CN113662961B - 一种可捕获镁离子的微流控水凝胶微球及制备方法与应用 - Google Patents

一种可捕获镁离子的微流控水凝胶微球及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种可捕获镁离子的微流控水凝胶微球及制备方法与应用。本发明通过席夫碱反应、配位结合的方法在接枝双膦酸盐(Bp)的甲基丙烯酰化明胶微球(GelMa‑Bp)表面螯合Mg2+，以此构建出一种受磁石启发的捕获Mg2+的微流控水凝胶微球(GelMa‑Bp‑Mg)，赋予了水凝胶微球Mg2+主动捕获性，微创注射性，持续缓释性和骨靶向性，从而大大增强了其激活成骨细胞，内皮细胞，抑制破骨细胞的能力，最终通过“集成多功能”的微球很好实现了松质骨重建。

Description

一种可捕获镁离子的微流控水凝胶微球及制备方法与应用
技术领域
本发明属于水凝胶制备技术领域，具体涉及一种可捕获镁离子的微流控水凝胶微球及制备方法与应用。
背景技术
骨质疏松是一种以骨量减少，骨微观结构改变，易引起脆性骨折为特征的渐进性、全身性疾病。骨质疏松性骨缺损是指骨质疏松症患者骨的结构完整性遭到破坏，常见于创伤、感染、肿瘤切除等。由于骨质疏松症患者体内成骨细胞介导的骨形成作用明显低于破骨细胞介导的骨吸收，易导致骨折且经常伴随骨缺损。骨质疏松性骨缺损具有骨质差、愈合慢、再缺损发生率高等特点。因此，临床上常用一些干预手段才能达到治疗目的，通常采用全身治疗结合局部治疗。全身治疗以全身药物干预为主，包括补充钙和维生素D，激素替代，阿仑膦酸钠，甲状旁腺素和甲状旁腺素激动剂，以及RANKL抑制剂等。然而，全身药物治疗难以实现长时间持续缓释，且靶向性差，需反复服用才能达到治疗作用的血液药物浓度，从而导致药物副作用过大；肝脏，肾脏代谢负荷过重。此外，临床上局部治疗骨质疏松性骨缺损主要采用人工骨或者自体骨移植。自体骨移植是目前治疗骨缺损的金标准。然而，自体骨移植的取自体骨会对患者造成极大的二次损害，且移植的新骨仍有被自身溶解的风险，骨修复效果较差，且无法实现微创，精准治疗。因此，需要提出一种集促成骨性能优越、微创、持续缓释、骨靶向性于一体的促进骨再生的替代治疗策略。
镁离子在机体中能维持骨骼强度和骨形成能力，与预防骨质疏松症相关。缺镁会对成骨细胞、破骨细胞之间的平衡产生影响，并导致人类骨质疏松。镁离子在骨生长中的作用已经证明，它通过增加成骨细胞的附着和分化，显著增强了人骨来源细胞的粘附，并促进了骨愈合。此外，有研究指出，镁离子在促进血管生成的过程中扮演着极其显著的作用。因此，镁离子作为一种优良的促进骨形成因子，使得镁骨组织工程材料被广泛运用于骨修复。Golafshan等通过挤出辅助三维打印技术，将锶离子改性的磷酸镁陶瓷和医用级聚己内酯聚合物相融合，制成负镁支架。体内体外实验表明，此支架显著诱导骨再生。然而，此材料在植入时对机体造成的创口较大，从而带来严重地附加损害，且容易导致炎症、感染、骨生长抑制等，从而难以实现微创治疗。此外，镁基材料已经成为一类有巨大前景的骨组织工程生物材料。它具有防止异型巨细胞形成的优势，其结构和孔结构条件对骨形成和改建活动有很大促进。镁基材料降解过程中释放出的氢气扩大了原有的孔隙，为侵入的细胞和血管提供了良好的空间。此外，镁基骨水泥以及镁表面生物涂层促进血管再生的能力非常显著。然而，这些镁骨组织工程生物材料大都通过被动方式混合金属镁，从而存在释放速率过快的缺陷。释放速率过快会产生过多的氢氧化镁，在植入物周围造成的“高镁微环境”，并扰乱位于植入物周围的细胞的钙依赖过程和生理，甚至对周围的细胞和组织造成毒性损害。Lin等设计了由聚乳酸-乙醇酸共聚物、海藻酸盐和氧化镁纳米粒子组成的单分散核壳微球给药系统。微球核心作为镁的储存层，而海藻酸壳作为外壳。该系统有效地提高体外成骨活性，并能刺激体内骨量、骨密度和术后骨小梁厚度的再生。然而，此生物材料不具有骨靶向性，不能实现药物选择性的作用于骨组织。
由于现有的镁骨组织工程材料大都采用被动的方式进行镁混合，很难实现主动地捕获Mg2+，且持续缓释能力较弱，进而难以实现集促成骨性能优越、缓释、微创、骨靶向性于一体的促进骨再生的替代治疗策略。因此，亟待开发一种新的可高效促进骨再生的微球给药系统，以实现上述功能。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种可捕获镁离子的微流控水凝胶微球及其制备方法与应用。本发明构建了一种受磁石启发的可捕获Mg2+的微流控水凝胶微球(GelMa-Bp-Mg)，赋予了水凝胶微球Mg2+主动捕获性，微创注射性，持续缓释性和骨靶向性，从而大大增强了其激活成骨细胞，内皮细胞，抑制破骨细胞的能力，最终通过“集成多功能”的微球很好实现了松质骨重建。
本发明的目的之一是提供一种可捕获镁离子的微流控水凝胶微球的制备方法，其包括以下步骤：
(1)GelMA的制备
将明胶加入到PBS中配制成明胶溶液，水浴下充分搅拌使其完全溶解并溶胀，使用微注射装置向明胶溶液中缓慢注入甲基丙烯酸酐进行反应，待反应完全后加入PBS终止反应，得到GelMA溶液，透析后冷冻干燥得到GelMA；
(2)GelMA-Bp的制备
将过量的戊二醛加入到阿仑膦酸盐中，混合体系升温后充分反应，获得醛改性的双膦酸盐，记为BP-CHO，静置后使用丙酮洗涤BP-CHO，干燥后将BP-CHO和GelMA去离子水溶液按质量体积比为2:1mg/mL-10:1mg/mL充分混合，热水浴中反应过夜，所得产物经透析和冷冻干燥，获得黄色多孔的GelMA-BP；
(3)GelMA-Bp微球的制备
以步骤(2)所得GelMA-Bp为原料，Span 80为表面活性剂，矿物油用作连续相，在光引发剂和紫外光照射下采用微流控装置制备GelMA-Bp微球；
(4)GelMA-Bp-Mg微球的制备
将GelMA-Bp微球与MgCl2在去离子水中反应，得到GelMA-Bp-Mg微球。
本发明的上述制备方法，是基于液滴微流控法，并充分考虑到可注射水凝胶微球是微创治疗的绝佳选择。其技术构思是基于磁石吸附金属的原理，磁石由于其内部特殊的原子结构，自身具有磁矩，能够产生磁场，具有吸引多种金属的特性。受此启发，本发明通过席夫碱反应、配位结合的方法在接枝双膦酸盐(Bp)的甲基丙烯酰化明胶微球(GelMa-Bp)表面螯合Mg2+，以此构建出一种受磁石启发的捕获Mg2+的微流控水凝胶微球(GelMa-Bp-Mg)，赋予该水凝胶微球Mg2+主动捕获性，微创注射性，持续缓释性和骨靶向性，从而增强其激活成骨细胞，内皮细胞，抑制破骨细胞的能力，最终通过“集成多功能”的微球实现松质骨重建。
本发明具体步骤如下：首先，Bp通过席夫碱反应和醛活化反应接枝到GelMa骨架上；其次，通过微流控法制备高度单分散的光交联GelMa-Bp微球；最终通过金属离子-配位配体结合方法构建捕获镁离子的光交联GelMa-Bp-Mg微球，并对其理化特性进行验证。通过体外细胞实验分别验证该微球复合体的细胞生物相容性，对细胞增殖、Mg2+的捕获和控释、血管化和成骨能力作用的潜能。通过构建骨质疏松性骨缺损大鼠模型，通过Micro-CT和病理切片染色评价微球复合体的血管化和成骨功能。结果表明，本发明构建了一种受磁石启发的能捕获镁离子和阿仑膦酸钠功能化的可注射水凝胶微球促进松质骨再生。
现有技术中的专利文献CN 108203448 A公开了一种促进矿化并提供生物活性离子的持续释放的可注射水凝胶，其是将无机纳米颗粒与有机聚合物网络结合在一起获得水凝胶，所得材料具有增强的机械性能和显著的矿化，并且提供了离子的持续长期释放。此外，从水凝胶释放的离子可以增强细胞铺展并促进植入细胞的成骨分化。其中同样采用了双膦酸盐和金属纳米颗粒以及多个甲基丙烯酸化聚合物链，然而该文献方法与本发明有以下不同：(1)文献方法制备的是常规形态的水凝胶，本发明提供的是一种微流控水凝胶微球，其具有微创可注射，单分散，比表面积大等优势；(2)文献方法中运用的材料为甲基丙烯酸透明质酸(MeHA)，本发明中使用材料为明胶甲基丙烯酸(GelMA)；(3)文献方法中首先制备BP-Mg纳米粒子，再通过纳米粒子表面的游离丙烯酸酯基团和MeHA聚合物链上的甲基丙烯酸酯基团进行自由基聚合，生成MeHA-BP-Mg纳米复合水凝胶。本发明方法首先通过席夫碱反应和醛活化反应将Bp接枝到GelMA骨架上；再通过微流控法制备高度单分散的光交联GelMa-Bp微球；最终通过金属离子-配位配体结合方法构建捕获镁离子的光交联GelMa-Bp-Mg微球。因此，二者在制备方法上有较大差别。另外，二者所得的水凝胶产物结构也有较大区别：文献中将MEHA、Ac-BP和MgCl2溶解在PBS中，反应5min，在将前驱体溶液加载到定制模具之前，将光引发剂添加到前驱体溶液中以制备各类型的水凝胶。因此，BP，Mg2+在水凝胶体系中均匀分布。而本发明制备的微流控水凝胶微球是在接枝BP的GelMA微流控微球表面捕获Mg2+，因此，BP水凝胶微球体系中均一分布，而Mg2+均匀分布在微球表面。另外，在水凝胶的功能上也有所差别：文献中所得材料具有增强的机械性能和显著的矿化，并且提供了离子的持续长期释放，此外，从水凝胶释放的离子可以增强细胞铺展并促进植入细胞的成骨分化。而本发明涉及的受磁石启发微流控水凝胶微球具有Mg2+主动捕获性，微创注射性，持续缓释性和骨靶向性，从而增强其激活成骨细胞，内皮细胞，抑制破骨细胞的能力，最终通过“集成多功能”的微球实现骨质疏松性骨缺损松质骨的重建，因此二者材料的功能有较大差别。
进一步的是，步骤(1)中所述明胶溶液的浓度为0.1-1g/mL，所述甲基丙烯酸酐的注入速率为0.1-0.8mL/min，明胶与甲基丙烯酸酐的质量体积比为2g:3mL-8g：1mL，反应时间为2小时，终止反应时调节明胶溶解的浓度为0.002-0.2g/mL。
进一步的是，步骤(1)中所述透析为在透析袋中进行，透析的操作为在35-40℃的去离子水中透析3-4天。
进一步的是，步骤(2)中所述混合体系升温后的温度为45℃，充分反应的时间不低于12h，所述静置的时间为20min，所述GelMA去离子水溶液的浓度为100mg/mL。
进一步的是，步骤(2)中所述热水浴的温度为37℃，所述透析为在去离子水中透析3天。
进一步的是，步骤(3)中所述紫外光的波长为365nm，紫外光处理时间为30分钟。
进一步的是，步骤(4)中所述MgCl2溶液的终浓度为100mM。
本发明的目的之二是提供一种由如上所述方法制备得到的可捕获镁离子的微流控水凝胶微球，所述水凝胶微球具有Mg2+主动捕获性。
本发明的目的之三是提供上述可捕获镁离子的微流控水凝胶微球的应用，其是将该水凝胶微球用于制备治疗骨质疏松性骨缺损的药物方面的应用，具体为促进松质骨再生的药物方面的应用。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明运用微流控技术制备了可注射的水凝胶微球；
(2)本发明的制备方法通过席夫碱反应和醛活化反应将Bp接枝到GelMA骨架上；
(3)本发明通过金属离子-配位配体结合方法构建捕获镁离子的光交联GelMA-Bp-Mg微球；
(4)本发明获得的微流控水凝胶微球具有Mg2+主动捕获性，微创注射性，持续缓释性和骨靶向性，可激活成骨细胞，内皮细胞，并抑制破骨细胞；
(5)本发明提供的复合微球实现了骨质疏松性骨缺损松质骨的重建。
附图说明
图1为复合微球的形态和尺寸分布，(A)GelMA微球(B)GelMA-BP微球和(C)GelMA-BP-Mg微球的光学显微照片；另外，随机计算每组复合微球的粒径分布。
图2为复合微球的特性，(A)GelMA，GelMA-BP，GelMA-BP-Mg微球的扫描电子显微镜代表性图像；(B)双膦酸盐在GelMA-BP微球上的分布是均匀的，并且双膦酸盐和捕获的Mg2+在GelMA-BP-Mg微球上的分布是均匀的；(C)能谱分析证实复合微球上存在相应的P和Mg元素；(D)3种复合微球的31PNMR光谱；(E，F)三种复合微球的药物释放曲线证实了双膦酸酯的成功接枝和Mg2+的有效捕获；(G)制备可捕获Mg2+的复合微球所涉及的化学方程式。
图3为复合微球的荧光染色图，用罗丹明将GelMA，GelMA-BP和GelMA-BP-Mg复合微球染色5分钟后，使用荧光显微镜观察每组复合微球的形态。
图4为复合微球的细胞生物相容性，(A,D)通过活/死染色分析与复合微球共培养1天，3天和5天的BMSC细胞和HUVEC细胞活性，活细胞为绿色，死细胞为红色；(B,E)统计两种细胞的存活率；(C,F).CCK-8检测这些复合微球的细胞毒性(NS，无显着性差异；*,P＜0.01；**,P＜0.001)。
图5为在第2、5和7天用鬼笔环肽分别对GelMA，GelMA-BP和GelMA-BP-Mg组中共培养的BMSCs细胞进行染色。
图6为复合微球的生物相容性，(A,B)在2、5和7天观察BMSC细胞和HUVECs细胞在复合微球上的增殖；(C)复合微球和细胞共培养，红色：骨架；蓝色：细胞核；(D，E)统计微球上细胞的数量(NS，无显着性差异；*,P＜0.01；**,P＜0.001)。
图7为复合微球对细胞的毒性，(A)将GelMA，GelMA-BP，GelMA-BP-Mg复合微球和HUVECs细胞共培养2、5和7天，并对每组微球复合物进行活/死染色；(B)细胞活力的定量分析。
图8为复合微球的体外血管生成，体外矿化和破骨细胞抑制作用，(A)培养1h，3h和6h后，HUVECs细胞形成内皮网络；(B,C)分析各组之间成管总长度(B)和节点数(C)的差异；(D)不同微球复合物组的骨髓间充质干细胞的茜素红S染色的图片；(E)不同微球复合物共培养的破骨细胞TRAP染色显微镜图片；(F,G)不同组别的茜素红S染色和TRAP染色的定量分析(NS，无显着性差异；*,P＜0.01；**,P＜0.001)。
图9为复合微球对BMSC细胞和HUVECs细胞成骨基因和成管基因表达的影响，(A,B,C,D)Q-PCR显示相关的mRNA表达，这些基因包括Runt相关转录因子2(Runx2)，碱性磷酸酶(ALP)，一氧化氮合酶的内皮亚型(e-NOS)和血管内皮生长因子VEGF；(E,F,G,H,I)Westernblot探究了基因的蛋白质表达并进行了定量分析，这些基因包括ALP，Runx2，e-NOS，VEGF(NS，无显着性差异；*,P＜0.01；**,P＜0.001)。
图10为Micro-CT评估可注射复合微球对体内骨骼再生的影响，(A,B,C)成功建立骨质疏松大鼠模型并进行定量分析；(D)骨质疏松性骨缺损的大鼠在4周和8周时的代表性Micro-CT图像；(E-H)定量分析不同治疗组的Micro-CT参数：E)Bv/Tv，F)Tb.Sp，G)BMD和H)Tb.Sp(NS，无显着性差异；*,P＜0.01；**,P＜0.001)。
图11为X射线评估复合微球在体内的治疗效果。上图为局部注射复合微球4周后对骨质疏松性骨缺损大鼠的修复作用，下图中白色圆圈代表骨缺损的大致区域。
图12为复合微球体内治疗的组织学分析，(A)各组治疗8周的骨组织切片HE染色代表性图片；(B)不同治疗组的新生骨面积百分比；(C)手术后8周拍摄的I型胶原免疫组织化学染色的股骨组织切片的代表性图片；(D)定量I型胶原蛋白阳性细胞；(E,F)免疫荧光染色CD31表达在各组中的变化，并对蛋白质表达差异进行定量(NS，无显着性差异；*,P＜0.01；**,P＜0.001)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
1.材料和方法
1.1.GelMA的制备
将20g明胶(Macleans，中国上海)混合到200mL PBS中，搅拌3小时以使其完全溶解，然后在60℃的水浴中再次充分搅拌直至其完全溶解并溶胀。使用微注射器泵以0.25mL/min的速率缓慢添加16mL的甲基丙烯酸酐(MA)(阿拉丁，上海，中国)，并且使其反应2小时。加入800mL PBS以终止反应。然后，将GelMA溶液转移到透析袋中，并在38℃的去离子水中透析3-4天。最后，将GelMA冷冻并使用冷冻干燥机干燥。
1.2.GelMA-Bp的制备
过量的戊二醛被加入到阿仑膦酸盐(阿仑膦酸盐，阿拉丁，中国上海)中。该体系在45℃下充分反应过夜，以获得醛改性的BP。静置20分钟后，使用大量冷丙酮洗涤BP-CHO。在通风处将BP-CHO完全干燥后，将10mL GelMA去离子水溶液(100mg/mL)和60mg BP-CHO充分混合，并在37℃的水浴中反应过夜。最后，将反应产物在去离子水中透析3天，将液体样品冷冻干燥后，获得黄色多孔的GelMA-BP，密封并在-20℃下保存。
1.3.GelMA-Bp微球的制备
采用微流控法制备了GelMA-Bp微球。5％(w/w)的Span 80是表面活性剂，并且矿物油用作连续相，因此微球形状可以更稳定。将GelMA-Bp溶解在去离子水中，然后将0.5％光引发剂加入到溶液系统中。油相可以连续切割水相，以使GelMA-Bp形成液滴，然后将这些液滴从出口转移到冷冻的培养皿中。在紫外线(365nm，30分钟)下，可以将GelMA-Bp小滴进行光交联以形成固体凝胶微球。为了去除表面活性剂和矿物油，使用75％的乙醇和丙酮反复洗涤微球。将洗涤的微球在-80℃下冷冻3小时，然后使用冷冻干燥机将GelMA-Bp微球冷冻干燥72小时。
1.4.GelMA-Bp-Mg微球的制备
为了制备GelMA-Bp-Mg微球，首先将GelMA-Bp微球放入去离子水中，然后将MgCl2溶液(溶液中的终浓度为100mM)加入去离子水中5分钟。在检测以下微球表征之前，将微球用去离子水冲洗以去除潜在的非螯合离子。
1.5.复合微球的理化性质
表征GelMA，GelMA-Bp，GelMA-Bp-Mg复合微球的理化性质。使用相差光学显微镜(PCOM，Nikon，Japan)检测水溶液中复合微球的形态和粒径，并用荧光染料若丹明对微球染色。SEM(FEI，美国)和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM，Zeiss，德国)用于检测冷冻干燥复合微球的表面形态。EDS(Thermo Scientific，USA)用于检测复合微球的表面成分。31P核磁共振(31PNMR)(日本JEOL的JNM-ECS400)用于表征BP是否已接枝到GelMA微球上。
1.6.复合微球的药物负载和释放
分析GelMA-Bp和GelMA-Bp-Mg微球捕获Mg2+并缓慢释放的性能。使用以下方法测试双膦酸盐的释放曲线。在37℃下，将10mg微球包封装在透析袋中，然后置于1.5ml离心管中，然后加入1ml 0.1N氢氧化钠溶液。每天取出200ul浸出溶液，并用等体积的0.1N氢氧化钠溶液代替。分光光度计用于通过在456.5nm处添加1,2-萘醌4-磺酸钠试剂来测量分析样品中的双膦酸钠的含量。
1.7.复合微球的生物相容性
选择HUVEC和大鼠BMSC细胞以研究复合微球的生物相容性。将BMSC或HUVEC细胞与复合微球以1×104/孔混合后，将该系统静置30分钟，然后转移至24孔组织培养板中进行共培养。培养基中含有10％的胎牛血清(Gibco)，100mg/mL链霉素和100U/mL青霉素(生命技术公司)。活/死细胞试剂盒(Invitrogen，L3224，美国)用于测试微球和微球提取物的生物相容性。孵育2、5和7天(1、3、5提取物)后，用500μL试剂将微球上的细胞染色20分钟，然后用共聚焦激光显微镜(LSCM，LSM800，Zeiss，德国)进行成像。
使用CCK-8测试试剂盒(Apexbio，K1018，美国)进一步检测细胞毒性。在第1、3和5天，将CCK-8试剂添加到每个孔中，并根据说明书温育2小时。温育2小时后，提取温育上清液100μL，并使用酶标仪在450nm的波长下测量OD值。此外，在同一时间点，将两种细胞用PBS洗涤3次后，将它们用4％多聚甲醛固定15分钟，然后用0.1％(v/v)Triton X-100处理15分钟。随后，用PBS洗涤细胞3次，并根据说明书分别用鬼笔环肽和4,6-二氨基-2-苯并吲哚二乳酸(DAPI)染色肌动蛋白和细胞核。最后，通过激光扫描共聚焦显微镜观察染色的细胞。
1.8.成管实验
用Matrigel(BD BioCoat Matrigel，美国)包被共聚焦24孔板并用于成管实验。将微球提取物与新鲜的高糖培养基混合后，将其用于培养HUVEC细胞，培养密度为3×104/孔。同样，将细胞在37℃的培养箱中在5％CO2条件下孵育1小时，3小时和6小时，然后用4％多聚甲醛固定。使用LSCM观察管形成，并使用Image J软件进行进一步分析，包括接头数量，总管长，网格以及每个组区域(网格区域)中的网格数量。
1.9.茜素红染色
用茜素红对与微球共培养的BMSC细胞的矿化结节进行染色。将密度为3×104/孔的BMSC细胞接种在12孔板上，并与复合微球共培养。培养24小时后，用成骨诱导培养基刺激细胞。将细胞培养7、14和21天后，除去微球，并用茜素红试剂盒对细胞进行染色。将10％乙酸添加到培养板中过夜，以准确定量茜素红染色并读取OD值。接下来，将混合溶液离心15分钟以提取上清液，并使用10％氢氧化铵混合上清液。最后，吸出100μL上清液，并通过紫外分光光度计读取OD值。
1.10.酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色
复合微球刺激后，使用TRAP染色评估每组破骨细胞的活性。每组细胞刺激72小时后，将细胞用PBS洗涤3次，并在10％福尔马林(在PBS中)中固定5分钟。用蒸馏水洗涤3次后，加入TRAP(Sigma-Aldrich)溶液并染色30-40分钟。在光学显微镜(奥林巴斯，东京，日本)下检查染色的细胞后，用数码相机(奥林巴斯)捕获图像。手动对多核细胞进行计数。
1.11.RT-qPCR和Western-blot
实时荧光定量PCR(RT-qPCR)用于检测碱性磷酸酶(ALP)，Runt相关转录因子2(Runx2)，一氧化氮合酶内皮亚型(e-NOS)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达。Gapdh是参考基因。简而言之，首先将每组复合微球灭菌，然后转移到6孔板中。接下来，将HUVEC和BMSC细胞与微球在孔板中以2×105/孔的密度共培养。在高血糖培养基中培养24小时后，使用成骨诱导培养基(10-8M地塞米松，50μg/mL抗坏血酸和10mM b-甘油磷酸酯)替换普通BMSCs培养基。将这两种细胞与每组复合微球共培养14天后，分析成骨基因和成血管基因的表达。简而言之，使用Trizol试剂(美国Invitrogen公司)对细胞进行胰蛋白酶消化以提取总RNA。随后，使用Prime Script RTKit(Nippon Treasure Wine)通过逆转录反应从提取的mRNA合成cDNA。接下来，使用ABI Step One Plus实时PCR系统(美国Applied Biosystems)和SYBRGreen RT-PCR试剂盒(日本Takara)进行RT-PCR。将每个样品重复3次，并根据试剂说明完成所有上述实验。如下表1显示了每个基因的引物序列。
表1
Figure BDA0003169226740000101
Figure BDA0003169226740000111
Western-blot用于检测与成骨和血管生成相关的蛋白表达。为了检测细胞裂解后总蛋白的浓度，使用了BCA蛋白试剂盒(Beyotime，P0012，中国)。接下来，将样品蛋白质进行SDS电泳并转移至PVDF膜(0.45μm，Millipore，美国)。PVDF膜用5％BSA处理1小时，以阻断非特异性结合的蛋白质。相关的一抗包括ALP(ab229126，Abcam，1：1500)，Runx2(ab76956，Abcam，1：1000)，e-NOS(ab76198，Abcam，1：750)和VEGF(NB100-664，Novus，1：1200)。用TBST将PVDF膜清洗3次后，使用相应的二抗(1：10,000)将膜孵育1小时。将二抗孵育后，用TBST洗涤3次以除去未结合的二抗，然后使用化学发光系统进行检测和成像。最后，通过Image J软件定量分析抗原-抗体复合物。
1.12.骨质疏松症模型的建立和体内骨修复的评估
建立去卵巢骨质疏松性骨缺损的大鼠模型，以评估复合微球体内的骨修复。购买了8周大的Sprague Dawley(SD)雌性大鼠(Broad&Bright，中国上海)。给小鼠腹膜内注射1％的戊巴比妥(0.1ml/100g)，在小鼠完全麻醉后，将其俯卧。在OVX组中，在第三个腰椎背侧的中线切开约0.5cm的切口，并进行钝器分离。切开腹膜后，用组织钳加深切口以找到卵巢，将其结扎在输卵管末端附近，然后用眼科剪刀将其除去，然后除去剩余的组织。最后缝合切口。
卵巢切除术后三个月，验证骨质疏松的大鼠模型是否建立成功。将异氟烷添加到动物气体麻醉机中以麻醉SD大鼠(24只动物，±50g)。充分麻醉后，使用股骨远端的横向纵向切口完全暴露股骨的外侧。用3mm的电钻钻入股骨的股骨外上髁，以形成3X3mm的骨缺损区域。最后，将制备的复合微球注射入骨质疏松性骨缺损处，并成功缝合手术切口。将24只大鼠共分为4组，n＝6，对照组，GelMA和GelMA-BP，GelMA-BP-Mg组。
1.13.X线评估
在第4和第8周处死各组动物以评估复合微球的骨修复效果。收集植入有生物材料的股骨并用4％多聚甲醛溶液固定，然后立即进行Micro CT扫描和3D重建骨缺损区域。定量比较和分析骨小梁厚度(Tb·Th)，骨矿物质密度(BMD)，骨小梁分离/间距(Tb.Sp)和骨组织体积/总组织体积。
1.14.组织学测试和免疫组织化学分析
通过HE染色，CD31免疫荧光和I型胶原免疫组织化学评估每组的病理切片。4％多聚甲醛用于固定骨组织。然后，将多聚甲醛更换两次后，将固定的样品转移到10％的乙二胺四乙酸(EDTA)中进行脱钙。脱钙完成后，将骨样品蜡封并进行病理切片。切片厚度为5μm，并用苏木精和曙红(HE)染色。在免疫组织化学染色中，使用0.5％胃蛋白酶(Life Tech)处理石蜡切片，然后使用1％BSA(Sigma)和3％H2O2(Life Tech)进一步处理。使用抗胶原蛋白I抗体(Abcam，ab270993，1：100)在4℃下孵育过夜，并在室温下与二抗孵育1小时。最后，将DAB用于底物系统的显色，使用Zeiss扫描仪(卡尔·蔡司，德国)扫描切片，并使用Image J软件定量分析阳性表达细胞。对于免疫荧光分析，将每组样品用0.1％Triton X-100穿透20分钟，并在5％室温下用5％BSA封闭20分钟。然后使用CD31(NB100-2284，Novus，1：2000)在4℃下过夜。温育后，将切片用PBS洗涤，并加入Alexa荧光缀合的二抗(Molecular Probes，1：4000，Life Tech，USA)。此外，DAPI用于核染色。最后，使用LSCM获得各组的染色切片图像，并使用Image J软件定量分析免疫信号的强度。所有标本都重复了五个部分。
1.15.数据统计和分析
使用三个独立实验的平均值±标准差表示所有分析数据。使用SPSS 20(美国伊利诺伊州芝加哥的SPSS公司)进行统计分析。使用GraphPad Prism软件(GraphPad SoftwareInc.)绘制所有图形。组内使用方差分析，并使用T检验分析组间差异。*，P＜0.05被认为是统计学上显着的。
2.结果与讨论
2.1复合微球的制备和表征
在本发明中，通过微流控方法制备了GelMA，GelMA-BP和GelMA-BP-Mg水凝胶微球。复合微球的直径为272±21mm，290±28mm，265±36mm，而孔隙率为72±5％(图1A，B，C)，可以看出制备的微球尺寸均匀。GelMA具有良好的生物相容性，高可用性，低成本和可降解性，因此可用于再生医学和组织工程的各个领域。此外，可以使用微流控技术制备粒径可控的GelMA水凝胶微球。经冻干机冻干后，微球具有干燥的多孔结构，可显着改善药物的负载和释放。另外，微流体水凝胶微球可以混入生理盐水中，吸入注射器中，经皮给药，这极大地实现了微创治疗的概念。
在进一步的研究中，GelMA微球是极好的载体，为Bp接枝提供了良好的基础，从而实现了对Mg2+的有效捕获。扫描电子显微镜观察发现，冷冻干燥的微球是多孔的(图2A)。图3显示了罗丹明染色的复合微球。Mg2+是激活酶的重要辅助因子，并在人体的各种生理和生化过程中发挥重要作用。据报道，Mg2+对成骨细胞的增殖，粘附和矿化具有显著作用。此外，将天然骨基质中存在的生物活性离子(例如铜离子，锶离子和镁离子)掺入骨替代物中可刺激血管化的骨再生。因此，在本发明中，Mg2+被用作实现骨再生的关键因素。通过捕获复合微球增强血管形成和成骨作用。BP是捕获Mg2+的理想工具，因为BP分子包含两个相邻的磷酸基团，所以当与各种金属离子(尤其是Mg2+)配位时，具有出色的效率。因此，能量色散X射线光谱(EDS)显示GelMA-BP微球具有均匀的P元素分布，而GelMA-BP-Mg微球具有均匀的镁和P元素分布(图2B)。此外，对于每组复合微球样品，EDS揭示了通过SEM观察到的GelMA-BP和GelMA-BP-Mg中存在相应的P元素和Mg元素(图2C)。31PNMR谱图(图2D)显示，只有GelMA-BP和GelMA-BP-Mg在17.6ppm16、25处有明显的共振峰。因此，我们的研究从多个方面和角度证实了双膦酸已被接枝到GelMA微球上。可以成功捕获Mg2+。图2E显示了双膦酸盐从三种类型的微球中释放。可以观察到，GelMA-BP和GelMA-BP-Mg微球在三天内，双膦酸盐的释放速度较快，然后双膦酸盐的释放较慢。GelMA微球不释放任何双膦酸盐。图2F显示了GelMA-BP-Mg微球的累积Mg2+释放曲线。GelMA和GelMA-BP微球没有任何镁释放。GelMA-BP-Mg微球系统显示出多阶段模式。在0-3天内，Mg2+呈现出突然释放，这与BP的突然释放具有一定的关系，并且在3-18天内获得了具有较低斜率的缓慢释放趋势。从图中可以看出，Mg离子的释放几乎在28天时就结束了，而BP的释放仍然可以持续。图2G显示了相关的化学反应方程式。总而言之，结果表明我们已经成功构建了可以捕获镁离子的复合微球。此外，通过微流控技术成功制备了粒径均匀的GelMA，GelMA-BP和GelMA-BP-Mg微球，GelMA-BP和GelMA-BP-Mg微球可以有效释放BP和/或Mg2+。
2.2.复合微球的体外生物相容性
首先，在24孔板中培养BMSCs和HUVECs细胞，然后使用GelMA，GelMA-BP，GelMA-BP-Mg微球共培养BMSCs和HUVECs细胞。根据活/死染色的结果，复合微球对共培养的细胞几乎无毒，培养1、3和5天后观察到的死细胞数量非常少(图4AB和DE)。另外，使用CCK-8的OD结果进一步验证了第1、3和5天后各组之间的细胞增殖活性，并对结果进行了定量分析(图4C和F)。定量统计分析表明，复合微球具有良好的生物相容性。图5显示，DAPI和鬼笔环肽用于染色与复合微球共培养2、5和7天的HUVEC。
在图6A-E和图7A中，B是BMSCs和HUVECs细胞与GelMA，GelMA-BP，GelMA-BP-Mg微球共培养2、5和7天的结果，并对细胞数量进行了定量分析。因此，这些结果全部表明单个复合微球具有良好的生物相容性，这对于细胞存活并因此在体内组织修复是必需的。
2.3.体外血管形成评估
由于松质骨富含血管，因此复合微球诱导血管形成的能力在松质骨重建过程中起着重要作用。因此，使用体外成管实验来研究复合微球对HUVECs血管形成过程的影响。图8A显示在给定的时间点，在每组复合微球样品的提取物中培养了HUVEC。3小时和6小时后，在GelMA-BP-Mg组中观察到更好的血管形成，这与GelMA-BP和GelMA组形成鲜明对比，表明从复合微球释放的Mg具有一定的血管生成活性。ImageJ用于计算结数和成管的总长度。因此，结果表明，GelMA-BP-Mg组的这些计算参数高于GelMA-BP和GelMA组的计算参数，并且具有统计学意义(图8B和C)。
2.4.BMSCs的体外成骨分化诱导和破骨细胞抑制作用
体外实验验证了复合微球促进BMSCs细胞骨形成的能力。这是成骨功能的重要形态学表现。大鼠骨髓间充质干细胞的体外矿化能力可以用茜素红S进行染色和验证。结果表明，在GelMA-BP-Mg组中，可以观察到大量矿化结节的形成，并且具有更直观的微观外观(图8D)。因此，OD值的定量结果进一步证实了GelMA-BP-Mg微球可以显着促进BMSC的成骨活性(图8F)。
接下来，比较每组复合微球对破骨细胞形成的影响。BP是双磷酸的合成类似物，双磷酸是一种具有抗破骨细胞吸收特性的氨基双膦酸盐。BP具有靶向骨的特性，可以与骨骼中的羟基磷灰石晶体结合，并优先与被破骨细胞吸收的骨骼结合。它显示出抑制破骨细胞和抑制骨吸收的作用，因此可以促进松质骨的重建。在我们的研究中，BP不仅起到捕获Mg2+的作用，而且还具有骨靶向作用和抑制破骨细胞活性的作用。因此，在使用微球刺激每组细胞后，进行了TRAP染色。与GelMA组相比，GelMA-BP-Mg和GelMA-BP组中TRAP阳性多核破骨细胞的数量显着减少(图8E)。最后，进行了定量统计分析(图8G)。因此，结果表明，GelMA-BP和GelMA-BP-Mg微球可以显着抑制破骨细胞。
2.5.Q-PCR和Western-blot检测
在血管评估方面，一氧化氮合酶(NOS)是在内皮细胞中发现的一个重要酶。最近，发现NOS负责血压调节，血管舒张，血小板聚集，炎症和心脏收缩过程中的免疫调节。牙髓内皮细胞中e-NOS的存在可能介导局部细胞增殖和血管舒张。研究表明，镁可以通过激活e-NOS信号通路来促进血管再生。另外，VEGF是血管化过程中的关键靶基因和蛋白质。有鉴于此，e-NOS和VEGF的表达已通过Western-blot和Q-PCR研究得到证实。培养24小时后，VEGF的表达水平GelMA-BP-Mg组的e-NOS和e-NOS明显高于GelMA-BP和GelMA组(图9A，B，E，F和G)。因此，这些结果证明我们的复合GelMA-BP-Mg微球可以有效释放Mg2+来激活e-NOS和VEGF途径，从而促进血管再生。
在成骨功能方面，我们显示了复合微球对成骨分化相关基因表达的影响。靶基因ALP和Runx2在成骨过程中很重要。我们用复合微球刺激BMSC细胞，并在21天时测试了ALP和Runx2基因的表达。因此，Q-PCR和Western-blot结果显示，在刺激和培养21天后，GelMA-BP-Mg组的ALP和Runx2基因表达明显高于GelMA-BP和GelMA组。(图9C，D，E，H，I)。
2.6.复合微球的体内骨再生评估
在骨质疏松性骨缺损的小鼠模型中，已经进一步研究了每组复合微球促进松质骨重建的潜力。骨质疏松症是一种典型的骨骼退行性疾病，具有扩大和松散的空间，骨皮质变薄以及小梁稀疏的特征。由于在骨质疏松症患者中，成骨细胞介导的骨形成明显低于破骨细胞介导的骨吸收，因此骨折很容易引起并且经常伴有骨缺损。在我们的研究中，已经成功建立了骨质疏松症模型，如图10A所示。此外，在骨质疏松大鼠的股骨外上髁上钻了一个3mmX3mm的孔，并注射生理盐水，GelMA微球，GelMA-BP或GelMA-BP-Mg微球。接下来，使用Micro-CT在第4周和第8周扫描骨骼。图11显示了每组大鼠中骨质疏松性骨缺损的修复效果的X射线评估。另外，计算了许多二维和三维图像参数。如图10A所示，假手术组和GelMA组在4周和8周后没有明显的骨再生，而GelMA-BP和GelMA-BP-Mg的骨质量有所改善。最后，注射了GelMA-BP-Mg的骨骼的Tb.Th，BV/TV和BMD显着高于GelMA和GelMA-BP组的骨骼(图10B-F)。因此，结果表明，与GelMA-BP组和GelMA组相比，GelMA-BP-Mg微球可以更明显地促进骨质疏松性骨缺损的修复。
2.7.组织学评估
与影像学研究结果一致，HE染色显示了复合微球治疗组有效促进松质骨重建的能力(图12A和B)。此外，GelMA-BP-Mg和GelMA-BP组显示出新的骨组织和连续的愈伤组织形成，而GelMA组则较少。另外，注射GelMA-BP-Mg的小鼠的骨修复面积和骨再生速率显着高于用GelMA-BP治疗的小鼠。根据一些研究，Mg2+可以促进长骨中新血管的形成和成骨，并且CD31高表达。CD31免疫荧光法用于测试每组的第4周切片(图12C和D)。定量分析结果表明，GelMA-BP-Mg组具有较高的CD31免疫荧光，表明该组更好地促进了新血管的形成。我们还通过I型胶原的免疫组织化学染色对骨缺损处新形成的骨组织进行了组织学分析(图12E和G)，结果与其他研究相似。定量分析结果表明，骨缺损对照组仍比较明显，而注射GelMA-BP和GelMA-BP-Mg微球的组松质骨重建效果更好。特别是，注射GelMA-BP-Mg微球的大多数缺陷都可以得到解决。因此，微球复合物具有优异的成骨作用，并且与GelMA-BP和GelMA相比，GelMA-BP-Mg具有更高的松质骨再生能力。
综上所述，在磁石吸引金属独特自然现象的启发下，本发明通过席夫碱反应、配位反应，在接枝Bp的GelMA-Bp微球表面螯合Mg2+，从而构造了一种仿“磁石”功能的可捕获Mg2+的微流控GelMA-Bp-Mg微球，由此赋予该复合微球Mg2+主动捕获性，微创注射性，有效缓释性和骨靶向能力，从而增强其激活成骨细胞和内皮细胞以及抑制破骨细胞的能力，并最终实现了“集成多功能”微球促进松质骨重建。显然，GelMA微球上Bp的接枝使GelMA-Bp微球具有强大的Mg2+捕获性能和缓释性能。GelMA-Bp-Mg复合微球在体外实验中表现出良好的Mg2+捕获和释放性能、血管化能力、成骨潜能和抑制破骨能力。进一步证明，此捕获Mg2+的复合微球能促进大鼠骨缺损内松质骨再生能力。这种基于“磁石”独特自然现象的可捕获Mg2+的复合微球将为临床骨质疏松性骨缺损修复提供新的理念。

Claims (10)

1.一种可捕获镁离子的微流控水凝胶微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)GelMA的制备
将明胶加入到PBS中配制成明胶溶液，水浴下充分搅拌使其完全溶解并溶胀，使用微注射装置向明胶溶液中缓慢注入甲基丙烯酸酐进行反应，待反应完全后加入PBS终止反应，得到GelMA溶液，透析后冷冻干燥得到GelMA；
(2)GelMA-Bp的制备
将过量的戊二醛加入到阿仑膦酸盐中，混合体系升温后充分反应，获得醛改性的双膦酸盐，记为BP-CHO，静置后使用丙酮洗涤BP-CHO，干燥后将BP-CHO和GelMA去离子水溶液按质量体积比为2:1mg/mL-10:1mg/mL充分混合，热水浴中反应过夜，所得产物经透析和冷冻干燥，获得黄色多孔的GelMA-BP；
(3)GelMA-Bp微球的制备
以步骤(2)所得GelMA-Bp为原料，Span 80为表面活性剂，矿物油用作连续相，在光引发剂和紫外光照射下采用微流控装置制备GelMA-Bp微球；
(4)GelMA-Bp-Mg微球的制备
将GelMA-Bp微球与MgCl2在去离子水中反应，得到GelMA-Bp-Mg微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述明胶溶液的浓度为0.1-1g/mL，所述甲基丙烯酸酐的注入速率为0.1-0.8mL/min，明胶与甲基丙烯酸酐的质量体积比为2g:3mL-8g：1mL，反应时间为2小时，终止反应时调节明胶溶解的浓度为0.002-0.2g/mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述透析为在透析袋中进行，透析的操作为在35-40℃的去离子水中透析3-4天。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述混合体系升温后的温度为45℃，充分反应的时间不低于12h，所述静置的时间为20min，所述GelMA去离子水溶液的浓度为100mg/mL。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述热水浴的温度为37℃，所述透析为在去离子水中透析3天。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述紫外光的波长为365nm，紫外光处理时间为30分钟。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述MgCl2溶液的浓度为100mM。
8.一种由权利要求1-7任一项所述方法制备得到的可捕获镁离子的微流控水凝胶微球。
9.根据权利要求8所述的可捕获镁离子的微流控水凝胶微球，其特征在于，所述水凝胶微球具有Mg2+主动捕获性。
10.如权利要求8或9所述的可捕获镁离子的微流控水凝胶微球的应用，其特征在于，是将该水凝胶微球用于制备治疗骨质疏松性骨缺损的药物方面的应用，具体为促进松质骨再生的药物方面的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115245598A (zh) * 2021-11-23 2022-10-28 上海市第六人民医院 一种钴离子缓释材料及其制备方法与应用
CN115137703B (zh) * 2022-06-08 2024-03-19 深圳先进技术研究院 载药微凝胶球、载药支架及其制备方法
CN115990294A (zh) * 2022-07-15 2023-04-21 苏州大学附属第一医院 可注射掺锂生物活性玻璃-GelMA水凝胶的制备方法及其应用
CN116715805B (zh) * 2023-08-01 2023-10-27 苏州大学 一种富含双膦酸基团多功能凝胶微球及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102065882A (zh) * 2008-04-14 2011-05-18 阿道恰公司 包含生长因子/两亲性聚合物复合物、阳离子的可溶性盐和有机支持物的成骨组合物

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1079845A4 (en) * 1998-06-08 2001-03-07 Advanced Medicine Inc NEW THERAPEUTIC SUBSTANCES FOR MACROMOLECULAR STRUCTURES
US20140294913A1 (en) * 2013-03-28 2014-10-02 Nesrin Hasirci Biodegradable bone fillers, membranes and scaffolds containing composite particles
WO2018113663A1 (en) * 2016-12-19 2018-06-28 The Chinese University Of Hong Kong Injectable hydrogels that promote mineralization and afford sustained release of bioactive ions
CN111195370B (zh) * 2018-11-16 2022-12-27 上海交通大学医学院附属第九人民医院 高镁微环境骨髓干细胞微球载体及其制备方法和应用
CN109970998B (zh) * 2019-03-14 2020-04-28 华南理工大学 一种以Pickering乳液法制备GelMA大孔水凝胶的方法及应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102065882A (zh) * 2008-04-14 2011-05-18 阿道恰公司 包含生长因子/两亲性聚合物复合物、阳离子的可溶性盐和有机支持物的成骨组合物

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