CN108690205A - 一种ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶及其制备和应用 - Google Patents

一种ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶及其制备和应用。该复合水凝胶由Ⅱ型胶原、丙烯酰胺类单体、交联剂、加速剂、引发剂和成胶溶液制成；通过在传统的聚丙烯酰胺凝胶中复合Ⅱ型胶原，利用Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺水凝胶对生物相容性和成软骨诱导能力的协同增效，显著改善聚丙烯酰胺水凝胶的生物相容性和Ⅱ型胶原的成软骨诱导能力，得到具有优良生物相容性和成软骨诱导能力的复合水凝胶，同时兼具良好的机械性能，可直接注射，可以直接作为软骨修复材料，也可以用于制备软骨修复材料，具有广泛的应用前景。该复合水凝胶的制备方法，简单易操作，条件温和，具有很好的产业化前景。

Description

一种Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶及其制备和应用
技术领域
本发明涉及水凝胶领域，具体涉及一种Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶及其制备和应用。
背景技术
软骨损伤在临床上十分常见，由它导致的关节疼痛、关节畸形，甚至严重的功能障碍等临床症状严重影响着人们的生活质量。但是，关节软骨缺乏修复损伤的未分化细胞，软骨细胞非常有限，因此软骨损伤自愈能力有限，目前软骨缺损修复仍然是骨科领域的热点、难点问题。随着生物医学工程的发展，研究者将软骨组织工程的概念引入至软骨缺损修复中。目前的支架材料种类很多，但是很难同时具备生物相容性、机械性能以及成软骨诱导能力，因此，开发一种新型的支架材料迫在眉睫。
聚丙烯酰胺(PAM)凝胶是一种人工合成凝胶，是由丙烯酰胺单体，以甲叉双丙烯酰胺(即N,N′-亚甲基双丙烯酰胺)为交联剂，经催化剂四甲基乙二胺(TEMED)催化，通过游离基引发(光引发、化学引发等，如过硫酸铵)聚合而形成的交联聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺水凝胶自1994年开始被用于软组织填充材料，并广泛应用于整形外科，具有良好的生物相容性和机械性能，是软骨组织工程支架材料的理想选择。Ⅱ型胶原作为关节软骨的主要成分，具有促进间充质干细胞成软骨分化的能力，并且较I型胶原可表现出更好的细胞形态以及成软骨的基因表达。如能将Ⅱ型胶原与聚丙烯酰胺复合得到一种新型的水凝胶，将具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明提供了一种Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶，旨在解决现有水凝胶作为软骨组织工程材料机械强度欠缺、生物相容性差以及无成软骨诱导能力等问题，具有良好的临床应用前景，可用于用于软骨缺损的修复。
本发明还提供了一种Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶的制备方法，该方法简单易操作，条件温和，具有很好的产业化前景。
一种Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶，由Ⅱ型胶原、丙烯酰胺类单体、交联剂、加速剂、引发剂和成胶溶液制成；
所述丙烯酰胺类单体为丙烯酰胺、丙烯酰胺衍生物中的一种或者两种；
其中，每毫升成胶溶液中，Ⅱ型胶原的用量为10mg-20mg，丙烯酰胺类单体的用量为50mg-150mg，交联剂的用量为1mg-10mg，加速剂的用量为1mg-2mg，引发剂的用量为1mg-2mg。
本发明通过在传统的聚丙烯酰胺凝胶中复合Ⅱ型胶原，利用Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺水凝胶对生物相容性和成软骨诱导能力的协同增效，显著改善聚丙烯酰胺水凝胶的生物相容性和Ⅱ型胶原的成软骨诱导能力，得到具有优良生物相容性和成软骨诱导能力的复合水凝胶。
为了达到更好的技术效果，进行以下优选：
所述Ⅱ型胶原可选用猪来源的Ⅱ型胶原、牛来源的Ⅱ型胶原、鸡来源的Ⅱ型胶原等中的一种或者两种以上。
所述丙烯酰胺类单体包括丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-羟甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺-丙烯酸共聚物等中的一种或者两种以上。
所述交联剂选用N,N′-亚甲基双丙烯酰胺。
所述加速剂选用N,N,N′,N′-四甲基乙二胺。
所述引发剂选用过硫酸钾、过硫酸铵中的一种或者两种。
所述成胶溶液用于提供成凝胶化环境，可选用水凝胶常用的水性成胶溶液，例如可选用水、生理盐水、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、培养基溶液等中的一种或者多种。
所述复合水凝胶具备良好的生物相容性，可与细胞进行复合，发挥其作用。因此，可在所述Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶中复合细胞(例如：可直接用Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶包覆细胞)，得到含细胞的Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶。当所述复合水凝胶中包含细胞时，所述成胶溶液优选培养基溶液，培养基溶液可根据复合水凝胶中所复合细胞的种类进行选择，以选择适合所述细胞培养环境的培养基为准。所述细胞可选用适于软骨缺损修复的各种细胞中的一种或者多种，例如：软骨细胞、干细胞等中的一种或者多种；所述干细胞可选用脐带间充质干细胞、脐血干细胞等中的一种或者多种。所述细胞的用量并没有严格的要求，可根据需要适量加入。
所述复合水凝胶中还可包覆一些药物(例如具有治疗关节软骨的药物)，达到药物缓释的效果，制备一种用于软骨缺损修复的药物缓释水凝胶制剂。
所述Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶的制备方法，包括步骤：
将Ⅱ型胶原溶解在成胶溶液中，得到Ⅱ型胶原溶液；
将丙烯酰胺类单体溶解在成胶溶液中，加入交联剂、引发剂和加速剂，溶解混合均匀后，再加入Ⅱ型胶原溶液，混合均匀，得到Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶。
本发明还提供了所述Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶的应用，该复合水凝胶成胶速度可控，机械性能可控，可直接注射，可以直接作为软骨修复材料，也可以用于制备软骨修复材料，具有良好的临床应用前景。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：
(1)本发明Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶同时具有优异的机械性能、良好的生物相容性以及可诱导间充质干细胞成软骨分化的能力，可作为一种优良的软骨修复的支架材料。
(2)本发明Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶具有良好的生物相容性，可与细胞进行复合，用于软骨缺损修复的治疗。
(3)本发明Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶具备多孔结构，且均在常温下进行，可包覆一些具有治疗关节软骨的药物，达到药物缓释的效果，具备更优的软骨缺损修复的性能。
(4)本发明Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶制备方法简单，流程易控，常温反应，反应条件温和，具有很好的产业化前景。
附图说明
图1是本发明实施例1复合水凝胶的扫描电子显微镜(SEM)图；
图2是本发明实施例1复合水凝胶的力学性能测试图；其中，横坐标为G'and G”(Pa)为弹性模量(G')和损耗模量(G”)，单位Pa，纵坐标Time(s)为时间(秒)；
图3是本发明实施例2复合水凝胶的力学性能测试图；其中，横坐标为G'and G”(Pa)为弹性模量(G')和损耗模量(G”)，单位Pa，纵坐标Time(s)为时间(秒)；
图4是本发明实施例6含细胞的Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶的生物相容性测试图；
图5是空白对照组进行软骨修复的效果图；
图6是本发明实施例1复合水凝胶进行软骨修复的效果图；
图7是空白对照组进行软骨修复的Ⅱ型胶原免疫组化图；
图8是本发明实施例1复合水凝胶进行软骨修复的Ⅱ型胶原免疫组化图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合附图与实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例1
称取10mgⅡ型胶原(猪来源)，充分溶解于0.5mL去离子水中，得到Ⅱ型胶原溶液，备用。称取50mg丙烯酰胺，溶解于0.5mL去离子水中，同时加入交联剂N,N′-亚甲基双丙烯酰胺4mg，引发剂过硫酸钾1.6mg以及加速剂N,N,N′,N′-四甲基乙二胺1.3mg，充分的溶解混合均匀后，向其中加入已制备的Ⅱ型胶原溶液，充分的混合均匀，10min可形成复合水凝胶。
实施例2
称取10mgⅡ型胶原(猪来源)，充分溶解于0.5mL去离子水中，得到Ⅱ型胶原溶液，备用。称取100mg丙烯酰胺，溶解于0.5mL去离子水中，同时加入交联剂N,N′-亚甲基双丙烯酰胺4mg，引发剂过硫酸钾2mg以及加速剂N,N,N′,N′-四甲基乙二胺1.8mg，充分的溶解混合均匀后，向其中加入已制备的Ⅱ型胶原溶液，充分的混合均匀，6min可形成复合水凝胶。
实施例3
称取20mgⅡ型胶原(猪来源)，充分溶解于0.5mL去离子水中，得到Ⅱ型胶原溶液，备用。称取50mg丙烯酰胺，溶解于0.5mL去离子水中，同时加入交联剂N,N′-亚甲基双丙烯酰胺8mg，引发剂过硫酸钾1.6mg以及加速剂N,N,N′,N′-四甲基乙二胺1.3mg，充分的溶解混合均匀后，向其中加入已制备的Ⅱ型胶原溶液，充分的混合均匀，3min可形成复合水凝胶。
实施例4
称取15mgⅡ型胶原(鸡来源)，充分溶解于0.5mL阿尔法培养基(Gibco)中，得到Ⅱ型胶原溶液，备用。称取70mgN-异丙基丙烯酰胺和80mgN-羟甲基丙烯酰胺，溶解于0.5mL阿尔法培养基中，同时加入交联剂N,N′-亚甲基双丙烯酰胺10mg，引发剂过硫酸钾1mg以及加速剂N,N,N′,N′-四甲基乙二胺2mg，充分的溶解混合均匀后，向其中加入已制备的Ⅱ型胶原溶液，充分的混合均匀，3min可形成复合水凝胶。
实施例5
称取15mgⅡ型胶原(牛来源)，充分溶解于0.5mL阿尔法培养基(Gibco)中，得到Ⅱ型胶原溶液，备用。称取50mg丙烯酰胺、50mg丙烯酰胺-丙烯酸共聚物和20mgN-羟甲基丙烯酰胺，溶解于0.5mL阿尔法培养基中，同时加入交联剂N,N′-亚甲基双丙烯酰胺1mg，引发剂过硫酸钾2mg以及加速剂N,N,N′,N′-四甲基乙二胺1mg，充分的溶解混合均匀后，向其中加入已制备的Ⅱ型胶原溶液，充分的混合均匀，3min可形成复合水凝胶。
实施例6
除了将实施例1中两次使用的0.5mL去离子水全部更换为0.5mL F-12培养基(Gibco)之外，其余操作同实施例1，9min可形成复合水凝胶。
再在复合水凝胶中包覆人源脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)，hUC-MSCs初始密度为5×104个/mL，得到含细胞的Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶。
实施例7
除了将实施例2中两次使用的0.5mL去离子水全部更换为0.5mL F-12培养基(Gibco)之外，其余操作同实施例2，5min可形成复合水凝胶。
再在复合水凝胶中包覆hUC-MSCs细胞，hUC-MSCs初始密度为5×104个/mL，得到含细胞的Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶。
实施例8
除了将实施例3中两次使用的0.5mL去离子水全部更换为0.5mL F-12培养基(Gibco)之外，其余操作同实施例3，3min可形成复合水凝胶。
再在复合水凝胶中包覆hUC-MSCs细胞，hUC-MSCs初始密度为5×104个/mL，得到含细胞的Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶。
实施例9
除了将实施例4中两次使用的0.5mL阿尔法培养基(Gibco)全部更换为0.5mL F-12培养基(Gibco)之外，其余操作同实施例4，3min可形成复合水凝胶。
再在复合水凝胶中包覆hUC-MSCs细胞，hUC-MSCs初始密度为5×104个/mL，得到含细胞的Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶。
实施例10
除了将实施例5中两次使用的0.5mL阿尔法培养基(Gibco)全部更换为0.5mL F-12培养基(Gibco)之外，其余操作同实施例5，3min可形成复合水凝胶。
再在复合水凝胶中包覆hUC-MSCs细胞，hUC-MSCs初始密度为5×104个/mL，得到含细胞的Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶。
对比例1未复合Ⅱ型胶原
称取50mg丙烯酰胺，溶解于0.5mL去离子水中，同时加入交联剂N,N′-亚甲基双丙烯酰胺4mg，引发剂过硫酸钾1.6mg以及加速剂N,N,N′,N′-四甲基乙二胺1.3mg，充分的溶解混合均匀后，13min可形成聚丙烯酰胺水凝胶。
本发明复合水凝胶具备多孔结构。实施例1-10的复合水凝胶的SEM图显示本发明复合水凝胶具备多孔结构，以实施例1所对应复合水凝胶的SEM图为例，参见图1，从图1中可以看出，本发明复合水凝胶具备多孔结构。分别将实施例1-10的复合水凝胶和对比例1的单纯聚丙烯酰胺水凝胶在TA AR2000ex应力控制流变仪(TA Instruments,USA)上进行测试，夹具为直径为20mm的平行板。将制备好的水凝胶迅速加到25℃的平板上，间隙值为1mm。检测弹性模量(G')和损耗模量(G”)随时间的函数来表征制剂的凝胶化性质，检测结果见表1、图2和图3。
本发明实施例1-5的复合水凝胶的成胶溶液还可替换为PBS、培养基、或生理盐水等，仍然可快速得到复合水凝胶。将实施例6-10得到的5种含细胞的Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶，增殖7天后，细胞密度见表1。死活细胞染色，荧光显微镜下观察细胞的生长状态和密度，显示实施例6-10含细胞的Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶中hUC-MSCs细胞的生长状态良好，密度较大，细胞增殖明显，具有良好的生物相容性；实施例6复合水凝胶中细胞的生长状态和密度检测结果见图4。图4显示实施例6复合水凝胶中hUC-MSCs细胞的生长状态良好，密度较大，细胞增殖明显，具有良好的生物相容性。
表1
使用该对比例1聚丙烯酰胺水凝胶进行hUC-MSCs复合培养，细胞增殖不明显，细胞的相容性较差；而本发明复合水凝胶进行hUC-MSCs复合培养，细胞增殖非常明显(具有显著差异，与对比例1比较P<0.05)，细胞的相容性良好；显示本发明复合水凝胶的生物相容性较对比例1聚丙烯酰胺水凝胶具有显著改善。
可见，Ⅱ型胶原对聚丙烯酰胺水凝胶的生物相容性具有协同增效，可以显著改善聚丙烯酰胺水凝胶的生物相容性，得到生物相容性优良的复合水凝胶。
对8周龄雄性新西兰兔(体重2.5-3kg)进行全身麻醉，无菌条件下右膝内侧髌骨旁切口，打开关节腔，剔除0.5cm*0.5cm大小软骨。实施例组动物分别原位注射本发明实施例1-5的复合水凝胶，对比例组动物使用对比例1的聚丙烯酰胺水凝胶，缝合关节腔及皮肤。以不加入任何支架材料的新西兰兔为空白对照组动物，逐层缝合伤口。术后每只兔每天肌注射40万单位青霉素，连续3天，以防膝关节感染。手术后动物不做固定，放回笼中饲养，自由活动。术后28天，实施例组动物切口愈合情况较好，膝关节活动度以及步态正常，切片显示关节腔以及缺损已进行明显修复，实施例1复合水凝胶进行软骨修复的效果图见图6；而对比例组使用对比例1聚丙烯酰胺水凝胶的动物，关节腔仍可见部分缺损；空白对照组动物，关节腔仍可见明显缺损，见图5。利用ICRS标准，对软骨修复的效果图进行评分，本发明实施例评分为7.2±0.2，对比例1评分为3.0±0.1，Ⅱ型胶原由于不成胶故未做考察，空白对照组评分为1.8±0.1，本发明实施例组较对比例组和空白对照组均具有显著性差异(P<0.05)。
进一步，将切片进行Ⅱ型胶原的免疫组化分析，实施例组动物切片中Ⅱ型胶原形成明显，实施例1复合水凝胶的Ⅱ型胶原形成明显(见图8)，对比例1几乎无形成，Ⅱ型胶原由于不成胶故未做考察，对照组几乎无形成(见图7)。利用ICRS标准，对软骨修复的效果图进行评分，本发明实施例评分为10.3±0.3，对比例1评分为3.5±0.1，空白对照组评分为2.5±0.1，本发明实施例组较对比例组和空白对照组均具有显著性差异(P<0.05)。
实验结果显示，本发明的复合水凝胶可有效修复软骨缺损，且具有明显的促进间充质干细胞软骨分化的能力，效果明显优于对比例1的聚丙烯酰胺水凝胶，也明显优于单纯的Ⅱ型胶原。可见，聚丙烯酰胺水凝胶对Ⅱ型胶原的促进间充质干细胞软骨分化的能力具有协同增效，可以显著改善Ⅱ型胶原的促进间充质干细胞软骨分化的能力，得到具备优良促进间充质干细胞软骨分化的能力的复合水凝胶。
与对比例1中的聚丙烯酰胺水凝胶、单纯的Ⅱ型胶原相比，本发明Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶的细胞的生物相容性得到显著的改进，具备明显的促进间充质干细胞软骨分化的能力，且促进间充质干细胞软骨分化的能力得到显著的改进，表明本发明Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶具有优良的细胞相容性以及有明显促进间充质干细胞软骨分化的能力且具有成胶时间短、机械强度优异等显著优于现有技术的技术效果。
本发明制备方法中参数的变化并不影响复合水凝胶的制备，因此本发明制备方法中任意参数的组合均可实现复合水凝胶的制备。在此不再赘述。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶，其特征在于，由Ⅱ型胶原、丙烯酰胺类单体、交联剂、加速剂、引发剂和成胶溶液制成；
所述丙烯酰胺类单体为丙烯酰胺、丙烯酰胺衍生物中的一种或者两种；
其中，每毫升成胶溶液中，Ⅱ型胶原的用量为10mg-20mg，丙烯酰胺类单体的用量为50mg-150mg，交联剂的用量为1mg-10mg，加速剂的用量为1mg-2mg，引发剂的用量为1mg-2mg。
2.根据权利要求1所述的复合水凝胶，其特征在于，所述丙烯酰胺类单体包括丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-羟甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺-丙烯酸共聚物中的一种或者两种以上。
3.根据权利要求1所述的复合水凝胶，其特征在于，所述成胶溶液为水、生理盐水、磷酸盐缓冲溶液、培养基溶液中的一种或者多种。
4.根据权利要求1所述的复合水凝胶，其特征在于，所述交联剂选用N,N′-亚甲基双丙烯酰胺；
所述加速剂选用N,N,N′,N′-四甲基乙二胺；
所述引发剂选用过硫酸钾、过硫酸铵中的一种或者两种。
5.一种含细胞的Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶，其特征在于，在权利要求1-4任一项所述复合水凝胶中复合细胞而得到。
6.根据权利要求5所述的含细胞的Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶，其特征在于，所述细胞为软骨细胞、干细胞中的一种或者多种。
7.根据权利要求6所述的含细胞的Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶，其特征在于，所述干细胞为脐带间充质干细胞、脐血干细胞中的一种或者两种。
8.一种药物缓释水凝胶制剂，其特征在于，在权利要求1-4任一项所述复合水凝胶中包覆药物而得。
9.根据权利要求1-4任一项所述的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括步骤：
将Ⅱ型胶原溶解在成胶溶液中，得到Ⅱ型胶原溶液；
将丙烯酰胺类单体溶解在成胶溶液中，加入交联剂、引发剂和加速剂，溶解混合均匀后，再加入Ⅱ型胶原溶液，混合均匀，得到Ⅱ型胶原和聚丙烯酰胺复合水凝胶。
10.根据权利要求1-4任一项所述的复合水凝胶在作为软骨修复材料或者制备软骨修复材料中的应用。
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