＭＳＯ中で反応を実施しなければならず、そのためアミド化反応終了後、透析によるＤＭＳＯの除去が必要になる。得られる複合体は、それらのＬＣＳＴより低い温度又は高い温度で許容できる粘度を有する。しかしながら、例えば、相当する刺激がゲル化をもたらす前に注入部位から流出（「ブリーディング」として知られる）してはいけない状況下の生物医学的応用例では、ＬＣＳＴより低い温度での高い粘度は非常に望ましい。

そのため、調製法に労力を要せず、有機溶剤の使用を必要としないヒアルロン酸系の新しい「刺激応答性」材料、特に感熱性材料、を提供する必要性がある。さらにまた、市販の感熱性材料と比較して、優れた流動学的性質を示す感熱性材料、特にブリーディングが低減され感熱性による流動学的転移が改善された材料の調製法を提供することが望まれる。

ＷＯ ２０１０／０９９８１８ 号公報（ＡＯ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＧ） ＥＰ０２１６４５３号公報（Ｆｉｄｉａ Ｓ．ｐ．ａ） ＥＰ１０９５０６４号公報（Ｆｉｄｉａ Ｆａｒｍａｃｅｕｔｉｃｉ Ｓ．ｐ．ａ） ＣＮ１０２７７２８２３号公報（Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）

Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ６０，２００４，２４４７−２４６７） Ｒｅｃｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ２，４，６−ｔｒｉｃｈｌｏｒｏ−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ６２，２００６，９５０７−９５２２） Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｂｏｘｙｌ ｐｏｌｙｓａｃｈｈａｒｉｄｅｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ−（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ６６８，２００７，１８７−１９０） Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ "Ｃｌｉｃｋ" ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１１，１２，８２４−８３０） Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｍｅｄｉａ ｂｙ ｔｒｉａｚｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｍｉｄａｔｉｏｎ−（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００７，８，２１９０−２１９５） Ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｅｐ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，９０，２０１２，１３７８−１３８５） Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ａｎｄ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｐｏｌｙ（Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ） ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ ｂｅｈａｖｉｏｕｒｓ （Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．１，ｐｐ８７−９３，２００６） Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｏｌｙ（Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）−ｇｒａｆｔｅｄ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３，１−９）

本発明は、順不同だが、好ましくは次の順番で、ａ．所定量のヒアルロン酸、ｂ．所定量の１，３，５−トリアジン（又はｓ−トリアジン）化合物、及びｃ．所定量の、少なくとも１つの末端アミノ基を有する一つ又は複数の感熱性ポリマーを接触させる工程からなる感熱性ヒアルロン酸複合体を調製する方法を提供する。

本発明は、さらに、順不同だが、好ましくは次の順番で、ａ．所定量のヒアルロン酸、ｂ．所定量の１，３，５−トリアジン（又はｓ−トリアジン）化合物、及びｃ．所定量の、少なくとも１つの末端アミノ基を有する一つ又は複数の感熱性ポリマーを接触させる工程からなる方法によって得られる感熱性ヒアルロン酸複合体を提供する。

本発明はさらに、上に述べたような感熱性ヒアルロン酸複合体及び一つ又は複数の生物活性薬剤からなる生物活性薬剤のデリバリーシステムを提供する。

発明のさらなる実施態様は、従属クレーム中に定める。

本発明の範疇では、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ９０ （２０１２）１３７８−１３８５に記載された手順に従って^１Ｈの核磁気共鳴スペクトル測定法を使用して測定した場合、用語「置換度」は、少なくとも１つの末端アミノ基を有する感熱性ポリマーと反応した、所定量のヒアルロン酸の利用できるカルボン酸部分のパーセンテージを指す。

本発明の範疇では、用語「熱応答性」及び「感熱性」は同じ意味で使われ、その温度に応じて物理的特性が変化する材料の能力を意味する。

本発明の範疇では、用語「ヒアルロン酸」及び「ヒアルロナン」は同じ意味で使われ、両者とも酸性型のヒアルロン酸とその一価又は二価カチオンの塩類、好ましくは一価のカチオン、中でも好ましくはアルカリ金属カチオン、最も好ましくはナトリウムの塩類を意味する。したがって、現在の文書の範囲内で、単語「ヒアルロン酸」又は「ヒアルロナン」は同義語として使われ、ポリマーが解離あるいは解離してない状態であることを示唆している。
本発明の範疇では、用語「有機溶剤を基本的に含まない溶液」は、１重量パーセント未満、好ましくは０．１重量パーセント未満の有機溶剤を含む溶液を指す。

発明の好ましい実施態様は、図面を参照して以下に記載するが、発明の現在の好ましい実施態様を例示するためであって、これを限定するためのものではない。

は、ＤＭＴＭＭ（本発明、実施例１）、ＣＤＩ（比較例、実施例１０）及びＥＤＣ／ＮＨＳ（比較例、実施例１１）などの異なる化合物を用いたヒアルロン酸とｐＮＩＰＡＭから調製される感熱性ヒアルロン酸複合体の２０から４０℃の温度範囲における流動学的な特性（貯蔵せん断率Ｇ’、及び損失せん断率Ｇ’’）を示す。

本発明は、順不同だが、好ましくは次の順番で、ａ．所定量のヒアルロン酸、ｂ．所定量の１，３，５−トリアジン（又はｓ−トリアジン）化合物、及びｃ．所定量の、少なくとも１つの末端アミノ基を有する一つ又は複数の感熱性ポリマーに接触させる工程からなる感熱性ヒアルロン酸複合体を調製する方法を提供する。

ここで用いられる用語「感熱性ポリマー」及び「熱応答性ポリマー」は同じ意味で用いられ、その下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）より低い温度において水溶液中で水和殻を形成することができる能力があり、その下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）より高い温度で水和反応が著しく変化することができるポリマーを指す。

少なくとも１つの末端アミノ基を有する一つ又は複数の感熱性ポリマーは、ポリアクリルアミド、ポリビニルアミド、ポリアルキルオキサゾリン、ポリビニルイミダゾール、ポロキサマー、ポリエーテルアミン、両親媒性ペプチドとそれらのコポリマー及び混合物からなる群から選択されてもよい。

少なくとも１つの末端アミノ基を有するそのような感熱性ポリマーの具体例として、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ｐＮＩＰＡＭ）、ポリ（Ｎ−ビニルカプロラクタム）、ポリ（Ｎ−イソプロピルオキサゾリン）、ポリ（ビニルイミダゾール）とポリ（Ｎ−アクリロイル−ピロリジン）、ポリ（Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド）、ポリエーテルアミン及びポロキサマーが挙げられる。

ここで用いられる用語「ポリ（Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド）」は、ポリ（Ｎ−アルキルメタクリルアミド）又はポリ（Ｎ−アルキルアクリルアミド）の両方を指す。

好ましい実施態様において、所定量の一つ又は複数の感熱性ポリマー、好ましくは水性溶媒に可溶化した、を所定量のヒアルロン酸、好ましくは水性溶媒に可溶化した、に接触させ、次に所定量の１，３，５−トリアジン（又はｓ−トリアジン）化合物を１つ又は複数の感熱性ポリマーとヒアルロン酸の混合物に接触させる。

別の実施態様において、所定量のヒアルロン酸、好ましくは水性溶媒で可溶化した、を所定量の１，３，５−トリアジン（又はｓ−トリアジン）化合物と接触させ、続いて所定量の一つ又は複数の感熱性ポリマー、好ましくは水性溶媒で可溶化した、を、可溶化したヒアルロン酸と１，３，５−トリアジンの混合物に接触させる。

別の実施態様において、所定量の一つ又は複数の感熱性ポリマー、好ましくは水性溶媒で可溶化した、を所定量の１，３，５−トリアジン（又はｓ−トリアジン）化合物に接触させ、続いて所定量のヒアルロン酸、好ましくは水性溶媒で可溶化した、を可溶化した１つ又は複数感熱性ポリマーと１，３，５−トリアジンの混合物に接触させる。

この方法の好ましい実施態様において、ヒアルロン酸と感熱性ポリマーを水性溶媒、好ましくはｐＨが４．０〜９．５、好ましくは４．５〜７．５、さらに好ましくは５．０〜７．５又は５．０〜６である水性緩衝液にて一緒に可溶化する。最も好ましくは、水性溶媒又は水性緩衝液は基本的に有機溶剤を含まない。

得られる溶液の分子量及び望ましい粘度に応じて、ヒアルロン酸の所定量を、０．１〜１５％ｗ／ｖ、好ましくは０．１〜５％ｗ／ｖ、特に約０．７％ｗ／ｖ、１．０％ｗ／ｖ又は１．５％ｗ／ｖのヒアルロン酸濃度となるように、水又は水性緩衝液などの水性溶媒に溶解してもよい。一般に、同じｗ／ｖ濃度では、高分子量ヒアルロン酸は、低分子量のヒアルロン酸より高い粘度が得られる。

ヒアルロン酸及び／又は感熱性ポリマーの可溶化にふさわしい水性溶媒は、当業者にとって周知の一般に用いられる水性溶媒のいずれであってもよい。水性溶媒は、水、純水あるいは超純水（注射用蒸留水を含む）、水性緩衝液、酸性溶液、塩基性溶液、食塩水、生理食塩水及びグルコース生理食塩水からなる群から選択されてもよい。ｐＨが４．０〜９．５の水性緩衝液は、例えば酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液食塩水、トリス緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ及びリン酸カリウム（例えば２５ｍＭ〜５００ｍＭの範囲及び４．０〜９．５のｐＨ範囲）である。水性溶媒又は水性緩衝液は、有機溶剤を最高６０％まで含むこともできる。有機溶剤の例として、アルコール類、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＮＭＰ、アセトニトリル、エタノール、メタノール、（ｎ−又はｉｓｏ−）プロパノール、ブタノール、ジオキサン及びＴＨＦが挙げられるが、これに限定されない。好ましくは、水性溶媒又は水性緩衝液は有機溶剤を含まず、すなわち水性溶媒又は水性緩衝液の有機溶剤の含有量が水性溶媒又は水性緩衝液の総重量に基づいて０．１重量％を超えないことを意味する。

本発明に従う方法は、＋２と＋５０℃、好ましくは＋２と＋８℃の間の温度範囲で、最高１週間、進行させてもよい。例えば本発明に従う方法が有機溶剤を含まない水性溶媒、例えば水、食塩水又は緩衝液で行われる場合には、この方法は好ましくは室温以下で、具体的には＋２と＋１５℃、より好ましくは＋２と８℃の間で実施される。より具体的には、反応時間の例として、４時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２日、３日、５日及び７日が挙げられるが、これに限定されない。好ましい実施態様において、反応は３〜５日間で進行させる。

最終生成物は、当業者に周知の標準的な有機化学及び高分子化学の手順、例えば透析、凍結乾燥、抽出、結晶化、溶媒添加又は蒸発により誘導される沈殿、温度変化によって誘発される沈殿又はゲル化、又はそれらの組合せなどを介して精製・分離される。

方法の別の実施態様において、少なくとも１つの末端アミノ基を有する感熱性ポリマーは、ポリ（Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド）、ポリエーテルアミン又はポロキサマーの中から選択され、より好ましくは少なくとも１つの末端アミノ基を有する感熱性ポリマーがポリ（Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド）であり、より好ましくはポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）である。

本発明に適するポロキサマーは、ポリ（エチレンオキシド）鎖が側鎖についているポリ（プロピレンオキシド）の中央鎖及び少なくとも１つの末端アミノ基からなるエチレンオキシドとプロピレンオキシドのコポリマーである。
本発明で有用なポロキサマーは、当業者に知られる方法で末端アミノ基を導入するなどで、一般式ＨＯ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａＨで表されるポロキサマーを修飾することによって得ることができる。例えばａ：ｂ ＝ １２：２０； ８０：２７； ６４：３７； １４１：４４； １０１：５６；あるいはＰｈＥｕｒ ６．０及びＵＳＰ３２−ＮＦ２７に含まれる他のポロキサマーの例がある。ポロキサマーは、例えばシンペロニック、プルロニック、コリフォール、ルトロール、モノラン、プルロニック、ポロキサルコール、ポロキサマー又はスプロニックなどの商標名で市販されている。

本発明に適するポリエーテルアミンは、商標ジェファミンＳ（登録商標）で市販されていて、ポリエーテル骨格末端に結合している第一級アミノ基からなる。ポリエーテル骨格は、通常プロピレンオキシド、エチレンオキシドあるいはエチレンオキシドモノマーに対するプロピレンオキシドの比が２０〜０．０５、好ましくは１０〜０．１５の範囲にあるプロピレンとエチレンオキシドとの混合物からなる。適切なポリエーテルアミンは、モノ、ジ又はトリアミンポリエーテルアミンから選択することができ、好ましくはポリエーテルアミンがモノアミンポリエーテルアミンである。さらに、適切なポリエーテルアミンとして、第二級、ヒンダード、高置換及びポリテトラメチレングリコールベースのポリエーテルアミンが挙げられる。

感熱性ポリマーがポリ（Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド）、具体的にはｐＮＩＰＡＭである特定の実施態様において、ヒアルロン酸及びポリ（Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド）を純水に接触させ可溶化し、１，３，５−トリアジン、具体的には４−（４，６−ジアルキロキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチル・モルホリニウム塩が、続けてヒアルロン酸とポリ（Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド）の溶液に加えられる。このようにして得られた混合物のｐＨは、酸性又はアルカリ性化合物、例えば０．１Ｍ、１Ｍ、１０Ｍなどの０．０１〜１０Ｍの範囲のモル濃度の塩酸（ＨＣｌ）水溶液、あるいは例えば０．１Ｍ、１Ｍ、１０Ｍなどの０．０１〜１０Ｍの範囲のモル濃度の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液を加えることによって５〜７．５の間の値に調整することができ、反応時間の全体を通して前記範囲の中で保持してもよい。

一つ又は複数の感熱性ポリマーがポリエーテルアミン又はポロキサマー（例えば市販のジェファミン（登録商標）又はプルロニック（登録商標））である別の特定の実施態様において、緩衝液なしの純水と１，３，５−トリアジンに接触させて可溶化し、具体的には続いて、４−（４，６−ジアルキロキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムの塩をヒアルロン酸とポリ（Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド）の溶液に加える。このようにして得られた混合物のｐＨは、酸性又はアルカリ性化合物、例えば０．１Ｍ、１Ｍ、１０Ｍなどの０．０１〜１０Ｍのモル濃度範囲の塩酸（ＨＣｌ）水溶液、あるいは例えば０．１Ｍ、１Ｍ、１０Ｍなどの０．０１〜１０Ｍのモル濃度範囲の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液を加えることによって、４．０〜９．５、好ましくは４．５〜７．５、さらにより好ましくは５．０〜７．５の間に調整することができ、反応時間の全体を通して前記範囲の中で保持してもよい。

方法のさらに好ましい実施態様において、ヒアルロン酸は５０〜１００００ｋＤａ、好ましくは５０〜２５００ｋＤａ及びさらに好ましくは１００〜１０００ｋＤａの分子量を有する。ヒアルロン酸の由来は、組織からの抽出あるいは遺伝子組替えＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの発酵などの生物工学技術によるものが含まれる。

方法の別の実施態様において、１，３，５−トリアジン（又はｓ−トリアジン）化合物は、４−（４，６−ジアルキロキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム又は４−（４，６−ジハロゲノ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムの塩で、より好ましくは塩化４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム又は４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチル・モルホリニウムテトラフルオロホウ酸塩である。

方法の別の実施態様において、所定量のヒアルロン酸及び所定量の１，３，５−トリアジン化合物は、利用可能なヒアルロン酸のカルボン酸部分又はＤ−グルクロン酸モノマーと１，３，５−トリアジン（又はｓ−トリアジン）化合物との間のモル比が０．０５〜２０、好ましくは０．５〜１０、より好ましくは０．８〜４、最も好ましくは１〜２の間にあるものが選択される。

方法の別の実施態様において、少なくとも１つの末端アミノ基を有する一つ又は複数の感熱性ポリマーは、５〜２００ｋＤａ、好ましくは１０〜１００ｋＤａの分子量を有する。一つ又は複数の感熱性ポリマーがポリ（Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド）である場合には、感熱性ポリマーの分子量が、好ましくは１５〜５０ｋＤａである。

１つの実施態様において、感熱性ヒアルロン酸複合体は、電解質を用いてイオン強度をヒアルロン酸及びその誘導体の沈殿のために必要とされる典型的なイオン強度に調整の後、エタノール又はメタノールを徐々に添加して沈殿させて、反応混合物から分離される。別の実施態様において、生成物は結晶化を経て分離される。別の実施態様において、生成物は溶媒蒸発を経て分離される。また別の実施態様において、生成物を水又は食塩水に対して透析し、凍結乾燥し凍結乾燥品を得る。

１つの好ましい実施態様において、感熱性ヒアルロン酸複合体は、反応混合物の温度を下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）より高い温度、例えば４０℃、５０℃又は６０℃まで昇温させて分離し、次に熱水で残留する廃棄物が除去されるまで洗浄し、最後に冷凍乾燥して貯蔵することができる。複合体の下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）は、ヒアルロン酸に共有結合している感熱性ポリマーから誘導される。

本発明はさらに、上記の方法によって得られる感熱性ヒアルロン酸複合体を提供する。

本発明はさらに、感熱性ヒアルロン酸複合体の溶液を提供し、この溶液は、水性溶媒又は水性緩衝液中で、１〜９５％ｗ／ｖ、１〜５０％ｗ／ｖ、１〜２０ｗ／ｖ％又は５〜１５ｗ／ｖの量の前記感熱性ヒアルロン酸複合体からなることを特徴とし、そこでは、好ましくは水性溶媒又は水性緩衝液は基本的に有機溶剤を含まない。

このように、発明はまた、感熱性ヒアルロン酸複合体の水性溶媒又は水性緩衝液の溶液を提供し、前記溶液の貯蔵せん断率Ｇ’がそのＬＣＳＴより低い温度で８Ｐａを超え、好ましくはＬＣＳＴより低い温度で８〜１００Ｐａであり、またＬＣＳＴより高い温度の前記貯蔵せん断率Ｇ’とＬＣＳＴより低い温度の貯蔵率Ｇ’の間の比率、すなわちＧ’（＞ＬＣＳＴ）／Ｇ’（＜ＬＣＳＴ）が８０を超え、好ましくは８０〜８０００、より好ましくは８０〜４０００、最も好ましくは１００から３０００の間にある。別の表現をすると、本発明の感熱性ヒアルロン酸複合体溶液がＬＣＳＴより高い温度に昇温されると８０倍以上固くなる。

このように、本発明はまた、感熱性ヒアルロン酸複合体の水性溶媒又は水性緩衝液の溶液も提供し、前記溶液の貯蔵せん断率Ｇ’が２５℃で８Ｐａを超え、好ましくは２５℃で８〜１００Ｐａであり、３５℃と２５℃における貯蔵率の比、すなわちＧ’（３５℃）／Ｇ’（２５℃）が８０を超え、好ましくは８０〜８０００、より好ましくは８０〜４０００、最も好ましく１００〜３０００である。

カルボニルジイミダゾール又はカルボジイミド誘導体によって仲介される直接的又は間接的なアミド化反応を経て得られる生成物とは対照的に、１，３，５−トリアジン（又はｓ−トリアジン）化合物によって仲介される直接的なアミド化反応を介した少なくとも１つの末端アミノ基を有する一つ又は複数の感熱性ポリマーとヒアルロン酸との複合体は、驚くべきことに、粘弾性が改善された特性を示す、したがって医療応用のための性能が改善した生成物を産生する。

本発明で開示される方法に従って得られる感熱性ヒアルロン酸複合体は、水中で温度依存性の溶解性を示す。それらは室温で透明な及び／又は流動性のある溶液を生じ、それぞれのＬＣＳＴより高い温度に昇温すると親水コロイド・ゲル状態に変わる。この転移は、感熱性ヒアルロン酸複合体の流動学的特性の変化を伴う。驚くべきことに、既知の方法から得られたヒアルロン酸複合体と比較して、開示された方法に従って得られたヒアルロン酸複合体は、系統的に粘弾性が改善されている。

本発明は、核磁気共鳴スペクトル測定法で測定した場合、０．１〜５０％、好ましくは２〜３０％、さらに好ましくは２．５〜２５％、最も好ましくは２．５〜１０％の置換度を有する上記に提供される方法によって得られる感熱性ヒアルロン酸複合体をさらに提供する。一つ又は複数の感熱性ポリマーがポリ（Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド）である場合には、核磁気共鳴スペクトル測定法によると、好ましくは置換度が２．５〜１０％である。

本発明による感熱性ヒアルロン酸複合体は、体の内側又は外側の傷治療、ドラッグデリバリーシステム、抗生物質デリバリーシステム又は他の抗感染性のデリバリーシステム（消毒薬、抗菌ペプチド、バイオフィルム形成を防止するクオラムセンシング阻害薬、銀（いずれの剤形でも）、ナノ粒子、細菌付着を防止する抗バクテリア・アドヘジン、抗ＭＳＣＲＡＭＭ（粘着性のマトリックス分子を認識する微生物表面構成要素）などの添加物を含むが、これに限定されるものではない）あるいは骨又は軟骨の治療において、使用に好適である。

本発明はさらに、上記の記述した方法により得た感熱性ヒアルロン酸複合体及び一つ又は複数の生物活性薬剤からなる生物活性薬剤デリバリーシステムを提供する。

一つ又は複数の生物活性薬剤として、無機塩類から高分子化合物又は低分子化合物、例えばストロンチウム塩類、ラネル酸ストロンチウム、ビスホスホネート、エチドロネート、クロドロネート、チルドロネート、パミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、リセドロネート、ゾレドロネート、イカリチンと類縁体、カルトゲニンと類縁体、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド、抗生物質、抗菌剤、抗菌性物質、消毒薬、防腐剤、並びにアミノグリコシド（特にゲンタマイシン）、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン（特に第１世代、第２世代、第３世代）、グリコペプチド、グリシルサイクリン、リピアルマイシン（例えばフィダキソマイシン）、リンコサミド、リポペプチド、マクロライド、モノバクタム、ニトロフラン、オキサゾリジノン（例えばリネゾリド）、ペニシリン、ペニシリンの組合せ、ポリミキシン、ポリペプチド、リファマイシン、キノロン、スルホンアミド、テトラサイクリン及びマイコバクテリアに対する薬剤などの感染予防と感染治療のための殺菌及び静菌性の物質から選択されてもよい。そのような物質の具体例として、アミカシン、ゲンタマイシン、銀、コロイド銀、銀粉、銀ナノ粒子、銀化合物、銀を放出する化合物、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、スペクチノマイシン、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、’リファキシミン’、ストレプトマイシン、ロラカルベフ、エルタペネム、ドリペネム、’イミペネム’／シラスタチン、メロペネム、セファドロキシル、セファゾリン、’セファロチン’、セファレキシン、セファクロール、セファマンドール、セホキシチン、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セホペラゾン、セホタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフェピム、セフタロリンフォサミル、セフトビプロール、テイコプラニン、バンコマイシン、テラバンシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、ダプトマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、スピラマイシン、アズトレオナム、フラゾリドン、ニトロフラントイン、リネゾリド、ポシゾリド、ラデゾリド、トレゾリド、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、テモシリン、チカルシリン、アモキシシリン／クラブラネート、アンピシリン／スルバクタム、ピペラシリン／タゾバクタム、チカルシリン／クラブラン酸、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、マフェニド、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジアジン銀、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、’スルファニルアミド’（旧名）、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、’トリメトプリム’−スルファメトキサゾール（コトリモキサゾール）（ＴＭＰ−ＳＭＸ）、スルフォンアミドクリソイジン（旧名）、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、クロファジミン、ダプソン、カプレオマイシン、サイクロセリン、エタンブトール、エチオナミド、イソニアジド、ピラジナミド、’リファンピシン’（米国ではリファンピン）、リファブチン、リファペンチン、ストレプトマイシン、アルスフェナミン、クロラムフェニコール、ホスホマイシ、フシジン酸、メトロニダゾール、ムピロシン、プラテンシマイシン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、チアンフェニコール、チゲサイクリン、チニダゾール、トリメトプリム、成長因子、酵素、抗腫瘍薬、抗炎症薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、麻酔薬、抗腫瘍薬、有糸分裂阻害剤、鎮痛薬、麻薬、抗血栓薬、抗凝固剤、止血剤が挙げられる。

より具体的には、少なくとも１つの生物活性薬剤が、（ａ）タンパク質又は（ポリ）ペプチド、例えばエリスロポイエチン（ＥＰＯ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、成長ホルモン（ヒト、ブタ、ウシなど）、成長因子、例えばＴＧＦベータ（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）など、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＯＰ１、デキサメタゾンと類縁体、コルチコステロイド、フィブロネクチン、フィブリノゲン、トロンビン、タンパク質、ＧＤＦ５、ＳＤＦ１、ＣＣＬ５、ホーミング因子、ＴＧＳ６、成長ホルモン放出因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、血液凝固因子、インスリン、オキシトシン、バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン、上皮成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、プロラクチン、ルリベリン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、ＬＨＲＨアゴニスト、ＬＨＲＨアンタゴニスト、ソマトスタチン、グルカゴン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストロン、セクレチン、カルシトニン、エンケファリン、エンドルフィン、アンジオテンシン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ヘパリナーゼ、ヒト心房ナトリウム利尿ペプチド（ｈＡＮＰ）、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−Ｉ）、レニン、ブラジキニン、バシトラシン、ポリミキシン、コリスチン、チロシジン、グラミシジン、シクロスポリンとその合成類縁体、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及びサイトカイン、（ｂ）ワクチン及び（ｃ）核酸（例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡとアンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチド（ＡＳ−ＯＤＮ））、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、統合ベクターウイルス（例えばレトロウイルス、レンチウイルス）などのウイルスベクター、リポソームなどの非ウイルスベクター、荷電ポリマー、リン酸カルシウムなどの遺伝物質と結合することができる無機塩類及び（ｄ）例えばテストステロン、エストラジオール、プロゲステロン、プロスタグランジンなどのホルモン類及びその合成類縁体、及び（ｅ）パクリタキセル、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、テガフール、イリノテカン、ドセタキセル、シクロホスファミド、ゲムシタビン、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ビンクリスチン、エトポシド、メトトレキセート、トポテカン、タモキシフェン、ビノレルビン、カンプトセシン、ダウノルビシン、クロラムブシル、ブリオスタチン−１、カリケアマイシン、ｍａｙａｔａｎｓｍｅ、レバミゾール、ＤＮＡ組み換え型インターフェロンα−２ａ、ミトキサントロン、ニムスチン、インターフェロンα−２ａ、ドキシフルリジン、ホルメスタン、酢酸ロイプロリド、酢酸メゲストロール、カルモフール、テニポシド、ブレオマイシン、カルムスチン、ヘプタプラチン、エクセメスタン、アナストロゾール、エストラムスチン、カペシタビン、ゴセレリン酢酸塩、多糖カリウム、メドロキシプロゲステロン酢酸エステル、エピルビシン、レトロゾール、ピラルビシン、トポテカン、アルトレタミン、トレミフェンクエン酸塩、ＢＣＮＵ、タキソテール、アクチノマイシンＤ、ポリエチレングリコール複合蛋白などの抗癌剤及び合成類縁体、及び（ｆ）クロドロネート、ドキシサイクリン、マリマスタット、２−メトキシエストラジオール、スクアラミン、サリドマイド，コンブレタスタチンＡ４、大豆イソフラボン、エンザスタウリン、ＣＣ ５０１３（レナリドミド；セルジーン社、ウオーレン、ニュージャージー州）、セレコキシブ、臭化水素酸ハロフジノン、インターフェロンα、ベバシズマブ、インターロイキン１２、ＶＥＦＧ−ｔｒａｐ、セツキシマブなどの血管新生抑制薬及びそれらの合成類縁体からなる群から選択されてもよい。

さらなる実施態様において、一つ又は複数の生物活性薬剤は、（治療用）細胞、好ましくは自己由来の（治療用）細胞でもよく、また幹細胞、間葉系幹細胞、前軟骨細胞、髄核細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞、臍帯静脈内皮細胞（ＵＶＥＣ）、骨芽細胞、成人幹細胞、シュワン細胞、希突起膠細胞、肝細胞、壁細胞（ＵＶＥＣと一緒に使われる）、筋芽細胞、インスリン分泌細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、［β］−細胞、内胚葉細胞、肝幹細胞、傍糸球体細胞、骨格筋細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞、皮膚線維芽細胞及び前脂肪細胞からなる群から選択されてもよい。

１つの実施態様において、一つ又は複数の生物活性薬剤は、生物活性薬剤デリバリーシステムの総乾燥重量に基づいて１０ｐｐｍ〜５０重量％、好ましくは約５０ｐｐｍ〜２５重量％の間にあってもよい。

本発明に従って、生物活性薬剤は、生物活性薬剤のデリバリーシステム内で分散してもよい。あるいは、生物活性薬剤は、生物活性薬剤とＤＭＴＭＭ活性化ヒアルロン酸カルボキシル部分との間のアミド化反応によって発明のコポリマー組成物と共有結合してもよい。

生物活性薬剤のデリバリーシステムはさらに、水性溶媒に溶解する一つ又は複数の添加物を含んでもよい。こうした添加物として、カチオン性ポリマー、アニオン性ポリマー、糖、多価アルコール、糖含有多価アルコールとポリマー含有多価アルコール、アミノ酸と糖含有アミノ酸、他の生物学的に利用可能な材料、糖含有イオン、界面活性剤、有機溶剤、防腐剤などが含まれてもよいが、これに限定されるものではない。さらに具体的には、少なくとも１つの添加物が、（ａ）ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ‐Ｌ‐リジン、ポリ（エチレングリコール）、ポリエチレンイミン、キトサン、プロタミンなどの２００〜７５０，０００の分子量を有する陽イオン・ポリマーなど、（ｂ）ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポリビニルアセテート（ＰＶＡ）、アルギン酸塩、元来のヒアルロン酸などの中性又はアニオン性ポリマー、（ｃ）アミロリド、プロカインアミド、アセチル−β−メチルコリン、スペルミン、スペルミジン、リゾチーム、フィブロイン、アルブミン、コラーゲン、成長因子（例えば形質転換成長因子ＴＧＦベータ（ＴＧＦ−β））、線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）など、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＯＰ１、デキサメタゾン、フィブロネクチン、フィブリノゲン、トロンビン、タンパク質、デクスラゾキサン、ロイコボリン、リシノール酸、リン脂質、小腸粘膜下組織、ビタミンＥ、脂肪酸のポリグリセリン・エステル、ラブラフィル、ラブラフィルＭｌ ９４４ＣＳ、クエン酸、グルタミン酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ゼラチン、イソプロピル・ミリスチン酸塩、ユードラジット、テゴベタイン、ジミリストイルホスファチジルコリン、スクレログルカンなどの生物学的に利用可能な材料、（ｄ）澱粉、シクロデクストリンとその誘導体、ラクトース、グルコース、デキストラン、マンノース、スクロース、トレハロース、マルトース、フィコールなどの糖、（ｅ）イノシトール、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、スクロースマンニトール、グルコースマンニトールなどの糖含有多価アルコール、トレハロース−ＰＥＧ、スクロース−ＰＥＧ、スクロース−デキストランなどのポリマー含有多価アルコール、（ｆ）アラニン、アルギニン、グリシン、ソルビトール・グリシン、スクロースグリシン、ペプチド両親媒性物質などのアミノ酸（糖含有アミノ酸を含む）、（ｇ）トレハロース−ＺｎＳＯ_４、マルトースＺｎＳＯ_４などの糖含有イオン及びケイ酸塩、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＢｒ、ＮａＩ、ＬｉＣｌ、ｎ−ＢｖｕＮＢｒ、ｎ−Ｐｒ_４ＮＢｒ、Ｅｔ_４ＮＢｒ、Ｍｇ（ＯＨ）_２、Ｃａ（ＯＨ）_２、ＺｎＣＯ_３、Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２、ＺｎＣｌ_２、（Ｃ_２Ｈ_３Ｏ_２）_２Ｚｎ、ＺｎＣＯ_３、ＣｄＣｌ_２、ＨｇＣｌ_２、ＣｏＣｌ_２、（ＣａＮＯｓ）_２、ＢａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２、ＰｂＣｌ_２、ＡｌＣｌ_３、ＦｅＣｌ_２、ＦｅＣｌ_３、ＮｉＣｌ_２、ＡｇＣｌ、ＡｕＣｌ_３、ＣｕＣｌ_２、硫酸テトラデシルナトリウム、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウムなどの生物学的に許容できる塩、クレモホル・エレクトロ・ルミネセンス、エタノール、ジメチルスルホキシドなどの有機溶剤、（ｈ）メチルパラベンなどの防腐剤及び（ｉ）さまざまな分子量のポロキサマー、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、トリトンＸ−ＩＯＯ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、Ｂｒｉｊ）などの界面活性剤からなる群から選択されもてよい。

一つ又は複数の添加物は、ＬＣＳＴより低い温度における取り込みによって、例えば分散によって生物活性薬剤デリバリーシステムに加えてもよく、生物活性薬剤デリバリーシステムの総乾燥重量に基づいて１０ｐｐｍ重量〜５０重量％、好ましくは５０ｐｐｍ重量〜２５重量％で存在してもよい。

別の特定の実施態様において、生物活性薬剤デリバリーシステムを形成するために、一つ又は複数の生物活性薬剤及び随意で添加物を、発明のコポリマーの水分散液に加えてもよく、それは直ちに使用してもよい。

発明のさらなる態様において、生物活性薬剤デリバリーシステムはさらに、無機塩類又はセラミック材料を最高８０重量％まで含み、好ましくは無機物又は当業者には骨伝導材料として知られるセラミック、より好ましくは二相リン酸カルシウムを無機塩類又はセラミック材料からなる生物活性薬剤デリバリーシステムの総重に基づく重量パーセントとして最高８０重量％まで含んでもよい。二相リン酸カルシウムは、ハイドロキシアパタイトとβリン酸三カルシウムの混合物からなり、好ましくはこの混合物である。

さらに、発明の態様は、ドラッグデリバリー、感染予防、感染根絶、特に腹部における癒着に対する予防、骨盤及び脊椎手術後の癒着予防、関節内補充療法、生体外細胞培養、組織充填剤と組織増殖、軟骨再生、椎間板再生、骨治癒と再生、脊椎固定術、及び美容・形成外科、再生医療、眼科、眼科手術、一般外科、リウマチ学、整形外科及び外傷の領域における再生医療の適応における感熱性ヒアルロン酸複合体の一層の使用に関する。

このように別の実施態様において、感熱性ヒアルロン酸複合体に共有結合又は分散する生物活性薬剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される細胞に対する前記生物活性薬剤の効果を調べるのに用いられてもよい。

もう一つの実施態様において、発明の感熱性ヒアルロン酸複合体が、細胞培養装置として使われてもよい。細胞は室温にて複合体の溶液中に懸濁され、次に加温して三次元細胞培養のために強固でかつ安定な親水コロイド・ゲルを作成してもよい。細胞の回収は単に親水コロイド・ゲルを冷やし、溶液状態に戻すことによって達成してもよい。

その感熱性特質のため、発明の感熱性ヒアルロン酸複合体又は生物活性薬剤デリバリーシステムは、その最終的な使用によってさまざまな投与経路で被験者に投与されてもよい。

こうした投与経路は、経口投与、口腔投与、粘膜投与、鼻投与、腹腔内投与、皮下注射、筋注投与、関節腔内注射、椎間板内注入、脊髄投与、経皮投与、局所投与及び腫瘍内投与を含んでもよく、皮下注射、関節内投与、局所投与、筋注投与又は経皮投与などの局所投与を介することが好ましい。

１つの実施態様において、生物活性薬剤デリバリーシステムは、生体に（ＬＣＳＴより低い温度で）水溶液として注射されてもよい。注射するに当たり、生物活性薬剤デリバリーシステムは、ｉｎ ｖｉｖｏの温度で硬い親水コロイド・ゲル状態である生物活性薬剤含有デポ剤を形成する。コポリマー組成物の分解又は貯蔵物からの単純拡散により、生物活性薬剤の放出（又は拡散）が起こる。化学的に取り込まれた生物活性薬剤（すなわち共有結合結合によるもの）の場合には、放出又は拡散も多糖骨格への化学結合の分解に依存している。

もう一つの実施態様において、生物活性薬剤デリバリーシステムが、乾燥スプレー、湿式のスプレー、泡、クリーム、軟膏、ローション剤、エマルジョンの剤形で局所的に使われてもよい。

もう１つの特定の実施態様において、生物活性デリバリーシステムが、感染予防のための創傷の局所治療、感染管理、消毒薬、静菌剤のために使われてもよい。

もう１つの特定の実施態様は、患者を適切な治療ユニットに搬送する前に、負傷、裂傷、切傷、軟組織及び／又は硬い組織を含む創傷に対して応急処置をするために、本発明のヒアルロン酸複合体を抗生物質、抗菌物質、殺菌薬、消毒薬、殺菌性又は静菌性物質の送達を目的とする局所製剤を調製するための薬剤成分、添加物、賦形剤と組み合わせて使用することである。

生物活性薬剤デリバリーシステムとしての使用の前に、ヒアルロン酸複合体は、次の使用まで凍結乾燥された形で保存されてもよい。このようにさらなる態様において、ヒアルロン酸複合体組成物からなる単一又は複数コンパートメントキットを発明に従って、無菌、凍結乾燥された形状で提供する。特定の実施態様において、キットは複合体組成物の再構成のために、所定量の水性溶媒及び／又は所定量の生物活性薬剤及び／又は所定量の添加物を別々のコンパートメントに含んでもよい。

可能性がある実施態様を例示することを目的として、発明をここに非限定的に、次の実施例でより詳細に説明する。いずれの場合にもその分野の専門家であれば発明の精神を逸脱しない範囲で変更することができる。

［実施例１］ＨＡ−ｐＮＩＰＡＭ複合体２８０−４５−６．５の合成
平均分子量２８０ｋＤａのヒアルロン酸（ＨＡ）のナトリウム塩１．０８ｇを、６０ｍｌの水に可溶化する。平均分子量４５ｋＤａのアミノ末端ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ｐＮＩＰＡＭ）３．５ｇを４０ｍｌの水に溶解する。両溶液を混合して、＋４℃に冷却し、７８０ｍｇのＤＭＴＭＭ粉末を加える。反応混合液を、＋４℃にて５日間にわたり反応させ、溶液を５０℃に加温してゼリー塊を得、副生成物が除去されるまで沸騰純水にて十分に洗浄する。洗浄した生成物を集めて恒量になるまで凍結乾燥する。ＮＭＲを用いた特性によると、６．５％のモル置換度を示す。

［実施例２］ＨＡ−ｐＮＩＰＡＭ複合体２８０−２５−９の合成
平均分子量２８０ｋＤａのＨＡのナトリウム塩１．０８ｇを、６０ｍｌの水に溶解する。３．５ｇの平均分子量２５ｋＤａのアミノ末端ｐＮＩＰＡＭを４０ｍｌの水に溶解する。両溶液を＋４℃に冷却し、混合して、７８０ｍｇのＤＭＴＭＭ粉末を加える。反応混合液を、＋４℃にて５日間にわたり反応させ、徹底的に透析後、恒量になるまで凍結乾燥する。ＮＭＲを用いた特性によると、９％のモル置換度を示す。

［実施例３］ＨＡ−ｐＮＩＰＡＭ複合体２８０−４５−５の合成
平均分子量２８０ｋＤａのＨＡのナトリウム塩１．０８ｇを、６０ｍｌの水に溶解する。２．５ｇの平均分子量４５ｋＤａのアミノ末端ｐＮＩＰＡＭを４０ｍｌの水に溶解する。両溶液を混合して、＋４℃にて冷却し、７８０ｍｇのＤＭＴＭＭ粉末を加える。反応混合液を、＋４℃にて５日間にわたり反応させ、この溶液を５０℃に加温してゼリー塊を得、副生成物が除去されるまで沸騰純水にて十分に洗浄する。洗浄した生成物を集めて恒量になるまで凍結乾燥する。ＮＭＲを用いた特性によると、５％のモル置換度を示す。

［実施例４］ＨＡ−ｐＮＩＰＡＭ複合体２８０−２５−７の合成
平均分子量２８０ｋＤａのＨＡのナトリウム塩１．０８ｇを６０ｍｌの水に溶解する。２．５ｇの平均分子量２５ｋＤａのアミノ末端ｐＮＩＰＡＭを４０ｍｌの水に溶解する。両溶液を混合して、＋４℃に冷却し、７８０ｍｇのＤＭＴＭＭ粉末を加える。反応混合液を、＋４℃にて５日間にわたり反応させ、この溶液を５０℃に加温してゼリー塊を得、副生成物が除去されるまで沸騰純水にて十分に洗浄する。洗浄した生成物を集めて恒量になるまで凍結乾燥する。ＮＭＲを用いた特性によると、７％のモル置換度を示す。

［実施例５］ＨＡ−ｐＮＩＰＡＭ複合体１５９０−２５−６の合成
平均分子量１５９０ｋＤａのＨＡのナトリウム塩２．１８ｇを１７０ｍｌの水に溶解する。５ｇの平均分子量２５ｋＤａのアミノ末端ｐＮＩＰＡＭを８０ｍｌの水に溶解する。両溶液を混合して、＋４℃に冷却し、１．５ｇのＤＭＴＭＭ粉末を加える。反応混合液を、＋４℃にて５日間にわたり反応させ、その後この溶液を５０℃に加温してゼリー塊を得、副生成物が除去されるまで沸騰純水にて十分に洗浄する。洗浄した生成物を集めて恒量になるまで凍結乾燥する。ＮＭＲを用いた特性によると、６％のモル置換度を示す。

［実施例６］ＨＡ−ｐＮＩＰＡＭ複合体１５９０−４５−５の合成
平均分子量２８０ｋＤａのＨＡのナトリウム塩１．０８ｇを６０ｍｌの水に溶解する。２．５ｇの平均分子量４５ｋＤａのアミノ末端ｐＮＩＰＡＭを４０ｍｌの水に溶解する。両溶液を混合して、＋４℃に冷却し、７８０ｍｇのＤＭＴＭＭ粉末を加える。反応混合液を、＋４℃にて５日間にわたり反応させ、溶液を５０℃に加温してゼリー塊を得、副生成物が除去されるまで沸騰純水にて十分に洗浄する。洗浄した生成物を集めて恒量になるまで凍結乾燥する。ＮＭＲを用いた特性によると、５％のモル置換度を示す。

［実施例７］ＨＡ−ｐＮＩＰＡＭ複合体６５０−４５−５の合成
平均分子量６５０ｋＤａのＨＡのナトリウム塩１．０８ｇを６０ｍｌの水に溶解する。２．５ｇの平均分子量４５ｋＤａのアミノ末端ｐＮＩＰＡＭを４０ｍｌの水に溶解する。両溶液を混合して、＋４℃に冷却し、７８０ｍｇのＤＭＴＭＭ粉末を加える。反応混合液を、＋４℃にて５日間にわたり反応させ、副生成物が除去されるまでこの溶液を水に対して十分に透析する。生成物を集めて恒量になるまで凍結乾燥する。ＮＭＲを用いた特性によると、５％のモル置換度を示す。

［実施例８］ＨＡ−ジェファミンＭ−６００複合体の合成
平均分子量２８０ｋＤａのＨＡのナトリウム塩１．０８ｇを６０ｍｌの水に溶解する。ＰＯ／ＥＯ比率が９／１及び分子量６００Ｄａを有する商標ジェファミン（登録商標）Ｍ−６００の名で市販されているポリエーテルアミン０．８ｇを４０ｍｌの水に溶解する。両溶液を混合して、＋１０℃に冷却し、９７５ｍｇのＤＭＴＭＭ粉末を加える。反応混合物を、＋１０℃にて３日間、反応させ、その後、この溶液をＮａＣｌに加えて９ｇ／ｌの濃度とし、エタノールにて沈殿させる。生成物を副生成物が除去されるまでエタノール／水（４／１）にて洗浄する。この生成物を無水エタノールにて洗浄し、残留溶媒が除去されるまで乾燥する。ＮＭＲを用いた特性によると、２８．７％のモル置換度を示す。

［実施例９］ＨＡ−ジェファミン（登録商標）Ｍ−２００５複合体の合成
平均分子量６５０ｋＤａのＨＡのナトリウム塩２．１５ｇを１２０ｍｌの水に溶解する。ＰＯ／ＥＯ比率が２９／６で分子量が２ｋＤａを有する商標ジェファミン（登録商標）Ｍ−２００５の名で市販されているポリエーテルアミン２．５ｇを８０ｍｌの水に溶解する。両溶液を＋４℃に冷却し、２．２２ｇのＤＭＴＭＭ粉末と混合する。反応混合液を、＋４℃にて５日間にわたり反応させ、副生成物が除去されるまでこの溶液を水に対して徹底的に透析する。生成物を集めて恒量になるまで凍結乾燥する。ＮＭＲを用いた特性によると、２３％のモル置換度を示す。

［実施例１０］先行技術（ＣＤＩ−介在型コンジュゲーション）によるＨＡ−ｐＮＩＰＡＭ複合体の合成
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ９０（２０１２）１３７８‐１３８５に記載の手順に従って、１，１’−カルボニルジイミダゾールを使用してＨＡ−ｐＮＩＰＡＭ複合体を合成する。
上記の実施例１で得られる生成物を再現するために、２８０ｋＤａの平均分子量のＨＡ及び４５ｋＤａの平均分子量のｐＮＩＰＡＭを使用した。ＮＭＲを用いた特性によると、６．５％のモル置換度を示す。実施例１２で記載される手順に従って、生成物の流動学的な特性を温度の関数として解析する。

［実施例１１］先行技術（ＥＤＣ＋ＮＨＳ介在型コンジュゲーション）によるＨＡ−ｐＮＩＰＡＭ複合体の合成
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１−９に記載の手順に従って、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを使用してＨＡ−ｐＮＩＰＡＭ複合体を合成する。この生成物は、実施例１２で記載される手順に従って、生成物の流動学的な特性を温度の関数として解析した。

［実施例１２］異なる方法で調製されるＨＡ−ｐＮＩＰＡＭ溶液の流動学的特性の比較
感熱性ヒアルロン酸複合体の１０％ｗ／ｖ溶液を、リン酸塩緩衝液食塩水に実施例１、１０及び１１の手順から得られる乾燥複合体を溶解して調製する。その後、このように調製した３つの溶液の粘弾性せん断率を、周波数１Ｈｚ及び１％ひずみにてペルチェロードセル搭載のＭＣＲ３０２レオメーター（アントンパール社）を用いて、２０〜４０℃の温度範囲で測定する。
主な性能指標すなわち、室温での粘度（粘性率）及びＬＣＳＴより高い温度又は低い温度における転移度（３５℃と２５℃における貯蔵せん断率Ｇ’の比率）を表１に示す。

表１から分かるように、ＥＤＣ／ＮＨＳを用いた実施例１１による複合体は、Ｇ’（３５℃）／Ｇ’（２５℃）間の比率が示すように、温度上昇に伴う粘弾性に軽度の変化しかみられなかったことから、生医学的応用からその使用を除外する。実施例１０による複合体は有意な粘弾性変化を示すが、室温（２５℃）で好ましくなく低い粘度から始まるため、やはり生医学的応用からその使用を除外する。対照的に、実施例１による複合体は、室温（２５℃）で優れた粘弾性及び粘着性を示し、また親水コロイド状態への明白な転移を示す。カニューレ注射を介する移植可能材料としての使用のためには、粘性が改善されると移植部位でより良好な粘着性が与えられ、複合体が流れ出し全身に広がるのを防止する一方で、コーティングのような生医学的応用のためには、粘性が改善されることでより良好な粘着性が付与される。また、ドラッグデリバリーシステムとしての適応には、粘度が増加すると本剤の放出が遅くなり、自由拡散が制限される。

［実施例１３］ＨＡ−ｐＮＩＰＡＭ複合体１５０−３９−７の合成
平均分子量１５０ｋＤａのＨＡのナトリウム塩１．０８ｇを６０ｍｌの水に溶解する。３．５ｇの平均分子量４５ｋＤａのアミノ末端ｐＮＩＰＡＭを４０ｍｌの水に溶解する。両溶液を混合して、＋４℃に冷却し、７８０ｍｇのＤＭＴＭＭ粉末を加える。反応混合液を、＋４℃にて５日間にわたり反応させ、その溶液を５０℃まで加温してゼリー塊を得、副生成物が除去されるまで沸騰純水にて十分に洗浄する。洗浄した生成物を集めて恒量になるまで凍結乾燥する。ＮＭＲを用いた特性によると、７％のモル置換度を示す。

［実施例１４］ＨＡ−ｐＮＩＰＡＭ複合体１５０−４５−９の合成
平均分子量１５０ｋＤａのＨＡのナトリウム塩１．０８ｇを６０ｍｌの水に溶解する。３．５ｇの平均分子量４５ｋＤａのアミノ末端ｐＮＩＰＡＭを４０ｍｌの水に溶解する。両溶液を混合して、＋５℃に冷却し、７８０ｍｇのＤＭＴＭＭ粉末を加える。反応混合物を、＋５℃にて７日間にわたり反応させ、この溶液を５０℃まで加温してゼリー塊を得、副生成物が除去されるまで沸騰純水にて十分に洗浄する。洗浄した生成物を集めて恒量になるまで凍結乾燥する。ＮＭＲを用いた特性によると、９％のモル置換度を示す。

［実施例１５］ＨＡ−ｐＮＩＰＡＭ−ＳＤＦ１移植片複合体の合成
平均分子量１５０ｋＤａのＨＡのナトリウム塩１．０８ｇを６０ｍｌの水に溶解する。３．５ｇの平均分子量４５ｋＤａのアミノ末端ｐＮＩＰＡＭ及び５ｍｇのストロマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ１）を４０ｍｌの水に溶解する。両溶液を混合して、＋４℃に冷却し、７８０ｍｇのＤＭＴＭＭ粉末を加える。反応混合液を、＋４℃にて５日間にわたり反応させ、未結合分子と副生成物が除去されるまでこの溶液を＋４℃にて水に対して透析する。精製された生成物を集めて恒量になるまで凍結乾燥する。化学誘引物質の分析をしたところ、移植されたＳＤＦ１がその生物活性を維持していることが確認される一方、ＮＭＲを用いた特性によると、ｐＮＩＰＡＭのモル置換度が６．５％を示し、再生医療において幹細胞を誘引するシステムとして適した製剤であることを立証するものである。

［実施例１６］ＨＡ−ｐＮＩＰＡＭ−ＢＭＰ２移植片複合体の合成
平均分子量１５０ｋＤａのＨＡのナトリウム塩１．０８ｇを６０ｍｌの水に溶解する。３．５ｇの平均分子量４５ｋＤａのアミノ末端ｐＮＩＰＡＭ及び１２ｍｇの骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）を４０ｍｌの水に溶解する。両溶液を混合して、＋４℃に冷却し、７８０ｍｇのＤＭＴＭＭ粉末を加える。反応混合液を、＋４℃にて５日間にわたり反応させ、未結合分子と副生成物が除去されるまでこの溶液を＋４℃にて水に対して透析する。精製された生成物を集めて恒量になるまで凍結乾燥する。骨形成能がアルカリホスファターゼ活性と石灰化法によって確認される一方、ＮＭＲを用いた特性によると、ｐＮＩＰＡＭのモル置換度が６．５％を示す。

［実施例１７］ＢＭＰ２を放出するリン酸カルシウム含有親水コロイド複合体の調製
実施例１により、ＨＡ−ｐＮＩＰＡＭ複合体を調製する。複合体８０ｍｇを２５０ｍｇの二相リン酸カルシウム（ヒドロキシアパタイトとβリン酸三カルシウムの組み合わせ）を顆粒が均一になるまで混合する。４００μｌの組成物を調製するために、続いてこの複合体材料をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に３０μｇのＢＭＰ２を溶解した溶液と混合する。この複合体からのＢＭＰ２の放出を、ＥＬＩＳＡ（供給元、Ｒ＆Ｄシステム）検出を用いて生理的条件をシミュレーションして評価する。濃度プロフィールは、２０日にわたり徐放性を示し、骨再生のための徐放システムとしての製剤の適合性が確認された。

［実施例１８］ＣＣＬ５を放出する複合体溶液の調製
実施例１によりＨＡ−ｐＮＩＰＡＭ複合体を調製する。５０ｍｇの複合体を、４．７μｇのケモカインリガンド（ＣＣＬ５）を含む４２０μｌのＰＢＳ溶液と混合する。複合体からの因子の放出は、ＥＬＩＳＡ（供給元、Ｒ＆Ｄシステム）検出を用いて生理的条件をシミュレーションして評価する。濃度プロフィールは、１４日にわたり徐放性を示し、再生医療における幹細胞の誘引のための徐放システムとして製剤に適していることが確認された。

［実施例１９］カルトゲニンデリバリーのための複合体溶液の調製
実施例１によりＨＡ−ｐＮＩＰＡＭ複合体を調製する。５０ｍｇのこの複合体を、ＰＢＳに４２０μｌのカルトゲニンを溶解した溶液（１３２ｎＭ）と混合する。複合体からの因子の放出は、７日間にわたる生理的条件をシミュレーションして評価する。最初の２４時間で２０％のカルトゲニンが放出され、さらに３８％が１週間の観察期間中に放出され、再生医療と軟骨再生において幹細胞を誘引するための徐放システムとしての製剤に適していることが確認された。

［実施例２０］ラネリック酸ストロンチウムを含むリン酸カルシウム含有複合体の調製
実施例１によりＨＡ−ｐＮＩＰＡＭ複合体を調製する。８０ｍｇのこの複合体を２８０ｍｇの二相リン酸カルシウム（ヒドロキシアパタイトとβリン酸三カルシウムの組合せ）と顆粒が均一になるまで混合する。４００μｌの組成物を調製するために、続いてこの複合体材料を３０μｇのラネル酸ストロンチウムをＰＢＳに溶解した溶液と混合する。この複合体からのラネル酸ストロンチウムの放出は、原子分光学検出を用いて、４週間にわたる生理的条件をシミュレーションして評価する。濃度プロフィールは、２８日間にわたって徐放性を示す。

［実施例２１］抗体放出のための複合体溶液の調製
実施例１によりＨＡ−ｐＮＩＰＡＭ複合体を調製する。１ｍｌの組成物を調製するために、１４０ｍｇのこの複合体を１．５ｍｇのゲンタマイシンをＰＢＳに溶解した溶液と混合する。この複合体からのゲンタマイシンの放出は、ＨＰＬＣ検出及びフタルジアルデヒドと蛍光検出を装備するプレカラム機能化を用いて、４週間にわたる生理的条件をシミュレーションして評価する。濃度プロフィールは、２８日間にわたって徐放性を示す。

［実施例２２］抗生物質を放出する泡製剤の調製
泡製剤を調製するために、実施例２１により調製されたゲンタマイシンを放出する製剤を適切な医薬賦形剤と混合する。この製剤からのゲンタマイシンの放出は、ＨＰＬＣ検出及びフタルジアルデヒドと蛍光検出を装備するプレカラム機能化を用いて、４週間にわたる生理的条件をシミュレーションして評価する。濃度プロフィールは、２８日間にわたって徐放性を示し、浅部及び深部創傷における感染予防と管理のための剤形に適していることが確認された。この製剤は、特に創傷と外傷の応急の管理に適している。

［実施例２３］抗生物質を放出する複合体溶液の調製
エマルジョン、ローション剤、クリーム、軟膏製剤を生産するために、実施例２１により調製されたゲンタマイシン放出製剤を適切な医薬賦形剤と混合する。この複合体からのゲンタマイシンの放出は、ＨＰＬＣ検出及びフタルジアルデヒドと蛍光検出を装備するプレカラム機能化を用いて、４週間にわたる生理的条件をシミュレーションして評価する。濃度プロフィールは２３日以上の間徐放性を示し、浅部及び深部創傷の感染予防のための製剤に適していることが確認された。

［実施例２４］細胞デリバリーのための複合体溶液の調製
実施例１によりＨＡ−ｐＮＩＰＡＭ複合体を調製する。２ｍｌの組成物を調製するために、２４０ｍｇの複合体をリン酸塩緩衝食塩水にて均一になるまで分散する。４００万個の間葉系幹細胞を、室温では流動可能であるが３０℃以上で硬い親水コロイドに変わる複合体溶液内で均一に分散する。このシステムは、再生医療のための生体系への細胞のデリバリーと共に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養にも適している。

Claims (29)

1. ａ．ヒアルロン酸を接触させる工程、
   ｂ．１，３，５−トリアジン（又はｓ−トリアジン）化合物を接触させる工程、及び
   ｃ．少なくとも１つの末端アミノ基を有する一つ又は複数の感熱性ポリマーを接触させる工程
   を含む感熱性ヒアルロン酸複合体を調製する方法。
2. 該ヒアルロン酸及び該感熱性ポリマーが、水性溶媒中で一緒に可溶化される請求項１に記載の方法。
3. 該水性溶媒又は水性緩衝液が有機溶剤を含まない請求項２に記載の方法。
4. 該少なくとも１つの末端アミノ基を有する感熱性ポリマーがポリ（Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド）、ポリエーテルアミン又はポロキサマーから選択される請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 該少なくとも１つの末端アミノ基を有する感熱性ポリマーがポリ（Ｎ−イソアルキル（メタ）アクリルアミド）である請求項４に記載の方法。
6. 該少なくとも１つの末端アミノ基を有する感熱性ポリマーがポリエーテルアミンである請求項４に記載の方法。
7. 該少なくとも１つの末端アミノ基を有する感熱性ポリマーが、ポリ（エチレンオキシド）鎖によって挟まれたポリ（プロピレンオキシド）の中央鎖を含み、少なくとも１つの末端アミノ基を有するポロキサマーである請求項４に記載の方法。
8. 該ヒアルロン酸が５０〜１００００ｋＤａの分子量を有する請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 該１，３，５−トリアジン（又はｓ−トリアジン）化合物が４−（４，６−ジアルキロキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチル・モルホリニウムの塩である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. ヒアルロン酸の利用可能な該カルボン酸部分と該１，３，５−トリアジン（又はｓ−トリアジン）化合物のモル比が０．０５〜２０である請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. １つ又は複数の該感熱性ポリマーが５〜２００ｋＤａの分子量を有する請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 前記ヒアルロン酸複合体の下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）より高い温度に昇温させることによって該ヒアルロン酸複合体を分離する工程ｄ．をさらに含む請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
13. 前記工程ｃ．が一つ又は複数の生物活性薬剤を接触させることをさらに含む請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
14. ヒアルロン酸と、１，３，５−トリアジン（又はｓ−トリアジン）化合物によって仲介される直接的なアミド化反応を介した少なくとも１つの末端アミノ基を有する一つ又は複数の感熱性ポリマーとの、感熱性ヒアルロン酸複合体であって、水性溶媒又は水性緩衝液中に溶解した場合に、貯蔵せん断率Ｇ’が２５℃で８Ｐａを超え、３５℃での貯蔵せん断率Ｇ’と２５℃での貯蔵せん断率Ｇ’の比率が８０を超える、前記感熱性ヒアルロン酸複合体。
15. 核磁気共鳴スペクトル測定法で測定する場合に、０．１〜５０％の置換度を有する請求項１４に記載の感熱性ヒアルロン酸複合体。
16. 該少なくとも１つの末端アミノ基を有する感熱性ポリマーが、１０〜１００ｋＤａの分子量を有するポリ（Ｎ−イソアルキル（メタ）アクリルアミド）である請求項１４又は１５に記載の感熱性ヒアルロン酸複合体。
17. 体の内側又は外側の傷の治療における使用のための請求項１４〜１６のいずれかに記載の感熱性ヒアルロン酸複合体。
18. ドラッグデリバリーシステムにおける使用のための請求項１４〜１６のいずれかに記載の感熱性ヒアルロン酸複合体。
19. 消毒剤組成物における使用のための請求項１４〜１６のいずれかに記載の感熱性ヒアルロン酸複合体。
20. 骨又は軟骨欠損の治療における使用のための請求項１４〜１６のいずれかに記載の感熱性ヒアルロン酸複合体。
21. 請求項１４〜１６のいずれかに記載の該感熱性ヒアルロン酸複合体及び一つ又は複数の生物活性薬剤からなる生物活性薬剤デリバリーシステム。
22. 該生物活性薬剤が、タンパク質又は（ポリ）ペプチド、ワクチン、核酸、ホルモン、がん治療薬、血管新生抑制薬、成長因子又は抗微生物物質である請求項２１に記載の生物活性薬剤デリバリーシステム。
23. 該生物活性薬剤が細胞である請求項２１に記載の生物活性薬剤デリバリーシステム。
24. 該生物活性薬剤が該感熱性ヒアルロン酸複合体に共有結合するか、あるいはその中に分散する請求項２１に記載の生物活性薬剤デリバリーシステム。
25. 該生物活性薬剤デリバリーシステムの総重に基づいて０．１〜８０重量％の骨伝導材料をさらに含む請求項２１に記載の生物活性薬剤デリバリーシステム。
26. 該骨伝導材料が無機塩類、ミネラル類又はセラミック材料から選択される請求項２１に記載の生物活性薬剤デリバリーシステム。
27. 該生物活性薬剤が、タンパク質又は（ポリ）ペプチドである請求項２１に記載の生物活性薬剤デリバリーシステム。
28. 該生物活性薬剤が抗生物質である請求項２１に記載の生物活性薬剤デリバリーシステム。
29. 貯蔵せん断率Ｇ’が２５℃で８〜１００Ｐａであり、また３５℃での貯蔵せん断率Ｇ’と２５℃での貯蔵せん断率Ｇ’の比率８０〜８０００である水性溶媒又は水性緩衝液中の請求項１４〜１６のいずれかに記載の感熱性ヒアルロン酸複合体の溶液。

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